enfermedad de newcastle

CAPÍTULO 2.3.14.
ENFERMEDAD DE NEWCASTLE
RESUMEN
La enfermedad de Newcastle (EN) está causada por virus específicos del paramixovirus aviar de
tipo I (APMV-1) que es un serotipo del género Avulavirus perteneciente a la familia
Paramyxoviridae. Existen nueve serotipos de paramixovirus aviar designados desde APMV-I a
APMV-9.
Se ha demostrado que el NDV es capaz de infectar más de 200 especies de aves, pero la
gravedad de la enfermedad causada depende de cuál sea el hospedador y la cepa del virus. Las
cepas menos patógenas pueden inducir una enfermedad grave si se exacerban por la presencia
de otros organismos o mediante condiciones ambientales adversas. El método preferido de
diagnóstico es el aislamiento del virus y su subsiguiente caracterización.
Identificación del agente: Se preparan suspensiones en solución antibiótica de muestras
traqueales o cloacales (o heces) obtenidas de aves vivas o de heces y muestras de órganos
seleccionados procedentes de aves muertas que se inoculan en la cavidad alantoidea de huevos
embrionarios de aves de corral de 9–11 días de edad. Los huevos se incuban a 37°C durante 4–
7 días. El líquido alantoideo de cualquier huevo que contenga embriones muertos o moribundos,
cuando surgen, y todos los huevos al final del periodo de incubación se ensayan para detectar
actividad hemoaglutinante.
Cualquiera de los agentes hemoaglutinantes debería probarse para demostrar la inhibición
específica con un antisuero monoespecífico frente al NDV. El NDV (APMV-1) puede mostrar
alguna relación cruzada antigénica con algunos otros serotipos del paramixovirus aviar,
particularmente el APMV-3 y el APMV-7.
La patogenicidad de cualquier nuevo virus aislado se puede evaluar mediante la determinación del
índice de patogenicidad cerebral. La patogenicidad de los aislamientos también se puede valorar
empleando técnicas moleculares, p. ej. la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción
inversa y la secuenciación. El NVD está sometido a un control oficial en la mayoría de países y es
un virus muy fácil de propagar desde el laboratorio; de ahí la necesidad de mantener las medidas
adecuadas de bioseguridad y seguridad humana; para determinar el grado necesario de tales
medidas es preciso llevar a cabo una evaluación de riesgo.
Pruebas serológicas: La prueba de inhibición de la hemoaglutinación es la más ampliamente
utilizada en la serología del NDV; su relevancia en el diagnóstico depende del estado inmune
vacunal de las aves a ensayar y de las condiciones predominantes de la enfermedad.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Dependiendo de la situación de
la enfermedad, se emplean virus vivos de baja virulencia (lentogénicos) o de virulencia moderada
(mesogénicos) para la vacunación de aves de corral. También se utilizan vacunas inactivadas.
Las vacunas vivas se pueden administrar a las aves por diversas vías. Normalmente se preparan
mediante la extracción de líquidos alantoideos/amnióticos infectados procedentes de huevos
embrionarios de aves inoculados; algunas se preparan a partir de cultivos celulares infectados. Se
debería obtener el producto final de la expansión de los inóculos original y de trabajo.
Las vacunas inactivadas se administran por vía intramuscular o subcutánea. Habitualmente se
obtienen mediante la adición de formaldehído a preparaciones víricas infectivas o mediante
tratamiento con beta-propiolactona. La mayoría de vacunas inactivadas se prepara para uso
mediante una emulsión con aceite vegetal o mineral.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
1
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
Si se emplean formas patógenas del NDV para la producción de vacunas o en estudios de desafío,
el servicio debería cumplir los requisitos de la OIE para los patógenos del nivel de Contención del
Grupo 4.
A. INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Newcastle (EN) está causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un
serotipo del género Avulavirus perteneciente a la subfamilia Paramyxovirinae, familia Paramyxoviridae. Los
paramixovirus aislados procedentes de especies aviares se han clasificado mediante pruebas serológicas en
nueve serotipos designados desde APMV-1 a APMV-9; el virus de ND (NDV) se ha denominado APMV-1 (6).
Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endémica en muchos países. La vacunación profiláctica
se practica en casi todos los países productores de aves de corral a escala comercial.
Una de las propiedades más características de las cepas diferentes del NDV es su enorme variación respecto a
la patogenicidad para los pollos. Las cepas del NDV se agrupan en cinco patotipos sobre la base de los signos
clínicos observados en los pollos infectados (13, 15). Estos son:
1.
Velogénico viscerotrópico: es muy patogénica en la que se observan frecuentemente lesiones intestinales
hemorrágicas;
2.
Velogénico neurotrópico: se presenta con mortalidad elevada, habitualmente seguida de signos
respiratorios y nerviosos;
3.
Mesogénico: se presenta con signos respiratorios y signos nerviosos ocasionales pero baja mortalidad;
4.
Lentogénico o respiratorio: se presenta con una infección respiratoria leve o subclínica;
5.
Entérico asintomático: normalmente consiste en una infección entérica subclínica.
Raramente los agrupamientos en patotipos son claros (6, 7), e incluso en infecciones de aves libres de
patógenos específicos (SPF), se puede apreciar un considerable solapamiento. Además, puede tener lugar una
exacerbación de los signos clínicos inducida por las cepas más benignas si se superponen infecciones de otros
organismos o cuando se presentan condiciones medioambientales adversas.
Como los signos de la enfermedad clínica en pollos varían ampliamente y el diagnóstico puede complicarse
posteriormente por las respuestas diferentes a la infección en los distintos hospedadores, los signos clínicos por
sí solos no presentan una base fiable para el diagnóstico de la EN. Sin embargo, los signos clínicos y las
lesiones asociadas con los patotipos virulentos proporcionarán una fuerte sospecha de enfermedad.
El virus de la enfermedad de Newcastle es un agente patógeno de los humanos. Las infecciones registradas no
suponen un riesgo para la vida y la debilidad que causan no dura más de dos o tres días (18). Los síntomas que
con mayor frecuencia se han señalado en las infecciones humanas son la infección ocular, que normalmente
consiste en enrojecimiento de uno o de los dos ojos, lagrimeo excesivo, edema en los párpados, conjuntivitis, y
hemorragia de la membrana subconjuntival. Aunque el daño ocular puede ser bastante grave, las infecciones son
normalmente pasajeras y la cornea no se ve afectada. Los informes sobre otros síntomas en humanos infectados
con el NDV no están tan bien documentados, pero apuntan a que a veces, puede presentarse un tipo de
infección más generalizada que provoca escalofríos, dolor de cabeza, y fiebre, con o sin acompañamiento de
conjuntivitis. Existen pruebas de que las cepas vacunales y las virulentas (para las aves) contra el NDV pueden
infectar y provocar síntomas clínicos en el hombre. No existe evidencia de contagio entre humanos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
La EN, tal como se la define en la sección B.1.f de este capítulo, está sometida al control oficial en la mayoría de
los países y existe un gran riesgo de propagación del virus desde el laboratorio; de ahí que se deba llevar a cabo
una evaluación de riesgo para determinar el nivel de bioseguridad y seguridad humana necesario para llevar a
cabo el diagnóstico y la caracterización del virus. La instalación debe cumplir los requisitos para el Grupo de
contención adecuado, tal como se determina la valoración de riesgos y como se esboza en el capítulo 1.1.2 de
este Manual terrestre. Los países que no tienen acceso a los laboratorios nacionales o regionales deben enviar
muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
a)
Aislamiento el virus (Prueba prescrita para el comercio internacional)

Muestras para el aislamiento vírico
Cuando las investigaciones de la EN son el resultado de la aparición de enfermedad severa y mortalidad
elevada en grupos de aves, es corriente intentar el aislamiento del virus a partir de aves muertas
recientemente o aves moribundas que se sacrifican de forma indolora. Las muestras procedentes de aves
muertas deberían consistir en frotis oronasales, tanto como muestras procedentes de tejidos de pulmón,
riñones, intestino (incluyendo contenidos), bazo, cerebro, hígado y corazón. Pueden ser recogidos
separadamente o en conjunto, aunque, habitualmente, las muestras intestinales se procesan de forma
separada de otras muestras.
Las muestras procedentes de aves vivas deberían incluir tanto frotis traqueales como cloacales; las últimas
deberían estar visiblemente cubiertas de material fecal. Los pájaros pequeños y delicados pueden dañarse
por el muestreo pero la recogida de heces frescas puede servir como alternativa adecuada.
En el caso de que sean limitadas las oportunidades de obtener muestras, es importante que se examinen
los frotis cloacales (o fecales) y los frotis traqueales (o tejido traqueal) tanto como los órganos o tejidos más
afectados o asociados con la enfermedad clínica. Las muestras deberían tomarse en las etapas tempranas
de la enfermedad.
Se tendrían que colocar las muestras en solución salina isotónica tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0–
7,4, que contenga antibióticos. También se han utilizado medios basados en proteína, como infusión de
cerebro-corazón (BHI) o caldo de triptosa con tampón Tris (TBTB), lo que puede incrementar la estabilidad
del virus, sobre todo durante el transporte. Los antibióticos pueden variar de acuerdo a las condiciones
locales, pero podría ser, por ejemplo, penicilina (2.000 unidades/ml); estreptomicina (2 mg/ml); gentamicina
(50 µg/ml); y micostatina (1.000 unidades/ml) para frotis traqueales y de tejidos, pero a concentraciones
cinco veces superiores para frotis cloacales y de heces. Es importante reajustar la solución a pH 7,0–
7,4 después de la adición de los antibióticos. Si se quiere controlar Chlamydophila, se debe incluir
0,05 0,1mg/ml de oxitetracilina. Las heces y los tejidos tomados finamente deberían prepararse como
suspensiones al 10–20% (p/v) en la solución de antibiótico. Las suspensiones deberían procesarse tan
pronto como fuera posible después de una incubación durante 1–2 horas a temperatura ambiente. Cuando
es impracticable el procesamiento inmediato, las muestras pueden conservarse a 4°C hasta 4 días.
b)
Cultivo del virus
Los líquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante la clarificación
por centrifugación a 1.000 g durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura que no exceda los
25°C se inoculan en volúmenes de 0,2 ml en la cavidad alantoidea de cada uno de al menos cinco huevos
embrionarios de aves SPF de 9–11 días de incubación. Después de la inoculación, se incuban a 35–37°C
durante 4–7 días. Los huevos que contengan embriones muertos o moribundos cuando surgen, y todos los
huevos que permanezcan hasta el final del periodo de incubación, deberían enfriarse primero a 4°C y
probar los líquidos alantoideos para detectar actividad de hemoaglutinación (HA). Los líquidos que den una
reacción negativa deberían ser pasados en al menos un lote posterior de huevos.
c)
Identificación del virus
La actividad HA detectada en líquidos bacteriológicamente estériles recogidos a partir de huevos inoculados
puede deberse a la presencia de cualquiera de los 16 subtipos de hemoaglutininas de los virus de la gripe A
o de los ocho restantes serotipos de paramixovirus. (El líquido no estéril podría contener actividad HA
bacteriana). El NDV puede confirmarse empleando antisuero específico en una prueba de inhibición de la
hemoaglutinación (HI). Habitualmente se utiliza el antisuero de pollo preparado contra una de las cepas del
NDV.
Las reacciones cruzadas en las pruebas HI entre el NDV y algunos otros APMV, especialmente los virus de
los serotipos APMV-3 y APMV-7 pueden causar algunos problemas que pueden resolverse empleando
controles adecuados de antígeno y antisuero.
d)
Índice de patogenicidad
La variación extrema en la virulencia de los diferentes aislamientos víricos de la EN y el uso generalizado
de vacunas vivas implica que la identificación de un aislamiento como NDV a partir de aves que muestren
signos clínicos no confirma un diagnóstico de la EN, por lo que también se requiere una valoración de la
virulencia del aislamiento (véase sección B.1.f. bajo el título “Definición de la enfermedad de Newcastle”).
En el pasado, se han utilizado pruebas como el promedio de muerte en huevos, la prueba de la
patogenicidad intravenosa, y las vacunaciones utilizadas en esas pruebas (27), pero por acuerdo
internacional, se utiliza la prueba de la patogenicidad intracerebral para la valoración de la virulencia del
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Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
virus. La definición actual de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) (sección B.1.e. más
adelante) también reconoce los avances en la comprensión de lo que son las bases moleculares de la
patogenicidad y permite una confirmación de la virulencia, aunque no la ausencia de virulencia, mediante
pruebas in vitro para determinar la secuencia de aminoácidos en el punto de escisión de la proteína FO.
•
Índice de patogenicidad intracerebral
i)
El líquido alantoideo infectivo y fresco con un título HA >24 (>1/16) se diluye 1/10 en solución salina
isotónica estéril sin aditivos, tales como antibióticos.
ii)
Se inyectan por vía intracerebral 0,05 ml del virus diluido en diez polluelos procedentes de huevos de
un grupo de aves SPF. En el momento de la inoculación, estos polluelos deben tener más de 24 horas
y menos de 48 horas.
iii)
Las aves se examinan cada 24 horas durante 8 días.
iv)
En cada observación, las aves se puntúan: 0 si es normal, 1 si está enferma y 2 si está muerta. Las
aves que están vivas pero son incapaces de comer o beber deben sacrificarse y ser contabilizadas
como muertas en la observación posterior. (Los individuos muertos deben puntuarse como 2 en cada
una de las observaciones diarias siguientes a la muerte).
v)
El índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) es la puntuación media por ave y por observación
durante el periodo de 8 días.
Los virus más virulentos presentarán índices que se aproximan a la puntuación máxima de 2,0, mientras
que las cepas entéricas lentogénicas y asintomáticas presentarán valores próximos a 0,0.
e)
Base molecular de la patogenicidad
Durante la replicación, las partículas del NDV se producen con un precursor glicoproteico, F0, que tiene que
escindirse en F1 y F2 para que las partículas víricas sean infectivas. Esta división post-traduccional está
mediada por proteasas de la célula hospedadora. La tripsina es capaz de escindir F0 de todas las cepas
víricas de la EN.
Parece ser que las moléculas F0 de los virus virulentos para los pollos pueden dividirse mediante una
proteasa del hospedador o proteasas encontradas en un rango amplio de células y tejidos y, de este modo,
extenderse a través del hospedador dañando órganos vitales, mientras que las moléculas F0 en los virus de
baja virulencia están limitadas en su ruptura a ciertas proteasas del hospedador, lo que resulta en la
restricción de estos virus a replicarse solo en ciertos tipos de células hospedadoras.
La mayoría de los NDV que son patogénicos para los pollos tienen la secuencia 112R/K-R-Q-K/R-R116 en el
extremo C-terminal de la proteína F2 y un residuo de F (fenilalanina) en la posición 117, en el extremo Nterminal de la proteína F1, mientras que los virus de baja virulencia tienen secuencias en la misma región
de 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y un residuo de L (leucina) en la posición 117. Algunos de las variantes víricas
de la paloma examinadas (PPMV-1) tienen la secuencia 112G-R-Q-K-R-F117, pero tienen valores ICPI altos.
De modo que parece que existe el requerimiento de al menos un par de aminoácidos básicos en las
posiciones 116 y 115 más una fenilalanina como residuo 117 y un aminoácido básico (R) en la posición 113
si el virus muestra virulencia hacia los pollos.
Se han realizado diversos estudios empleando técnicas moleculares para determinar la secuencia del punto
de escisión de F0 mediante la reacción en cadena de la polimerasa de trascripción inversa (RT-PCR), bien
en virus aislados o bien en tejidos y heces procedentes de aves infectadas, realizándose a continuación el
análisis del producto mediante el análisis con enzimas de restricción, la hibridación con sonda o la
secuenciación de nucleótidos al objeto de establecer una prueba in vitro rutinaria para determinar la
virulencia (para una revisión véase ref.2). La determinación de la secuencia de escisión de F0 puede
proporcionar una indicación clara de la virulencia del virus y esto se ha incorporado a la definición de la EN
(véase sección B.1.f.).
En el diagnóstico de la EN es importante entender que la demostración de la presencia del virus con
múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0 confirma la presencia de virus virulentos o
potencialmente virulentos, pero la falta de detección de virus o la detección de NDV sin múltiples
aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0 empleando técnicas moleculares, no confirma la
ausencia de virus virulentos. Una primera correspondencia mala o la posibilidad de que en una misma
población estén mezclados virus virulentos y avirulentos, implica que todavía será necesario el aislamiento
del virus y una valoración in vivo de su virulencia.
Los análisis recientes de virus aislados en Irlanda en 1990 y los realizados durante los brotes de la EN de
1998–2000 en Australia han proporcionado una clara evidencia de que los virus virulentos pueden surgir a
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
partir de virus progenitores de baja virulencia (5, 39). También se ha generado de manera experimental un
virus virulento de la EN a partir de un virus de baja virulencia mediante pases en pollos (34).
f)
Definición de la enfermedad de Newcastle
Parece probable que la gran mayoría de aves sea susceptible a la infección con NDV tanto de virulencia
alta como de virulencia baja para los pollos, aunque los signos clínicos observados en aves infectadas con
el NDV varían ampliamente y dependen de factores tales como: el virus, la especie hospedadora, la edad
del hospedador, la infección con otros organismos, el estrés medioambiental y el estado inmune. Bajo
algunas circunstancias la infección con los virus extremadamente virulentos puede provocar una mortalidad
repentina alta con signos clínicos relativamente escasos. Así que los signos clínicos son variables y están
influidos por otros factores de modo que ninguno puede considerarse patognomónico.
Incluso en los hospedadores susceptibles, tales como los pollos, los NDV muestran un rango considerable
de virulencia. Generalmente, la variación consiste en grupos alrededor de los dos extremos en la prueba,
pero, por diversas razones, algunos virus pueden mostrar virulencia intermedia.
La variación enorme en la virulencia y en los signos clínicos implica la necesidad de definir cuidadosamente
lo que constituye la EN para los propósitos de comercio, políticas y medidas de control. La definición de la
EN actualmente en uso en todos los estados miembros de la Unión Europea es la que se contempla en la
Directiva 92/66/EEC (17, 20).
La definición de la OIE para anunciar un foco de la EN es:
“La enfermedad de Newcastle se define como una infección de aves causada por un virus del serotipo 1 del
paramixovirus aviar (APMV-1) que cumple uno de los criterios siguientes de virulencia:
a)
El virus tiene un índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) en polluelos de un día (Gallus
gallus) de 0,7 o superior.
o
b)
Se han demostrado en el virus múltiples aminoácidos básicos (o directamente o por deducción)
en el extremo C-terminal de la proteína F2 y un residuo de fenilalanina en la posición 117, la cual
está en el extremo N-terminal de la proteína F1. El término “múltiples aminoácidos básicos” se
refiere a que existen al menos tres residuos de arginina o lisina entre las posiciones 113 y 116.
La imposibilidad de demostrar el modelo característico de residuos de aminoácidos como se ha
descrito anteriormente requeriría la caracterización del virus aislado mediante una prueba ICPI.
En esta definición, los residuos de aminoácidos se numeran desde el extreme N-terminal de la secuencia
de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de nucleótidos del gen F0 donde las posiciones 113–
116 corresponden de la –4 a la –1 a partir del punto de escisión.”
g)
Anticuerpos monoclonales
Se han utilizado anticuerpos monoclonales de ratón (MAb) dirigidos contra cepas del NDV en pruebas HI
para conseguir una identificación rápida del NDV sin las posibles reacciones cruzadas con otros serotipos
APMV que pueden tener lugar con sueros policlonales. Se han creado MAb que dan reacciones en pruebas
HI y que son específicos para cepas particulares o variantes de aislamientos del NDV (4, 6, 9, 10).
Se han empleado tablas de MAb para establecer perfiles antigénicos de aislamientos del NDV basándose
en si reaccionan o no con los virus. Se ha demostrado que es un método valioso para agrupar y diferenciar
los aislamientos del NDV y ha sido particularmente de valor para entender la epidemiología de los brotes (9,
10).
h)
Estudios filogenéticos
En los últimos años el desarrollo de técnicas mejoradas para la secuenciación de nucleótidos, la
disponibilidad de datos de la secuencia de más NDV en bases de datos informatizadas y la demostración
de que incluso longitudes de secuencia relativamente cortas pueden dar resultados significativos en análisis
filogenéticos, han conducido a un incremento considerable en tales estudios. Se ha detectado una
diversidad genética considerable, pero los virus que comparten parámetros temporales, geográficos,
antigénicos o epidemiológicos tienden a encuadrarlos en linajes o grupos taxonómicos específicos, y se ha
comprobado que esto es importante para valorar tanto la epidemiología global como la propagación local de
la EN (4, 8, 19, 28, 32, 33, 38, 41, 43, 44)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
Aunque en el pasado los estudios filogenéticos han sido impracticables como herramienta rutinaria, en la
actualidad la mayor disponibilidad y el incremento en la velocidad de obtención de resultados empleando
kits sofisticados y disponibles comercialmente para la RT-PCR y secuenciadotes automáticos permite que
tales estudios se encuentren dentro de los equipamientos de muchos más laboratorios de diagnóstico y que
puedan proporcionar resultados significativos que sean contemporáneos en lugar de retrospectivos (2).
Aldous et al. (4) propusieron que la genotipificación de los aislamientos del NDV formaran parte de la
caracterización diagnóstica del virus para los laboratorios de referencia mediante la producción de la
secuencia de 375 nucleótidos del gen F, que incluye el punto de escisión del F0, de forma rutinaria para
todos los virus y la comparación de las secuencias obtenidas con otros aislamientos y 18 virus
representativos de los linajes y sublinajes reconocidos. Ese análisis permitiría una rápida valoración
epidemiológica de los orígenes y la propagación de los virus responsables de los brotes de EN.
i)
Técnicas moleculares para el diagnóstico
Además del uso de la RT-PCR y de otras técnicas similares para la determinación de la virulencia de los
NDV (véase sección B.1.e.) o para estudios filogenéticos (véase sección B.1.h.), han habido varias
publicaciones sobre el uso de tales técnicas moleculares para detectar el NDV en muestras clínicas, con la
ventaja de la demostración extremadamente rápida de la presencia del virus e incluso de su virulencia si se
emplean cebadores que cubran la parte del genoma que codifica el punto de escisión de F0 (12, 20, 21).
Se debería tener cuidado en la selección de muestras clínicas ya que algunos estudios han demostrado
falta de sensibilidad en la detección de los virus en algunos órganos y particularmente en las heces (20, 21,
23, 25). Como ocurre en la determinación de la virulencia, es importante que tales técnicas no se empleen
solas para registrar un resultado como negativo en las investigaciones en las que se sospeche la EN (30).
Con frecuencia se utilizan frotis traqueales u orofarínegos como muestras de elección porque son fáciles de
procesar y por lo general, contienen poco material orgánico extraño que pueda interferir con la recuperación
y amplificación del ARN mediante la PCR. No obstante, también se han utilizado con cierto éxito muestras
de tejidos y de órganos e incluso las heces. El sistema utilizado para la extracción del ARN también influirá
en la eficacia de la RT-PCR con muestras clínicas, y se debe procurar escoger los kits comerciales más
adecuados o validados para las muestras a examinar.
Normalmente se han utilizado sistemas de RT-PCR para amplificar una porción específica del genoma que
tienen un valor añadido; por ejemplo, amplificando parte del gen F que contiene el punto de escisión del FO
de manera que el producto pueda utilizarse para valorar la virulencia (3, 14, 23, 25, 29, 37, 38). El principal
inconveniente de la utilización de la RT-PCR para el diagnóstico estriba en la necesidad del procesamiento
que sigue a la amplificación debido a la contaminación potencial del laboratorio y la contaminación cruzada
de las muestras.
Una de las estrategias que se siguen para no tener que realizar el procesamiento post-amplificación
consiste en la utilización de las técnicas de la RT-PCR (rRT-PCR) en tiempo real. La ventaja de estas
pruebas es que la rRT-PCR basada en el uso de sondas de hidrólisis fluorogénica o de tinciones
fluorescentes hace innecesaria la fase de procesamiento post-amplificación y se pueden obtener los
resultados en menos de 3 horas. La aplicación más eficaz de las pruebas de la rRT-PCR se realizó en
EE.UU. cuando ocurrieron los brotes de EN en 2002–2003, cuando se aplicó la prueba descrita por Wise et
al. (46), que mostró una sensibilidad del 95% en comparación con el aislamiento del virus para más de
1.400 muestras. La prueba se realiza con tres conjuntos de cebadores y sondas que se utilizan en
reacciones independientes: un conjunto de cebadores/sondas para la matriz que está diseñado para
detectar la mayoría de las cepas del NDV, un conjunto de cebadores/sondas de fusión con los que se
puede identificar cepas virulentas del NDV (incluyendo muchos virus PPMV-1) y un conjunto de
cebadores/sondas diseñados para detectar cepas de virus de baja virulencia. Primero se examinan las
muestras con los cebadores/sondas de la, luego se ensayan las muestras positivas con las de baja
virulencia y con la fusión y los conjuntos de cebadores/sonda para confirmar la presencia de los virus de
poca virulencia y los de mucha virulencia, respectivamente. Los cebadores y las sondas del mencionado
informe fueron validadas en cepas lentogénicas, mesogénicas y velogénicas que se encuentran
habitualmente en los Estados Unidos de América. En el momento álgido del brote, se ensayaron entre
1.000 y 1.500 muestras cada día mediante rRT-PCR. La desventaja de la rRT-PCR es que, actualmente,
los termocicladores especiales que se precisan son demasiado caros, lo que obliga a muchos laboratorios a
descartar el empleo de este sistema.
Una cuestión adicional es que, mientras que la mayor parte de los aislamientos del NDV están muy
relacionados genéticamente, se ha demostrado que algunos son genéticamente diferentes. Por ejemplo, un
grupo de virus adscrito al genogrupo 6 por Aldous et al. (4) y ulteriormente a la Class I por Czegledi et al.
(24), es tan diferente de todos los demás aislamientos de NDV, p. ej. de los virus de la Clase II (24) que se
necesitan diferentes cebadores para sus detección mediante pruebas de RT-PCR.
Al igual que para establecer la virulencia, es importante que no se utilicen solo las técnicas PCR para
registrar un resultado negativo en las investigaciones de la EN sospechosa.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
2.
Pruebas serológicas
El NDV puede emplearse como un antígeno en una variedad amplia de pruebas serológicas, lo que permite que
se utilicen las técnicas de neutralización o de enzimoinmunoensayo (ELISA) y HI para valorar el nivel de
anticuerpos en las aves. En la actualidad, la prueba HI es la más ampliamente utilizada para la detección de
anticuerpos contra el NDV en las aves, aunque muchos productores de aves de corral utilizan kits de ELISA
comerciales para valorar los niveles de anticuerpos tras la vacunación
En diferentes laboratorios se practican variaciones de los procedimientos para las pruebas HA y HI. Los
siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulación de plástico y fondo en V en las que el
volumen final para ambos tipos de prueba es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS
isotónico (0,1 M), pH 7,0–7,2, y RBC procedentes de un mínimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen
igual de solución de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre procedente de aves no
vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al NDV). Las células se
deberían lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensión al 1% (células empacadas v/v). Debería
realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antígenos y de los
antisueros.
a)
Pruebas de hemaglutinación y de inhibición de la hemaglutinación
Los sueros de pollo raramente dan reacciones positivas no específicas en esta prueba y es innecesario cualquier
pretratamiento de los sueros. Los sueros procedentes de especies distintas a las de los pollos a veces pueden
causar aglutinación de los eritrocitos (RBC) de pollo, así que esta propiedad debería determinarse primero, y
posteriormente extraer mediante adsorción del suero con RBC de pollo. Esto se realiza adicionando 0,025 ml de
RBC de pollo empacados a cada 0,5 ml de antisueros, agitando suavemente y dejándolos durante al menos
30 minutos; a continuación los RBC se precipitan mediante centrifugación a 800 g durante 2–5 minutos y se
decantan los sueros adsorbidos.
En diferentes laboratorios se practican variaciones de los procedimientos para las pruebas HA y HI. Los
siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulación de plástico y fondo en V en las que el
volumen final para ambos tipos de prueba es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS
isotónico (0,1 M), pH 7,0–7,2, y RBC procedentes de un mínimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen
igual de solución de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre procedente de aves no
vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al NDV). Las células se
deberían lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensión al 1% (células empacadas v/v). Debería
realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antígenos y de los
antisueros.
•
Pruebas de hemaglutinación
i)
Se distribuyen 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico y fondo en
V.
ii)
A cada pocillo se adicionan 0,025 ml de la suspensión vírica (p. ej. líquido alantoideo infectivo). Para
una determinación precisa del contenido de HA, se debería hacer a partir de una serie de diluciones
muy cercanas a una inicial, p. ej. 1/3, 1/5, 1/7, etc.
iii)
A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de la suspensión vírica en volúmenes de
0,025 ml.
iv)
Posteriormente se adicionan a cada pocillo 0,025 ml de PBS.
v)
En cada pocillo se dispensan 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v).
vi)
La solución se mezcla golpeando suavemente la placa. Se dejan estáticos los RBC durante unos
40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. aproximadamente a 20°C, o durante 60 minutos a 4°C si las
temperaturas son altas, considerando que los RBC control deberían sedimentar de una forma distinta.
vii)
La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de una corriente en
forma de lágrima de los RBC. Debería leerse la titulación a la dilución más alta a la que se de una HA
completa (sin corriente); esto representa 1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a
partir del rango inicial de diluciones.
•
Prueba de inhibición de la hemaglutinación
i)
Se dispensan 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico y fondo en
V.
ii)
Se adicionan 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.
iii)
A lo largo de la placa se realizan diluciones dobles del suero en volúmenes de 0,025 ml.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
iv)
A cada pocillo se añaden 4 HAU de virus/antígeno en 0,025 ml y la placa se deja durante un mínimo
de 30 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20°C, o 60 minutos a 4°C.
v)
A cada pocillo se añaden 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v) y, después de mezclar suavemente,
los RBC se dejan estáticos unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20°C, o durante
unos 60 minutos a 4°C si las temperaturas del ambiente son altas, considerando que los RBC control
deberían sedimentar de una forma distinta.
vi)
El título de HI es la dilución mayor de suero que causa la inhibición completa de 4 HAU de antígeno.
La aglutinación se valora inclinando las placas. Debería considerarse que muestran inhibición solo
aquellos pocillos en los que la corriente de RBC se produce a la misma velocidad que los pocillos
control (que contienen 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS).
vii)
La validez de los resultados debería evaluarse frente a un suero control negativo, que no debería
presentar un título >1/4 (>22 o >log2 2 cuando se expresa como el recíproco), y un suero control
positivo para el cual el título debería encontrarse entre una de las diluciones del título conocido.
El valor de la serología en el diagnóstico está relacionado claramente con el estado inmune esperado de las
aves afectadas. Los títulos de HI pueden considerarse positivos si hay inhibición a una dilución del suero de
1/16 (24 o log2 4 cuando se expresa como el recíproco) o superior contra 4 HAU de antígeno. Algunos
laboratorios prefieren usar 8 HAU en las pruebas de HI. Mientras esto se permita, afectará a la
interpretación de los resultados de modo que un título positivo será 1/8 (23 o log2 3) o superior. Se debería
incluir una nueva titulación del antígeno en todas las pruebas para verificar el número de HAU utilizadas.
Los títulos de HI pueden emplearse para evaluar el estado inmune de un grupo de aves. En grupos
vacunados que estén siendo controlados serológicamente, es posible identificar respuestas anamnésicas
como resultado de una infección de desafío con el virus de campo (13), pero se debería proceder con gran
cautela porque se pueden producir variaciones por otras causas. Por ejemplo, se ha demostrado que las
infecciones por el virus APMV-3 de pavos vacunados contra el NDV darán por resultado títulos
sustancialmente elevados frente al NDV (11).
b)
Enzimoinmunoensayo
Se dispone comercialmente de una variedad de kits de pruebas ELISA que se basan en diversas
estrategias para la detección de anticuerpos contra el NDV, incluyendo ELISA indirecto, tipo sándwich y de
bloqueo o competitivo, que emplean MAb. Al menos uno de los kits utiliza una subunidad antigénica.
Habitualmente estas pruebas se han validado y evaluado por el fabricante y, por tanto, es importante que
para su uso, se sigan cuidadosamente las instrucciones especificadas. Las pruebas HI y ELISA pueden
medir los anticuerpos contra diferentes antígenos; dependiendo del sistema utilizado, la prueba ELISA
puede detectar anticuerpos contra más de un antígeno, mientras que el uso de la prueba HI probablemente
se limita a los anticuerpos contra la proteína de la EN. No obstante, algunos estudios de tipo comparativo
han demostrado que los ELISA son reproducibles y tienen sensibilidad y especificidad altas; se ha
demostrado que correlacionan bien con la prueba HI (1). Los ELISA convencionales tienen la desventaja de
que es preciso validar la prueba para cada especie de ave con la que aquella se utiliza. En los ELISA
competitivos normalmente se utilizan MAb que, debido a su especificidad para los epitopos individuales,
puede ser que no reconozcan todas las cepas del APMV-1.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
Se ha publicado una descripción detallada de todos los aspectos de las vacunas del NDV, incluyendo su
producción y usos (11, 13) y debería consultarse para conocer los detalles de los procedimientos que aquí se
recogen. En el capítulo 1.1.8. Principios de producción de vacunas veterinarias, se indican las directrices para la
producción de este tipo de vacunas. Las directrices dadas aquí y en el capítulo 1.1.8 pretenden ser de carácter
general y pueden complementarse en el caso de que existan requisitos regionales y nacionales.
En esta sección se considerarán vacunas convencionales y comerciales vivas e inactivadas, porque todavía se
emplean universalmente. Sin embargo, se debería recordar que existen muchos trabajos recientes sobre la
aplicación de técnicas de biología molecular en la producción de nuevas vacunas y hay constancia del éxito en la
obtención de inmunidad protectora con virus recombinantes de la viruela aviar, el virus vacunal, el virus de la
viruela de la paloma, el herpesvirus del pavo y las células aviares en las que se expresan el gen HN, o el gen F,
o los dos genes, del NDV. En algunos países se ha autorizado el uso de varios de estos virus recombinantes.
Las cepas víricas de la EN empleadas en las vacunas comerciales de virus vivos se encuadran en dos grupos:
vacunas lentogénicas tales como Hitchner-B1, La Sota, V4, NDW, I2 y F, y vacunas mesogénicas, tales como
Roakin, Mukteswar y Komarov. Las cepas de ambos grupos han sido seleccionadas y clonadas para satisfacer
8
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
los diferentes criterios en su producción y aplicación. Todos los virus de vacunas mesogénicas tienen dos pares
de aminoácidos básicos en el punto de escisión F0 y valores ICPI de aproximadamente 1,4. Esto significa que
las infecciones de aves con estos virus entrarían dentro de la definición propuesta para la EN (sección B.1.f.)
pero como estas vacunas se emplean principalmente en países donde la EN es endémica, este hecho puede
que no excluya necesariamente su uso. Algunos países han dispuesto que solo se puedan utilizar cepas
lentogénicas del NDV en las vacunas (42).
El servicio de producción de vacunas debería operar bajo los procedimientos y prácticas apropiados de
bioseguridad. Si la EN, como se define en la sección B.1.f. de este capítulo, se utiliza para la producción de
vacunas o para estudios de desafío de la vacuna, la parte del servicio donde se realice el trabajo debería cumplir
los requisitos para los patógenos del nivel de Contención del Grupo 4, como se recoge en capítulo 1.1.2 de este
Manual.
La mayoría de vacunas con virus vivos crecen en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios de aves pero
algunas, notablemente algunas cepas mesogénicas, se han adaptado a una variedad de sistema de cultivos de
tejidos.
Las vacunas con virus vivos pueden administrarse a las aves incorporándolas en el agua de bebida,
administrándose como un spray grueso o mediante instilación conjuntival o intranasal. En los Estados Unidos de
América se ha autorizado una vacuna lentogénica para uso in ovo. Algunas cepas mesogénicas se obtienen por
inoculación intradérmica en la membrana del ala. Se han preparado vacunas que dan resultados óptimos
mediante la aplicación de vías específicas. En general, las vacunas vivas más inmunogénicas son más virulentas
y, por tanto, es más probable que causen efectos secundarios adversos. Por ejemplo, la vacunación con la cepa
La Sota causará problemas considerablemente mayores en aves susceptibles jóvenes que la cepa Hitchner-B1,
aunque La Sota induce una respuesta inmune más fuerte.
Las vacunas inactivadas se consideran más caras que las vacunas vivas y su empleo entraña la manipulación e
inyección de aves individuales. Se preparan a partir de líquido alantoideo al que se inactiva su infectividad
mediante la adición de formaldehído o beta-propiolactona. Se incorpora en una emulsión con aceite mineral y se
administra por vía intramuscular o subcutánea. Así las aves individuales reciben una dosis estándar. No se
produce la propagación subsiguiente del virus ni reacciones respiratorias adversas. Se utilizan tanto cepas
virulentas como avirulentas como inóculo vírico aunque, desde el punto de vista del control de la seguridad, el
uso de estas últimas parece menos adecuado. Como después de la administración no se produce la
multiplicación vírica, se requiere una cantidad de antígeno para la inmunización mucho mayor que en el caso de
la vacunación con virus vivos. Es importante un rendimiento elevado de virus para producir una vacuna potente,
y, para este propósito, es muy adecuada la cepa Ulster 2C.
La duración de la inmunidad depende del programa de vacunación elegido. Una de las consideraciones más
importantes que afectan a los programas de vacunación es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jóvenes
que puede variar considerablemente de granja a granja, de lote a lote y entre pollos individuales. Por esta razón,
se emplean diversas estrategias. O los pájaros no se vacunan hasta las 2–4 semanas de vida cuando la mayoría
de ellos será susceptible, o se vacunan con 1 solo día de vida por instilación conjuntival o mediante la aplicación
de un spray grueso. Se establecerá una infección activa en algunas aves que persistirá hasta que la inmunidad
maternal decrezca. Entonces, se llevará a cabo una revacunación 3–4 semanas más tarde. Se ha demostrado
que las vacunas inactivadas también pueden ser empleadas adecuadamente para vacunar polluelos de 1 día
que tienen cierto grado de inmunidad maternal (15, 17), y los mejores resultados se han obtenido cuando a los
polluelos maternalmente inmunes de 1 día se les da una combinación de vacunas viva e inactivada, comparada
con vacunas vivas o inactivadas dadas de forma separada (14, 16). La vacunación de aves de 1 día totalmente
susceptibles, incluso con las vacunas vivas más suaves, puede provocar en enfermedad respiratoria,
especialmente si están presentes en cantidad significativa bacterias patógenas comunes.
Normalmente se practica una vacunación después de 3 semanas de vida solo en gallinas de crianza y gallinas
de puesta. Se debería llevar a cabo con intervalos de suficiente frecuencia para mantener una inmunidad
adecuada. Los programas de vacunación emplean con frecuencia vacunas con virus vivos un poco más
patogénicos para reforzar la inmunidad de las usadas inicialmente. También pueden usarse estas vacunas vivas
más patogénicas después de una vacunación inicial con vacunas inactivadas en emulsión de aceite.
Cuando se diseña un programa de vacunación, debería tenerse en consideración el tipo de vacuna utilizada, el
estado inmune y de enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de protección requerido en relación a cualquier
posibilidad de infección con el virus de campo bajo las condiciones locales (13). Aquí se indican dos ejemplos de
programas de vacunación que pueden utilizarse en diferentes circunstancias de enfermedad. Para el primer
ejemplo, cuando la enfermedad es leve y esporádica se sugiere que se adopte el siguiente orden de vacunación:
vacuna viva Hitchner-B1 mediante administración conjuntival o de spray a 1 día de edad; vacuna viva Hitchner-B1
o La Sota a los 18–21 días de vida en el agua de bebida; vacuna viva La Sota en el agua de bebida a las
10 semanas de vida y una vacuna inactivada en emulsión de aceite en el momento de la puesta. Para el
segundo ejemplo, cuando la enfermedad es severa y más extendida, se adopta el mismo protocolo ya indicado
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
hasta los 21 días de vida y a esto le sigue la revacunación a los 35–42 días de vida con la vacuna viva La Sota
en el agua de bebida o como spray; esta revacunación se repite a las 10 semanas de vida con una vacuna
inactivada (o una vacuna viva mesogénica) y de nuevo se repite en el momento de la puesta (13).
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
El primer principio a considerar cuando se selecciona una cepa para una vacuna viva del NDV es si se va a
usar como vacuna primaria o secundaria, siendo su patogenicidad la principal consideración. Los métodos
de aplicación y frecuencia de uso son consideraciones válidas. El uso de MAb ha demostrado una variación
considerable en la antigenicidad de cepas diferentes (9, 10). Esto puede indicar la necesidad de adaptar las
vacunas más cuidadosamente a virus antigénicamente relacionados con cualquier virus de campo
predominante.
Se ha introducido una vacuna viva basada en la cepa V4 del NDV, seleccionada por su estabilidad al calor,
para combatir los problemas específicos asociados con la crianza del pollo campero en los países en
desarrollo. La intención es que esta vacuna pueda estar protegida por el alimento para los pollos que se
alimentan de restos. Hasta la fecha, los ensayos realizados en diferentes países han producido resultados
mezclados; bien puede ser que los factores locales sean extremadamente importantes afectando al éxito de
esta estrategia (35, 40). Más recientemente se ha desarrollado la vacuna I2 termoestable específicamente
para la vacunación de los pollos camperos; actualmente se recomienda que esta vacuna se suministre
mediante gota al ojo (9).
El uso de vacunas vivas puede estar restringido por la legislación. Por ejemplo, la Decisión de la Comisión
93/152/EEC (18, 21) restringe el uso de vacunas en los estados miembros de la Unión Europea desde el
1 de Enero de 1995 a aquellos para los que el inóculo original se ha probado y muestra tener un ICPI <0,4
si se administran a cada ave no menos de 107 dosis infectivas de huevo (EID50), o <0,5 si se administran a
cada ave no menos de 108 EID50. De manera similar, la Comisión de Estándares de la OIE ha
recomendado que mientras en principio las vacunas deberían tener un ICPI < 0,7 para poder explicar la
variabilidad entre distintos ensayos y laboratorios, se tendría que admitir un margen de seguridad con
objeto de que las cepas víricas del inóculo original para la fabricación de vacunas no tengan un ICPI que
exceda el valor 0,4 (30, 35).
La consideración más importante en la selección de un inóculo para preparar una vacuna inactivada es la
cantidad de antígeno producida cuando crece en huevos embrionarios; raramente es rentable concentrar el
virus. Se han usado tanto cepas virulentas como lentogénicas para preparar vacunas inactivadas, pero las
primeras ofrecen un riesgo innecesario porque supone la manipulación de grandes cantidades de virus
virulentos así como el peligro de una inactivación inadecuada y la posible contaminación consiguiente. Este
riesgo está contemplado en la Decisión de la Comisión 93/152/EEC (18, 21), que restringe el uso de virus
para la fabricación de vacunas inactivadas en los estados miembros de la Unión Europea a partir del 1 de
enero de 1995 a aquéllos para los cuales se ha probado el inóculo original y muestra tener un ICPI <0,7 si
se administra a cada ave no menos de 108 EID50. Algunas cepas lentogénicas crecen hasta niveles muy
altos en los huevos. Se pueden obtener títulos excepcionalmente elevados mediante la cepa Ulster 2C, la
cual se recomienda como inóculo para la vacuna inactivada (22, 26). Sin embargo, cuando se usan como
inóculos las cepas Hitchner B1, La Sota o F se consiguen vacunas inactivadas con éxito comercial.
b)
Método de cultivo
Se establece un inóculo original y a partir del mismo un inóculo de trabajo. Si la cepa se ha clonado
mediante dilución limitante o selección en placa, el establecimiento de un cultivo maestro solo puede
implicar la producción de un gran volumen de líquido alantoideo infectivo (como mínimo 100 ml), que puede
conservarse en forma de alícuotas liofilizadas (0,5 ml).
c)
Validación como vacuna
A los virus del inóculo de origen desconocido se les debería realizar pases a través de huevos SPF y ser
clonados antes de producir el inóculo original. También puede ser conveniente algún pase a través de
pollos SPF (11, 13). En cualquier caso, después de su preparación, el inóculo original se debería comprobar
su esterilidad, seguridad, potencia y presencia de agentes extraños. Algunos países también exigen
estudios mediante pases retrospectivos para la vacuna viva del NDV a fin de asegurarse de que no
aumenta la patogenicidad como consecuencia de su circulación entre pájaros (42).
10
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
2.
Método de producción
Para la producción de la vacuna, primero se establece un inóculo de trabajo, a partir de cualquiera de los lotes de
vacuna producidos, mediante la expansión de una alícuota del inóculo original hasta un volumen suficiente para
permitir la producción de la vacuna durante 12–18 meses. Es mejor conservar el inóculo de trabajo de forma
líquida a una temperatura de –60°C o inferior porque el virus liofilizado no siempre se multiplica hasta un título
alto en el primer pase subsiguiente (11, 13).
La mayoría de las vacunas de la EN se producen en huevos embrionarios de ave y las vacunas de virus vivos
deberían producirse en huevos SPF. El método de producción es la propagación del virus aséptica y a gran
escala; todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad.
Es habitual diluir el inóculo de trabajo en PBS estéril, pH 7,2, de modo que aproximadamente se inoculan 103–
104 EID50/0.1 ml en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios SPF de 9 o 10-días de vida. A continuación se
incuban a 37°C. Se deberían desechar los huevos que contengan embriones muertos en las 24 horas. El tiempo
de incubación dependerá de la cepa vírica utilizada y se predeterminará para asegurar una producción máxima
con el número mínimo de muerte de embriones.
Los huevos infectados deberían enfriarse a 4° C antes de recogerse. Se quitan las partes superiores de los
huevos y se aspiran los líquidos alantoideos después de la eliminación del embrión. Debería evitarse la inclusión
de cualquier resto de yema o de albúmina. Se deberían conservar todos los líquidos inmediatamente a 4° C y
comprobar la ausencia de contaminación bacteriana antes de preparar grandes cantidades para la liofilización o
inactivación. Normalmente, las vacunas vivas se liofilizan. La metodología depende de los aparatos utilizados y
de la pericia de los fabricantes, pero esta es una etapa muy importante ya que una liofilización inadecuada
resulta tanto en pérdidas de título como en un periodo de validez reducido.
En la producción de vacunas inactivadas, se trata el líquido alantoideo recogido con formaldehído (una
concentración final típica es 1/.1.000) o beta-propiolactona (una concentración final típica es 1/2.000–1/4.000). El
tiempo requerido debe ser suficiente para asegurar que esté libre de virus vivos. La mayoría de vacunas
inactivadas no se concentran; el líquido alantoideo inactivado normalmente se emulsiona con aceite mineral o
vegetal. Generalmente, las fórmulas exactas son secretos comerciales.
Generalmente, las vacunas inactivadas basadas en aceite se preparan como emulsiones primarias de agua en
aceite. Habitualmente, la fase oleosa consiste en nueve volúmenes de aceite mineral altamente refinado, tal
como Marcol 52, Drakeol 6VR y BayolF, más un volumen de agente emulsionante, tal como Arlacel A, Montanide
80 y Montanide 888 (31, 36). La fase acuosa es el virus inactivado al que se le adiciona un emulsionante no
iónico como Tween 80. Normalmente la relación fase oleosa a fase acuosa es de 1:1 hasta 1:4. Los fabricantes
se esfuerzan para conseguir un balance entre el efecto adyuvante, la viscosidad y la estabilidad. Si la viscosidad
es demasiado alta, la vacuna será difícil de inyectar; si es demasiado baja, la vacuna es inestable.
3.
Control del proceso
Cada lote de vacuna con virus vivo debe probarse en cuanto a su viabilidad y potencia. Para aquéllas producidas
en huevos, el control más importante del proceso es comprobar la ausencia de contaminación bacteriana y
fúngica. Esto es necesario debido a la aparición ocasional de huevos en estado de putrefacción que pueden no
ser detectados hasta el momento de la recogida.
Para las vacunas inactivadas debe probarse la eficacia del proceso de inactivación en huevos embrionarios,
tomando 25 alícuotas (0,2 ml) de cada lote y realizando pases cada tres veces a través de embriones SPF (11,
13).
4.
Control de lotes
La mayoría de los países han publicado especificaciones para el control de la producción y comprobación de las
vacunas del NDV (p. ej. ref. 29, 34), que incluyen la definición de las pruebas obligatorias en vacunas durante y
después de su manufactura.
Es necesario probar la infectividad de las vacunas con virus vivos para conseguir que se administren los niveles
adecuados de virus. Habitualmente se titula el virus en huevos embrionarios de aves hasta conseguir la EID50.
Esto implica realizar diluciones a la décima del virus; se inoculan 0,1 ml de cada dilución en entre cinco y siete
huevos embrionarios de aves de 9–10 días de vida. Después de 5–7 días de incubación a 37°C, los huevos se
enfrían y se prueban para demostrar su actividad hemoaglutinante, que es una indicación de la presencia del
virus vivo. La EID50 a punto final se calcula empleando una formula estándar tal como la de Spearman–Kärber
(10, 12).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
11
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
a)
Esterilidad
Las pruebas para determinar que los materiales biológicos están estériles y libres de contaminación se
encuentran en el capítulo 1.1.2
b)
Inocuidad
El uso de pollos para la comprobación de las vacunas supone la inoculación de diez o más aves de la edad
indicada que procedan de un grupo SPF. Se administrarán diez dosis de vacuna viva por vía
supraconjuntival a cada ave y a continuación las aves se mantendrán en observación durante 21 días.
Ningún pollo debería mostrar signos clínicos serios y ninguno debería morir por causas atribuibles a la
vacuna (19, 22). Como alternativa, se utiliza se utiliza la parte pre-desafío de la prueba de potencia descrita
más adelante como prueba de inocuidad y, si aparecen reacciones desfavorables debidas al producto, se
considera la prueba como no concluyente y se repite la prueba de inocuidad. Si la repetición no es
satisfactoria, el lote se etiqueta como insatisfactorio.
En el caso de las vacunas inactivadas, se administrará una dosis doble por la vía recomendada a diez aves
de 3 semanas de edad y se mantendrán en observación durante 2 semanas para comprobar la ausencia de
signos clínicos de enfermedad o lesiones locales.
c)
Potencia
Se han propuesto varios métodos para comprobar la potencia de las vacunas del NDV. Se ha subrayado la
importancia de usar una adecuada cepa de desafío para la valoración (11, 13). Las cepas de desafío
adecuadas son la Herts 33 o la GB Texas. Para las vacunas vivas, el método recomendado (19) supone la
vacunación de 10 o más aves SPF u otras completamente susceptibles – algunos países especifican
20 aves (22) – a la mínima edad recomendada por la vía sugerida, empleando la dosis mínima
recomendada. Después de 14–21 días, cada ave vacunada y diez aves control se desafían por vía
intramuscular con 105 LD50 (dosis letal 50%) del virus de desafío de la EN. La vacuna pasa la prueba si al
cabo de 10 días el 90% de los pollos vacunados sobrevive sin síntomas de enfermedad, pero todos los
controles mueren en 6 días.
Para las vacunas inactivadas, se emplean pollos SPF o susceptibles de 21–28-días. Se inyectan por vía
intramuscular tres grupos de 20 aves con volúmenes de vacuna equivalentes a 1/25, 1/50 y 1/100 de una
dosis. Se mantiene un grupo de diez pollos como control. Se desafían todas las aves mediante inyección
intramuscular de 106 LD50 del virus de desafío de la EN, 17–21 días más tarde. Se observan los pollos
durante 21 días. La PD50 (dosis protectora 50%) se calcula mediante métodos estadísticos estándar. La
prueba solo es válida si todas las aves control de desafío mueren en 6 días. La vacuna cumple con la
prueba si la PD50 no es menos que 50 por dosis y si el límite de confianza menor no es menos que 35 PD50
por dosis. Algunas autoridades de control aceptan una prueba solo a 1/50, por razones de sanidad animal.
No es necesario repetir la prueba de potencia en cada lote si se ha demostrado que ha pasado la prueba un
lote representativo del producto final procedente del inóculo original.
d)
Duración de la inmunidad
El nivel de inmunidad alcanzado con cualquier dosis única o régimen de vacunación de la EN, variará
enormemente tanto con la vacuna como con la especie hospedadora. Es extremadamente complejo y difícil
de evaluar el nivel de inmunidad requerido en un hospedador dado (p. ej. para proteger contra la muerte, la
enfermedad, las pérdidas de producción de carne o huevos). Generalmente, se debería hacer alguna
evaluación de la longevidad de los anticuerpos del suero y adoptarse regímenes de vacunación para
mantener estos por encima de un nivel aceptable (11, 13).
e)
Estabilidad
El producto o vacuna final, cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, debería mantener su
potencia durante al menos 1 año. Las pruebas de estabilidad acelerada, tales como la reducción de la
infectividad seguida de la incubación a 37°C durante 7 días (26, 31), pueden utilizarse como una guía para
las capacidades de almacenaje de un lote de vacuna viva. Las vacunas en emulsión de aceite, también
deberían someterse a un agente acelerador mediante almacenamiento a 37°C, durante un mínimo de un
mes, sin separación de las fases acuosa y oleosa. Los EE.UU. exigen que se compruebe la estabilidad en
tiempo real para algunos de los primeros lotes de la vacuna del NDV. Normalmente se comprueban tres
muestras de la vacuna muerta y 10 de la vacuna viva. Las vacunas con virus vivos deben emplearse
inmediatamente después de su reconstitución. Las vacunas inactivadas no se deben congelar.
12
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
f)
Conservantes
En muchos países, para las vacunas vivas no se deben incluir conservantes en el producto vivo liofilizado,
pero los conservantes antimicrobianos pueden incorporarse en el diluyente utilizado para reconstituir la
vacuna. Una alternativa en EE.UU. es permitir el uso de ciertos conservantes, a condición de que se
indiquen en el etiquetado.
g)
Precauciones (riesgos)
Las vacunas vivas de la EN pueden representar un riesgo para los humanos. Se ha informado de que los
NDV, tanto los virulentos como los poco virulentos para los pollos, han infectado a humanos, causando
normalmente conjuntivitis aguda después de la introducción directa en el ojo. Habitualmente, las infecciones
son transitorias y no afectan a la córnea.
Las vacunas en emulsión de aceite mineral representan un riesgo serio para el vacunador. La inyección
accidental de humanos debería tratarse con prontitud mediante la incisión y el lavado de la zona, como para
el caso de una herida por “inyección de grasa”.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Véase la sección C.4.b. arriba
b)
Potencia
Véase la sección C.4.c. arriba.
REFERENCIAS
1.
ADAIR B.M., MCNULTY M.S., TODD D., CONNOR T.J. & BURNS K. (1989). Quantitative estimation of Newcastle
disease virus antibody levels in chickens and turkeys by ELISA. Avian Pathol., 18, 175–192.
2.
ALDOUS E.W. & ALEXANDER D.J. (2001). Technical Review: Detection and differentiation of Newcastle disease
virus (avian paramyxovirus type 1) Avian Pathol., 30, 117–128.
3.
ALDOUS E.W., COLLINS M.S., MCGOLDRICK A. & ALEXANDER D.J. (2001). Rapid pathotyping of Newcastle
disease virus (NDV) using fluorogenic probes in a PCR assay. Vet. Microbiol., 80, 201–212.
4.
ALDOUS E.W., MYNN J.K. BANKS J. & ALEXANDER D.J. (2003). A molecular epidemiological study of avian
paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide
sequence of the fusion protein gene. Avian Pathol., 32, 239–357.
5.
ALEXANDER D.J (2001). Newcastle disease – The Gordon Memorial Lecture. Br. Poult. Sci., 42, 5–22.
6.
ALEXANDER D.J. (2003) Newcastle disease, other avian Paramyxoviruses and pneumovirus infections:
Newcastle disease. In: Diseases of Poultry, Saif Y.M., ed. Iowa State University Press, USA, 64–87.
7.
ALEXANDER D.J. & ALLAN W.H. (1974). Newcastle disease virus pathotypes. Avian Pathol., 3, 269–278.
8.
ALEXANDER D.J., BANKS J., COLLINS M.S., MANVELL R.J., FROST K.M., SPEIDEL E.C. & ALDOUS E.W. (1999).
Antigenic and genetic characterisation of Newcastle disease viruses isolated from outbreaks in domestic
fowl and turkeys in Great Britain during 1997. Vet. Rec., 145, 417–421.
9.
ALEXANDER D.J., BELL J.G. & ALDERS R.G. (2004). A Technology Review: Newcastle disease – With special
emphasis on its effects on village chickens. FAO Animal Production and Health Paper 161. Food and
Agriculture Organization of the United Nations Rome, Italy.
10. ALEXANDER D.J., MANVELL R.J., LOWINGS J.P., FROST K.M., COLLINS M.S., RUSSELL P.H. & SMITH J.E. (1997).
Antigenic diversity and similarities detected in avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates
using monoclonal antibodies. Avian Pathol., 26, 399–418.
11. ALEXANDER D.J., PATTISON M. & MACPHERSON I. (1983). Avian paramyxovirus of PMV-3 serotype in British
turkeys. Avian Pathol., 12, 469–482.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
13
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
12. ALLAN W.H. & HEBERT C.N. (1968). The precision of virus endpoint determinations. Arch. Gesamte
Virusforsch., 25, 330–336.
13. ALLAN W.H., LANCASTER J.E. & TOTH B. (1978). Newcastle Disease Vaccines. Food and Agriculture
Organization of the United Nations, Rome, Italy.
14. BARBEZANGE C. & JESTIN V. (2002). Development of a RT-nested PCR test detecting pigeon Paramyxovirus-1
directly from organs of infected animals. J. Virol. Methods, 106, 197–207.
15. BEARD C.W. & HANSON R.P (1981). Newcastle disease. In: Diseases of Poultry, Eighth Edition, Hofstad M.S.,
Barnes H.J., Calnek B.W., Reid W.M. & Yoder H.W., eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA,
452–470.
16. BENNEJEAN G., GUITTET M., PICAULT J.P., BOUQUET J.F., DEVAUX B., GAUDRY D. & MOREAU Y. (1978).
Vaccination of day-old chicks against Newcastle disease using inactivated oil adjuvant vaccine and/or live
vaccine. Avian Pathol., 7, 15–27.
17. BOX P.G., FURMINGER G.S., ROBERTSON W.W. & WARDEN D. (1976). The effect of Mareks disease vaccination
on the immunisation of day-old chicks against Newcastle disease using B1 and oil emulsion vaccine. Avian
Pathol., 5, 299–306.
18. CHANG P.W. (1981). Newcastle disease. In: CRC Handbook Series in Zoonoses. Section B: Viral Zoonoses
Volume II, Beran G.W., ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 261–274.
19. COLLINS M.S., FRANKLIN S., STRONG I, MEULEMANS G. & ALEXANDER D.J. (1998). Antigenic and phylogenetic
studies on a variant Newcastle disease virus using anti-fusion protein monoclonal antibodies and partial
sequencing of the fusion protein gene. Avian Pathol., 27, 90–96.
20. COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1992). Council directive 92/66/EEC of 14 July 1992 introducing
Community measures for the control of Newcastle disease. Off. J. European Communities, L260, 1–20.
21. COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1993). Commission Decision of 8 February 1993 laying down
the criteria for vaccines to be used against Newcastle disease in the context of routine vaccination
programmes. Off. J. European Communities, L59, 35.
22. COUNCIL OF EUROPE (1997). European Pharmacopoeia, Third Edition. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France.
23. CREELAN J.L., GRAHAM D.A. & MCCULLOUGHMCCULLOUGH S.J. (2002). Detection and differentiation of
pathogenicity of avian paramyxovirus serotype 1 from field cases using one-step reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Avian Pathol., 31, 493–499.
24
CZEGLEDI A., UJVARI D., SOMOGYI E., WEHMANN E., WERNERLOMNICZI(2006). Third genome size category of
avain paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus and evolutionary implications. Virus Res., 120,
36–48.25. GOHM D.S., THUR B. & HOFMANN M.A. (2000). Detection of Newcastle disease virus in organs
and faeces of experimentally infected chickens using RT-PCR. Avian Pathol., 29, 143–152.
26
GOUGH R.E., ALLAN W.H. & NEDELCIU D. (1977). Immune response to monovalent and bivalent Newcastle
disease and infectious bronchitis inactivated vaccines. Avian Pathol., 6, 131–142.
27
HANSON R.P. (1980). Newcastle disease. In: Isolation and Identification of Avian Pathogens, Hitchner SB.,
Purchase HG. & Williams J.E., eds. AAAP, College Station, Texas, USA, 63–66.
28
HERCZEG J., WEHMANN E., BRAGG R.R., TRAVASSOS DIAS P.M., HADJIEV G., WERNER O. & LOMNICZI B. (1999).
Two novel genetic groups (VIIb and VIII) responisble for recent Newcastle disease outbreaks in South
Africa, one (VIIb) of which reached Southern Europe. Arch. Virol., 144, 2087–2099.
29. JESTIN V. & JESTIN A. (1991). Detection of Newcastle disease virus RNA in infected allantoic fluids by in vitro
enzymatic amplification (PCR). Arch. Virol., 118, 151–161.
30. KOCH G. (2003) Laboratory issues: Assessment of the sensitivity and specificity of PCR for NDV on cloacal
and tracheal swabs compared to virus isolation. Proceedings of the Joint Seventh Annual Meetings of the
National Newcastle Disease and Avian Influenza Laboratories of Countries of the European Union, Padova,
Italy, 2002, 114–117.
14
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.3.14. — Enfermedad de Newcastle
31
LENSING H.H. (1974). Newcastle disease – live vaccine testing. Dev. Biol. Stand., 25, 189–1 94.
32
Lomnicizi B., Wehmann E., Herczeg J., Ballagi-Pordany A., Kaleta E.F., Werner O., Meulemans G.,
Jorgensen P.H., Mante A.P., Gielkens A.L.J., Capua I. & Damoser J. (1998). Newcastle disease outbreaks
in recent years in Western Europe were caused by an old (VI) and a novel genotype (VII). Arch. Virol., 143,
49–64.
33. MASE M., IMAI K., SANADA Y., SANADA N., YUASA N., IMADA T., TSUKAMOTO K & YAMAGUCHI S. (2002).
Phylogenetic analysis of Newcastle disease virus genotypes isolated in Japan. J. Clin.. Microbiol., 40, 3826–
3830.
34
MINISTRY OF AGRICULTURE, FISHERIES AND FOOD (1993). Specifications for the Production and Control of Avian
Live Virus Vaccines. Her Majesty’s Stationery Office, London, UK.
35
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2000). Report of the meeting of the OIE CommissionStandards
Commission,November 2000. OIE, Paris, France, p. 4.
36
PALYA V. & RWEYEMAMU M.M. (1992). Live versus inactivated Newcastle disease vaccines. Proceedings of
the FAO Symposium Newcastle Disease Vaccines for Rural Africa, Debre Zeit, Ethiopia, April 1991, 107–
119.
37. PARK N.-Y., CHOI H.-I., CHO H.-S., KANG S.-K., CHO K.-O. & BROWN C. (2002). Development of diagnostic
techniques for Newcastle disease in chickens by in situ RT-PCR and in situ hybridization. Korean J. Vet.
Res., 42, 351–362.
38
SEAL B., KING D.J. & BENNETT J.D. (1995). Characterisation of Newcastle disease virus isolates by reverse
transcription PCR coupled to direct nucleotide sequencing and development of sequence database for
pathotype prediction and molecular epidemiological analysis. J. Clin. Microbiol., 33, 2624–2630.
39. SHENGQING Y., KISHIDA N., ITO H., KIDA H., OTSUKI K., KAWAOKA Y. & ITO T. (2002). Generation of velogenic
Newcastle disease viruses from a nonpathogenic waterfowl isolate by passaging in chickens. Virology, 301,
206–211.
40
SPRADBROW P.B., ED. (1992). Newcastle Disease in Village Chickens. Proceedings No. 39, Australian Centre
for International Agricultural Research, Canberra, Australia, 189 pp.
41
TAKAKUWA H., ITO T., TAKADA A., OKAZAKI K. & KIDA H. (1998). Potentially virulent Newcastle disease viruses
are maintained in migratory waterfowl populations. Jpn J. Vet. Res., 45, 207–215.
42. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (USDA) (2000). Code of Federal Regulations, Title 9, Parts 1–
199. US Government Printing Office, Washington DC, USA.
43. WEHMANN E., CZEGLEDI A., WERNER O., KALETA E.F. & LOMNICZI B. (2003). Occurrence of genotypes IV, V, VI
and VIIa in Newcastle disease outbreaks in Germany between 1939 and 1995. Avian Pathol., 32, 157–163.
44. WEINGARTL H.M., RIVA J. & KUMTHEKAR P. (2003). Molecular characterisation of avian paramyxovirus 1
isolates collected from cormorants in Canada from 1995 to 2000. J. Clin.. Microbiol., 41, 1280–1284.
45
WESTBURY H. (2001). Commentary. Newcastle disease virus: an evolving pathogen. Avian Pathol., 30, 5–11.
46. WISE M.G., SUAREZ D.L., SEAL B.S., PEDERSEN J.C., SENNE D.A., KING D.J., KAPCZYNSKI D. & SPACKMAN E.
(2004). Development of a real-time reverse-transcription PCR for detection of Newcastle disease virus RNA
in clinical samples. J. Clin. Microbiol., 42, 329–338.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Newcastle (véase el cuadro en la parte 3
de este Manual de animales terrestres o consúltese una lista más actualizada en la página web de la OIE:
www.oie.int).
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