toma y conservacion de muestras para histología

TOMA Y CONSERVACION DE MUESTRAS PARA HISTOLOGÍA
Valero Elizondo German1
*Monroy Basilio Juan I.2
Para obtener un buen diagnóstico histológico, es indispensable la toma correcta
de porciones de tejido, por lo que es importante considerar los siguientes aspectos:
Para la evaluación de las tumoraciones deberán considerarse varios factores
como: el tamaño, la invasión local o a la periferia de la masa del tejido que lo rodea, y
el linfonodo regional involucrado. Un mapa topográfico de la masa localizada en el
paciente ayuda a documentar nuevas lesiones y cambios identificados previamente en
neoplasias benignas. La punción con aguja delgada (PAD) en la mayoría de los casos,
se debe realizar después de un examen físico minucioso. Un diagnóstico rápido y final
es posible en procesos benignos tales como en quistes de inclusión, abscesos, y en
masas neoplásicas de células redondas como; mastocitoma, histiocitoma, linfoma,
tumor venéreo transmisible y plasmocitoma, o un diagnóstico presuntivo puede
realizarse en neoplasias de origen epitelial o mesenquimal. La biopsia de aspirado con
aguja delgada no es adecuado en ciertas ocasiones cuando un procedimiento de biopsia
es preferible basado en la localización del tumor (ejemplo tumor oral o nasal) o cuando
existe un gran potencial de un resultado inconcluso (ejemplo sospecha de tumor
mesenquimal o neoplasia mamaria). Sin embargo las improntas en tejido o especimenes
de biopsias, pueden ser usadas como una herramienta opcional previa al tratamiento.
En esta situación o cuando la información del pronostico puede ser útil a partir se una
muestra de tejido para planear el mejor tratamiento, una biopsia es recomendada aún si
un diagnóstico preliminar es hecho con la técnica de PAD. La decisión de llevar a cavo
una biopsia puede ser hecha considerando el tamaño de la masa, el sitio y el grado del
tejido normal que puede ser removido por cualquier procedimiento. El sitio de punción
o corte de la biopsia debe ser en el área la cual será completamente tratada una vez que
el plan de tratamiento ha sido determinado. Esto significa que los bordes de la biopsia
deben ser completamente extirpados o en su defecto realizar terapia con fármacos o
irradiación. Es esencia lo importante es obtener el tejido adecuado para su evaluación.
Si es utilizada una aguja adecuada, deberá ser dirigida hacia en el mismo punto de la
superficie del tejido cuantas veces sea posible para obtener suficiente cantidad de
muestras.
Desde una perspectiva clínica, una biopsia debería primeramente determinar si
una masa es o no neoplásica, entonces identificar el tipo morfológico del tejido (ejemplo
celulas redondas, epitelial, mesenquimal) y finalmente proveer alguna información del
pronóstico que será útil para decidir un tratamiento.
La habilidad de alcanzar un resultado terapéutico esta basado en la evolución e
historia natural del tipo específico del tumor, como también indicadores predictivos
clínicamente relevantes (ejemplo grado) y la opción de tratamientos disponibles. Una
definición de cura regularmente usada en medicina veterinaria es una probabilidad de
mas del 50% dada a un tipo de tumor que podrá ser controlado (recurrencia ni
metástasis detectable) por al menos un año postratamiento. Si la información disponible
sugiere que tal control no es posible con una terapia convencional, deberán ser
considerados los tratamientos paliativos.
Sólo deben trabajarse aquellos casos que requieran histopatología para su
evaluación o diagnóstico. Si las lesiones macroscópicas y otros exámenes practicados
son suficientes para emitir el diagnóstico deseado, no deben desperdiciarse los recursos
en laminillas de histopatología superfluas. Asimismo, si se puede obtener la misma
información con una simple impronta coloreada o aspirado del tejido (punción con
aguja delgada), debe preferirse a la inclusión en parafina.
Elección del órgano a muestrear
Sólo hay que tomar especímenes de los órganos necesarios para el diagnóstico.
Debe evitarse el muestreo indiscriminado ya que usualmente representan gastos
innecesarios de tiempo y recursos.
Elección de la zona a muestrear
Debe tomarse una pieza representativa del órgano; en caso de lesiones severas,
conviene incluir una parte no lesionada dentro de la muestra para poder identificar el
órgano al momento de la observación microscópica. Es frecuente encontrar laminillas
de histopatología con lesiones claras, pero en las que no se identifica el órgano o el
tejido original, lo que da lugar al penoso caso de tener que describir un carcinoma
indiferenciado en un órgano indeterminado.
Obtención correcta de la pieza
Es importante que los instrumentos de corte deban contar con un excelente filo.
Del uso de cuchillos poco afilados, o tijeras escolares, resulta la compresión y tracción
exagerada de los tejidos, que pueden producir artificios indeseables, sobre todo en
órganos blandos como testículo, en aquellos con glándulas tubulares como útero, y en
órganos tubulares como intestino y conducto deferente.
La primera fase del estudio macroscópico es la inspección general del material,
con la descripción del tipo de pieza, estructuras que la componen, dimensiones, peso,
forma y color, así como la identificación de las partes normales y las aparentemente
patológicas. Dependiendo del material y para obtener una adecuada fijación se
procederá del siguiente modo:
a) Para órganos sólidos se efectuarán cortes seriados sin realizarlos por completo.
b) Las vísceras huecas pueden abrirse en fresco o bien ser fijadas simultáneamente
desde el exterior por inmersión y desde el interior mediante inyección con jeringa o
catéter.
c) En las lesiones quísticas (como en algunos tumores ováricos) es aconsejable extraer
por punción su contenido liquido para realizar estudio citológico y bioquímico, y
reemplazarlo por formalina al 10%.
d) En las piezas de gran tamaño es aconsejable la fijación a 4o C evitando así la
autólisis propia del tejido; si además la pieza tiene gran cantidad de tejidos blandos
y óseos, se pueden realizar cortes transversales y tomar muestras de todos los
compartimientos anatómicos de la pieza. También, es posible disecar las partes
blandas de las óseas y fijar las primeras de manera habitual.
Marcado de bordes quirúrgicos
En ciertos casos existe la necesidad de identificar y orientar los bordes del tejido
removido en una cirugía, como lo es frecuentemente utilizado en procesos tumorales. El
cirujano veterinario debe tener presente que en algunas ocasiones no se tiene la certeza
de haber removido completamente el tejido neoplásico dejando pequeñas porciones de
tejido potencialmente maligno, por lo que el paciente puede desarrollar nuevamente el
tumor e incluso presentar metástasis, de tal manera que es de vital importancia por su
trascendencia pronostica y terapéutica.
En este tipo de situaciones es posible aplicar la técnica de marcado de bordes,
sumergiendo la pieza en un frasco que contenga tinta china (escolar), durante un corto
tiempo y la cual deberá permanecer indeleble tras el procesado histológico rutinario del
tejido y sea fácilmente reconocible por el patólogo en el examen microscópico.
Posteriormente se escurre y se pasa a la solución fijadora de formalina. El patólogo
realizará los cortes necesarios e indicara al clínico dentro de sus resultados el espesor
del tejido adyacente al del tejido neoplásico. Se puede emplear un pincel y tintas china
de uso escolar (o soluciones colorantes de hematoxilina y eosina) para marcar con
diferentes colores los distintos bordes quirúrgicos (craneal, caudal, dorsal, ventral) de la
pieza y poder orientarla al momento de incluirla en parafina o utilizando un sistema de
marcaje con diferentes tipos de suturas para indicar áreas o márgenes (internos,
externos, anterior, posterior etc.). Si el tejido es muy grande para ser procesado
completo, la muestra de cada margen es cortada y marcada individualmente. Muestras
de múltiples sitios internos de la masa también pueden ser marcadas. El tiempo y costo
adicional es necesario para examinar por completo los bordes de crecimiento de las
células neoplásicas, pero esta información es vital para el adecuado control del cáncer.
El informe por escrito del patólogo, debe ser conciso y descriptivo sobre los bordes
quirúrgicos. También debe estar libre de abreviaturas y tecnicismos y el uso de la
terminología debe ser clara y de fácil entendimiento para los clínicos que lean el
informe.
Para emitir un pronóstico más exacto de los casos, es importante identificar y
clasificar la lesión tumoral y describir los bordes quirúrgicos donde puede quedar la
duda de haber o no removido todo el tejido.
Autólisis
La destrucción de los órganos celulares es una consecuencia de la muerte
celular. Cuando algunas células mueren en un organismo viviente se produce necrosis.
Cuando todas las células del organismo mueren se produce la autólisis. La apariencia
microscópica de una célula necrosada y otra autolizada son idénticas; es la distribución
de las lesiones y la reacción del organismo lo que nos permite diferenciarlas. Por esto,
es muy importante el minimizar la severidad de la autólisis post mortem, para poder
reconocer con facilidad las lesiones antemortem. Con frecuencia se intenta disminuir la
autólisis con refrigeración del cadáver o las muestras.
La autólisis depende del estado nutricional del animal, presencia de piel,
cantidad de pelo o grasa aislante, temperatura corporal al momento de la muerte,
temperatura ambiente y metabolismo del tejido particular.
Fijación de tejidos.
El proceso de fijación no solo preserva los tejidos deteniendo la autólisis sino
que también permite que permanezcan sin cambio luego de subsecuentes tratamientos.
Se requiere que los tejidos se endurecen ligeramente pero no se fragmenten,
permitiendo que las estructuras tisulares no se encojan y que estén muy cerca del estado
in vivo. La fijación deberá hacerse inmediatamente ya que cualquier demora seca el
tejido y acelera la autólisis. La congelación del tejido antes de la fijación puede producir
cambios morfológicos severos. La colocación de muestras de tejido en solución salina
antes del proceso de fijación inicia y acelera el proceso de autólisis.
En la selección de fijador intervienen varios factores tales como la estructuras y
entidades que se van a demostrar y los efectos a corto y largo plazo del almacenaje. Hay
numerosos tipos de fijadores, cada uno con sus ventajas y desventajas. Algunos
fijadores son restrictivos, otros se pueden usar de diferentes formas.
La formalina neutra al 10% estabilizada, está considerada como el mejor fijador
general para especímenes patológicos porque preserva el número más grande de
estructuras, requiere un período de fijación relativamente corto, puede ser usada para
almacenamiento de muestras de tejido a largo plazo y penetra rápida y regularmente sin
producir endurecimiento del tejido. Los tejidos sin procesar pueden permanecer por
varios meses sin efectos adversos y sin precipitados de formalina, siendo la
preservación del detalle nuclear y citoplásmico muy adecuada. Más aún, especímenes
fijados con formalina pueden ser tratados de nuevo con otro fijador, permitiendo así la
posibilidad de hacer microscopia electrónica. Muchas reacciones inmunohistoquímicas
pueden tener efecto adverso en tejidos previamente fijados en formalina. Por estas
razones la formalina neutra al 10% estabilizada, se usa casi universalmente.
La concentración usual de formalina en agua
fosfatada) es del 10%.
(solución salina isotónica o
Formaldehido, 37%, 40% ----------------------------- 100.0 ml
Agua destilada -------------------------------------------- 900.0 ml
Fosfato de sodio monobásico ------------------------- 4.0 g
Fosfato de sodio dibásico ------------------------------- 6.5 g
Para estudios especiales, se dispone de una gama muy amplia de fijadores.
Quien los use debe estar consciente de las ventajas y desventajas de cada fijador y
también de los artefactos de fijación asociados con ellos. El tiempo de fijación, el
tamaño de las muestras de tejido a fijar y el potencial de almacenamiento a largo plazo
son consideraciones de importancia.
Componente de los fijadores:
A.- Liquidos:
Los líquidos más comúnmente usados, ya sea solos o en combinación con otros
líquidos o sólidos, son el alcohol, la acetona, la formalina, el glutaraldehido, y el ácido
acético. El ácido tricloracético es usado con menor frecuencia como fijador y como
agente descalcificante.
El alcohol absoluto preserva el glucógeno; sin embargo, causa distorsión
del detalle nuclear y comprime el citoplasma.
La acetona fría es preferida cuando se efectúan ciertos estudios histoquímicos
para enzimas, especialmente lipasas y fosfatasas. La acetona no se usa como fijador de
rutina porque causa distorsión nuclear y compresión del citoplasma; además, no
preserva el glucógeno.
El glutaraldehido penetra más lentamente que el formaldehido y es muy valioso
en microscopía electrónica y en histoquímica enzimática. Hay muchas variaciones en la
preparación de este fijador, incluyendo el porcentaje de glutaraldehido, otros aditivos y
otros estabilizadores. Pequeños bloques de tejido, 1-2 mm en espesor, se fijan bien a
temperaturas bajas, 1 a 4 C, y muestras de tejido fijado pueden almacenarse en una
solución estabilizadora por muchos meses. La penetración tan lenta, la baja temperatura
requerida, y la necesidad de un medio de almacenamiento impiden el uso de este fijador
en la histotecnología diagnóstica de rutina. Los electromicroscopistas, sin embargo, son
capaces de usarlo con continuo éxito.
El ácido tricloracetico ya no se usa, supuestamente preserva ciertos aminoácidos
que contienen azufre, como la cistina, la cisteina, y la metionina en las proteínas. Este
liquido fijador también se usó antes como un agente descalcificante.
El ácido acético nunca se usa solo, sino en combinación con otros fijadores que
causen contracción tisular. El ácido acético penetra rápida y completamente pero lisa los
eritrocitos.
La formalina no precipita las proteínas y sólo precipita ligeramente otros
componentes de las células. No endurece o altera la solubilidad de la albúmina y
previene el endurecimiento subsecuente de los alcoholes. La formalina no preserva ni
destruye las grasas. Es un buen fijador de complejos lipídicos pero no tiene ningún
efecto en las grasas neutra. Aunque la formalina no es fijador de elección para los
carbohidratos, si preserva las proteínas para que mantengan el glucógeno, el cual así no
se disuelve fácilmente. La formalina es ideal para cortes en congelación.
El formaldehido 100% pura es un gas incoloro con olor fuerte. Es un irritante
instantáneo de los ojos, la nariz y la garganta. La piel y el sistema respiratorio son
particularmente afectados. Las medidas de seguridad deben incluir: adecuada
ventilación y exteriorización de gases, los periodos de exposición deben ser limitados o
restringidos y realizar un lavado concienzudo si se derrama en la piel. Aunque la
fijación con formalina es universalmente aceptada como ideal, sus efectos son
considerados como de fijación suave. Las muestras de tejido en formalina pueden
desarrollar cierta formación de burbujas en el núcleo. La fijación ulterior con formalinaácido acético (FAA) es similar al de los fijadores de metales pesados. La calidad
histológica de los especímenes puede ser mejorada retornándolos a la fase acuosa,
fijándolos ulteriormente en FAA y luego reprocesandolos. Cuando hay burbuja nuclear
la fijación ulterior con FAA va a producir tinciones más brillantes ya sean con
hematoxilina y eosina, Giemsa, u otras tinciones especiales. La fijación ulterior
proporciona mejor preservación de los antígenos en las preparaciones
inmunohistoquímicas.
La formalina no se debería usar con cromatos porque se oxida muy fácilmente a
ácido fórmico. Aún teniendo en cuenta que el proceso de neutralización se puede lograr
con carbonato de calcio, los especímenes removidos de la formalina neutralizada de esta
manera no mantienen su pH. Más aún, el carbonato de calcio se puede depositar en los
tejidos, dejando áreas de seudocalcificación. Para mantener un pH estable por varios
meses y para almacenar especímenes por periodos prolongados se recomienda la
formalina con fosfatos estabilizadores, los fosfatos monobásicos y dibásicos de sodio.
La formalina usada sin neutralización o estabilización se oxida a ácido fórmico,
el cual a su turno produce hematina ácida a partir de la hemoglobina. Resultan muy
interesantes las experiencias con agua potable de la Ciudad de México, que por su alto
contenido de sales y materia orgánica en su suspensión, funciona como una solución
amortiguadora débil. En condiciones rutinarias, existe muy poca diferencia apreciable
entre las muestras fijadas con formalina en solución amortiguada con fosfatos, las
fijadas con formalina disuelta en solución salina isotónica, y aquellas fijadas con
formalina disuelta en agua de la llave. Algunas personas le ponen trozos de gis blanco
(sulfato de calcio) a las soluciones de formalina. Otros investigadores le adicionan un
poco de rojo de fenol para tener una idea del pH de la solución.
Almacenar en un recipiente claramente rotulado. El rotulo debe especificar que
se trata de una sustancia química PELIGROSA.
El tiempo mínimo usado de fijación es de 24 a 40 horas; los órganos huecos
(aparato digestivo) se pueden ligar de ambos extremos e inyectar con el fijador. El
pulmón puede requerir de un trozo de papel o algodón en la superficie para asegurarse
de que lo cubra completamente el fijador. Todos los órganos o tejidos deben agitarse en
forma suave dentro del frasco con fijador para evitar que se adhieran a las paredes o al
fondo.
La relación usual entre el peso de la muestra y el volumen del fijador es de 20
partes a 1, o sea, 20 mililitros de solución fijadora por cada gramo de tejido.
El grosor ideal para muestras de tejidos rutinarios es de tres a 5 milímetros.
Las piezas por fijar nunca deben congelarse.
B.- Sólidos.
Hay un cierto número de sólidos que se combinan con otros sólidos y con
líquidos para mejorar la fijación como el cloruro de mercurio, dicromato de potasio,
ácido crómico, el tetroxido de osmio y el ácido pícrico.
Para resumir, aunque ciertos fijadores tienen usos especiales, la formalina neutra
estabilizada con fosfatos es el fijador más versátil y práctico y es recomendado tanto
para procedimientos de rutina como para muchos procedimientos más especializados.
El colocar las muestras con fijador en refrigeración a 4 C disminuye la autólisis
y preserva mejor el detalles celular, aunque aumenta el tiempo necesario para la fijación
de la muestra hasta tres o cuatro días. El colocar la muestra en estufa a 56 C acelera el
proceso de fijación a cerca de 4 horas, pero a costa de reducir el detalle celular.
Es posible obtener una fijación ultrarrápida de tejidos con la utilización de un
horno de microondas casero.
LITERATURA CONSULTADA
1.- Laboratorio de Anatomía Patológica: Raimundo García del Moral. Ed.
Interamaricana, 1993.
2.- Diagnóstico Veterinario: Germán Valero Elizondo. 2ª. Ed., Sociedad Mexicana de
Patólogos Veterinarios A.C. 1997.
3.- Métodos Histopatológicos: Edna B. Prophet. Instituto de Patología de las Fuerzas
Armadas de los Estados Unidos de Amkerica (AFIP). Washington, D.C. 1995.
4.- Tumors in domestic animals: Donaldo J. Meuten. 4ª Ed. Iowa State Press. 2002.
5.- Dermatología de pequeños animals. Medleau L. Hnilica K A. 2a ed. 2007.