Anti-TPO Humana BINDAZYMETM Kit de Enzimoinmunoensayo

•
•
INSTRUCCIONES DE USO
Anti-TPO Humana BINDAZYMETM
Kit de Enzimoinmunoensayo
MK039
Kit para diagnóstico in vitro únicamente
Spanish
Producto fabricado por:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
The Binding Site sucursal en España,
C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona
Teléfono 902027750
Fax: 902027752
e-mail: [email protected]
web: www.bindingsite.es
1
UTILIZACIÓN
Este kit está preparado para la medición in vitro de anticuerpos anti-peroxidasa
tiroidea (TPO) IgG específicos presentes en el suero, como ayuda en el
diagnóstico de enfermedades tiroideas.
Se suministra material suficiente para analizar un máximo de 41 muestras en
duplicado o bien 89 en un único ensayo, con una curva de calibración y
controles positivo y negativo.
2
INFORMACIÓN GENERAL
Las enfermedades tiroideas autoinmunes, en particular la tiroiditis de
Hashimoto y la enfermedad de Graves, se caracterizan por la presencia de
autoanticuerpos patogénicos1. Los dos autoanticuerpos principales se dirigen
contra la tiroglobulina2 y la peroxidasa tiroidea (TPO)3,4,5.
Tiroiditis de Hashimoto (hipotiroidismo)
La enfermedad de Hashimoto se caracteriza por una función tiroidea reducida
y se asocia a síntomas de fatiga, debilidad, depresión, aumento de peso,
hipotermia y piel seca. Afecta sobre todo a mujeres entre 30 y 60 años de
edad, con una tendencia hacia el grupo de mayor edad. Niveles elevados de
ambos anticuerpos anti-tiroglobulina y anti-TPO, correlacionan con la actividad
histológica1 de la enfermedad. Además, el desarrollo del hipotiroidismo se ha
asociado a niveles elevados de anticuerpos anti-TPO en mujeres
asintomáticas durante el embarazo6.
Enfermedad de Graves (hipertiroidismo)
La incidencia de la enfermedad de Graves es 5 veces superior en mujeres
entre 20 y 40 años de edad que en hombres del mismo grupo de edad. Se
caracteriza por una producción excesiva de hormonas tiroideas lo que da una
pérdida de peso, hiperactividad, intolerancia al calor y desórdenes del sueño.
Se encuentran niveles elevados de anticuerpos anti-tiroglobulina y anti-TPO
así como anticuerpos anti-hormona estimulante del tiroides (TSH)1.
El 98% de los pacientes de tiroiditis tienen anticuerpos anti-tiroglobulina y antiTPO. Su detección es una valiosa herramienta en el diagnóstico ya que un test
negativo prácticamente excluye la tiroiditis. Se han observado resultados
positivos en personas con tiroides normales, especialmente en mujeres
mayores7,8.
3
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los pocillos se encuentran sensibilizados con TPO recombinante. Los
calibradores, controles y muestras diluidas de pacientes se añaden a los
pocillos y los autoanticuerpos que reconocen la TPO se unen durante la primera
incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar las proteínas no unidas,
se añade un conjugado de conejo purificado anti-IgG (específico de cadena γ)
humana marcado con peroxidasa. El conjugado se une al anticuerpo humano
capturado y el exceso de conjugado no unido se elimina mediante un lavado
posterior. El conjugado unido se visualiza con el sustrato 3,3’,5,5’
tetrametilbenzidina (TMB) que da un producto de color azul cuya intensidad es
proporcional a la concentración de anticuerpo en la muestra. Se añade ácido
fosfórico a cada pocillo para parar la reacción, lo que produce un color amarillo
final que se lee a 450nm.
4
INHIBIDOR
CONCENTRACIÓN
Kathon
Azida sódica
PrCclin™ 300
Bromonitrodioxano
Metilisotiazona
0.02%
0.099%
0.045%
0.002%
0.002%
ProClin™ es marca registrada de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
•
•
•
Kathon es irritante y puede causar sensibilización por contacto con la piel.
La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M, que es irritante. Evite el
contacto con la piel y los ojos.
Derrames de reactivo deben limpiarse adecuadamente, según las normativas
locales y medioambientales.
4.2 ADVERTENCIAS
• Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente
entrenadas.
• Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede
afectar a la funcionalidad de este ensayo y a los resultados obtenidos. Ponga
especial atención a los avisos y “Notas” que encontrará en estas instrucciones
de uso.
• NO se pueden intercambiar reactivos de distintos lotes. Si se ha de realizar un
elevado número de ensayos, se debe asegurar que todos los reactivos sean del
MISMO lote. Deben tomarse todas las tiras del mismo envoltorio. La sustitución
de cualquier componente puede conducir a resultados erróneos.
• Utilice únicamente material plástico o de vidrio limpio. Nunca devuelva reactivos
no utilizados a los viales.
• No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o
evaporación dará resultados inconsistentes.
• El sustrato TMB no debe ser expuesto a la luz o al agua.
• Muestras hemolizadas, lipémicas, con material particulado o contaminación
microbiana no deben ser utilizadas.
• No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los
controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas
calibradas y muestras internas apropiadas CQ.
• La utilización de sistemas automáticos, dilutores de muestra u otro equipo
automatizado puede llevar a diferencias en los resultados cuando se compara
con el procedimiento manual. Cada laboratorio es responsable de validar el
sistema completo y asegurar que los resultados entran dentro de los límites
indicados en esta hoja de instrucciones y el certificado QC asociado.
• Todo el equipamiento ha de ser calibrado y mantenido según las instrucciones
del fabricante.
4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
•
•
•
5
•
•
•
•
6
El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de
conservación no adecuadas afectarán a los resultados.
El tampón de lavado diluido en una botella limpia puede conservarse a
temperatura ambiente (20-24ºC) durante un máximo de 4 semanas.
La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior.
OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS
Las muestras de sangre se han de obtener por venopunción, dejar que
coagule de modo natural y separar el suero.
El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 7 días antes del ensayo9, o para
periodos superiores, ha de alicuotarse y conservarse a -20ºC.
Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.
Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede
ocasionar resultados falsos positivos.
MATERIALES
6.1 MATERIAL SUMINISTRADO
*
Hoja de instrucciones: Indica todos los detalles del ensayo.
*
Certificado QC: Indica la funcionalidad esperada del lote.
*
Pocillos sensibilizados con TPO: 12 tiras de 8 pocillos separables,
sensibilizados con TPO recombinante y marcados en color rojo. La placa se
suministra en una bolsa que puede volver a cerrarse y que contiene dos bolsas
de desecante.
*
Diluyente de muestra: 2 botellas con 50mL de tampón para dilución de la
muestra. Listo para uso. Coloreado en amarillo.
*
Tampón de lavado concentrado 20x: 1 botella con 50mL de tampón
concentrado 20 x para el lavado de los pocillos.
*
Calibradores de TPO: 5 viales cada uno con 1.2mL de suero humano diluido,
con las siguientes concentraciones de autoanticuerpo anti-TPO: 2700, 900,
300, 100 y 33.3 UI/mL. Listo para uso.
*
Control positivo TPO: 1 vial con 1.2mL de suero humano diluido. El valor
esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso.
*
Control negativo Tiroideo: 1 vial con 1.2mL de suero humano diluido. El
valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso.
PRECAUCIONES
4.1 AVISOS
• Todos los donantes de suero humano suministrado en este kit han sido
analizados para la presencia de HBsAg, HIV1 y HIV2 y HCV, con resultados
negativos. De todos modos dichos ensayos no pueden asegurar la ausencia de
dichos agentes infecciosos, por tanto deben establecerse procedimientos
adecuados para la manipulación y eliminación de material potencialmente
infeccioso, y únicamente personal con entrenamiento adecuado debe llevar a
cabo dichos procedimientos.
La azida sódica puede provocar la formación de azidas explosivas en contacto
con el cobre y plomo de los desagües. Al eliminar los reactivos dejar correr
abundantes cantidades de agua para evitar la formación de dichos compuestos.
Los tampones y suero suministrado con este kit contienen diversos inhibidores
enzimáticos, como se indica a continuación. Deben manipularse con precaución.
Insert Code: E039.E, Version: 3rd April 2008, Page 1 of 4
*
Conjugado TPO: 1 vial con 12 mL de anticuerpo humano purificado IgG
marcado con peroxidasa. Color rojo. Listo para uso.
*
SustratoTMB: 1 botella con 14mL de sustrato TMB. Listo para uso.
•
Solución de parada: 1 botella con 14 mL de ácido fosfórico 3M. Listo para
uso.
4.
Lavado
Repita el paso 2.
5.
Adición del sustrato (TMB)
Dispense 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, seque la parte superior de
los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: Nunca devuelva cantidades sobrantes de TMB a la botella de reactivo,
para evitar su contaminación.
Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
6.
Parada
Dispense 100µL de solución de parada en cada pocillo. De este modo se
produce un cambio de color de azul a amarillo.
7.
Medición de la densidad óptica
Lea la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450nm en un lector de
microplacas, dentro de los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción.
6.2 MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO NO SUMINISTRADO
•
•
•
•
•
•
7
Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las
placas pueden lavarse manualmente.
Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450 nm en
referencia al aire.
Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta posible.
Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL.
Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de
conjugado, solución sustrato y solución de parada.
Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra.
METODOLOGÍA DE ENSAYO
7.1 PASOS PRE-ENSAYO
1.
•
•
Lleve el kit a temperatura ambiente
Los kits están diseñados para su uso a temperatura ambiente (20-24°C).
Retire el kit de la cámara frigorífica y déjelo a temperatura ambiente durante
aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su envoltorio
hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente.
NOTA: los kits pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta una
semana.
2.
Componentes del kit
Agite suavemente cada componente del kit antes de su uso.
3.
Dilución del tampón de lavado
Añada 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada
(dilución 1 a 20) en un recipiente limpio y mezcle. Pueden prepararse
volúmenes más pequeños diluyendo adecuadamente.
NOTA: El tampón de lavado diluido puede conservarse a temperatura
ambiente hasta 4 semanas, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria.
4.
5.
Dilución de la muestra
Diluya 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente de muestra (1:100) y
mezcle bien. NOTA: La muestra diluida debe utilizarse dentro de las 8 horas
siguientes a la dilución.
Manipulación de tira y marco
Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione
a partir del pocillo A1, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través
de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los bordes largos del marco
para evitar que los pocillos caigan fuera.
NOTA: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su
envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para
minimizar su exposición a la humedad.
Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo.
ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a
contaminación por polvo u otro material particulado provocará la
degradación del antígeno, dando como resultado una precisión pobre del
método y potencialmente resultados falsos.
8
1.
•
•
•
Cálculo de densidades ópticas medias (Sólo para ensayos que se lleven a
cabo en duplicado)
Calcule la media de DO de las lecturas duplicadas para cada calibrador,
control y muestra. El %CV para cada duplicado de DO ha de ser menor al
15%.
3.
Trazado de la curva de calibración
Se puede trazar la curva de calibración de modo manual o automático, con los
valores de concentración de autoanticuerpo anti-TPO en la escala log frente a
la DO en la escala lineal, para cada calibrador:
Automático – utilice un software adecuado y validado y el ajuste de curva que
mejor se adapte a los datos.
Manual – utilice papel gráfico log/lineal y dibuje una curva suave a través de
los puntos (no una línea recta o punto a punto).
•
•
4.
Tratamiento de puntos anómalos
Si alguno de los puntos no entra en la curva, puede eliminarse. Si la ausencia
de dicho punto implica que la forma de la curva es distinta a la curva de
calibración de muestra, o más de un punto parece ser anómalo, el ensayo
debe repetirse.
5.
Cálculo de los valores de control
Lea el nivel de autoanticuerpo anti-TPO directamente de la curva de
calibración. El valor debe entrar dentro del rango indicado en el certificado QC.
6.
Cálculo del nivel de autoanticuerpo en las muestras diluidas
Lea el nivel de autoanticuerpo anti-TPO en las muestras diluidas directamente
de la curva de calibración.
Nota: Los valores de calibrador han sido ajustados en un factor de 100 para
tener en cuenta la dilución de la muestra 1:100. Por tanto, no hace falta
ninguna corrección posterior.
7.
Calibración del ensayo
El ensayo se encuentra calibrado frente a la preparación de referencia de antimicrosomas tiroideos NIBSC 66/387, suministrada de Nacional Institute for
Biological Standards and Control (NIBSC: nibsc.ac.uk).
8.
•
•
Limitaciones
Este kit se utiliza únicamente como ayuda en el diagnóstico.
Un resultado positivo sugiere la presencia de ciertas enfermedades, que
deben confirmarse mediante otros resultados serológicos y la historia
clínica del paciente.
Los resultados de este ensayo no son una prueba diagnóstica de la
presencia o ausencia de enfermedad.
Los resultados dudosos deben repetirse ya sea con una muestra fresca o
unos días más tarde. Es importante realizar ensayos de seguimiento
regulares de los pacientes con el fin de monitorizar posibles cambios en
los niveles de autoanticuerpos anti-TPO.
Mantenga la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso.
2.
Adición de la muestra
Dispense 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida (1:100) en los
pocillos adecuados de la placa.
Nota: Las muestras deben añadirse lo más rápidamente posible a la placa
para minimizar la deriva del ensayo, y conectar el timer tras la adición de la
última muestra.
Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Lavado
El procedimiento de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un
lavado inadecuado de la placa dará resultados inexactos, con una precisión
pobre y fondos elevados.
Tras la incubación retire la placa y lave 3 veces con 250-350µL de tampón de
lavado por pocillo. Puede lavar la placa con un lavador de placas automático o
manualmente como se indica a continuación. Después del último lavado
automático, invierta la placa y golpee los pocillos sobre papel secante.
Las placas pueden lavarse de modo manual como sigue:
a.
Sacuda el contenido de la placa en un fregadero
b.
Golpee los pocillos sobre papel secante
c.
Pipetee 250-350µL de tampón de lavado en cada pocillo con una
pipeta multicanal
d.
Agite la placa suavemente en una superficie plana
e.
Repita a-d dos veces.
f.
Repita a y b.
3.
Adición del conjugado
Dispense 100µL de conjugado en cada pocillo, seque la parte superior de los
pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: No devuelva cantidades que sobren de conjugado al vial original del
reactivo, con el fin de evitar su contaminación.
Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Control de calidad
Para que un ensayo sea válido se han de cumplir los siguientes requisitos:
Se han de incluir calibradores y controles positivo y negativo en cada ensayo.
El valor obtenido para el control positivo y negativo ha de entrar en el rango
especificado en el certificado QC.
La forma de la curva ha de ser similar a la curva de calibración que se muestra
en el certificado QC.
Si estos requisitos no se cumplen el ensayo no es válido y debe
repetirse.
2.
7.2 METODOLOGÍA DE ENSAYO
1.
RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD
•
•
9
VALORES ESPERADOS
Se determinó el rango normal a partir de sueros de 200 donantes de sangre
adultos normales (107 hombres y 93 mujeres), vea la sección 10.2.
Estos rangos se indican únicamente como una guía. Los ensayos ELISA son
muy sensibles y capaces de detectar pequeñas diferencias en muestras de
poblaciones. Por tanto es recomendable que cada laboratorio determine sus
propios rangos de normalidad, basado en la población, técnicas y equipo
utilizado.
VALORES ESPERADOS
< 40 U/mL
Negativo
40-100 U/mL
Dudoso
> 100 U/mL
Positivo
Insert Code: E039.E, Version: 3rd April 2008, Page 2 of 4
10
10.1
CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO
PRECISIÓN
Se midió la precisión intra- e inter-ensayo utilizando 3 muestras en el rango
de la curva de calibración. Se muestra a continuación la concentración y
%CV para cada una:
10.2
n=16
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
PRECISIÓN INTRA-ENSAYO
Concentración (U/mL)
203
356
870
% C.V.
1.6
3.8
5.1
n=3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
PRECISIÓN INTER-ENSAYO
Concentración (U/mL)
64
167
1010
% C.V.
7.5
3.1
4.0
6.
7.
8.
9.
12
PLANTILLA DE PLACA
Vea la parte posterior de la hoja de instrucciones.
RANGO NORMAL
Resumen del procedimiento
Se ensayaron 200 sueros de donantes de sangre adultos normales (93
mujeres y 107 hombres) para anticuerpos anti-TPO. Tomando como
referencia un resultado dudoso en el rango de 40-100 y un cut-off positivo
de >100, 15 muestras (12 mujeres y 3 hombres) mostraron resultados
elevados, lo que representa un 7.5% de la población ensayada. El cut-off se
indica únicamente como guía. Se recomienda que cada laboratorio
establezca sus propios rangos de normalidad.
Valor
U/mL
<40
>40-49
50-74
75-100
>100-199
200-1000
>1000
10.3
Clin Endo and Metab, 1990; 71, No.3:661-669.
Czarnocka B et al. Purification of the human thyroid peroxidase and its
identification as the microsomal antigen involved in autoimmune thyroid
diseases. FEBS, 1985;190, No.1:147-152.
Roman SH et al. Thyroid Autoantibodies in HLA-Genotyped Type 1 Diabetic
Families: Sex limited DR5 Association with Thyroid Microsomal Antibody.
Clin Endocrinol, 1986; 25:23-33.
Stagnaro-Green A et al. Detection of At-Risk Pregnancy by Means of Highly
Sensitive Assays for Thyroid Autoantibodies. JAMA, 1990; 264, No11:14221425.
Peter JB, Shoenfeld Y. Autoantibodies.1996; Page 810-821. Publisher:
Elsevier ISBN 0-444-82383-2.
Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A
Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
5.
Muestras
Número
%
185
92.5
2
1.0
0
0.0
1
0.5
5
2.5
4
2.0
3
1.5
92.5%
Dudoso
1.5%
Positivo
+
Dudoso
EIA
Sensibilidad relativa
Especificidad relativa
Correlación relativa
2.
Añada100µL de conjugado a cada pocillo.
Incube durante 30 minutos.
Lave.
3.
Añada 100µL de sustrato a cada pocillo.
Incube durante 30 minutos.
4.
Añada 100µL de solución de parada a cada pocillo.
Mida la absorbancia a 450 nm.
6.0%
ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD Y CORRELACIÓN
BINDAZYME
Añada 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida 1:100 en los
pocillos correspondientes.
Incube durante 30 minutos.
Lave.
Clasificación
Negativo
La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se determinaron frente a
un kit alternativo EIA anti-TPO.
EIA
1.
+
47
4a
1b
EIA alternativo
Dudoso
0
3c
2d
94.7%
100%
96.2%
BINDAZYME™ es marca registrada de
The Binding Site Ltd.
P.O. Box 11712, Birmingham
B14 4ZB. England
0
0
23
La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se ha determinado
considerando todos los resultados dudosos como positivos.
a. Todas las muestras dudosas con el ensayo BINDAZYME, con unos
resultados de 56, 63, 83 y 89 U/mL respectivamente, y positivos con el kit
alternativo en referencia al cut-off de >100U/mL con valores de 115, 110,
105 y 118 U/mL.
b. Esta era una muestra de un donante de sangre normal y dio un resultado
positivo con el kit alternativo de 152 U/mL.
c. Estas tres muestras fueron dudosas con ambos ensayos.
d. Estas dos fueron negativas con el ensayo BINDAZYME con valores de 22
y 35 U/mL y dudosas con el ensayo alternativo con valores de 64 y 84 U/mL
respectivamente.
10.4
SUSTANCIAS INTERFERENTES
Se ensayaron distintos tipos de sueros para comprobar el posible efecto de
sustancias interferentes. Los resultados indicados a continuación muestran
el número de muestras que dieron un resultado positivo/el número
ensayado.
SUERO
POSITIVO /Nº ENSAYADO
Lipémico
0/8
Hemolizado
2/10
Bilirrubina alto
0/10
Hiperproteico (Mieloma)
0/10
Los resultados indican que el uso de muestras hemolizadas pueden originar
resultados falsos positivos.
10.5
SENSIBILIDAD ANALÍTICA
Se determinó la sensibilidad como la concentración media +2 DS obtenida
en 20 ensayos del diluyente de muestra. El resultado es 1,8 U/mL.
10.6
11
1.
2.
3.
4.
RANGO DE MEDIDA
El rango de medida del ensayo es 33.3 - 2700 U/mL.
REFERENCIAS
Väkevä A et al. Thyroid peroxidase antibodies in children with autoimmune
thyroiditis. J Clin Path, 1992; 45:106-109.
Prentice LM et al. Geographical distribution of subclinical autoimmune
thyroid disease in Britain: A study using highly sensitive direct assays for
autoantibodies to thyroglobulin and thyroid peroxidase. Acta Endocrinologica
(Copenh), 1990; 123:493-498.
Mariotti S et al. Comparison of Serum Thyroid Microsomal and Thyroid
Peroxidase Autoantibodies in Thyroid Disease. J Clin Endo and Metab,
1987; 65, No.5:987-993.
Mariotti S et al. Antithyroid Peroxidase Autoantibodies in Thyroid Disease. J
Insert Code: E039.E, Version: 3rd April 2008, Page 3 of 4
Plantilla de placa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Insert Code: E014, Version: 13 February 2006, Page 4 of 4