S3-BYQ14

GENOVARES DE Chlamydia trachomatis CAUSANTES DE CONJUNTIVITIS
NEONATAL EN NIÑOS NACIDOS EN LOS ALTOS DE CHIAPAS, MÉXICO.
Bautista Viguri J*., Ochoa Hector**., Leyva Vázquez MA*., Espinoza-Rojo M*.
*UA Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. Av. Lazaro
Cardenas S/N, C.U., Chilpancingo, Guerrero. [email protected]
RESUMEN
Chlamydia trachomatis, es el agente infeccioso causante de enfermedades oculares como oftalmia
neonatorum, paratracoma y tracoma, todas ellas con graves secuelas y asociadas a menudo con infecciones
recurrentes del tracto genital y a condiciones de extrema pobreza. La región de los altos de Chiapas, es una
zona endémica a enfermedades de este tipo. Razón por la cual el objetivo de este trabajo es: Conocer la
prevalencia de infección ocasionada por los genovares de Chlamydia trachomatis en la conjuntiva de
neonatos, en tres hospitales ubicados en la zona endémica de los Altos de Chiapas. Se realizó un estudio
transversal, en 184 muestras de raspado de conjuntiva tarsal, obtenidas de recién nacidos. Un fragmento del
gen omp1 de C. trachomatis fue amplificado y los productos fueron tipificados mediante RFLPs.
Encontramos un 25% de muestras positivas, para el microorganismo de interés y cinco genovares distintos: 17
(9.2%) corresponden al genovar F, 15 (8.2%) al genovar C, 8 (4.3%) al genovar D, 1 (0.5%) del genovar I,
1 (0.5%) del genovar E y 4 (2.2%) productos insuficientes para tipificar. Con este trabajo se detecta infección
ocular causada por C. trachomatis en uno de cada cuatro recién nacidos en los hospitales estudiados,
predominando el genovar F, lo cual permite deducir un contagio al cruzar por el canal del parto, como
consecuencia de una infección en el tracto reproductor de la madre. Además fue prevalente el genovar C, lo
que permite pensar en una transmisión ojo-mano-ojo y como fuente de infección a la madre del recién nacido.
INTRODUCCIÓN
Chlamydia trachomatis es una bacteria intracelular responsable de enfermedades de transmisión sexual,
oculares y respiratorias. Las infecciones ocasionadas por Chlamydia trachomatis, tienen una distribución
mundial las cuales se definen como: tracoma, conjuntivitis de inclusión, infecciones del tracto urogenital,
tanto del hombre como de la mujer, neumonía infantil, el linfogranuloma venéreo y la psittacosis. 1, 2, A
menudo estas infecciones son leves, aunque algunas veces están asociadas con una significativa invasión
local o sistémica y puede tener importantes secuelas tardías, tales como fibrosis rectal o tubal, disminución de
la vista, etc. Así como en otras enfermedades infecciosas, el grado de daño tisular y las complicaciones, son
en parte un resultado de la respuesta inmune contra el agente etiológico, más que el daño ocasionado
directamente por el agente. 3, 4 Los síndromes oculares causados por C. trachomatis son tres: Tracoma que
ocurre principalmente en personas que viven en condiciones de pobreza, mala sanidad y pobre higiene. Es una
conjuntivitis, ocasionada por las serovariedades A, B, Ba y C de C. trachomatis, de comienzo insidioso o
repentino; el tracoma ha sido definido como una queratoconjuntivitis crónica, caracterizada por folículos,
hiperplasia papilar y formación de cicatrices. Es una enfermedad que generalmente se inicia en la infancia,
durante los primeros meses de vida, comienza como una inflamación de los párpados, ojos rojos con
secreciones. La intensidad se incrementa en niños de entre 6 y 8 años de edad. 5-7 La cicatrización del párpado,
se presenta en personas que no han recibido tratamiento o que han sufrido infecciones repetidas a lo largo de
su vida. Las cicatrices notables de la conjuntiva causan deformidades de los párpados y las pestañas
(triquiasis y entropión), que a su vez ocasionan abrasión crónica de la córnea, deterioro visual y ceguera en la
vida adulta. La ceguera debida al tracoma es más común en adultos, aún más en mujeres y generalmente es
bilateral. Estudios epidemiológicos y experimentales, han demostrado que el tracoma y la conjuntivitis de
inclusión no son enfermedades diferentes, si no más bien representan un amplio espectro de respuesta clínica
a las diferentes biovariedades de C. trachomatis.5,7 La Conjuntivitis de Inclusión, también llamada
Paratracoma, inicia como una conjuntivitis folicular aguda en niños y adultos, y si no es tratada persiste, sin
llegar a la ceguera.8 Los genovares D-K de Chlamydia trachomatis son los agentes etiológicos involucrados
con mayor frecuencia en esta conjuntivitis. En el recién nacido, es una enfermedad aguda o subaguda, con
abundante exudado purulento, que suele identificarse de 5 a 12 días después del nacimiento. La etapa aguda
por lo común cede espontáneamente en unas cuantas semanas, pero sin tratamiento la inflamación puede
persistir incluso durante un año o más y dejar cicatrices leves en las conjuntivas. Por último la Oftalmia
Neonatorum adquirida de la madre al momento del nacimiento, se presenta como hinchazón del párpado, y
progresa a inflamación mucopurulenta, si la enfermedad no es tratada, puede persistir por más de un año,
aunque normalmente se auto limita, como consecuencia de infecciones bacterianas secundarias puede
ocasionar ceguera. El tracoma se distribuye mundialmente, se ha estimado que alrededor de 500 millones de
personas están infectadas y de estas 7 a 9 millones están ciegas por esta causa; se presenta como enfermedad
endémica, con mayor frecuencia en las comunidades rurales más pobres de los países en vías de desarrollo.
En las zonas endémicas, la enfermedad afecta frecuentemente a los niños, cede durante la adolescencia y deja
grados variables de cicatrices que pueden ser invalidantes. En el Sureste de México, se reconocen zonas
endémicas para las infecciones ocasionadas por Chamydia trachomatis, por lo que los habitantes de dichos
lugares, potencialmente pueden desarrollar secuelas invalidantes tales como infertilidad o ceguera. Por otro
lado en los pocos estudios que se han realizado se reporta una prevalencia del 25% de tracoma activo en niños
y 100% de tracoma cicatrizal en adultos. Sin embargo, en el caso de infecciones oculares, el agente causal no
ha sido reportado en la población neonatal, que sería el periodo de la vida en que se presente mayor
susceptibilidad para adquirir por primera vez la enfermedad, al ser trasmitida por la vagina infectada de la
madre al momento de nacer.9 La importancia de conocer la prevalencia de la infección y de los genovares
circulantes en la población que involucra este estudio, estriba en que, es el primer análisis molecular
realizado en neonatos, en esa población reconocida mundialmente como endémica, y la información de él
obtenida, nos da una primera aproximación de la magnitud del problema y permitirá sentar las bases para
futuros estudios epidemiológicos, tendientes a conocer la dinámica de transmisión y persistencia de esta
infección y de sus graves secuelas.5, 10, 11. Además se pretende que contribuya a establecer mecanismos
tendientes a la profilaxis de la enfermedad, que pueden ser, desde manejar los factores de riesgo para la
conjuntivitis y aplicación de terapéuticas accesibles.1, 12,13
MATERIALES Y METODOS.
Fueron elegidos niños recién nacidos de los siguientes hospitales: Hospital Regional SSA, de San Cristóbal de
las Casas. Clínica de Campo San Felipe Ecatepec, IMSS- Oportunidades. Hospital Rural Nº. 32, Ocosingo,
IMSS-Oportunidades. Todos los neonatos participantes en este estudio, previo consentimiento informado de
los padres, fueron reclutados desde finales del embarazo materno, hasta treinta días de edad.
Características de la población.
Los Hospitales antes citados dan cobertura a la Región de los Altos, que es una de las nueve regiones
económicas del Estado de Chiapas. En general, es una zona de alta a muy alta marginación, excepto San
Cristóbal de las Casas, que es calificada de baja marginación. Es catalogada como una de las regiones más
pobres del estado y endémica de tracoma.14
Obtención de muestras biológicas y extracción del DNA.
Entre los meses de mayo a noviembre de 2003, se colectaron 184 muestras de conjuntiva tarsal, de recién
nacidos obtenidos por parto vaginal, excluyéndose aquellos que presentaron malformaciones congénitas
óculo-palpebrales. Las muestras fueron colocadas en 750 μl de solución de extracción (Tris-HCl 10mM, pH
8.0; EDTA 20mM pH 8.0; SDS 0.5%) y almacenadas a -70ºC, hasta su envío a Chilpancingo, Guerrero,
donde se almacenaron a -20ºC hasta su procesamiento. La extracción de DNA se llevó a cabo mediante la
técnica de fenol/ cloroformo alcohol isoamílico, previa digestión con proteinasa K y precipitación con etanol,
según el método establecido por Yang.15
Amplificación del gen omp1. Utilizando la técnica de PCR anidada, se procedió a la amplificación de una
región del Gen omp1 de aproximadamente 1129 pb. La PCR fue hecha en un volumen total de 50μl. La
mezcla final contenía: agua destilada estéril, los iniciadores (20 pM de cada uno): YOC1 (5´GCCGCT TTG
AGT TCT GCT TCC TC 3´); YOC 2 (5´ATT TAC GTC AGC AGC TCT CTC AT 3´); 1.0 μl de dNTPs;
buffer 10X (Gibco/BRL); 1.5 μl de MgCl2 (Gibco/BRL); 0.5 μl (2.5U) de Taq DNA polimerasa (Gibco/BRL).
Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización inicial de 95ºC por 5 min., 35 ciclos
de amplificación, desnaturalización a 95ºC por 1.30 min, alineamiento a 60ºC por 2.30 min, extensión a 72ºC
por 3.0 min y una extensión final a 72ºC por 10 min. Como control positivo se utilizaron muestras
confirmadas positivas.15 El producto de la primera amplificación se sometido a una segunda amplificación
utilizando los oligonucleotidos iniciadores: YOC3 (5´TGA CTT TGT TTT CAG CCG TGT TTT 3¨; YOC4
(5´TTT TCT AGA TTT CAT CTT GTT CAA3´), que amplifican un segmento de 867 pb. Se utilizó de
templado 5 μl del producto de la primera PCR en una mezcla de reacción de 50 μl que contenía: agua
destilada estéril, buffer para PCR 10X (Gibco/BRL), MgCl 2, 1.5 μl (Gibco/BRL), 1.0 μl de dNTPs , 1.5 μl
oligonucleótidos iniciadores YOC3 y YOC4 y 0.5 μl de taq DNA polimerasa (gibco/BRL). Las condiciones
de amplificación fueron las siguientes, desnaturalización inicial de 94ºC por 4 min., 40 ciclos de
amplificación como sigue: desnaturalización a 94ºC por 1 min. Alineamiento a 60ºC por 1 min. Extensión a
72ºC por 2 minutos y una extensión final de 72ºC por 10min. Del producto de la segunda PCR se visualizaron
7 μl en un gel de agarosa al 1.5%, teñido con bromuro de etidio. 15 Para llevar a cabo un control de calidad
interno y para verificar la reproducibilidad del método, se repitieron las muestras ciegas tres veces. RFLPs.
Los productos de la segunda PCR, de 867 pb, se sometieron a restricción con las enzimas AluI y
Msp1(GIBCO/BRL). incubándose dos horas a 37ºC. Los fragmentos obtenidos fueron resueltos en gel de
poliacrilamida al 10%. Los genovares fueron identificados por comparación de los RFLP´s con un panel de
referencia.16
RESULTADOS.
La población estudiada, 184 especímenes de raspado de tejido epitelial de la conjuntiva tarsal de niños recien
nacidos, la mayoría se obtuvo en el hospital Regional SSA de San Cristóbal de las Casas (37.5%). Las edades
de los menores fluctuaron entre 1 y 30 días de edad siendo más frecuente el rango de 13 a 18 (34.(%) días de
nacido (cuadro 1).
Cuadro 1. Distribución de neonatos por edad en cada uno de los hospitales estudiados.
Grupos de edad (días de nacido)
1-6
7-12
13-18
19-24
25-30
Hospital
No.
Regional SSA, de San
Cristóbal de las Casas.
14
7.6
5
2.7
33
17.9
7
3.8
10
5.4
69
37.5
Clínica de Campo San
Felipe Ecatepec, IMSSOportunidades
19
10.32
9
4.8
14
7.6
10
5.4
6
3.2
58
31.5
25
13.58
8
4.3
17
9.2
2
1.0
5
2.7
57
31.0
Rural Nº. 32, Ocosingo,
IMSS-Oportunidades.
%
No.
%
No.
%
No
%
No.
%
Total
No.
%
total
58
31.5
22
12.0
64
34.8 19 10.3
21
11.4 184 100
Una vez obtenido el DNA, Chlamydia trachomatis fue diagnosticada como agente causal de la infección
conjuntival, mediante PCR anidada, la cual fue repetida tres veces, para asegurar un control de calidad interno
y la reproducibilidad del método. Los productos fueron analizados en geles de agarosa (fig. 1). Resultando 46
muestras positivas (25%) para este microorganismo (cuadro 2), siendo más frecuente entre el grupo de edad
de 13 a 18 días de nacido (9.2%), aunque el microorganismo se presentó en todos los grupos de edad. Todas
las muestras positivas a la infección por Chlamydia trachomatis, se tipificaron mediante la técnica de RFLPs
(fig.2) y el resultado es que de las 46 muestras positivas, 17 corresponden al genovar F, 15 al genovar C , 8
al genovar D, 1 del genovar I , 1 al genovar E y 4 productos insuficientes para tipificar (cuadro 1).
M
1
2
3
4
5
C+ C-
M
872pb
1
2
3
4
5
6
7
867pb
Fig. 1. Productos de la segunda PCR para amplificar
867 pb, del gen Omp1 de C. trachomatis. Carril M se
observa el marcador PhiX 174, indicando 872 pb, en
carrilles 1-5 muestras positivas, carril 7 control
positivo DNA de C. trachomatis y carril 8 control
negativo.
Fig. 2. Corrimiento electroforético de la restricción
de los Fragmentos Largos Polimorficos. Se muestran
los patrones de restricción para la enzima alu1.
Carril M, marcador de peso molecular PhiX174
digerido con Hae III, carriles 2 al 6 genovar C,
carriles 1 y 7 ilegibles.
Cuadro 2. Distribución y frecuencia de los genovares de C. trachomatis diagnósticados, tomando en cuenta la
edad de los pacientes
1-6
Genovar
No.
C
3
5
0
6
0
1
15
D
E
F
I
No indentificado
total
Grupos de edad (días de nacido)
13-18
19-24
7-12
%
No.
1.6
2.7
0
3.3
0
0.5
8.1
2
0
1
2
1
0
6
%
No.
1.1
0
0.5
1.1
0.5
0
3.3
%
6
3
0
5
0
3
17
No
3.3
1.6
0
2.7
0
1.6
9.2
%
1
0
0
2
0
0
3
25-30
No.
0.5
0
0
1.1
0
0
1.6
Total
%
3
0
0
2
0
0
5
1.6
0
0
1.1
0
0
2.7
No.
%
15
8
1
17
1
4
46
37.5
4.3
0.5
9.2
0.5
2.2
25.5
Cuadro 3. Distribución y frecuencia de los genovares diagnosticados en cada una de los hospitales estudiados.
Variedades de Chlamydia trachomatis (genovares)
D
E
F
I
C
%
No.
%
No.
%
No
%
No
%
N/S
No
Total
HOSPITAL
No.
%.
No
%
Regional SSA, de San
Cristóbal de las Casas
3
1.6
3
1.6
0
0
4
2.2
0
0
1
0.5
11
6
Clínica de Campo San
Felipe Ecatepec,
IMSS-Oportunidades
7
3.8
1
0.5
1
0.5
7
3.8
0
0
1
0.5
17
9.2
Rural No. 32,
Ocosingo, IMSSOportunidades
5
2.7
4
2.2
0
0
6
3.3
1
0.5
2
1.1
18
9.8
Total
15
8.1
8
4.3
1
0.5
17 9.2
1
0.5
4
2.2
46
25
Con respecto a los sitios de estudio, los dos hospitales rurales: Clínica de campo San Felipe Ecatepec y el
Rural No. 32 de Ocosingo, ambos del programa IMSS-oportunidades, presentaron una mayor frecuencia de
casos positivos 17 (9.2%) y 18 (9.8%) respectivamente, con respecto a la población estudiada (cuadro 3). De
igual manera los genovares que se presentaron con mayor frecuencia en estos hospitales son el C y el F y los
de menor el E y el I. En 4 casos (2.2%) la tipificación no fue posible, por ser insuficiente el producto de PCR.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Este trabajo, es el primer estudio molecular realizado en Recién Nacidos, en la región de los Altos en
Chiapas, México, zona catalogada por la Organización Mundial de la Salud, como endémica para todo tipo de
infecciones ocasionadas por Chlamydia trachomatis, con la finalidad de conocer la prevalencia de los
genovares de esta bacteria como agente causal de oftalmia neonatorum.14 La prevalencia de Chlamydia
trachomatis encontrada en este estudio fue del 25 %, dato que supera lo esperado, dado que hay reportes, en
esa zona con prevalencias entre 2.0% a 8%12, con lo cual se confirma que en esta zona existen los
reservorios humanos para este microorganismo. Aunque en estudios realizados en otros países, la prevalencia
de este patógeno, ha resultado muy variable (del 2.0 al 66.0%), es importante señalar que los estudios no se
han hecho en niños recien nacidos.17 De acuerdo a el número de muestras positivas, distribuidas en los
diferentes Hospitales se observa que en el Hospital Regional SSA, de San Cristóbal de las Casas el número
de especimenes obtenido fue mayor (69), y en el Hospital Rural Nº. 32, Ocosingo, IMSS-Oportunidades se
obtuvieron un menor numero de muestras (57), sin embargo, los resultados posistivos, se presentaron de
manera inversa, ya que el mayor número de muestras positivas fueron de las muestras tomadas en el Hospital
de Ocosingo, lo que nos habla y corrobora nuevamente, que esta enfermedad prevalece en condiciones de
extrema pobreza ya que el Hospital de San Cristobal de las Casas se ubica en un zona de baja marginación
mientras que el Hospital de Ocosingo esta ubicado en una zona de alta marginación. En este trabajo se
detectaron y tipificaron cinco genovares de la bacteria, resultando más frecuente el genovar F (9.2%), lo que
indica que esta infección es secundaria a una enfermedad genital de la madre, dado que este subgrupo de
clamidias se ha determinado como agente causal de enfermedades urogenitales. También es importante la
presencia del genovar C (8.2%), que ha sido identificado en otros trabajos como agente etiológico de tracoma
en combinación con las serovariedades A, B, Ba y C, esto nos permite suponer que la infección pudo haber
sido adquirida después del nacimiento, por malos hábitos de higiene de la madre, hermanos o por fomites, ya
que la mayor frecuencia de esta variedad de la bacteria, está en el grupo de edad de 13 a 18 días de nacido. 5, 6,
7, 18
Con base en los resultados obtenidos, se puede decir, que Chlamydia trachomatis, es un importante agente
causal de la infecciones oculares en los recién nacidos, en la zona de los altos de Chiapas, México,
presentándose en uno de cada cuatro casos estudiados y que los genotipos circulantes en esta población son:
C, D, E, F, I.
BIBLIOGRAFÍA
1. Beatty, W.L., Byrne G.I. and Morrison, R.P. Repeated and persistent infection with Chlamydia and
development of chronic inflammation and disease. Trends Microbiol, 1994. 2(3):94-8.
2. Raos K, Madhavan HN, Padmanablan P, Lakshmi S, Natarajan K, Gary D. Ocular Chlamydial
infections; clinic microbiological correlation. Cornea. 1996; 15: 62-5.
3. Armstrong, J. Zacarias , F, and Rein , M. Ophthalmia Neonatorum: A Chart Review. Pediatrics.
2001: 6: 884- 892.
4. Toney, J.F. and Larkin. Contemporary Strategies for detecting Chlamydial infection in women.
Medscape Women Health. 1996. 1(5):1.
5. Chin, J. El control de las enfermedades transmisibles. Informe oficial de la Asociación
Estadounidense de Salud Pública. 2001. 87-89; 359-362.
6. Pöschl. J, Hellstern. G., Ruef., P., Bauer and Linderkamp. O. Ophthalmia Neonatorum Caused by
Group B Streptococcus.Scand J. Infect. Dis. 2003. 34: 921-943.
7. West. S., Raposa. P., Muñoz. B., Katala. S., Taylor. H. Epidemiology of ocular Chlamydial infection
in a Trachoma .hiperendemic area. J. Infect. Dis. 1997.163:752-756.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Tabbara KF, Hyndiuk R. A,Chlamydia: trachoma and conjunctivitis of inclusions. Infections of the
eye. 1996:433-51.
Acosta-Cazares, B.L. Ruiz, M. and Escobedo P. Prevalence and risk factors for Chlamydia
trachomatis infection in low-income rural and suburban populations of México. Sex. Trans. Dis.
1996. 23(4):283-8.
Dean. D., Ferrero. D., and McCarthy. M. Comparison of Performance And Cost-Effectiveness Of
Direct Fluorescent. Antibody, Ligase Chain Reaction, and PCR Assays for Verification of
Chlamydial Enzime Immunoassay Results for Populations with a Low to Moderate Prevalence of
Chlamydia trachomatis Infection.J. of Clin. Microbiol. 1999. 36: 94-99.
Domínguez, E. A., Asociación de Chlamydia trachomatis con cuadro clínico de tracoma en
comunidades endémicas en la región Altos de Chiapas. Universidad Autónoma de Chiapas. 2000. 150.
Remington, J.S. and Klein,JO Infectious diseases of the fetusand newborn infant. The Centers for
Disease control. 2000. 25( 2):7266-70.
Solomon A, Holland MJ, Burton MJ, West S. et al. Strategies for control of trachoma:
observational study with quantitative PCR. The Lancet.2003; 362: 198-204.
Taylor.H., Velasco. F., Sommer. A.The ecology of trachoma: an epidemiological study in southerm
Mexico. Bull World Health Organ. 1985. 63:559-567.
Yang, C.L., Maclean, I. and Brunham, R.C. DNA sequence polymorphism of the Chlamydia
trachomatis omp 1 gene. The Journal of Infectious Diseases. 1993. 168: 1225.30.
Kreuzer, H. and Massey A. Recombinant DNA and Biotechnology: A guide for Teachers. 1996:
American Society for Microbiology. 668.
Elnifro E, Cooper RJ, Klapper, PE, Bailey AS, Tullo, AB. Diagnosis of viral and chlamydial
keratoconjuntivitis: Which laboratory test?. Br J Ophthalmol. 1999; 83:622-627.
Bobo, L. D., Novak, N. Muñoz, B., Hsieh , Y. Quinn, T. and West, S. Severe disease in children
with Conjunctivitis is associated with persistent Chlamydia trachomatis infection. The journal of
infect. dis. 2001. 176:1524-30.