Tinción con Anticuerpos

Trabajo Práctico de Biología
Celular
Objetivo General:
Reconocimiento de estructuras subcelulares
mediante transfección de proteínas
fluorescentes e inmunocitoquímica
Transfección: proceso por el cual un gen de
interés es introducido dentro de la célula
eucariota por métodos químicos ó físicos.
Inmunocitoquímica: se emplean anticuerpos
para detectar y localizar antígenos específicos
en células ó tejidos (Inmunohistoquímica).
GFP-PTP 1B DA
VINCULINA
Manipulación de células en cultivo:
1) MEDIO DE CULTIVO
Requerimientos
MEDIO DE CULTIVO
Aporte
Nutrientes
Composición
*glucosa (fuente de C)
*aminoácidos (fuente de N)
*cofactores enzimáticos
*vitaminas
*sales
*Transferrina
*Albumina,
*Factores de crec.
*Factores de anclaje
SUERO
Estimulo proliferativo y
adhesivo
ANTIBIOTICO
*penicilina
Prevención de contaminaciones, *estreptomicina
selección
*gentamicina
SUPLEMENTO
Estimulo especifico
BUFFER
Mantiene el PH
*hormonas
*Factores de crec.
*Bicarbonato
*Indicador: Rojo Fenol
2) FACTORES FISICOQUIMICOS
•PH: 7.2-7.5
•OSMOLARIDAD : 280-320mOsmol/kG
•CO2: 2-5 %
•TEMPERATURA: 35-37 ºC
3) ESTERILIDAD
1) Manipulación de células en flujo laminar
2) Exposición de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15´ antes de empezar a
trabajar
3) Todo el material usado debe estar estéril
* por autoclavado (120 C, 1 atm, 20´) en el caso de tips, frascos,
eppendorfs, pipetas, etc.
* por filtración (poro de 0,2µM) en el caso de medio (antes del
agregado de SFB y antibióticos), buffers, agua, etc.
4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol
70%
Inmunocitoquímica
- Fijación
- Permeabilización
- Bloqueo
- Tinción con anticuerpos
- Inmunocitoquímica directa
- Indirecta
Fijación
Preserva la morfología celular y la localización y estructura de los antigenos.
Glutaraldheído
Modo de acción
Por puentes entre grupos
aminos de las proteínas
Microscopia electrónica
Uso mas frecuente y algunos estudios de
fluorescencia
ventajas/
desventajas
*provee la mayor
preservación de la estructura
fina
*es el mas severo de los
fijadores
*en gral. Altera los
epitopes
*provoca fluorescencia
inespecifica
Paraformaldheído
Metanol/Acetona
Por puentes entre grupos
aminos de las proteínas
Por precipitación de
proteínas y carbohidratos
Ampliamente usado para
estudios de fluorescencia e
inmunocitoquímicos
Gran variedad de estudios
*produce menor
autofluorescencia que el
gluteraldheído
*menor cantidad de puentes
que el glutaraldheído
*penetra mas rápidamente
dentro de la célula.
*fijación mas rápida que el
aldheído
*frecuentemente altera el
patrón de localización de
antígenos
*Fija y permeabiliza
* antígenos solubles pueden
perderse
*contracción de la muestra
Inmunocitoquímica
- Fijación
- Permeabilización
- Bloqueo
- Tinción con anticuerpos
- Inmunocitoquímica directa
- Indirecta
Permeabilización
Produce poros en las membranas celulares
Permite la entrada de los anticuerpos a la célula
No es necesario si se quiere detectar antígenos
expuestos en la cara exoplásmica de la
membrana plasmática o de matriz extracelular
Se utilizan generalmente detergentes no iónicos
Permeabilización
Micela de detergente en agua
Ruptura de la membrana por detergente
Inmunocitoquímica
- Fijación
- Permeabilización
- Bloqueo
- Tinción con anticuerpos
- Inmunocitoquímica directa
- Indirecta
Bloqueo
En general se utiliza BSA (Sero-albúmina bovina)
Su función es evitar interacciones
inespecíficas de los anticuerpos
Inmunocitoquímica
- Fijación
- Permeabilización
- Bloqueo
- Tinción con anticuerpos
- Inmunocitoquímica directa
- Indirecta
Tinción con Anticuerpos
• Los anticuerpos son proteínas que tienen la
capacidad reconocer y unirse específicamente y
con alta afinidad a otras proteínas .
• La molécula que induce la producción de
anticuerpos y a la éstos se unen se denomina
antígeno.
• Cada antígeno suele presentar varios
determinantes antigénicos o epitopes.
Anticuerpos
Policlonales
Monoclonales
Anticuerpos producidos por
diferentes clones de linfocitos
Anticuerpos producidos por
un único clon de linfocitos
Mezcla heterogénea de anticuerpos,
reconocen distintos epitopes de
un mismo antígeno.
Población de anticuerpos homogéneos,
reconoce un único epitope del anticuerpo
Anticuerpos policlonales
Conejo, cabra, oveja, etc.
Purificación
de
anticuerpos
Separar el
suero
Anticuerpos monoclonales
• Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por
fusión con células de mieloma de ratón.
• Las células fusionadas (hibridomas) producirán
inmunoglobulinas idénticas a las que producía el
linfocito B normal parental y es inmortal como el
mieloma que le dio origen.
Anticuerpos monoclonales
Fusión
Células productoras de
anticuerpos
Hibridomas
Producción de anticuerpos monoclonales
Anticuerpos monoclonales
• Alta especificidad, reconocen un único epitope.
• Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con
las mismas características.
• Mayor costo que los sueros policlonales.
César Milstein (Bahía Blanca, 8/10/1927 – Cambridge, 24/3/2002)
Premio Nobel de Química 1984
Inmunocitoquímica
- Fijación
- Permeabilización
- Bloqueo
- Tinción con anticuerpos
- Inmunocitoquímica directa
- Indirecta
Inmunofluorescencia directa
Anticuerpo fusionado
a un fluoróforo
Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas
Inmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo primario (IgG)
•anti-tubulina (producido en conejo)
•anti-vinculina
(producido en conejo)
Inmunofluorescencia indirecta
Fluoróforo
Anticuerpo secundario
(anti IgG de conejo)
Anticuerpo primario (IgG)
•anti-tubulina
•anti-vinculina
Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas
Inmunofluorescencia indirecta
Microscopio de
fluorescencia
Inmunofluorescencia
DIRECTA
Anticuerpo marcado
con fluoróforo
Ventajas
primario
Acorta tiempos de
incubación
INDIRECTA
secundario
• Mayor sensibilidad
• El anticuerpo secundario puede ser
usado para localizar cualquier
anticuerpo primario producido en el
mismo animal para el cual fue hecho
el secundario
TP INMUNOCITOQUÍMICA
CÉLULAS EN MONOCAPA
TRANSFECCIÓN
FIJACIÓN
(paraformaldehído )
PERMEABILIZACIÓN
BLOQUEO
LAVADOS
ANALISIS POR
MICROSCOPIA
DE FLUORESCENCIA
ANTICUERPO PRIMARIO
ANTICUERPO SECUNDARIO
ACTINA ACTINA/NUCLEO/RETICULO
VINCULINA/NUCLEO/RETICULO
MICROTUBULOS/NUCLEO/VESICULAS