manual de prácticas de laboratorio de patología clínica

 MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE
PATOLOGÍA CLÍNICA
1/70 CONTENIDO
Página
I. PRESENTACIÓN
Introducción
3
II. PRÁCTICAS
1. Reconocimiento de Material y Equipo de Laboratorio.
4
2. Hemograma.
21
3. Pruebas de coagulación
37
4. Pruebas cruzadas.
43
5. Urianálisis o Examen General de Orina.
45
6. Valoracion de la glucemia y su relación con alteraciones metabólicas
en los individuos
51
7. Metabolismo Hepático y Renal.
54
8. Evaluacion Citológica y de Acumulación de líquidos.
60
III. BIBLIOGRAFÍA
82
IV. ANEXOS
Valores de referencia para distintos analitos
83
V. ACTUALIZACIÓN
86
2/70 FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE PATOLOGIA CLINICA
INTRODUCCION
Describir los procedimientos rutinarios realizados en laboratorio clínico condensados en un solo documento
para su fácil acceso y consulta por parte de los alumnos que realicen practica en el Laboratorio.
Este procedimiento aplica a todas las practicas realizadas por los alumnos de la Unidad de Aprendizaje de
patología clínica con la finalidad de mantener una mejor expectativa en la Unidad de Aprendizaje.
El presente manual está dirigido a todo aquel personal (Alumnos) que opera o proporciona mantenimiento
preventivo a equipos de laboratorio clínico. En el manual se describen algunos de los equipos más
comúnmente usados y sus principales funciones. Algunos de estos son de funcionamiento sencillo tales
como: Microscopio binocular, Centrífuga, Balanza Analítica, Espectrofotómetro y Pipetas automáticas.
Es importante hacer notar que este manual no pretende ser un sustituto del manual del fabricante, sino por
el contrario un complemento de él.
OBJETIVOS
1. Mostrar al Alumno el uso adecuado de los equipos, fomentando el seguimiento de las
recomendaciones del fabricante.
2. Mostrar los procedimientos para el adecuado mantenimiento y cuidado de los equipos.
3. Darle las Herramientas al Alumno para el desarrollo de las practicas de laboratorio realizadas en
la unidad de aprendizaje de Patologia Clinica.
3/70 PRACTICA I. RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
I.
Introducción
Es fundamental conocer el equipo y material de laboratorio comúnmente usado en Patología Clínica para
facilitar el desenvolvimiento de los alumnos en prácticas posteriores.
II.
Objetivos
El discente reconocerá el material de laboratorio comúnmente usado en Patología Clínica.
El discente desarrollará las habilidades y conocimientos que le permitan identificar y usar el material de
laboratorio.
El discente reconocerá el equipo de laboratorio comúnmente usado en Patología Clínica y aprenderá a
trabajar con el microscopio con la iluminación de Köeler.
I.1. Reconocimiento de equipo de laboratorio
Describir la operación de algunos de los equipos
El microscopio es un equipo que consta de un juego de lentes que permiten al ojo humano observar detalles
que a simple vista es imposible observar. El uso de este equipo en los laboratorios clínicos, permite
determinar la presencia de parásitos, larvas, cristales, restos de tejido, componentes de la sangre y otros
cuerpos. En el Laboratorio de Anatomía Patológica, permite el estudio de tejidos para poder determinar
enfermedades, malformaciones o deficiencias.
El microscopio se compone básicamente de tres partes (Ver figura 1):
• Sistema Óptico.Constituido por lentes, espejos y prismas dispuestos en un tubo que amplían la imagen.
Este incluye: Los oculares, el cuerpo binocular, y los objetivos.
• Sistema de Iluminación.Por lo general consta de un bombillo que puede ser de tungsteno (halógeno), el
cual es controlado por un interruptor de encendido y un regulador de intensidad; además consta de un
condensador, que tiene como función concentrar y enviar un haz de luz perpendicular a la muestra y luego al
objetivo.
• Sistema Mecánico. Es toda la estructura del microscopio y lo compone: El revólver, la base, El
Macrométrico y el Micrométrico, la base de platina, la perilla de platina en cruz, la perilla del
portacondensador y el brazo.
4/70 Figura 1. Microscopio Binocular
1. Oculares 2. Cuerpo Binocular 3. Brazo o Estativo 4. Macrométrico 5. Micrométrico 6. Interruptor de encendido 7. Revólver 8. Objetivos 9. Platina I.2 Recomendaciones de uso
De un buen uso y manejo del microscopio depende el funcionamiento continuo de éste. Es importante tomar
muy en cuenta las siguientes recomendaciones:
a. El microscopio debe ser cubierto con cobertores de tela, no con plásticos, ya que estos por el
calor que producen, permiten la formación de hongos en los lentes.
b. Nunca debe ser expuesto directamente a los rayos del sol, ni cerca de sustancias tóxicas, ni cerca
de lavaderos. Tampoco deben estar en el mismo mueble donde se encuentran equipos que
producen vibración.
c. El polvo se encuentra prácticamente en todo lugar, ocasionando serios problemas en las partes
mecánicas que se deslizan sobre guías con extrema precisión, si estas guías están sucias, el polvo
con la lubricación hace las veces de esmeril o lija, ocasionando desajustes en los movimientos, por
lo que será necesario limpiar y lubricar periódicamente.
d. Verifique si su equipo funciona correctamente:
5/70 • Revise en forma visual que el tomacorriente macho se encuentre conectado al
tomacorriente hembra de la pared, de modo que se establezca un buen contacto.
• Accione el interruptor (switch), compruebe que la lámpara encienda. Mueva de izquierda a
derecha el regulador de intensidad y compruebe su funcionamiento.
• Revise si las partes mecánicas y ópticas funcionan adecuadamente: movimientos
macrométricos
y
micrométricos,
desplazamientos
libres
de
la
platina
en
cruz,
portacondensador, diafragmas, revolver.
• Cualquier anormalidad en el microscopio, repórtela al Departamento de Mantenimiento.
Nunca trate de corregirla o que la corrijan personas que no poseen los conocimientos
técnicos necesarios.
e. No se debe fumar cerca del microscopio, ya que eventualmente los lentes, llegan a cubrirse con
una capa de material no combustible, mezclado con residuos de carbón. Lo que produce
decoloración y un campo borroso.
f. No se deben usar cantidades exageradas de aceite de inmersión, pues si éste no se quita cuando
se termina el trabajo, se secará sobre los lentes y producirá problemas para el microscopista. En la
mayoría los casos, es suficiente usar una gota de aproximadamente 5 mm de diámetro. NOTA:
Favor de no rotar el objetivo 10 X ó 40X, sobre el aceite de inmersión, por lo tanto girar primero al
lado contrario para utilizar el objetivo 100X con aceite.
g. Cuando hay necesidad de movilizar el microscopio de un sitio a otro, éste debe sostenerse
en posición vertical, y tomarlo por el brazo y por la base, que son las partes más sólidas del equipo.
La movilización inadecuada puede desviar los prismas y su arreglo solo puede hacerlo un experto.
h. La calidad del microscopio depende de la calidad de los objetivos. Estos objetivos son lentes
muy costosos y se debe tener un excesivo cuidado para evitar que se rallen. Siempre se debe
comenzar enfocando con el objetivo de menor aumento y luego pasar al de mayor aumento.
Enfoque siempre hacia arriba y no hacia abajo, pues el lente puede golpearse y rallarse con la
lámina o la platina.
i. Las lámparas no deben usarse al máximo de intensidad, ya que se acorta su vida útil. Lo que se
debe hacer es centrar, enfocar y subir el condensador o diafragmas para lograr optimizar al máximo
la luz.
6/70 I.3 Mantenimiento preventivo por parte del operador
De los elementos que componen el microscopio, los sistemas de lentes son las partes que exigen mayor
número de cuidados especiales. Los componentes mecánicos y de iluminación pueden ser reemplazados y
ajustados sin que para ello se realicen grandes esfuerzos; en cambio el deterioro de un componente óptico
es un hecho lamentable, cuyo costo es considerable y no puede compararse al de los otros tipos de fallas.
Debido a esto, a continuación se detalla el procedimiento para realizar un buen mantenimiento preventivo
para mantener en optimas condiciones los diferentes sistemas que forman el microscopio:
a. Limpie la superficie del equipo con un trapo humedecido con agua, no use alcohol, acetona u otra
sustancia demasiado fuerte, ya que la pintura puede desprenderse.
b. Verifique que el cable de conexión no presente ningún deterioro en su aislante, especialmente en
sus extremos, si se presenta cámbielo o repórtelo a Mantenimiento.
c. Compruebe el buen funcionamiento de él o los diafragmas, y el correcto montaje del condensador.
Céntrelo si es necesario.
d. Verifique los desplazamientos mecánicos de la platina y el portaobjetos; limpie y lubrique con
grasa fina las cremalleras o guías visibles.
e. Es recomendable tener a la mano un bombillo de repuesto, para no interrumpir el trabajo cuando
se queme el que está en uso.
f. Desmontar los objetivos y oculares para su limpieza, según se detalla:
f.1 Objetivos:
− Con un ocular en posición invertida observar el lente externo del objetivo, conservando un
ángulo de aproximadamente 30º, para detectar partículas de polvo o aceite, rayones u
hongos.
− Con un hisopo humedecido ligeramente en agua destilada frotar el lente externo del
objetivo en forma circular y luego pasarle un hisopo seco para secar el lente.
− Con una perilla insufladora sopletear cualquier partícula de polvo o algodón interna y
externamente del objetivo.
− Por ningún motivo desarme el objetivo, porque puede dañarlo o hasta desajustarlo.
− Si la suciedad persiste, repórtelo de inmediato al Departamento de Mantenimiento.
7/70 f.2 Oculares:
− Para determinar si los oculares se encuentran sucios, montar una lámina con cualquier
muestra en el portaobjeto de la platina y observarla con el objetivo 40x, una vez enfocado el
objeto hacer girar un ocular a la vez y si se observan partículas que giran, es signo de
suciedad en los lentes de los oculares.
− Cuando se retiren los oculares, cubrir los orificios donde estos se encuentran para que no
entre polvo en los prismas del cuerpo binocular del microscopio.
− Sobre una franela o pedazo de tela desarme cuidadosamente el ocular, teniendo especial
cuidado de conservar el orden y posición en la que se encuentran los lentes y separadores.
− Cada lente debe limpiarse con un pedazo de algodón ligeramente humedecido con agua
destilada y luego secarlo con algodón seco, teniendo el cuidado de no tocar los lentes con la
yema de los dedos, porque quedaran impresas sus huellas digitales.
− Con la pera insufladora sopletear los lentes para retirar cualquier partícula de polvo o
algodón.
− Armar cuidadosamente de nuevo el ocular, conservando el orden, de manera inversa a la
cual se desarmo.
− Nunca use sustancias como acetona, xilol, alcohol 90º, éter u otro para limpiar los lentes;
estas sustancias solamente son usadas por personal de Mantenimiento técnicamente
capacitados.
− Si la suciedad persiste y dificulta demasiado la visualización del objeto, repórtelo al
Departamento de Mantenimiento del Laboratorio.
I.4 CENTRÍFUGAS
I.4.1 Descripción del Equipo
Las centrífugas son equipos médicos utilizados en los laboratorios, clínicas y otros, para la separación de
solutos de sus solventes. Por ejemplo en la rama de laboratorio clínico, para el análisis de sangre, por lo
general es necesario separar el plasma de los otros componentes para poder ser analizado. Existen varios
tipos básicos:
8/70 Centrífugas Clínicas (para separación de sueros o plasma) de baja velocidad (Macrocentrífuga, entre 2,000
y 6,000 R.P.M. aproximadamente), Centrífugas para microhematócritos (Microcentrífuga entre 10,000 y
18,000 R.P.M. aprox.) y las ultracentrífugas (de 20,000 hasta 75,000 R.P.M.) para la separación de
proteínas.
También pueden ser catalogadas basándose en otras características, como: grandes, medianas y pequeñas;
o de piso.
En la figura No. 2, se muestra una centrífuga típica, con sus partes. Las partes principales de este equipo
son las siguientes (Ver figura 2):
Figura 2. Centrífuga
1. Tapadera
5. Marcador de tiempo
2. Cámara o gabinete
6. Tacómetro
3. Base
7. Freno
4. Interruptor de encendido
8. Control de velocidad
• Tapadera. Impide el acceso a las muestras, mientras estas están en movimiento. En la mayoría de
modelos funciona en forma automática, de modo que no pueda ser abierta mientras la centrífuga
está en funcionamiento.
• Cámara o gabinete. Es el espacio físico donde se realiza el proceso de centrifugación.Dentro de
esta gira el rotor (araña).
9/70 • Base. Está construida generalmente de materiales pesados, y con sistemas de fijación a las
superficies, de modo que brinda estabilidad al equipo. Generalmente aquí están ubicados los
controles.
• Interruptor de encendido. Permite controlar el suministro de energía al equipo, a modo de
encenderlo, apagarlo, y generalmente incluye selección de modo de operación.
• Control de Tiempo. Permite controlar el tiempo de centrifugación. Generalmente también permite
visualizar el tiempo transcurrido o pendiente para que finalice un proceso seleccionado.
• Tacómetro. Muestra la velocidad a la que gira el rotor, es decir la velocidad de centrifugación (en
revoluciones por minuto, RPM).
• Freno. Algunas centrífugas, dependiendo del modelo, presentan este control, el cual permite ya
sea hacer más rápido el proceso de paro de la centrífuga, o detenerla en situaciones de emergencia.
Su función específica es determinada por el fabricante, por tanto debe ser utilizado con precaución
según las instrucciones de éste.
Otras partes no mostradas en la figura, pero importantes en la centrífuga son:
• El rotor. También conocido como araña, es la parte en la cual se colocan los porta muestras. Para
su conservación es importante seguir las instrucciones de cargado de la centrífuga (sección IV.2).
• Porta muestras. Son una especie de recipientes donde se colocan las muestras. Su tamaño
depende de la aplicación para la que esté diseñado el equipo: Banco de sangre, hematócrito, etc.
Estos componentes pueden ir variando dependiendo de la complejidad y calidad del equipo.
I.4.2 Cargado de la Centrífuga
El cargar la centrífuga en una forma adecuada es muy importante para el funcionamiento correcto de la
misma, y su preservación. Un procedimiento incorrecto de cargado, ocasiona que la centrífuga vibre durante
el proceso de centrifugación, lo que ocasiona que el rotor sufra daños que pueden llevar a su sustitución.
Un procedimiento de cargado correcto, implica el colocar las cargas en el rotor de forma balanceada.
Las centrífugas están diseñadas para obtener un balance cuando están en movimiento. Para esto es
necesario cumplir los siguientes requisitos:
a) Colocar las cargas de modo que las cargas que tienen la misma masa o peso queden colocadas
de forma opuesta en el rotor. Si tiene un número impar de muestras para ser cargadas, busque otra
muestra de igual peso a modo de siempre formar pares opuestos de igual peso; nunca coloque un
10/70 número impar de muestras dentro de la centrífuga. Utilice la balanza para estar seguro de la
igualdad de los pesos.
b) Además de tener la misma masa (peso), deben tener el mismo centro de gravedad, es decir: no
coloque tubos y recipientes como pares contrapuestos, que tengan diferente forma, tamaño,
espesor, etc.
c) Utilice la centrífuga colocando todos los accesorios en el rotor, ya que estos equipos han sido
diseñados para trabajar con estos.
d) Utilice el rotor y accesorios originales del equipo. Las piezas no originales pueden producir un
desbalance y acortamiento de la vida útil del equipo.
e) Complemente estas recomendaciones con las instrucciones del fabricante.
I.4.3 Otras Recomendaciones de Uso
Además de seguir las recomendaciones de la sección I.4.2, es importante tomar en cuenta otras para
mantener la centrífuga en las condiciones adecuadas:
1. Mantenga la centrífuga limpia de restos de muestras, vidrio o polvo.
2. Cuando esté centrifugando mantenga cerrada la tapadera. Si algo se rompe apague
inmediatamente el equipo y no lo abra hasta que se detenga o el indicador de apertura de la
tapadera lo indique.
3. Reemplace los recipientes metálicos que estén deformados, pues producen una presión no
uniforme sobre el tubo de muestra.
4. No utilice equipo de vidrio rallado o agrietado, porque la presión centrífuga puede producir una
ruptura en estos puntos, pulverizando el vidrio y contaminando las otras muestras.
5. Reemplace los tapones amortiguadores de los portamuestras. Cuando se deterioren y/o se rompa
un tubo de vidrio, limpie los restos (macrocentrífuga).
6. Compruebe que la superficie donde tiene el equipo esté perfectamente nivelada, ya que si sucede
lo contrario causaría vibraciones.
7. Compruebe el funcionamiento del equipo realizando los siguientes pasos:
− Cargue la centrífuga correctamente y ciérrela.
11/70 − Asegúrese que la centrífuga esté bien cerrada.
− Accione el interruptor de encendido, fijando previamente la velocidad y/o el tiempo de
centrifugación (sí el equipo cuenta con estos controles).
− Observe detenidamente el funcionamiento; si no existiese ningún problema continúe con
su trabajo.
− Si existen problemas de vibración, balancear correctamente los portamuestras.Si no
funciona el equipo, revisar el cable de conexión eléctrica, carbones o fusibles.
I.4.4 Mantenimiento Preventivo por parte del operador
1. Tome un pañuelo humedecido con agua y limpie internamente la cámara y la superficie externa;
luego pase suavemente un pañuelo seco. Si tiene manchas póngale al pañuelo humedecido, un
poco de detergente, si las manchas persisten repórtelas a mantenimiento. Recuerde que la orina y la
sangre son altamente corrosivas, por lo tanto, cuando se derramen limpie inmediatamente como se
detalló anteriormente.
2. Revise que el mecanismo de seguridad de la puerta funciona correctamente.
3. Verifique el funcionamiento y exactitud del control de tiempo y velocidad, si los tuviese.
4. Revise el estado del freno automático o manual, si lo tuviera.
5. Revise él o los empaques de hule, en la mayoría de los casos el tubo capilar (en la
microcentrífuga) perfora el empaque, botando la muestra de sangre, la plastilina y/o pulverizando el
tubo capilar. No hay necesidad de cambiar el empaque, basta con despegarlo con mucho cuidado y
girarlo un tercio del espacio entre marca y marca de un tubo capilar y el otro; pegarlo nuevamente
con pega de zapatero. Este procedimiento puede hacerse hasta dos veces, después cámbielo.
6. Verifique la alimentación eléctrica del equipo para detectar posibles peladuras, cortes o
degradación del material aislante.
7. Para cambiar los carbones, algunas centrífugas tienen acceso directo a ello, y basta con
desmontar las tapaderas de los portacarbones y verificar el estado de estos. Si estuviesen bien
gastados (entre un 60% y 75% de su tamaño normal), agrietados o astillados, cámbielos
inmediatamente. Siempre se cambian los dos carbones, nunca debe cambiarse solo uno. En la
mayoría de las centrífugas el acceso a los carbones se tiene por la parte de abajo del equipo, basta
con retirar los portamuestras e invertir el equipo, con un destornillador plano o Phillips (según sea el
12/70 caso), retirar los tornillos de la tapa inferior; verificar los carbones usando el criterio anterior. Antes
de realizar este procedimiento es importante que el técnico de mantenimiento le haya explicado
cómo hacerlo, de lo contrario reporte la falla a mantenimiento.
8. Verifique que al centrifugar las muestras, no exista vibración excesiva. Si la hay, verifique las
cargas; si estas están bien y la vibración persiste, repórtelo al departamento de Mantenimiento del
laboratorio.
1.5 BALANZA GRANATARIA
1.5.1 Descripción del Equipo
Se estudia la balanza granataria en el presente manual por ser un equipo que tiene importancia en el
Laboratorio Clínico, ya que de su buen uso depende la exactitud en la preparación de reactivos y de
estándares.
La balanza granataria (Ver figura 3) es la que nos proporciona mayor exactitud, es por eso que es usada de
preferencia en ambientes como los laboratorios clínicos, en donde se requiere de gran precisión en la
medida.
Figura 3. Balanza Analítica
1. Botón de liberación de platos
4. Soporte de platillos
2. Botón de liberación del fiel
5. Tornillos de base
3. Escala de centésimas de gramo
6. Botón de movilización de caballete
13/70 7. Platillos
8. Escala de décimas de gramo
Cabe observar que la balanza analítica manual de dos platillos, es muy delicada, ya que todas sus piezas
van colocada
sobre pequeñas cuñas, lo que hace que una vibración fuerte, cerca de ella pueda
desequilibrarla.
1.5.2. Operación del Equipo
a) Antes de iniciar el uso de la balanza, asegúrese que todo el sistema esté a 0 (calibrado).
b) Para pesar un reactivo, debe pesarse primero el papel para film o papel encerado y a ese peso
sumarle la sustancia que se desea pesar.
c) Se coloca la sustancia que se va a pesar, en el platillo de la izquierda y en el platillo de la derecha
las unidades de gramo.
d) Cuando se inicia el proceso de pesado primero se liberan los platillos de sus soportes con el
botón lateral y luego se libera el fiel, con el botón central.
e) Cuando se ha liberado el fiel, nos indica de acuerdo a su desplazamiento, si la sustancia que
estamos pesando, necesita mayor o menor peso.
f) Las unidades de gramos, las colocamos sobre el platillo de la derecha, las décimas sobre la escala
superior.
g) Para obtener las centésimas y milésimas de gramos, se busca en la escala colocada al lado
derecho de los platillos, se toma como referencia el 0 de un pequeño nonius colocado bajo la escala.
1.5.3. Cuidados del Equipo
a) La balanza debe protegerse de las variaciones de temperatura y humedad, exposición a la luz
solar, no colocarse cerca de hornos, baños de María, etc., tanto al almacenarse como en su uso, ya
que los objetos calientes o tibios tienen un peso menor que cuando están fríos, debido a corrientes
que se establecen con el aire que los rodea.
b) Debe colocarse en una mesa que sea firme y protegerla de vibraciones (de ser posible una mesa
exclusiva para ella).
14/70 c) Los platillos y el fiel deben descansar en sus soportes, siempre que no se está utilizando la
balanza.
d) La campana debe permanecer siempre cerrada.
e) Mientras la balanza está oscilando, la sustancia a pesar no debe colocarse sobre los platillos, ni
removerse. Para colocar el peso, debe de estar cerrado el fiel y los platillos colocados sobre los
soportes.
f) Si se derrama algún reactivo durante la pesada, hay que limpiar de inmediato con un paño limpio y
seco.
g) No manipular con los dedos, hay que utilizar las pinzas que se encuentran en la caja de pesas.
h) Para mantener un ambiente libre de humedad dentro de la campana, colocar en las esquinas de
la misma dos beakers (de 100 ml.) llenos de sílica gel o Carbonato de Sodio.
i) Los pesos mayores de 1 gr deben ser añadidos estando el brazo en posición de reposo, pues de lo
contrario se puede dañar la porción oscilante que une el platillo al brazo. El brazo siempre debe
soltarse suave y lentamente.
j) Se debe observar si hay una marcada oscilación del platillo después de soltarse el brazo, pues
esto indica falta de alineación. La alineación debe hacerla personal capacitado. Repórtela al
departamento de mantenimiento.
k) La balanza debe protegerse de corrientes de aire, pues estas producen inestabilidad. Se requiere
más o menos 15 minutos con 30 segundos para que el flujo de aire cese después de que se ha
cerrado la puerta.
I.6 PIPETAS AUTOMATICAS
I.6.1 Descripción del equipo
El creciente aumento en las enfermedades de alto riesgo (VIH y Hepatitis B) hace necesario que el personal
que trabaja en los laboratorios clínicos tome muy en serio las recomendaciones dadas por la OMS. Una de
las más importantes recomendaciones es la prohibición de usar pipetas con la boca.
Es por ello que se hace necesario el conocimiento del uso de las pipetas automáticas y de las pro-pipetas
(Ver figura 8).
15/70 Figura 8. Pipetas automáticas de diferentes volúmenes
I.6.2 Operación del Equipo
Técnica de pipeteo para líquidos claros:
a. Se presiona el botón superior suavemente hasta el primer tope.
b. Se sumerge la punta, en la solución que se necesita pipetear estando seguros que la punta este
bien colocada y que no haya ningún tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta.
c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solución.
d. Para descartar la solución de la punta presione el botón hasta el segundo tope.
e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas.
Técnica de pipeteo para líquidos con alta viscosidad:
a. Presione el botón superior hasta el segundo tope.
b. Sumerja la punta en la solución (2-3 mm) y suelte el botón despacio. La punta tiene que estar bien
llena.
c. Descarte el líquido de la punta presionando suavemente el botón superior hasta el primer tope.
16/70 I.6.3 Cuidados y Mantenimiento del Equipo
a. Iniciar el día limpiando la parte externa de las pipetas de polvo o suciedad.
b. Use solamente etanol al 70% para la limpieza de la pipeta. Otro tipo de solvente no es
aconsejable.
c. Utilizar las puntas adecuadas a las pipetas y a la cantidad de solución que se va a medir.
d. El pistón y el cilindro pueden ser chequeados al menos una vez al año si la pipeta es usada
diariamente.
EQUIPO
FALLA
POSIBLES SOLUCIONES
Microscopio binocular
a) No enciende
-Revise que el cordón está bien
conectado al toma-corriente
-Remueva el foco, inspeccione
visulamente si está quemado sí
es así reemplazelo
b) Luz parpadea
c)
Hongos
en
los
lentes
y
prismas
Sí no están muy dañados limpiar
con líquido a base de alcohol ó
éter
Centrífuga
a)
Vibración
fuerte,
tubos de ensayo
quiebra
-Revisar patas de hule
-Poner iguales todos los tapones
de hule en los portamuestras
-Pesar y balancear pesos de los
b) Funciona muy lento
portamuestras
-Revisar si los electrodos de
carbón están gastados y cambiar
carbones
Balanza analítica
No se puede calibrar
-Revisar el agua de preferencia
que esté centrada
-Centrarla con los tornillos que
sirven de base
17/70 TÉCNICAS DE HEMATOLOGÍA
PRACTICA II. - HEMOGRAMA
I.
Introducción
El hemograma es un estudio rutinario realizado para el diagnóstico clínico de algunas entidades patológicas
o como medio de seguimiento de evolución de las mismas. Los datos que aporta de manera importante es la
presencia de anemia o eritrocitosis, así como la evidencia de enfermedades inflamatorias y ocasionalmente
alérgicas, asi como también permite identificar agentes etiológicos (Babesia spp.).
Consta de partes importantes, el eritrograma (Hematocrito, eritrocitos e índices de Wintrobe), el leucograma
(Leucocitos totales y cálculo diferencial) así como la evaluación de las plaquetas y la medición de sólidos
totales por refractometría. A continuación se describen las técnicas para obtener los distintos valores del
hemograma.
II.
Objetivo
El discente desarrollará las habilidades necesarias para hacer un hemograma obteneniendo el hematocrito,
el número de eritrocitos, los índices de Wintrobe, conteo de leucocitos, así como el diferencial, para clasificar
las anemias o en su caso policitemias presentes en el paciente, procesos inflamatorios y/o infecciosos, para
asi tomar decisiones terapéuticas sobre los pacientes.
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL MICROHEMATOCRITO
III.
MATERIAL NECESARIO
•
Tubos capilares
•
Microcentrífuga
•
Plastilina o un encendedor
•
Sangre con EDTA o heparina
18/70 TECNICA
1. Llenar un tubo capilar liso (75 mm x 1.0 mm), hasta 3/4 partes de su capacidad con sangre
anticoagulada con EDTA o heparina, sosteniendo el tubo en una posición casi horizontal para
facilitar el llenado.
a. Como una alternativa puede obtenerse sangre por punción capilar de la oreja, la uña o dedo
utilizando tubos heparinizados.
2. Limpiar el exceso de sangre del exterior del capilar.
3. El extremo capilar que tiene el anillo coloreado debe sellarse con plastilina manteniendo el capilar en
posición horizontal e introduciendo este extremo seco en la placa con el compuesto sellador en un
ángulo de 90°, girar el capilar ligeramente y retirar la placa. El tapón formado debe tener menos de 4
mm de longitud.
a. También puede ser sellado acercándolo a la flama de un mechero (o encendedor en su
defecto) teniendo cuidado de no calentar la sangre.
4. Colocar el capilar en la microcentrifuga con la parte sellada hacia la periferia. Identificar bien los
tubos.
5. Fijar el cabezal de la centrífuga y cerrar la tapa.
6. Centrifugar durante 5 minutos entre 12.500 y 15.000 rpm. no usar el freno para detener la centrífuga.
7. Se retiran los tubos de la centrifuga y se lee el porcentaje de hematocrito o también conocido como
PVC (packed cell volume). Utilizando la tabla para su lectura.
19/70 8. Se debe leer el nivel de eritrocitos centrifugados; no incluir la capa rica en leucocitos y plaquetas
(buffy coat). El valor del hematocrito se calcula dividiendo la longitud de la capa de eritrocitos entre
la longitud total constituida por los eritrocitos, buffy coat y plasma.
Valor de referencia
Perros adultos = 0.37 – 0.55 L/L (37 a 55%)
Cachorros perros y gatos = (4 a 6 semanas) 0.24 a 0.34 L/L (24 a 34%)
Gatos adultos = 0.30 a 0.45 (30 a 45%)
Estos valores son ligeramente más bajos en hembras, y dependen de la localidad donde se evalúen, por lo
que se recomienda realizar tablas de referencia para valores hematológicos.
RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS
MATERIAL NECESARIO
•
Hematocitómetro
o
cámara
de
Neubauer
•
Pipeta de Thomas
•
Tubo de hule y boquilla
•
Sangre con EDTA
•
Diluyente
de
Harem
(cloruro
de
mercurio 0.5g, cloruro de sodio 1.0g,
sulfato de sodio 5.0g, y agua destilada
200ml) ó solución salina
TÉCNICA
1. Se ensambla el equipo, uniendo la boquilla al tubo de hule y este a la pipeta de Thomas.
2. Mezclar la sangre.
3. Aspirar la sangre con la pipeta hasta la marca de 0.5 usando una suave succión.
20/70 4. Se debe limpiar la sangre del exterior de la pipeta con un trozo de papel filtro.
a. Si se rebasa la marca se debe ajustar eliminando el exceso de sangre con un papel filtro o
un algodón, aun así pueden quedar adheridas células a la pipeta y la cuenta podría resultar
más alta.
5. Después se aspira el diluyente de Harem ó sino tenemos utilizar solución salina, con una succión
uniforme hasta la línea de 101 por encima del bulbo y se debe girar suavemente mientras se llena.
6. La pipeta se retira del diluyente de forma horizontal y se tapan los orificios con los dedos, toda la
sangre debe estar en el bulbo.
7. La pipeta debe agitarse por 2 o 3 en un agitador mecánico, si se hace manual debe ser formando
8´s con la muñeca.
Conteo de eritrocitos
1. La cámara y el cubreobjetos deberán limpiarse cuidadosamente quitando la pelusa y grasa.
2. Se coloca el cubreobjetos especial con los extremos más largos paralelos y sobre los bordes de
apoyo de la cámara, manejándolo solo de los extremos más largos paralelos y sobre los bordes de
apoyo de la cámara, manejándola solo de los extremos largos.
3. Inmediatamente después de agitada la pipeta se desechan 3 gotas y se limpia la punta de la pipeta
con un algodón.
4. Con la punta de la pipeta se toca el espacio entre el cubreobjetos y la cámara dejando fluir el líquido
por capilaridad, sin que se derrame por los bordes, y se retira la pipeta.
21/70 5. Si se derrama hay que repetir este paso, previamente limpiando la cámara.
6. Se esperan 3 minutos para que sedimenten las células, pasado ese tiempo inicia la evaporación.
7. Con el objetivo de 10x del microscopio se localiza el cuadro central de los 9 cuadros grandes y una
distribución homogénea de las células.
8. Con el objetivo de 40x se deben contar los eritrocitos en 5 de los 25 cuadros pequeños del área
central.
9. Cada uno de los 5 cuadros está limitado por líneas dobles y triples y se dividen en 16 más
pequeños.
a. Se cuenta iniciando a la izquierda de la fila superior de los cuatro cuadros pequeños, luego
de derecha a izquierda en la siguiente fila y así sucesivamente.
b. En la línea triple: no se cuentan las células que toquen las líneas internas superior e
izquierda.
c.
En la línea doble: no se cuentan las que toquen las líneas interna inferior y derecha y si se
cuentan las que toquen las líneas externas superior e izquierda.
22/70 d. Cálculo
•
Eritrocitos/Litro= Células contadas ÷ 100 (0.1mm de profundidad) X 5 (1/5 de mm cuadrado) X 200
(dilución de 1:200)
•
12
Lo que es igual a 1 x10 /L la suma de las células contadas en los 5 cuadros = Eritrocitos / micro
litro
•
Si existe anemia marcada (Hto < 0.2 L/L) la pipeta se llena con sangre hasta la marca de 1 de la
pipeta y se diluye hasta 101 y las células contadas se multiplican por 5000.
•
Cuando son demasiados eritrocitos o muy grandes la sangre se extrae hasta la marca de 0.3 y se
diluye hasta la marca de 101 y la dilución que se usa en el cálculo es de 1:333.
INDICES ERITROCITARIOS
Volumen globular medio (VGM)
12
VGM= Hto (L/L) x 1000 /recuento de eritrocitos (x 10 /L)
12
VGM= Hto (%) x 10 /recuento de eritrocitos (x 10 /L)
Valores de referencia
Perros adultos 60 a 77 Femtolitros (fL).
Perros recién nacidos 95 a 100 fL hasta los 2 meses de edad.
Gatos adultos 39 a 55 fL.
Gatos recién nacidos 90 fL hasta el mes de edad.
23/70 Concentración media de hemoglobina globular (CMHG)
CMHG (g/dL) = hemoglobina (g/dl) x 100 / Hto (%)
CMHG (g/L) = hemoglobina (g/L) / Hto (L/L)
Valores de referencia
Los valores de las células normocrómicas varían de 320 a 370 g/L, de las células hipocrómicas son menores
a 320 g/L y los de células hipercrómicas son mayores que 370 g/L.
RETICULOCITOS
En los casos en que es diagnosticada una anemia (Hto < 0.37 L/L) es imperativo determinar si esta es
regenerativa, por lo que se debe realizar un conteo de reticulocitos y calcular todos los parámetros que este
conteo ofrece.
MATERIAL NECESARIO
•
Colorante (Nuevo azul de Metileno –NAM, Azul de cresilo brillante)
•
Sangre completa con EDTA
•
Pipeta automática
TECNICA
1. Colocar 50 microlitros de sangre en un tubo de ensayo.
2. Agregar 50 microlitros del colorante.
3. Homogenizar la mezcla y tapar el tubo.
4. Dejar reposando por 15 minutos.
5. Realizar un frotis y secarlo al aire
6.
Teñirlo con Wright *.
7. Enfocar con el objetivo de 10X y realizar el conteo con el objetivo 100x utilizando aceite de
inmersión.
8. Se realiza el conteo de 500 eritrocitos incluyendo reticulocitos. Se debe calcular el:
a. Porcentaje relativo de reticulocitos
b. El valor absoluto (n° de reticulocitos real en 1 litro de sangre)
c.
Cuando el hematocrito esta bajo, el porcentaje de reticulocitos puede elevarse de forma
artificial porque la sangre entera tiene menos eritrocitos y por lo tanto se usa un factor de
corrección que considera al hematocrito normal de 0.45 L/ L
24/70 * EL FROTIS PUEDE OBSERVARSE SIN NECESIDAD DE TEÑIR NUEVAMENTE CON WRIGHT.
Cálculo
% de reticulocitos = N° de reticulocitos X 100 / 500
9
Valor absoluto de reticulocitos (reticulocitos x10 /L) = Eritrocitos totales X porcentaje de reticulocitos X
9
10. Si el valor es mayor a 60 x10 /L se considera una anemia regenerative.
Reticulocitos corregidos= Porcentaje de reticulocitos X Hto. observado (L/L)/ Hto. Normal (0.45L/L perro;
0.35 L/L en gato). Este valor corrige para casos donde existe destrucción de eritrocitos maduros de forma
aguda.
Índice de producción de reticulocitos (IPR)
Representa el incremento de la producción de eritrocitos: es decir, un IPR de 4 significa que la producción de
eritrocitos es 4 veces mayor que la tasa normal.
IPR =
Recuento de reticulocitos (%) x valor de Hto observado (L/L)
Tiempo de maduración
Tiempo de maduración
Hto (L/L)
Hto (%)
0.45
45
1
0.35
35
1.5
0.25
25
2
0.15
15
2.5
reticulocitaria
Interpretación: IPR < 2 = anemia no regenerativa; IPR > 2 = anemia regenerativa; IPR > 3 = sugerente a
anemia hemolítica
25/70 RECUENTO DE GLOBULOS BLANCOS
MATERIAL NECESARIO
•
Hematocitómetro o cámara de Neubauer
•
Pipeta de Thomma para blancos
•
Tubo de hule y boquilla
•
Sangre con EDTA
•
Microscopio
•
Solución de Turk (ácido acético glacial 3ml, violeta de genciana al 1% 1ml, agua destilada c.b.p. 100
ml)
TÉCNICA
1. Se sigue la misma técnica que con los eritrocitos solo que la pipeta tiene una marca de 11 por
encima del bulbo.
2. La sangre se aspira hasta la marca del 0.5 y diluida hasta la marca de 11 con la solución de Turk.
3. Se desechan 2 o 3 gotas de la pipeta antes de llenar la cámara.
4. Se deja 1 minuto para que los eritrocitos se lisen y que los leucocitos sedimenten.
5. Con el objetivo de 10x se cuentan las células de cada uno de los 4 cuadros grandes de las esquinas
como se muestra en la siguiente figura.
26/70 a. Se debe reducir la iluminación para detectar a los leucocitos como objetos uniformes y
oscuros.
b. La regla de incluir y excluir las células es la misma que la de los eritrocitos.
Cálculo
9
•
Leucocitos totales /x10 /L= Células contadas x 0.05.
•
Lo que es igual a 50 por la suma de las células contadas en los 4 cuadrados= Leucocitos totales
/microlitro.
•
Cuando se encuentran más de 5 eritrocitos nucleados en el diferencial, la cuenta leucocitaria
se debe corregir de la siguiente manera:

Cuenta corregida = Leucocitos totales X 100 / 100 + Glóbulos rojos nucleados
observados.
RECUENTO DIFERENCIAL
Este conteo permite saber los porcentajes y valores absolutos de las distintas líneas de leucocitos, que
permitiría determinar la presencia de diferentes reacciones.
MATERIAL NECESARIO
•
Portaobjetos
•
Cubreobjetos
•
Tinción de Wright
•
Sangre con EDTA
TÉCNICA
1. Hacer una extensión de sangre bien mezclada con sangre con anticoagulante EDTA o capilar con el
método de atraer y arrastrar.
2. Seque rápidamente al aire o en una corriente de aire tibio.
3. Tiña el frotis con la técnica indicada en el apartado de tinciones soluciones.
4. Formas incorrectas de extendido de frotis:
27/70 Examen microscópico
•
En 10x examinar calidad global del frotis, color y distribución de células, la formación de rodillos por
los eritrocitos o la aglutinación de los mismos, debe revisarse con rapidez en busca de cualquier
célula anormal grande o incluso parásitos inesperados.
•
En 40x se selecciona la zona correcta del extendido donde se debe iniciar el recuento y evaluar la
morfología celular. Para ello se selecciona el área en la que los eritrocitos estén superpuestos de 2 a
3 pero que la mayoría estén separados entre sí.
28/70 •
En 100x se coloca una gota de aceite de inmersión y se enfoca con este objetivo, se cuentan y
clasifican 100 leucocitos y se informan como porcentajes de leucocitos (valores relativos). La
morfología de eritrocitos y plaquetas así como la estimación de estas últimas se hacen también con
este.
Diferencial leucocitario
•
9
Cuando el recuento leucocitario es mayor a 40.0 x 10 /L se debe realizar el conteo diferencial en 200
células.
•
El barrido del frotis debe hacerse en forma de almena para lograr que la observación sea
representativa como se muestra en la figura siguiente.
•
Es importante incluir los bordes laterales para incluir las células más grandes como monocitos,
linfocitos reactivos y células inmaduras.
29/70 •
También se informan anomalías de leucocitos, granulaciones toxicas (se informan como ligeras a
marcadas o 1+ a 3+), cuerpos de Dohle, linfocitos reactivos (pueden reportarse como porcentajes o
como aislados o abundantes).
La formula para convertir valores relativos en absolutos nunca debe omitirse ya que son los
valores más útiles para la interpretación es la siguiente:
9
9
Línea celular/x10 /L= % de línea celular contado X total de leucocitos (x10 /L)/ 100
•
La morfología eritrocitaria se informa de acuerdo a las formas encontradas y además en cantidad
como ligera, moderada y abundante o en escala de 1+ a 3+
PROTEINAS PLASMÁTICAS
MATERIAL NECESARIO
•
Tubo capilar
•
Sangre con EDTA
•
Refractómetro
•
Tornillo calibrador (Flecha blanca)
TÉCNICA
1. Se realiza la técnica para medir el microhematocrito mencionada anteriormente.
2. Una vez separados los componentes se revisa el color del plasma sobre un fondo blanco. Se
pueden observar las coloraciones siguientes: amarillo pálido o paja, transparente, amarillo intenso,
rosado o rojizo, blanco lechoso o turbio, rosa lechoso.
3. Posteriormente el tubo capilar se rompe por encima del Buffy coat.
30/70 4. Se depositan 1 o 2 gotas del plasma sobre el prisma del refractómetro por la parte contraria a la que
se rompió el tubo capilar.
5. Se observa y se registran los niveles de proteínas plasmáticas en g/dl para multiplicarlos por 10 para
obtener el valor en g/L.
Nota: los valores pueden estar falsamente elevados en hiperlipidemia, hemólisis y/o hiperbilirrubinemia.
Las proteínas plasmáticas y el hematocrito deben interpretarse en forma conjunta.
Se tiene que calibrar antes de la lectura el refractometro, aplicando una gota de solución buffer,
ajustando el tornillo (flecha blanca), despues de la lectura se realiza la limpieza con solucion fisiologica y
secar perfectamente el refractómetro.
31/70 PRACTICA III. - PRUEBAS DE COAGULACIÓN
I.
Introducción
La evaluación de los tiempos de coagulación es una práctica ideal para conocer los distintos tipos de
coagulopatías que podrían presentarse en la práctica clínica. Aunque no son enfermedades comunes si son
situaciones que ponen en peligro la vida de los pacientes y deben ser reconocidas correctamente.
II.
Objetivo
El discente desarrollará las habilidades necesarias para evaluar los tiempos de coagulación y poder
diferenciar las vías afectadas de dicha coagulación.
TIEMPO DE PROTROMBINA (PT TEST)
III.
MATERIAL REQUERIDO:
•
Plasma citratado (tubo azul)
•
Tromboplastina tisular (reactivo refrigerado) “simplastin”
•
Cubetas pequeñas
•
Equipo (Trombotimer)
TÉCNICA
El trombotimer- 1 debe ser encendido 10 minutos previos al inicio del análisis.
Centrifugar la sangre a 1500 a 2000 rpm por 3 minutos.
1. Colocar 100 microlitros de plasma citratado en 1 cubeta pequeña y posicionarla en el trombotimer en
el lado derecho.
2. Colocar 200 microlitros de reactivo (tromboplastina tisular- TP) en una cubeta grande y posicionarla
en el trombotimer en el lado izquierdo.
3. Colocar el Balín en la cubeta con el plasma y comprimirla.
4.
Eso hará que el foco de LED se encienda indicando el inicio de la incubación. El foco comenzará a
parpadear cuando ya este por terminar la incubación y se apagara cuando así sea.
32/70 5. Cuando termine la incubación, pasar la cubeta pequeña con el plasma y el balín al orificio central
(lector) e inmediatamente detener el conteo oprimiendo RESET.
6. Agregar los 200 microlitros del reactivo PT incubado en la cubeta grande a la cubeta pequeña que se
encuentra en el lector, posteriormente este se comprime.
7. Registrar el tiempo de coagulación.
El porcentaje y el índice de coagulación es el siguiente:
Tiempo de protrombina
% del pool de5 animales sanos
Interpretación
6.3 segundos
100 %
Normal
8.1 segundos
50 %
Normal
15.9 segundos
25 %
29.4 segundos
12.5 %
Plasma + PT LED Lecto
LED Valores de referencia
Perro 7 a 10 seg.
Gato 7 -12 seg.
33/70 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL (PTTA TEST)
MATERIAL REQUERIDO:
•
Plasma citratado (tubo azul)
•
Reactivo refrigerado APTT “Dade Actin”
•
Cloruro de Calcio refrigerado
•
Cubetas pequeñas
•
Equipo (Trombotimer)
TECNICA
Centrifugar la sangre a 1500 a 2000 rpm por 3 min.
1. Colocar 100 microlitros de plasma citratado en 1 cubeta pequeña más 100 microlitros de reactivo
(APTT) y posicionarla en el trombotimer en el lado derecho.
2. Colocar 100 microlitros de Cloruro de calcio en una cubeta pequeña y posicionarla en el trombotimer
en orificio inferior derecho.
3. Colocar el Balín en la cubeta con el plasma y comprimirla.
Eso hará que el foco de LED se encienda indicando el inicio de la incubación. El foco comenzará a
parpadear cuando ya este por terminar la incubación y se apagara cuando así sea.
4. Cuando termine la incubación, pasar la cubeta pequeña con el plasma mas el APTT y el balín al
orificio central (lector) e inmediatamente detener el conteo oprimiendo RESET.
5. Agregar los 100 microlitros del cloruro de calcio incubado a la cubeta pequeña que se encuentra en
el lector, posteriormente este se comprime.
6. Registrar el tiempo de coagulación.
Valor Normal: < 20 segundos.
LED Plasma + APTT+ Balín Lector 34/70 CaCl LED Valores de referencia
Perro < 11 seg
Gato < 15 seg
RECUENTO PLAQUETARIO
MATERIAL NECESARIO
•
Sangre venosa con EDTA
•
Realizarse entre los primeros 30 min a 6 hrs de colectada la muestra.
•
Pipeta para conteo de eritrocitos
•
Caja de petri y papel filtro
•
Hematocitometro o cámara de neubauer normal
TECNICA
1. Con la pipeta de eritrocitos se aspira sangre capilar que fluye hasta la marca de 0.5 y se diluye hasta
la marca con oxalato amónico.
2. Se mezcla durante 5 minutos, de preferencia en un rotor mecánico.
3. Se desechan las primeras 3 o 4 gotas y se llena la cámara.
4. En la caja de petri con el papel filtro húmedo sobre la tapa o bien la hoja de papel húmedo en la
parte de abajo y la cámara sobre dos soportes que la separen del papel filtro húmedo, y encima la
tapa de la caja de petri para evitar la entrada de detritus y basura.
5. Ahí se deja reposar la cámara por 15 minutos para que las células sedimenten
6. Se cuentan todos los trombocitos en toda el área rayada reservada para la cuenta de eritrocitos. Se
utiliza microscopia de contraste con el aumento de 40x.
7. Deben contarse ambos lados del hematocitometro y los recuentos no deben diferir en más de un
10%
3
8. Como se usó una dilución 1:100 se observa 0.1mm , el valor de trombocitos es el mismo para
9
concentracion de x 10 /L.
35/70 Valores de referencia
9
Perros
200 a 575
x10 /L
Gatos
230 a 680
x10 /L
Trombocitopenia leve
100 – 175
x10 /L
Trombocitopenia grave
< 20
x10 /L en el cual puede haber signos clínicos.
9
9
9
Estimación plaquetaria
1. Se lleva a cabo sobre el frotis de sangre teñido con Wright
2. Se evalúa el final del frotis en busca de agregados plaquetarios en caso de observarlos se señala
que hay una cantidad “adecuada o suficiente”
3. Si no se observan estos se hace la lectura en 10 campos homogéneos en el objetivo de 100x en
donde se tiene una sola capa celular y se divide entre 10 para obtener un promedio y el promedio se
multiplica por 20.
4.
9
Cada plaqueta contada por campo a 100 X equivale a 20 x 10 /L plaquetas.
Valores de referencia
Perros 8 ≥ 15 plaquetas por campo
Gatos 8 ≥ 15 plaquetas por campo
36/70 PRUEBA DE FIBRINOGENO
1. El tiempo de trombina mide la cantidad de fibrinógeno funcional.
2. Método de Millar. Se calienta el plasma a 56° C en un tubo capilar para microhematocrito para
precipitar el fibrinógeno: medición sencilla y bastante confiable del fibrinógeno.
a. Se colecta la sangre con EDTA y se pone en un tubo de microhematocrito, se sella uno de
los extremos
b. Se hace girar por 5 minutos en una centrifuga de microhematocrito
c.
Se coloca el tubo en un baño de agua a 56° C (± 1) por 3 minutos. Asegurando se la
columna de plasma quede completamente bajo la superficie del agua.
d. El fibrinógeno precipitado queda empacado arriba de una capa amortiguada por
centrifugación, esto dura 3 minutos.
e. Una vez precipitado por temperatura y centrifugado se obtiene el suero y se hace la lectura
en el refractometro.
La diferencia de las proteinas plasmaticas observadas antes y despues de la incubacion es el valor de
fibrinogeno en la muestra.
37/70 PRÁCTICA IV. -
I.
PRUEBAS CRUZADAS
Introducción
La anemia es una entidad clínica sumamente común en la práctica diaria, en ocasiones esta anemia puede
ser tan grave que los mecanismos compensatorios podrían verse superados y por tanto poner en riesgo la
vida del paciente. La transfusión sanguínea es una técnica que se lleva a cabo siempre que existe un déficit
de eritrocitos que transporten suficiente cantidad de oxígeno a los tejidos. Una de sus principales
desventajas es la existencia de incompatibilidades que deben ser evaluadas previamente a la administración
de sangre entre individuos, para hacer a esta práctica más segura.
No se debe transfundir a un paciente simplemente con base a un hematocrito (Hto), sino también tomar en
cuenta la causa y si persiste la pérdida de sangre, si está respondiendo al tratamiento sintomático, etc. El
funcionamiento renal, cardiaco y pulmonar también deben ser tomados en cuenta antes de realizar una
transfusión. Cuando el Hto es menor a 0.30 L/L se encuentra deprimida la función ventricular, sin embargo,
la extracción de oxígeno y la presión venosa central de O2, permanecen normales hasta que se alcanza un
Hto de 0.20 L/L (2, 3). El volumen sanguíneo circulante (plasma + eritrocitos) normal en perros es de 85 a 90
ml/kg., y en el gato es de 65-75 ml/kg (4).
II.
Objetivo
El discente desarrollará las habilidades necesarias para identificar las posibles incompatibilidades
sanguíneas entre individuos de la misma especie, antes de realizar la transfusión sanguínea.
III.
Material

2 Mililitros de sangre con EDTA de cada paciente (donador y receptor).

Solución salina

Microscopio clínico

Centrífuga clínica

Laminillas

Cubreobjetos

Pipetas automáticas 20-200 µL

Pipetas pasteur
38/70 Técnica
Procedimiento para las pruebas cruzadas
1. Se deben extraer al menos 2 mililitros de sangre con EDTA de cada paciente (donador y
receptor).
2. Se centrifugan las muestras a 3500 r.p.m. durante un minuto, a partir de aquí se separa el
plasma.
3. Se realiza un lavado con solución salina de los eritrocitos, se homogeinizan, se vuelve a
centrifugar y se elimina el sobrenadante, esta acción se repite tres veces.
4. Del concentrado de eritrocitos de cada paciente se obtienen 20 µL de eritrocitos se mezclan con
980 µL de solución salina (Eritrocitos al 2%). De ambos el receptor y el donador.
5. Prueba cruzada MAYOR
Se agregan 150 µL de eritrocitos del donador (solución al 2%) a 150 µL del plasma del receptor.
6. Prueba cruzada MENOR
Se agregan 150 µL de solución de eritrocitos (solución al 2%) del receptor a 150 µL de plasma
del donador
7. Prueba CONTROL
Se agregan 150 µL de eritrocitos del donador a 150 µL de plasma del donador. (Figura 1).
8. Se incuban las tres preparaciones a 25º C durante 30 minutos.
9. Evaluar la presencia de hemólisis o aglutinación, tanto macro como microscópicamente en las
tres pruebas. Colocar en un portaobjetos 10 µL de cada reacción y cubreobjetos encima.
Interpretación
La aglutinación o hemólisis indica un resultado de incompatibilidad. El desarrollo de alguna de estos
fenómenos es indicativo de la presencia de anticuerpos contra uno o más de los antígenos de superficie de
los eritrocitos, tanto del donador como del receptor, por lo que se corre un alto riesgo de desarrollo de
reacciones adversas post-tranfusionales.
39/70 Eritrocitos y Plasma Receptor
Eritrocitos Y Plasma Donador
Preguntas para discusión:
¿Cuantos tipos de sangre tiene la especie de la que se realizó la prueba?
¿Existen anticuerpos naturales en la especie contra otros grupos sanguíneos?
¿A que pueden deberse las reacciones adversas a parte de los grupos sanguíneos?
40/70 PRÁCTICA V.- URIANÁLISIS O EXAMEN GENERAL DE ORINA
I.
Introducción
El Urianálisis como herramienta diagnóstica, permite evaluar distintos órganos y sistemas tales Como la
sangre, el páncreas endocrino, el hígado y el sistema inmunológico, así como algunas enfermedades
neoplásicas y musculares. Lo anteriormente descrito indica que se deben interpretar correctamente los
resultados para poder tomar decisiones diagnósticas y/o terapéuticas.
II.
Objetivo
El discente desarrollará las habilidades necesarias para evaluar las alteraciones presentes en el Urianálisis
que le permitirán diferenciar los orígenes de estas.
III.
IV.
Material

5 mililitros de orina.

Tubos de ensayo

Refractómetro

Microscopio clínico

Centrífuga clínica (1500-3000 rpm)

Tiras reactivas de orina (diferentes marcas)
Técnica
El examen de la orina está conformado por tres partes, un examen físico, uno químico y uno microscópico,
que se realizan en ese orden. El procedimiento entiende de la obtención de 5 mililitros de orina por
diferentes técnicas como son:
Micción espontánea
Ventajas

Fácil.

No traumático.
41/70 Desventajas

Falta de cooperación del animal.

Necesidad de evitar el residuo del final de la micción.

Riesgo de hematuria y rotura de la vejiga con la presión manual.

Volumen variable.

Riesgo de contaminación fecal/muestra no adecuada para cultivo.
Cistocentesis
Ventajas

Rápida.

Aséptica.

Sin contaminación uretral.

Fácil de realizar cuando la vejiga esta moderadamente distendida
el paciente
adecuadamente sujeto.

Riesgo mínimo de hematuria e iatrogenia.
Desventajas


Experiencia
Contraindicado cuando hay Trombocitopenia o la vejiga esta hiperdistendida (obstrucción
del tracto urinario inferior) ó no está suficientemente llena.
Cateterización
Ventajas

Sin riesgo de contaminación
Desventajas

Experiencia

Riesgo de infección e iatrogenia, hematuria por lesión en la mucosa

Coste del equipo y del catéter desechable.
Una vez obtenida la muestra esta debe ser vertida en un tubo de cristal nuevo o limpio que no contenga
ningún tipo de aditivo. En este tubo es donde se observarán las distintas pruebas a realizar en la orina.
42/70 EXAMEN FÍSICO
Evaluar las características organolépticas de la orina
1. Color.- suele ser
amarilla, pálido o ámbar, depende de la concentración urinaria y se debe
interpretar junto con la densidad urinaria. El color se determinan al observar la orina en el tubo de
ensayo.
1. Amarilla (clara, pálida, oscura)
2. Incolora
3. Café-amarillenta o rojiza
4. Verde
5. Rojo
6. Azul
7. Lechoso
2. Olor.- (este paso suele evitarse) pero se determina por medio del olfato indirectamente al verter la
muestra de orina al tubo, debe hacerse con distancia y puede reportarse:
1. Normal o característico
2. Amoniacal
3. Dulce
4. Putrefacto
5. A fármacos
3. Aspecto.- hay que comparar el aspecto de la orina fresca en los perros y gatos normales, la cual
suele ser transparente durante la micción; puede presentar cierto grado de turbidez debido a
factores como cristales, células, lípidos, etc. Puede reportarse:
1. Transparente
2. Ligeramente turbia
3. Turbia
4. Muy turbia
4. Densidad urinaria, Refracción urinaria o Gravedad específica.- se determina mejor utilizando un
refractómetro (Fig.1), el cual tiene una escala de densidad calibrada según el índice de refracción,
que es lo que realmente mide. Se debe utilizar un refractómetro compensado para temperatura, el
cual debe calibrarse diariamente equilibrando con agua destilada y poniendo la base a cero con el
tornillo calibrador.
43/70 Técnica:

Después de centrifugar la muestra a 1500 rpm durante 3 minutos.

Con un pipeta se toma una pequeña cantidad de orina fresca

Colocar una(s) gota(s) sobre el prisma del refractómetro

Se observa el lente del mismo y se anota la densidad observada

Al terminar la lectura se limpia el prisma con un algodón humedecido con agua destilada y
después de seca con otro seco, cuidando de no rayar el prisma.
Si la lectura sale de la escala, se diluye un pequeño volumen de orina con igual volumen de agua destilada,
se toma la lectura de nuevo y se multiplica por 2 las últimas cifras.
Fig. 1 Refractómetro
EXAMEN QUÍMICO
Técnica manual:

Realizar el examen químico dentro de la primera hora de recolectada la orina.

La muestra de orina deberá depositarla en un tubo de ensayo, lo suficiente para poder introducir la
tira reactiva de orina y esta se humedezca de manera correcta y completa; retirarla inmediatamente
para evitar que se disuelvan los reactivos.

Al momento de sacar la tira deslice el borde de la tira contra el canto del recipiente para eliminar el
exceso de orina.

Mantenga la tira en una posición horizontal para prevenir posibles mezclas de los reactivos y/o
contaminar las manos con orina.

Leer visualmente comparando las áreas reactivas con la correspondiente escala de color de la carta
adherida al frasco a los tiempos especificados más adelante.

Mantenga la tira cerca de los bloques de color y compare cuidadosamente

Evitar tocar la carta de color con la tira para que no se deteriore la carta.
44/70 Los tiempos para estas tiras son:
Glucosa
pH
60”
30”
Bilirrubina
30”
Proteínas
60”
Cetonas
40”
Urobilinogeno
60”
Nitrito
60”
Gravedad
Específica
45”
Sangre
60”
NOTA: Estos tiempos pueden variar con la marca productora de la tira reactiva.
Técnica con el aparato:
 Prender el aparato, posterior introducir el nombre del ID del operador y
2 veces el ID del paciente, al tener estos datos proceder a los siguiente.
 Realizar mismo procedimiento, de colocar la muestra de orina en un
tubo de ensayo
 Introducir la tira reactiva lo suficiente para que se humedezca y retirar
de inmediato, para evitar las complicaciones antes mencionadas.
 Oprimir la opción INICIO y colocar la tira reactiva sobre la repisa que
sobre sale del aparato (hay que retirar el exceso de orina con papel de baño). Esperar los 10
segundos.

Se te pedirá que introduzcas las características de la orina.

Al tener los datos, oprimir la opción IMPRIMIR.

Es importante resaltar que para que los resultados por este equipo sean validos, debe
utilizarse la marca de tiras reactivas compatible que en la mayoria de los casos es la misma
marca del equipo.
EXAMEN MICROSCÓPICO
Para interpretar el sedimento urinario deberá de ser de manera inmediata o bien centrifugar la muestra y
recoger el sedimento para comenzar a examinarlo. Si se demora para hacer la inspección las células pueden
lisarse, cambiar el pH y la precipitación de cristales sin trascendencia.
45/70 Técnicas: hay dos planteamientos de la microscopia, cada uno de los cuales requiere una interpretación
diferente.
T1: Microscopia directa

Mezclar una muestra de orina reciente por inversión

Poner con una pipeta una gota en un portaobjetos limpio y cubrirlo con un cubreobjetos. La gota
de la orina debe ser lo suficientemente grande para ocupar toda la superficie del cubreobjetos
pero no tan grande que este flote.

Explorar el portaobjetos a baja intensidad con contraste de fases o reducción de la luz mediante
cierre parcial del diafragma y moviendo el condensador hacia abajo, si no dispone de un
microscopio de contraste de fases.

Examinar primero los campos con un objetivo de 10X y posterior 40X para identificar cilindros,
células y cristales.

Formarse una impresión subjetiva de leucocitos y eritrocitos por campo.
T2: Sedimento centrifugado

En un tubo de ensayo añadir aproximadamente 5 ml de orina en un tubo de ensayo limpio y
utilizar otro tubo de ensayo que contenga la misma cantidad (para equilibrar la centrifuga) y
centrifugar de 1,500 a 2, 000 rpm durante 3 minutos.

Una vez centrifugado reportar la cantidad de sedimento como escaso, moderado o abundante.

Se deberá decantar la muestra y con una pipeta de Pasteur mezclar el sedimento y recolectar
aproximadamente 0.5-1 ml del sobrenadante.

Sobre un portaobjetos limpio colocar una gota de la orina y colocar encima un cubreobjetos.

Examinar la muestra primero con un objetivo de 10X y posterior con 40X.

Los hallazgos pueden reportarse como cantidad promedio que se observa por campo o escasos,
varios y abundantes.
Interpretación u Observaciones
Examen Químico
Los resultados se deben reportar de manera cualitativa (como 1+, 2+, 3+, etc.) ya que la determinación del
color es apreciativa del técnico y la concentración depende de la gravedad específica o densidad urinaria).
Sólo deberán colocarse concentraciones aproximadas cuando se utilicen aparatos ópticos para la lectura de
las tiras reactivas.
46/70 Examen Microscópico
La muestra se observa en un objetivo 10X, para encontrar el plano donde hay sedimento, determinar la
cantidad del sedimento y encontrar elementos de mayor tamaño como cilindros y agregados celulares, se
debe examinar el área completa bajo el cubreobjetos debido a que los cilindros tienden a flotar en el extremo
de cubreobjetos. Estos se reportan como el número medio observado en el objetivo poco aumentado.
Para detectar la presencia de bacterias e identificar algunos cristales y diferenciar
tipos celulares es
necesario el objetivo 40X. las células epiteliales, los eritrocitos y leucocitos se reportan como número medio
observado por un objetivo de muchos aumentos.
Las bacterias se registran como escasas, moderas o abundantes y su morfología (coco, bacilo, filamento,
etc).
47/70 PRÁCTICA VI.VALORACIÓN DE LA GLUCEMIA Y SU RELACIÓN CON ALTERACIONES
METABÓLICAS EN LOS INDIVIDUOS.
DETERMINACIONES BIOQUIMICAS
Las determinaciones bioquímicas en nuestro laboratorio se realizan utilizando suero como principal muestra,
se prefiere trabajar con suero porque este se hemoliza menos probablemente que el plasma, además no
contiene anticoagulantes los cuales pueden interferir en las determinaciones que se vayan hacer o pueden
extraer el agua de las células sanguíneas originando la dilución de los constituyentes. Sin embargo, el
plasma puede ser utilizado en las determinaciones de urea y glucosa porque no existe una diferencia muy
marcada en la concentración de estos metabolitos en los eritrocitos y en el plasma, pero la diferencia en las
concentraciones de otros constituyentes es mas elevada. En nuestro laboratorio se realizan con mayor
frecuencia y con fines diagnósticos las siguientes determinaciones:
GLUCOSA
I.
Introducción
El nivel de glucosa sanguínea refleja las condiciones nutricionales, emocionales y endocrinas del sujeto.
Después de la comida aumenta “hiperglucemia alimentaria” en animales monogástricos, pero no en los
rumiantes. Durante la excitación aumenta probablemente como efecto de la liberación de norepinefrina. Por
esta razón es costumbre obtener la sangre de individuos post-absortivos quietos, para determinar la “glucosa
sanguínea en ayunas”. La concentración de glucosa en los eritrocitos se aproxima a la concentración de
glucosa en plasma en la mayoría de los monogástricos y rumiantes jóvenes. Los eritrocitos de los equinos
contienen también poca glucosa, la concentración de glucosa en el plasma excede generalmente a la de
glucosa en sangre en 10 a 30 mg/dL en rumiantes y caballos adultos.
La concentración de glucosa sanguínea aumenta por la norepinefrina, epinefrina y glucagón, tres
substancias glucogenolíticas, y por los glucocorticoides que inhiben la utilización de la glucosa y estimulan la
gluconeogénesis. También se elevan los valores de glucosa por diabetes mellitus asociada con
hiperadrenocorticalismo, debido a una hipersecreción de las hormonas adrenocorticales por neoplasia o
superdosificación de corticoesteroides, se asocia también con hipertiroidismo y convulsiones. La
concentración de glucosa disminuye por el ayuno o por el ejercicio prolongado, por el exceso de insulina ya
sea por un insulinoma o por dosis altas de insulina como terapia; en toxemia, inanición y lesiones hepáticas;
también disminuye en hipoadrenocorticalismo debido a una reducción en la secreción de las glándulas
adrenales o a una producción reducida de ACTH por la glándula pituitaria.
48/70 II.
Objetivo
La medición de la glucemia en muestras sanguíneas en animales domésticos, tanto en suero como plasma y
describir las diferencias encontradas
III.
IV.
Material

2 mililitros de sangre con EDTA o suero de distintas especies domésticas

Tiras reactivas dextrostix

Espectrofotómetro con varios canales para la medición por química húmeda

Tubos de reacción de 3 ml

5 mililitros de orina.

Pipetas automáticas con volumen variable.
Método.
GOD-POD. Test color - enzimático. Glucosa - oxidasa - peroxidasa.
Principio.
La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa (GOD), en ácido glucónico y en peróxido de
hidrógeno, el cual en presencia de peroxidasa (POD), oxida el cromógeno (4-aminofenazonal/ fenol),
convirtiéndolo en un compuesto de color rojo, el cual es cuantificado por el fotómetro del equipo.
MUESTRA.
Suero o plasma con EDTA.
EQUIPO.
QUICK LAB
REACTIVOS.
1 reactivo (tampón/enzimas/cromógeno)
1-A Fenol
La solución 1 es estable a 2-8°C durante 2 meses y a 15 -25°C durante 2 semanas.
49/70 CONDICIONES.
El animal en lo posible debe estar en “ayunas”. (Mínimo 8 horas).
Evitar en lo posible la fuerza en el momento de la toma de muestra, para minimizar las condiciones
de estrés, que pueden alterar el metabolismo de los carbohidratos.
LINEALIDAD.
La linealidad del método se obtiene hasta 500mg/dl.
PROCEDIMIENTO
Preparar fotómetro a una temperatura de 37°C.
Blanco Standard Muestra
Solución 1
1000 µl
1000µl
1000µl
Solución standard
--
10µl
--
Suero problema
--
--
10µl
Incubar a 37°C en baño de María por 15 min, o a temperatura ambiente por 30 min.
Colocar el Blanco en la cubeta de reacción y presionar la tecla “BLANK”, luego colocar el estándar y
presionar la tecla “CALIBRATE”, por último colocar la muestra y presionar la tecla “ANALYSE”.
EXPRESION DE RESULTADOS.
Los resultados para esta prueba en nuestro laboratorio, se expresan en mg/dl. Para convertirlo al
sistema internacional de Unidades debe multiplicarse por 0.051 o dividirse entre 18 (mg/dL a
mmol/L)
V. Interpretación u observaciones
Las concentraciones de glucemia evalúan indirectamente la actividad endocrina del páncreas, adrenales,
hipófisis y el estado nutricional del individuo. Valores de hiperglucemia pueden indicar insuficiencia de
insulina o efecto esteroidal endógeno o exógeno. Valores de hipoglucemia pueden indicar desnutrición
severa, insuficiencia hepática o consumo in vitro, por lo que se recomienda interpretar los resultados a la luz
de la historia clínica de cada individuo.
50/70 PRÁCTICA VII.- METABOLISMO HEPÁTICO Y RENAL.
UREA
La urea es un compuesto orgánico relativamente simple producido por los mamíferos en el hígado como
producto final del catabolismo de las proteínas. Es una de las substancias más difusibles en el cuerpo y se
encuentra en todos los líquidos del cuerpo. Es relativamente atóxica, aunque en concentraciones altas
desnaturaliza proteínas con la formación de productos tóxicos. La urea se elimina principalmente por los
riñones, pero una porción de ella por la piel, sobre todo en los animales que sudan. Se ha observado que el
nitrógeno ureico sanguíneo no se eleva en perros, salvo pocas excepciones, hasta que al menos el 75% del
riñón funcional se ha destruido, y se aconseja hacer la determinación en todos los pacientes quirúrgicos de
mas de 5 años y en toda enfermedad en perros viejos antes de iniciar el tratamiento. La urea se aumenta en
sangre por trastornos renales como la insuficiencia renal crónica y aguda; por obstrucción de las vías
urinarias; excesiva destrucción de proteínas como en estados de fiebre, toxicidad o sepsis extensa. También
se pueden aumentar los niveles de urea por una hemoconcentración debida generalmente a graves vómitos
o diarreas; cuando existe alteración de la función cardiaca que reduce el flujo de sangre a través del riñón se
ve aumentada la concentración de urea en sangre.
El descenso en los niveles de urea son raros, teóricamente pueden presentarse en asociación con graves
enfermedades hepáticas o malnutrición de proteínas.
II. Objetivo
La evaluación orgánica de los distintos sistemas es importante al interpretar los cambios clínicos observados
en el paciente, la evaluación hepática y renal son dos de las pruebas que se realizan más frecuentemente en
la clínica veterinaria.
III. Material

IV. Técnica
METODO.
UV a tiempo fijo.
PRINCIPIO.
La urea se hidroliza en presencia de ureasa, en amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco
51/70 producido en esta reacción se combina con α-cetoglutarato y NADH en presencia de
deshidrogenasa de glutamato, para producir glutamato y NAD. La cantidad consumida de NADH
determinado por la disminución de absorbancia en el ultra violeta es proporcional a la cantidad de
urea en la muestra.
MUESTRA.
Suero, plasma con EDTA y orina diluida 1:50 con agua destilada.
EQUIPO.
QUIK LAB
REACTIVOS
1 ENZIMAS/ COENZIMA/ SUBSTRATO
1 A Tampón
PATRON: Urea 80mg/dl. Listo para su uso.
La solución 1 se mantiene estable durante 4 semanas de 2- 8°C y durante una semana de 1525°C.
CONDICIONES.
El animal debe tener un “ayuno” de 12 horas antes de la toma de muestra.
Aunque la urea es estable en suero, plasma u orina durante varios días bajo refrigeración, las
muestras, especialmente la orina, deberán valorarse a las pocas horas para evitar la contaminación
bacteriana, que podrían provocar una perdida rápida de la urea.
LINEALIDAD.
En suero y plasma la linealidad del método es hasta 300mg/dl y 150 g/l para la orina. Para
concentraciones altas, diluir la muestra 1:2 con agua destilada, repetir la valoración y multiplicar el
resultado por 2.
52/70 PROCEDIMIENTO.
Preparar el fotómetro a una temperatura de 30°C.
Standard Muestra
Solución de trabajo
1000 µl
1000µl
Solución Standard
10µl
--
Suero problema
--
10µl
Leer inmediatamente colocando muestra por muestra.
EXPRESION DE RESULTADOS.
Los valores en el laboratorio se expresan en mg/dl.
CREATININA
La creatinina esta en el cuerpo principalmente en forma de fosfato de alta energía. En los músculos es
fuente de energía. En animales jóvenes de crecimiento se encuentra en mayores cantidades. La creatinina
es una substancia muy difusible y distribuida de manera uniforme en el agua corporal. Se elimina del plasma
aproximadamente en la tasa de filtración glomerular.
Al estudiar la excreción de creatinina, tiene valor el hecho de que los niveles séricos de creatinina casi no
son afectados por la creatinina exógena de los alimentos, por la edad, el sexo, el ejercicio o la dieta. Por lo
tanto los niveles elevados solamente se presentan cuando se altera la función renal. La medición de los
niveles de creatinina en sangre proporcionan la misma información para el diagnóstico y pronóstico de la
función renal que la obtenida por la medición del nitrógeno ureico.
MÉTODO.
Picrato alcalino con desproteinización
PRINCIPIO.
La creatinina reacciona en un medio alcalino que no contenga proteínas con picrato, para formar un
compuesto rojo –anaranjado (Reacción de Jaffé).
53/70 MUESTRA.
Suero o plasma.
Orina: diluida: 1:50 con agua destilada
EQUIPO.
QUIK LAB
REACTIVOS.
1 Picrato de sodio............ 44mmol/L
2 Hidróxido de sodio....... 4.0 N
PATRON: Creatinina 2 mg/dl. Listo para ser utilizado.
Los reactivos 1 y 2 son estables a temperatura ambiente de 15 a 25°C hasta la fecha de caducidad
que viene indicada en la etiqueta.
CONDICIONES.
No requiere ayuno previo, porque su excreción depende muy levemente de la alimentación y la
diuresis. No debe estar el animal sometido a estrés intenso que puede ser causado en el momento
de la toma de muestra, por la resistencia que el animal ejerza.
LINEALIDAD.
El método es lineal hasta 12 mg/dl de creatinina. Para concentraciones mayores mezclar un
volumen de la muestra con un volumen igual de agua destilada, repetir el ensayo y multiplicar el
resultado por 2.
PROCEDIMIENTO.
Prepara el fotómetro a una temperatura de 30°C.
Standard
Muestra
Solución de trabajo
1000 µl
1000µl
Solución Standard
100µl
--
54/70 Suero problema
--
100µl
Leer inmediatamente colocando muestra por muestra.
Colocar la solución standard y presionar la tecla “CALIBRATE”, luego colocar la muestra y presionar
la tecla “ANALYSE”.
EXPRESION DE RESULTADOS
Los resultados dependiendo del tipo de muestra se expresan así:
SUERO: Se expresa en mg/dl o µmol/L.
ORINA: Se expresa en mg/Kg de peso en 24 horas.
ALANINA AMINO TRANSFERASA ó TRANSAMINASA GLUTAMICA PIRUVICA (ALT-GPT)
Esta enzima cataliza la transferencia de un grupo a- amino de la alanina al ácido a-cetoglutarico. La enzima
se encuentra en el hialoplasma de todas las células y existe una relación lineal entre la GPT hepática y el
peso del animal. Siendo este el caso la determinación de GPT es casi especifica del hígado del perro y el
gato, mientras que es de escaso o de ningún valor en las enfermedades de bovinos y equinos. Se ha
encontrada muy elevada en la necrosis hepática. Es una enzima muy estable, y en estado de congelación se
conserva largo tiempo. La ictericia no estorba la determinación de la enzima, pero debe evitarse la hemólisis.
Las enfermedades hepáticas que producen niveles elevados de GPT comprenden neoplasias malignas,
cirrosis y hepatitis, incluyendo la que se produce en el perro por el virus de la hepatitis canina infecciosa
(HCI)
METODO.
Test cinético UV
PRINCIPIO.
α-cetoglutarato + L- alanina en presencia de GPT produce L–glutamato + piruvato, este a su vez
+
NADH + H en presencia de LDH produce lactato + NAD.
55/70 MUESTRA.
Suero, plasma con EDTA.
EQUIPO.
QUIK LAB
REACTIVOS.
1 Reactivo Tampón / substrato.
1 A NADH/LDH
2 a - cetoglutarato
PIRIDOXAL 5-FOSFATO
La solución 1 es estable de 2-8°C durante 3 meses y de 15-25°C durante 1 semana.
La solución 2 es estable de 2-8°C durante 4 meses y de 15-25°C durante 1 mes.
CONDICIONES.
El animal debe tener un “ayuno” de 8 horas como mínimo.
LINEALIDAD.
Para concentraciones mayores de 265 y 271 U/L a una absorbancia de 340 y 334 nm
respectivamente, realizar una dilución 1:10.
PROCEDIMIENTO
Preparar el fotómetro a una temperatura de 37°C.
Muestra
Solución 1
1000 µl
Suero Problema
100 µl
Incubar en baño de María a 37°C
56/70 Solución 2
100 µl
Colocar a temperatura ambiente durante 30 segundos.
Leer muestra por muestra, colocar la muestra en la cubeta de reacción y presionar al tecla
“START”.
EXPRESION DE RESULTADOS
Los resultados para esta prueba se expresan en U/L.
FOSFATASA ALCALINA (ALP)
Esta enzima hidroliza los fosfatos orgánicos en fosfato inorgánico y la fracción orgánica. Es una enzima muy
estable y puede ser congelada con poca o ninguna pérdida de actividad se halla gran cantidad en el hígado,
riñón, mucosa intestinal y hueso. En la mayoría de los animales, quizá con excepción del gato se elimina en
su forma natural por el hígado por lo tanto cualquier obstrucción al flujo de la bilis causa aumento de la
enzima en el suero. El problema es determinar la fuente de esta elevación cuando no es patente la
enfermedad hepática. Se producen elevaciones de la enzima en el suero, en enfermedades del bazo,
hígado, riñón, mucosa intestinal o hueso. En la obstrucción biliar se eleva notablemente, las neoplasias
óseas malignas causan a veces niveles elevados. También se puede elevar la ALP por una mayor actividad
de los osteoclastos durante el crecimiento del esqueleto, por enfermedades óseas degenerativas en
animales adultos, raquitismo, osteomalacia y en osteosarcoma. Durante interferencias con la excreción
hepática, debida a una destrucción de las células hepáticas o a una destrucción del conducto biliar. Los
resultados se interpretan mejor en conjunción con los niveles de GPT, que generalmente se encuentran
aumentados en estos casos.
MÉTODO.
Colorimétrico.
PRINCIPIO.
P-nitrofenilfosfato + H2O en presencia de fosfatasa alcalina produce fosfato + P-nitrofenol.
MUESTRA.
Suero o plasma heparinizado.
57/70 EQUIPO.
QUIK LAB
REACTIVOS.
1 TAMPON
1 A substrato
CONDICIONES.
El animal debe tener un “ayuno” mínimo de 8 horas.
LINEALIDAD
El método tiene una linealidad de 1492U/I, valores superiores a este realizar diluciones 1:10.
PROCEDIMIENTO
Preparar el fotómetro a una temperatura de 37°C.
Muestra
Solución 1
1000
µl
Suero Problema
10
µl
Incubar en baño de María a 37°C 60 segundos.
Solución 2
100
µl
Colocar a temperatura ambiente durante 30 segundos.
Leer muestra por muestra, colocar la muestra en la cubeta de reacción y presionar la tecla
“START”.
ACCIONES CORRECTIVAS PARA RESULTADOS INACEPTABLES.
EXPRESION DE RESULTADOS.
Los resultados se expresan en U/l.
58/70 La utilización del equipo depende del técnico laboratorista preparado, por lo que se recomienda siempre leer
el manual del usuario. Para corregir algunos problemas se presentan las siguientes acciones:
ACCIONES CORRECTIVAS PARA RESULTADOS INACEPTABLES.
_ Calibración del equipo.(Remitirse al manual del equipo).
_ Centrifugar muestras lo más rápido posible.
_ Cambio de lote de sueros multicalibradores y reactivos, realizar nueva calibración del equipo.
_ Verificar reactivos que correspondan a la prueba pedida y evitar agotamiento de los mismos.
_ Rechazar muestras hemolizadas e insuficientes.
_ Muestras que no se preparan el mismo día, refrigerar a 4ºC.
_ Confirmar la linealidad de la prueba y si es necesario realizar las diluciones respectivas.
_ Asegurar el mantenimiento del equipo.
V. Interpretación u observaciones
Incrementos en la Urea y Creatinina se asocian a estados de hiperfusión renal y posiblemente lesión activa,
es importante compara estos resultados con la concentración urinaria dada por el resultado de
refractometría: densidad urinaria (ver Urianálisis).
La estructura hepática evaluada a través de la medición de la actividad enzimática sérica de las
transaminasas y la fosfatasa alcalina permite determinar en la mayoría de la especies un daño hepático.
59/70 Práctica VIII.- Evaluación Citológica y de acumulación de líquidos
I.
Introducción
La evaluación citológica de los líquidos corporales, de los tejidos y de las lesiones tumorales se ha
convertido en una opción muy importante en medicina veterinaria. Sobre todo desde hace casi 20 años. Se
trata de un medio de diagnóstico muy rápido, fácil de realizar, barato, con un mínimo de riesgos y que
permite con frecuencia evaluar las muestras e interpretarlas antes de que el paciente se retire de la sala de
examen, e identificar el proceso como neoplásico o inflamatorio. En algunos casos se pueden establecer los
procedimientos indicados para llegar a un diagnóstico final, como el realizar una biopsia, una evaluación
microbiológica, un examen radiológico, etc. Con revisiones periódicas se puede efectuar un seguimiento de
la evolución del caso, así como un control del tratamiento, determinando si éste es eficaz o se debe
reemplazar por otro. En una gran proporción de casos, la citología permite llegar a un diagnóstico final y
establecer un pronóstico.
Aquellos clínicos que se inician en el muestreo citológico, frecuentemente obtienen muestras no
significativas, contaminadas con sangre u otros tejidos o por microorganismos, etcétera, esto disminuye el
entusiasmo por el empleo de la citología. Si no se realiza con la asepsia adecuada existe la posibilidad de
que se contaminen tejidos sanos con microorganismos, o si se punciona un absceso, que se ocasionen
fístulas u otros abscesos.
Una importante limitante es que en algunos casos es necesario recurrir a una biopsia para la evaluación
histológica, ya que es prácticamente imposible distinguir un adenoma o una hiperplasia; lo mismo sucede
cuando una neoplasia maligna es bien diferenciada y citológicamente no podemos ver la estructura
histológica ni la presencia de invasión a vasos o tejidos circundantes.
II.
Objetivo
El discente desarrollará las habilidades necesarias para reconocer cuando las lesiones tumorales y en su
caso lesiones susceptibles de ser muestreadas, para diferenciar eventos inflamatorios o neoplásicos.
III.
Material
•
•
•
•
Jeringa de 10 ml
Aguja No. 21
Laminas portaobjetos
Pistola para citología
60/70 IV.
Técnica
Técnicas de colección de muestras
Existen varios tipos de preparación de laminillas para su evaluación. El que se emplea con mayor
frecuencia en citología es el frotis o extendido, similar al que se realiza en hematología. Se deben
emplear laminillas limpias, no melladas, sin huellas (porque la grasa hace impermeable a la laminilla
e impide que se adhiera la película celular a ésta).
Aspiración de lesiones con aguja fina
La aspiración es la técnica en citología más usual para la obtención de muestras de lesiones
inflamatorias o neoplásicas de la mayoría de tejidos, pues en general permite una muy buena
conservación de la morfología celular y con muy poca destrucción.
3
Se introduce una aguja directamente en la lesión, se aplica una presión negativa de algunos cm (en
general de 5 a 8), dependiendo de la consistencia de la masa: mientras más sólida, mayor presión;
si es muy dura la masa se puede mantener la presión efectuando en corto un "raspado" con la aguja,
para obtener mejores muestras y más celulares. Generalmente se ejerce presión negativa jalando el
émbolo dos o tres veces, se suelta y se permite que regrese a su posición original antes de retirar la
aguja de la masa, de lo contrario, la muestra pasará al barril de la jeringa y será prácticamente
imposible recuperarla. Si ejercemos demasiada presión negativa y nos esperamos hasta ver sangre
en el barril, las muestras estarán muy contaminadas. Las muestras más "limpias", es decir, con
menor contaminación sanguínea, se obtienen cuando se percibe ligeramente un líquido en la base
plástica de la aguja. en ese momento se debe dejar de ejercer la presión negativa. Son aún mejores
las muestras si el líquido celular accede solamente a la parte metálica de la aguja.
Cuando la lesión cuenta con varias consistencias (dura. turgente, suave o blanda) se recomienda
efectuar las aspiraciones cambiando la dirección de la aguja para obtener material del centro, de un
lado, de la periferia, de las partes sólidas, de las blandas, con la finalidad de conseguir una imagen
completa de la lesión.
En la mayoría de los casos no es necesario efectuar este tipo de maniobra, ya que el tejido para las
muestras en general es homogéneo.
Extendido (frotis)
Antes de efectuar el frotis, se ensaya el deslizamiento sin tocar la muestra para detectar
imperfecciones en el lavado o el borde de la laminilla en que se va a extender y poder reemplazarla
cuando no deslice libremente. Se aplica en líquidos con una densidad parecida a la sangre, también
en material de lesiones tumorales aspirado con aguja fina. La fuerza de separación es de moderada
a ligera, dependiendo del ángulo que se emplee para su confección. En general, debe ser de
alrededor de 45º para líquidos como la sangre, >45º para líquidos poco celulares o en tejidos muy
61/70 delicados y <45º cuando se desea mayor fuerza de separación celular para su extendido adecuado y
su cómoda evaluación.
Sedimentación
Se coloca un cilindro (por ejemplo 0.5 mL de una jeringa), se adhiere a la laminilla con
cera,
asegurándose de que sea hermético para evitar la salida de la muestra en la unión cilindro y
laminilla, se coloca hasta 0.5 mL del líquido que se va a evaluar y se deja reposar 30 minutos.
Impresiones
Se pueden realizar directamente de una lesión cutánea o de un órgano interno o llevarse acabo a
partir de biopsias.
En las biopsias, las impresiones se realizan con una porción del tejido de interés de una dimensión
3
no mayor de 1 cm , se toma con las pinzas de disección y se hacen unas impresiones sobre papel
absorbente para eliminar el exceso de líquido y que exista mayor poder de adhesión de las células al
vidrio de la laminilla.
Se hacen impresiones en secuencia en el papel, cada vez es menor la cantidad de líquido que se
desprende, hasta que se encuentra casi seco siguiendo la dirección de las flechas.
Raspados
Se realizan en lesiones duras, con una hoja de bisturí para obtener mayor número de células. El
raspado se efectúa con ligeros movimientos en corto hasta obtener una pasta celular.
Posteriormente se lleva a cabo la extensión de esa "pasta celular", con delicadeza para evitar un
destrozo celular.
Hisopados
Esta técnica está reservada para lesiones fistulosas o para órganos tubulares como vagina. útero,
canal auditivo, fosas nasales; inclusive se ha llegado a emplear en muestreos de tráquea bajo una
técnica particular. Se verifica que el hisopo estéril de algodón esté bien adherido al palillo para evitar
que se quede por accidente dentro de la luz del órgano que se está muestreando, posteriormente se
introduce y se gira suavemente para descamar células del epitelio o canal, se retira y se deposita
62/70 sobre la laminilla, se ejerce una ligera presión con el índice y se rueda hasta el otro extremo, se
puede efectuar hasta 3 veces sobre la misma laminilla.
LÍQUIDOS SINOVIALES, CEFALORRAQUÍDEOS Y DE LAVADOS
Estos tipos de líquidos son habitualmente poco celulares: para su evaluación se requiere de un
método de concentración eficaz, que no afecte la morfología celular.
La citocentrifugación es el método de elección empleado para los diferentes tipos de líquidos, a
excepción de los que se encuentran muy turbios o viscosos. La ventaja es que puede concentrar las
células en un área aproximada a la de un confeti, todos los elementos formados (células,
microorganismos, cuerpos extraños, etc.) que se encuentren en 0.3 a 0.5 ml de muestras, se
encontrarán en el "confeti celular", por lo tanto, la evaluación citológica completa se lleva a cabo en
unos minutos.
V.
Interpretación u Observaciones
La evaluación precisa de lesiones en el laboratorio requiere de una descripción apropiada, la ubicación
anatómica, un muestreo con la técnica adecuada para el tipo de lesión y finalmente de una protección de
esas muestras para que lleguen a su destino en buenas condiciones.
Es necesario incluir la reseña del animal (especie, raza, género, edad), ya que ciertas neoplasias no se
encuentran en todas las especies o son particulares para una de ellas. También es importante conocer la
raza, ya que algunas son más propensas que otras a ciertos tumores; lo mismo ocurre con el género y la
edad.
El objetivo principal de la evaluación citológica es determinar si las lesiones son Inflamatorias, degenerativas
o neoplásicas; para ello se requiere conocer las diferentes clasificaciones y los criterios para una
interpretación apropiada.
Clasificación de la inflamación según el tipo celular
a) Neutrofílica. Con valores de los neutrófilos superiores a 85%.
63/70 b) Neutrofílica-Macrofágica. Cuando hay predominio de los neutrófilos y se acompañan con valores
de 30-50% de macrófagos.
c) Macrofágica. Cuando hay predominio de macrófagos y en presencia de células epitelioides o de
células gigantes.
d) Eosinofílica. Cuando se observa una cantidad superior a 20% de eosinófilos o de 5% de
mastocitos.
Clasificación de la inflamación en cuanto a la presencia o no de microorganismos
a) Séptica. Cuando se observen bacterias intracelulares o, en su defecto, cuando no se observen
microorganismos, los neutrófilos deben presentar diferentes grados de degeneración rápida (por
toxinas) como la degeneración hidrópica nuclear, vacuolación de citoplasma o la cariolisis (es decir,
la destrucción del núcleo).
b) No séptica. Cuando la muerte de los neutrófilos ocurre en forma lenta (muerte natural) donde se
observan los núcleos de los neutrófilos en picnosis o en cariorrexis (picnosis de cada lóbulo).
Características clínicas de las lesiones neoplásicas
Clasificación de las neoplasias
a) Epiteliales. Las muestras en estos casos suelen ser bastante celulares. Estas células se
distinguen por ser poliédricas, son angulares cuando están bien diferenciadas y pueden encontrarse
en forma individual o en sábanas o en ambas. Pueden ser epiteliales: papilomas.si son benignas o
carcinomas, si son malignas; o glandulares: adenomas o adenocarcinomas, si son benignas o
malignas, respectivamente. Las células glandulares en general muestran una fragilidad del
citoplasma superior a las otras células, el citoplasma se encuentra en cantidad de moderada a
abundante y con frecuencia se observan núcleos desnudos. En ocasiones se aprecia en el
citoplasma material de secreción. Asimismo, pueden encontrarse células con el núcleo excéntrico y
oprimido por la gran cantidad de material de secreción.
b) Mesenquimatosas. En general la celularidad suele ser muy escasa, por lo tanto, de mayor
dificultad para la evaluación. Las células se presentan comúnmente en forma individual y se
caracterizan por ser fusiformes, en general, y tener una membrana citoplásmica no aparente. El
núcleo es principalmente céntrico ovalado o fusiforme.Ejemplos de estos tumores son los benignos,
con el sufijo oma, y los malignos.con el sufijo sarcoma (osteoma, osteosarcoma; condroma,
condrosarcoma; fibroma, fibrosarcoma; hemangioma, hemangiosarcoma).
64/70 c) Células redondas. Este tipo de tumores presenta, por lo general, muestras con una celularidad
elevada, la forma es redonda como su clasificación lo dice. Este tipo de células se caracteriza por
tener una membrana citoplásmica evidente, el citoplasma en cantidad moderada y un núcleo
redondo generalmente céntrico. Como ejemplos de tumores de células redondas están los
histiocitomas, melanomas, tumores venéreos transmisibles, mastocitomas, linfosarcomas y
sarcomas de plasmocitos (mielomas múltiples).
Criterios de malignidad
Existen criterios generales de malignidad como la anisocitosis, macrocitosis, la hipercelularidad y
el pleomorfismo, que no tienen gran peso en la interpretación final, al igual que los criterios de
malignidad del citoplasma como la basofilia, vacuolación y la membrana citoplásmica más espesa.
Los criterios de importancia capital en la interpretación son los nucleares y los nucleolares, los
últimos tienen mayor peso en la designación final.
Criterios de malignidad nucleares y nucleolares
a) Macrocariosis. Es la presencia de núcleos de mayor dimensión que los de la estirpe celular
normal.
b) Anisocariosis. Núcleos de diferente tamaño.
e) Relación núcleo/citoplasma. Aumentado por incremento del tamaño nuclear.
el) Multinucleación. Células que presentan dos o más núcleos. Criterio más importante si la misma
célula presenta, además, anisocariosis.
e) Índice mitótico. Elevado. En general no se observan células en mitosis.
f) Mitosis anormales. Criterio de mucho peso para la designación de maligno.
g) Cromatina granular gruesa, en cordones o en terrones. Indica alta actividad o capacidad mitótica
de las células.
h) Anisonucleolosis. Nucléolos de diferente tamaño.
i) Macronucleolosis. Cuando los nucléolos son mayores que un eritrocito (>5Jlm).
j) Numero diferente de nucléolos
k) Nucléolos angulares
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66/70 ANEXOS
67/70 68/70 69/70 V. ACTUALIZACIÓN
Manual de Prácticas de Laboratorio de Inmunología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la
Universidad Autónoma del Estado de México. Toluca, México; 25de febrerode 2013.
Primera Edición
Director:
Dr. en C. José Mauro Victoria Mora
Elaboró:
M en C. Lemuel León Lara
Revisó:
70/70