S3-BYQ16

LACTOFERRINA: PROTEÍNA DE LA LECHE CON ACTIVIDAD AMEBICIDA EN
TROFOZOÍTOS DE Entamoeba histolytica HM1-IMSS
N. León-Sicairosa,b, M. Reyes-Lópeza, M. de la Garzaa
a
Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN, Av. IPN
2508, México, D.F., México, [email protected]
b
Departamento de Investigación, Hospital Pediátrico de Sinaloa “Dr. Rigoberto Aguilar Pico”, Blvd.
Constitución S/N col. Almada, Culiacán Sinaloa México, [email protected]
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue el conocer qué componentes de la leche materna poseen actividad contra los
trofozoítos de Entamoeba histolytica, protozoario parásito causante de la amibiasis, enfermedad que afecta
a personas de países en vías de desarrollo como el nuestro, y que inclusive llega a causar la muerte, sobre
todo en niños y en ancianos. Primeramente ensayamos la capacidad de la leche como amebicida midiendo
la viabilidad de las amibas incubadas con leche humana y bovina, posteriormente, fraccionamos la leche
para obtener por un lado, las proteínas, la capa de caseína y la fracción lipidica y la probamos en los
trofozoítos de Entamoeba histolytica, después de esto, probamos algunas de las proteínas de la fracción
proteica para ver si eran amebicidas, las identificamos por inmunoblot y finalmente estudiamos por
microscopia confocal el tipo de daños que causaban las proteínas de la leche a las amibas. En los
resultados encontramos que la leche humana y bovina, presentan actividad amebicida contra los
trofozoítos de Entamoeba histolytica. La fracción proteica de la leche fue la responsable de esta actividad
y en esta fracción estaban presentes las proteínas lisozima, IgA y lactoferrina. De todas ellas, la
lactoferrina fue la que presento mayor actividad amebicida, y al estudiar el modo de acción de estas
proteínas encontramos que, se unen a la membrana de los trofozoítos, la dañan y finalmente las células se
fragmentan. Todas estas actividades fueron dependientes de la ausencia de Hierro en el medio de cultivo,
indicando una posible participación del hierro en la resistencia de las amibas a ciertos agentes amebicidas.
Estos resultados muestran por primera vez que la lactoferrina, proteína de la leche y de otras secreciones,
tiene un amplio espectro microbicida y antitumorigeno, además, es el principal componente de la leche
materna que tiene actividad amebicida. Estos resultados nos obligan a orientar a las madres de lactar a los
bebes con el seno materno, para que estén protegidos de la amibiasis y probablemente también de otras
infecciones.
I. INTRODUCCIÓN
Entamoeba histolytica es un protozoario que parasita exclusivamente al ser humano y causa infecciones que llegan a
adquirir importancia clínica. La amibiasis ataca a personas de cualquier edad, siendo más frecuente en niños y
adultos jóvenes (Stauffer y Ravdin 2003). La amibiasis es más frecuente en regiones tropicales, con climas cálidos y
templados, pero más aún en áreas pobres y mal saneadas. En el ámbito mundial, está catalogada como la segunda
parasitosis causante de muerte. Se considera que alrededor del 10 al 20% de la población mundial está infectada y el
10% de ésta sufre la enfermedad, con una letalidad que oscila entre el 0.1 y 0.25%. E. histolytica se adquiere por
ingerir agua o alimentos contaminados con quistes, los cuales se transforman en el íleon terminal a trofozoítos
(Stanley 2001). Los trofozoítos se reproducen en abundancia y provocan la formación de abscesos que, al romperse,
descargan moco y sangre en el propio intestino. Esto provoca la licuación de las heces y genera diarrea que puede
ser sanguinolenta o mucoide. Puede haber diseminación de los trofozoítos por la corriente sanguínea y formar
abscesos en el hígado o, con menor frecuencia, en los pulmones o el cerebro (Martinez-Palomo 1987, EspinosaCantellano y Martinez-Palomo 2000, Stanley 2001). La amibiasis hepática es la causante de muerte en casi todos los
casos, cuando los pacientes no reciben tratamiento. A pesar de la importancia de la amibiasis como problema de
salud pública, se cuenta con un número reducido de medicamentos para el tratamiento de la disentería y del absceso
hepático amibianos, la mayoría de ellos con un margen terapéutico estrecho y con diversos efectos secundarios en el
paciente. De hecho, el metronidazol, el fármaco más frecuentemente usado para combatir la amibiasis, es tóxico y
mutagénico a las dosis recomendadas (Chacko et al. 1985, Dobias et al. 1994, el-Nahas y el-Ashmawy 2004). En
cuanto a la respuesta inmune del ser humano contra E. histolytica, se sabe que pueden estar participando los
componentes de la inmunidad innata y la adquirida (Asgharpour et al. 2005). Se ha visto la participación de las
células de la respuesta inmune y también de algunas proteínas, tales como IgA de leche humana y suero, tanto la no
inducida como la inducida (Gillin et al. 1983, Akisu et al. 2004), sin embargo no se sabe a ciencia cierta cuales son
los componentes de la leche responsables de la actividad amebicida.
La lactoferrina (Lf) es una proteína del sistema inmune innato que presenta actividad microbicida contra una gran
variedad de patógenos. Normalmente se encuentra en la forma libre de Fe a la que se conoce como apolactoferrina
(apoLf), y participa en la hipoferremia de la infección, proceso importante en la defensa del hospedero contra
invasiones por patógenos. La Lf se encuentra en secreciones de mucosas, en lágrimas, saliva etc. en calostro y leche
madura. En la leche hay una gran cantidad de Lf y forma parte importante de la inmunidad del recién nacido, puede
actuar en sinergismo con otros componentes de la leche materna tales como la inmunoglobulina A (IgA) y la
proteína lisozima, potenciando la capacidad microbicida contra una gran variedad de patógenos (Orsi, 2003).
Nuestro objetivo fue conocer el o los componentes de la leche humana con capacidad para inhibir el crecimiento de
los trofozoítos de E. histolytica in vitro.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Se usaron cultivos de Entamoeba histolytica cepa HM-1:IMSS, los cuales provenían del medio de Diamond (1968),
1X106 células se usaron para cada experimento y se incubaron en el medio de Diamond con o sin fierro (Fe), durante
1 h a 37ºC, con diferentes concentraciones de leche humana y bovina (5, 10, 15 y 20% adicionada al medio de
crecimiento) o con diferentes concentraciones de la leche fraccionada (20%, durante mas tiempo), ó bien con 1
mg/ml de apoLf, inmunoglobulina A (IgA), lisozima; solas o en combinación. La viabilidad se estimó usando el
criterio de exclusión del colorante azul de tripano, el cual solo tiñe células muertas.
Con el objetivo de ver el sitio blanco de apoLf, lisozima e IgA en amibas, los trofozoítos se fijaron y se incubaron
durante 30 min con una combinación de apoLf e IgA, o bien apoLf y lisozima (100 µg/ml de cada una). Para ver
daños en las células después del tratamiento con apoLf, IgA y lisozima (1 mg/ml durante 1 h), los trofozoítos se
incubaron previamente con 10 µg/ml de Rojo Nilo, colorante que tiñe lípidos en rojo y verde, las muestras se
procesaron para ser analizadas en un microscopio confocal.
2. RESULTADOS
Los trofozoítos de E. histolytica se incubaron con leche humana y bovina a diferentes concentraciones, y se observa
que cuando se añadió una concentración de 20% tanto la leche humana como la leche bovina presentaron actividad
amebicida ya que inhibieron el crecimiento de los trofozoítos (Figura 1A), el mismo experimento se llevó a cabo en
medio sin Fe y el efecto amebicida de la leche fue mejor (Figura 1B). Posteriormente la leche se ultracentrifugó para
obtener diferentes fracciones las cuales se adicionaron a los trofozoítos y en la figura 2 se observa que la fracción
proteíca presentó la actividad amebicida ya que la viabilidad disminuyó drásticamente, sobre todo en medio sin Fe
(Figura 2B). Se hicieron experimentos de inmunoblot de la fracción proteíca y se utilizaron anticuerpos contra Lf,
IgA y lisozima y en la figura 3 se observa que estos anticuerpos reconocen a estas proteínas en la fracción proteíca.
Posteriormente encontramos que estas proteínas presentaron actividad amebicida (Figura 4, panel A) y sobre todo en
medio sin Fe (figura 4, panel B). Finalmente en experimentos de microscopia confocal se observa que tanto la IgA
(Figura 5A, panel c, azul) colocalizó con la apoLf (panel b, verde) en color blanco en la membrana de las amibas
(panel d, blanco), indicando que pueden actuar al mismo nivel de reconocimiento y acción. También la lisozima
(panel g, azul), colocalizó con la apoLf (verde) en la membrana de las amibas (panel h). Posteriormente, en la Figura
5B, se observa que las células teñidas con Rojo Nilo (tiñe lípidos en rojo y verde), y cuando son tratadas con apoLf,
IgA y lisozima (paneles e, f, g y h) se dañan drásticamente en los primeros 30 min. de incubación, comparado con
las amibas del afigura 5ª, que no fueron tratadas con las proteínas (paneles a, b c y d). Todos estos resultados nos
sugieren que las amibas son afectadas por la leche, y que los componentes de la leche responsable de este efecto son
apoLf, IgA y lisozima, si bien no hay un efecto sinérgico de acción, si hay un efecto combinado en la actividad
amebicida de apoLf con IgA y lisozima. Estos datos nos sugieren que la apoLf es la principal molécula de la leche
con capacidad amebicida, y que actua junto con IgA y lisosima. Estas proteínas provocan daños a los trofozoitos
después de incubarlos con ellas. Todos estos efectos ocurren en medio sin Fe, sugiriendo una participación de este
metal en la resistencia de las amibas a los componentes amebicidas, como se ha reportado para otros agentes
infecciosos (Weimberg, 1999).
Figura 1. Efecto amebicida de leche humana y bovina. Trofozoítos (1X106) se incubaron en medio con Fe (A) o
sin Fe (B) y con diferentes concentraciones de leche humana y bovina (1, 5, 10 Y 20%) durante 1 h a 37ºC.
Posteriormente las células se lavaron y se midió su viabilidad usando el criterio de exclusión de los colorantes,
yoduro de propidio y azul de tripano. Los experimentos se hicieron al menos tres veces por triplicado, la media fue
calculada y también la desviación estándar.
Figura 2. Efecto amebicida de la fracción enriquecida en proteínas de leche humana. Trofozoítos (1X106) se
incubaron en medio con o sin Fe y con diferentes fracciones de leche humana (10%) obtenidas por
ultracentrifugación, durante 1 h a 37ºC. Posteriormente las células se lavaron y se midió su viabilidad usando el
criterio de exclusión de los colorantes, yoduro de propidio y azul de tripano. Los experimentos se hicieron al menos
tres veces por triplicado, la media fue calculada y también la desviación estándar.
Figura 4. Identificación de proteínas microbicidas en la fracción proteica de la leche humana. Las proteínas de
la fracción proteica de la leche humana (30 μg) se separaron en gel de poliacrilamida al 12% (A) y después se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (B). Después, la membrana se bloqueó y después se incubó con Abs
específicos para IgA, Lf y Lisozima. Posteriormente, se usaron anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa se
rábano. La reacción de color se reveló usando la técnica de la diaminobencidina.
Figura 4. Las proteínas de la fracción proteica de la lecha son amebicidas y actúan en combinación.
Trofozoítos (1X106), Se incubaron con 1 mg/ml de apoLf, inmunoglobulina A y lisozima, en medio con o sin Fe,
sólas o combinadas durante 3 h a 37ºC. Posteriormente a las células se les midió su viabilidad usando el criterio de
exclusión de los colorantes, yoduro de propidio y azul de tripano. En todos los casos se calculó la media y la
desviación estándar.
Figura 5. Las proteínas de leche materna pueden actuar solas o con apolactoferrina (apoLf), además
combinadas lisan a las células en poco tiempo. A. Trofozoítos (1X105) se incubaron con 100 μM de apoLf-FITC
(paneles b y f, verde), o con 100 μg/ml de IgA (panel c) o lisozima (panel g), en medio sin Fe durante 3 h a 37ºC.
Posteriormente, las muestras se fijaron y se usaron Abs para detectar a IgA y Lisozima, y para inmunodetectar a cada
una de las proteínas se usaron Abs secundarios acoplados a Cy5. B. Trofozoítos (1X105) se depositaron en medio sin
Fe y en presencia de rojo Nilo (RN) para teñir los lípidos durante 30 min a 37ºC. Se puede ver el patrón de
distribución y la integridad celular en los paneles (a, b. c y d), no así cuando después los trofozoítos se incubaron con
1 mg/ml de apoLf, IgA y lisozima durante 20 min. En ambos casos, las células se fijaron y procesaron para ser
analizadas mediante microscopía confocal. Barra, 10 μm.
4. DISCUSION
En este trabajo identificamos los componentes de la leche con actividad amebicida. Ya se había publicado la
actividad amebicida de leche humana, y se pensaba en la IgA inducida como responsable de esta actividad. Sin
embargo, nuestro trabajo concuerda con otros, hechos en bacterias donde han reportado la acción de IgA y lisozima
junto con apoLf como antimicrobiano. Esta combinación de moléculas microbicidas y estimuladores de la respuesta
inmune hacen a la leche materna el alimento de elección para los infantes. Con los datos anteriores suponemos que la
apoLf es un componente inmune que actúa en contra de E. histolytica bajo ciertas condiciones, y tiene varios
mecanismos para ejercer su efecto. Entre los mecanismos pudieran estar la liberación de colesterol, el cual mantiene
la forma e integridad de la membrana del parásito, lo que permitiría que la apoLf gane acceso a las cargas negativas
de los fosfolípidos, generando huecos en la membrana plasmática de los trofozoítos, llevando a la entrada de agua y
al estallamiento de la amiba. Sin embargo, aparte de todo este efecto que puede ocurrir por interacción directa de
apoLf y el péptido Lfcin B con los trofozoítos, la IgA y la lisozima también pudieran estar actuando conjuntamente
con apoLf en contra de la amiba in vivo, la suma del efecto de los diferentes mecanismos hace más efectiva la
actividad amebicida, y esta acción combinada es muy atractiva como terapia. Por otro lado, estos mismos
componentes de la leche pudieran usarse en combinación con metronidazol con el objetivo de disminuir los efectos
tóxicos y mutagénicos de ese fármaco a las dosis usadas en pacientes. Lo único que se tiene que tomar en cuenta es
el estado de saturación de la Lf y la concentración de Fe libre que pudiese haber en cada uno de los sitios donde E.
histolytica esta colonizando dentro del organismo humano. ApoLf tiene actividad de serina y cisteína proteasa, por lo
que sería interesante comprobar si estas actividades las desarrolla en el bloqueo de algunos componentes implicados
en la adherencia y colonización de E. histolytica. En síntesis, apoLf podría ser probada contra la amibiasis, teniendo
la ventaja de ser un compuesto del sistema inmune, que no es tóxico, sino benéfico por su actividad
inmunoestimuladora y que ya ha sido validado en tratamientos en pacientes, tanto contra otros agentes infecciosos,
como en cáncer.
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