Solutions for the Analysis of Dioxins and 3

Soluciones para el análisis de Dioxinas y 3MCPD
Javier Rodríguez
Sevilla, 29 de septiembre de 2015
The world leader in serving science
Análisis de Dioxinas
• Entre los compuestos más tóxicos que existen. 70.000 veces más que el
Cianuro.
• Subproductos de procesos industriales, como combustiones con Cl y
aromáticos.
• Solubles en las grasas y se acumulan en tejido adiposo de los animales
• Se mide como TEQ o cantidad equivalente de toxicidad o la cantidad de
2,3,7,8-TCDD necesaria para producir la misma toxicidad
2
Extracción automatizada con FMS PLS+PowerPrep+PowerVap
3
Alternativas con nuestro Thermo ScientificTM ASETM 350 y Kit
SP3 ST de Cape Tech.
4
Thermo Scientific™ DFS™ Magnetic Sector GC-HRMS:
Patrón oro para medir Dioxinas
GC-HRMS sector magnético DFS– diseñado para Dioxinas *
* o cualquier otro compuesto
5
que requiera la más alta sensibilidad
DFS GC-HRMS: Patrón
oro para medir Dioxinas
10.83
100
95
90
85
¿Especificaciones?
80
75
70
Relative Abundance
65
60
55
50
45
40
35
30
Sensibilidad < 20 fg TCDD
25
20
15
10
5
7.59 7.68
7.92
8.13 8.40 8.47 8.78
8.81
9.09 9.26 9.33 9.63 9.74
10.04
10.29
10.53
10.91 11.09
11.26
11.60
0
7.5
6
8.0
8.5
9.0
9.5
Time (min)
10.0
10.5
11.0
11.5
DFS GC-HRMS: Patrón
oro para Dioxinas
10.83
100
95
90
85
¿Especificaciones?
¡Esta es la nuestra!
80
75
70
Relative Abundance
65
60
55
50
45
40
35
30
Sensibilidad – 20 fg TCDD
25
20
15
10
5
7.59 7.68
7.92
8.13 8.40 8.47 8.78
8.81
9.09 9.26 9.33 9.63 9.74
10.04
10.29
10.53
10.91 11.09
11.26
11.60
0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
Time (min)
10.0
10.5
11.0
11.5
GC-HRMS sector magnéticoThermo Scientific DFS :
 El MS preferido para confirmación en España y en todo el mundo:
• probado y establecido en análisis de Dioxinas…………...¡¡más de 10 años !!
• complimiento de TODOS los métodos oficiales………….en todo el mundo
• sensible, robusto, máxima confianza en identificación...maxima fiabilidad
• larga vida operativa a máximas prestaciones
7
¿Porque es el método de referencia para Dioxinas y PCBs?
• Sensibilidad
• Cumplimiento de todas las
normativas mundiales
• La mejor especificación en Dioxinas
• e.g. 40% mejores que QQQ
• Dioxinas, PCBs, BDEs
• EPA 1613,1668,1614 y otras
• Masa exacta, uso PFK, lockmass
trace etc.
• Por Referencias
• Laboratorio publicos y privados
Dioxinas en todo el mundo etan
equipados con cientos de HRMS
(MAT95 & DFS)
• Literatura científica: muchos
trabajos en Dioxinas y POPs con
DFS
8
• Apuesta segura
• GC-HRMS desde hace 3 decadas
obtiene los mejores resultados en
Dioxinas en tests round robin test
(MAT95 & DFS)
• Unica configuración Dual GC para
confirmación con 2 columnas distintas
• Especificaciones del análisis
• Mejores ratios, linealidad, precisión, etc
combinados con robustez y larga vida
de la instrumentación
Alternativas con nueva normativa Europea: Triple Cuadrupolo
• El triple cuadrupolo GC-MS Thermo Scientific™ TSQ 8000™ Evo fue
empleado para detectar y confirmar niveles traza de PCDD/Fs en extractos de
muestras, segun las nuevas normativas EU Commission Regulation 589/2014 y
la reciente Regulation No. 709/2014 para screening y confirmación
• Se pesenta una validación exhaustiva del TSQ 8000 Evo GC-MS/MS para
confirmación de dioxinas.
• Se comprobó la sensitibilidad, linealidad, chromatografia, LOD/LOQs y la
precisión de las medidas.
• Los datos adquiridos con GC-MS/MS se han comparado con los datos
adquiridos con GC-HRMS para las mismas muestras y se comprobaron las
incertidumbres.
9
Experimental
DFS GC-HRMS
10
Thermo ScientificTM TSQTM 8000 Evo GC-MS
• Sistema GC-MS de triple cuadrupolo avanzado de ultima tecnologia presentado en
ASMS 2014
• Celda de colisión rápida con opticas de alta velocidad con tecnologia EvoCell para
obtener velocidad rápidas de transiciones SRM, alta precisión y alta sensibilidad
• Fuente de iones ExtractaBrite™ calefactada para trabajar con matrices sucias
• Fuente de iones totalmente extraible, calefactada, y bajo vacío. Cuando es
necesario limpiarla o cambiar un repuesto se extrae sin romper vacio.
11
Condiciones GC & MS
GC
Thermo Scientific™ TRACE™ 1310 GC Parameters
Column
Injection Volume (mL):
Liner
Inlet (°C):
Inlet Module and Mode:
Carrier Gas, (mL/min):
Oven Temperature Program time (min):
TG-5 SIL MS, 60 m x 0.25 x 0.25
2
SSL single taper 4mm ID 78.5mm
260
splitless
He, 1.2
33
MS
TSQ 8000 Evo Mass Spectrometer Parameters
Transfer line (°C):
280
Ionization type:
EI
Ion source(°C):
300
Electron energy (eV):
40
Acquisition Mode:
SRM
Q1 Peak Width (AMU):
0.7
Q3 Peak Width (AMU):
0.7
12
DFS Mass Spectrometer Parameters
Muestras
• Muestras en matriz (previamente analizadas en un equipo GC-HRMS) proporcionadas por el EU-RL,
Freiburg
• Muestras elegidas estaban naturalmente contaminadas con niveles bajos de PCDD/Fs.
• Comprobado y validado los LOQs en matriz asi como los controles de precisión para el contenido total
de dioxina a niveles bajos.
Mixed animal fat
Fish meal
Egg fat 11
Egg fat 2
Weighted sample:
Lipid content [%]:
Moisture content [%]:
Final volume:
2378 TCDF
12378 PCDF
23478-PCDF
123478 HxCDF
123678 HxCDF
234678 HxCDF
123789 HxCDF
1234678 HpCDF
1234789 HpCDF
OCDF
2378 TCDD
12378 PCDD
123478 HxCDD
123678 HxCDD
123789 HxCDD
1234678 HpCDD
OCDD
1234-TCDD
10.0 g fat
60.2 g sample (= 10.0 g fat)
n/a
16.6
n/a
5.3
40 µl
40 µl
13C Internal standard
13C Internal standard
50
50
50
50
200
200
100
100
100
100
50
50
50
50
100
100
50
50
100
100
50
50
100
100
100
100
200
200
50
50
200
200
600
600
13C Recovery standard 13C Recovery standard
50
50
0.52 g fat
n/a
n/a
10 µl
13C Internal standard
10
10
40
20
20
10
10
20
10
20
10
20
20
40
10
40
120
13C Recovery standard
10
0.51 g fat
n/a
n/a
10 µl
13C Internal standard
10
10
40
20
20
10
10
20
10
20
10
20
20
40
10
40
120
13C Recovery standard
10
• Extracción y Clean-up de acuerdo con los metodos existentes para alimentos y piensos ya sea
automaticamente (PowerPrep™ SPE) o parte automático parte manual (GPC, multi-capa silica,
Florisil®, carbon).
13
Adquisición de y Procesado de Datos
• Datos adquiridos mediante Monitorización de la Reacción Seleccionada por
ventanas de tiempo (timed-SRM) en Triple Cuadrupolo o Mediante timed-SIM en
Alta resolución.
• Se adquieren un mínimo de 12 puntos cromatográficos por pico.
• El procesado de datos se realiza con el programa
Thermo Scientific™ TargetQuan 3.1.
• El programa realiza automáticamente los cálculos
para convertir la concentración cálculada a partir de
las curvas de calibración de cada compuesto en
TEQ y los chequeos de control exigibles segun norma
14
Test Sensibilidad: patrones crecientes
• Superposición de cromatogramas SRM (ion cuant.) de 6 congéneres TCDD en cada
nivel de concentración.
• Concentraciones representadas como cantidad absoluta en columna.
RT: 13.37 - 14.94
SM: 3B
14.78
100
95
1
2
3
4
5
6
7
8
10 fg
3129
3045
3047
2637
2678
2964
2828
2699
25 fg
7011
6209
7055
7440
6376
6513
6931
6579
mean
STDEV
% RSD
2878.4
192.5
6.7
6764.3
411.7
6.1
90
85
80
75
70
65
60
Concentration
100 fg
250 fg
25940
60219
25998
59108
27425
58262
25734
59335
27805
58583
27097
58902
26347
59936
25033
55519
Inj. No.
26422.4
940.7
3.6
58733.0
1452.1
2.5
500 fg
87635
85789
87578
87079
83897
85373
86844
79471
1000 fg
239216
240162
237274
233655
234470
238554
242740
232038
85458.3
2730.3
3.2
237263.6
3625.3
1.5
NL: 8.47E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_11
NL: 8.33E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_03
NL: 8.49E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_05
NL: 8.25E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_06
NL: 8.35E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_07
NL: 8.38E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_08
NL: 8.53E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_09
NL: 8.48E4
TIC F: + c EI SRM ms2
[email protected]
[258.925-258.935] MS
19May2014_10
2378-TCDD
1000 fg
IR % = 4
55
50
1234-TCDD
500 fg
IR % = 11
45
40
14.56 14.57
1478-TCDD
250 fg
IR % = 6
35
30
14.30
25
1378-TCDD
100 fg
IR % = 7
20
15
1379-TCDD
25 fg
IR % = 6
1368-TCDD
10 fg
IR % = 9
10
5
13.52 13.53
13.65
15
13.5
13.6
14.38 14.41
13.76
0
13.4
14.15
13.7
13.8
13.9
14.0
14.1
14.2
Time (min)
14.3
14.4
14.86
14.67
14.5
14.6
14.7
14.8
14.9
DETERMINACION DE DIOXINS EN
EXTRACTOS DE MUESTRA
16
Chromatografia y Selectividad 2,3,7,8-TCDD en extractos
Alimento peces
95 fg
17
Mezcla grasa animal
98 fg
huevo
28 fg
Comparación con GC-HRMS
18
Ratios iónicos: IR muestra de huevo vs. IR Teórico
19
Mezcla de grasas animales: Precisión del contenido total de
Dioxina (n=13)
Obtener estimaciones válidas de las concentraciones de
PCDD/Fs en los extractos es crítico.
20
Esquema análisis de Dioxinas y PCBs
21
Conclusiones
• Excelente sensibilidad para ambas técnicas
(ex: 28 fg 2378-TCDD absolutos on column QQQ y < 20 fg GC-HRMS)
• Mayor selectividad en Alta Resolución y Masa Exacta además del análisis con
dos columnas ( 2 GC) de diferente selctividad en DFS para confirmar positivos
• Medidas de Precisión para el contenido total de dioxinas (WHO-PCDD/F-TEQ-ub)
para dos niveles de muestras contaminadas (pienso y grasa animal) obtuvieron
valores de %RSD <6% (n=13). Desviación del contenido total de dioxina en QQQ
del dato analizado con GC-HRMS dentro del ±20% para todas las matrices y
muestras.
• El triple cuadrupolo TSQ 8000 Evo es un sistema sensible y robusto adecuado
para la cuantificación a bajos niveles de dioxinas y furanos en alimentos y
piensos. Confirmación negativos ( muestras nivel < limite máximo)
• El GC HRMS DFS es el instrumento oficial de confirmación. (> limite máximo)
22
DETERMINACION DE 3-MCPD EN
ACEITES Y GRASAS
23
2 MCPD, 3 MCPD y Glicidol: derivados del Glicerol
MRL 3-MCPD libre:
20 µg/kg
Glicidol es
cancerígeno y
mutagénico
Se producen en refinado (desodorización a alta temperatura). Casi todos los
aceites y grasa refinados los contienen. Forman esteres con los ácidos grasos
y se liberan con la digestión de la comida
24
Alternativas analíticas: Analisis directo o indirecto
Análisis directo: análisis de todos los ésteres originales
Eliminación de matriz: GPC, SPE
LC-MS/MS QQQ ó
LC-MS/MS HRMS
(Orbitrap)
El cromatograma muestra >27 analitos
25
Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of
Lipids / June 20-21 2013 / Het Pand, Ghent,
Belgium
Analisis directo: desafío cromatográfico
Tanto mono como di-esteres no se separan isómeros por LC y la respuesta
MS es muy diferente de un isómero a otro. P ej 2 palmitoil 3-MCPD es 40%
menos que 1 palmitoil 3-MCPD
Riesgo de no contar con 3-MCPD libre NESTLE M. Dubois; Oral presentation AOCS Annual Meeting 2011,
Cincinnati, Ohio
26
Analisis indirecto: cromatografia sencilla. Mayor preparación
Aceite vegetal hipotético 3
acidos grasos relevantes
Rotura del ester:
alcalina/ácida/enzimática 3 min – 16 h
Matriz: extr liq/liq
Derivatización:
p.ej.
HFBA/Acetona/PBA
GC-MS/MS
Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of Lipids / June 20-21 2013
/ Het Pand, Ghent, Belgium
27
Cromatograma muestra tres
analitos. LOQ de 0,05 a 0,25
mg/kg
Ventajas/desventajas del método indirecto
• Solo 3 compuestos de referencia (patrón y patrón interno)
• Eliminación de matriz e instrumentación menos sofisticada / costosa
• Menos riesgos de subestimar MCPD libre
• Separación cromatográfica sencilla
• Reacciones químicas isomerización o transformación de los analitos.
MCPD glicidol o formación de artefactos
• Derivatización para el análisis por GC
Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of Lipids / June 20-21 2013
/ Het Pand, Ghent, Belgium
28
Solución para uso en rutina para análisis de 3-MCPD
Metodo AOAC: preparación de muestra con cromatografia
FLASH, concentración en rotavapor y derivatización
liquido/liquido
Thermo Scientific: QuEChERS modificado, concentración y
derivatización
Thermo Scientific™ TriPlus RSH™ Autosampler
Sampling volume : 1.0mL
Thermo Scientific™ Trace ™ GC
Column : Thermo Scientific™ TraceGOLD TG-5MS 15 m × 0.25 mm I.D. df = 0.25mm
(Thermo Scientific p/n 26-098-1300)
Injection mode : PTV 2.0mm I.D. Siltek Baffled liner
Injection program : 250℃ Splitless (1.0 min.) Split Flow 50ml/min. Cleaning Temp. 300℃
for 2.0 min. Solvent Valve Temp. 120℃
Oven Temp : 50℃(1 min)→40℃/min→250℃(1min) Equilibration time 0.5min.
Flow : Constant flow 1.5 ml/min. Transfer line Temp : 280℃
Mass Spectrometer: Thermo Scientific™ TSQ Quantum ™ XLS
Ion Source Temp. : 250℃
Emission Current : 50uA
Detector Gain : 3.0×105
Ionization mode : EI
Analytical mode : SRM Q1 and Q3 at 1.0u
Evaldo de Armas. Pittcon 2012 Thermo Fisher Scientific
29
Solución para uso en rutina para análisis de 3-MCPD
30
Nadie es perfecto: no hay método perfecto
Metodos directos:
Faltan sustancias de referencia/ int std. Aplicación dificil por esto para esteres
de ac. Grasos poliinsaturados (Oliva, aceite de pescado)
Algunas grasas y emulsificadores dificiles de pasar por SPE
Separación cromatográfica
Solución: mejoras en método, Instrumentación más sofisticada
Metodos indirectos:
La neutralización o la transesterificación dificulta aplicación a muestras ácidas.
P ej. Ac grasos libres. Solución añadir más concentración de reactivo para
romper el ester.
31
Conclusiones análisis 3-MCPD
•Estudios interlaboratorio encargados por la Comisión Europea en 2013
concluyen que los laboratorios prefieren el método indirecto para el análisis en
rutina
•Los métodos directos e indirectos actuales muestran similares resultados en
aceites simples y grasas
•Estan apareciendo nuevos métodos que deben ser evaluados y verificar sus
resultados en distintas matrices: análisis directo por GC-HRMS, la separación
enzimática del ester, pretratamiento acido para convertir los esteres glicidicos en
esteres de MBPD
Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of Lipids / June 20-21 2013
/ Het Pand, Ghent, Belgium
32