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Validación de la hibridación de ácidos nucleicos múltiple
quimioluminiscente en la detección de viroides de cítricos y su aplicación
en áreas citrícolas de Cuba.
Autores: K. Velázquez¹, J. M. Pérez¹, L. Batista¹, E. López¹, S. Yepe¹, J. Cueto 1, M.
Alvarez¹, R. Pérez¹, D. Rodríguez¹, I. Peña 1 y N. Duran-Vila².
¹Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Playa. C. Habana. Cuba. C.P
11300.
²Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. Valencia. España. C.P 46113.
Resumen
Los viroides en los cítricos son causantes de dos enfermedades de importancia
económica, la exocortis y la cachexia. Las pérdidas en este cultivo dependerán
entre otros factores, de las especies de viroides presentes, así como de los
patrones y cultivares empleados. Debido a esto, resulta necesario disponer de
técnicas de diagnóstico confiables que garanticen la calidad de la certificación
del material de propagación. En este trabajo se validó la hibridación de ácidos
nucleicos quimioluminiscente para la detección simultánea de todos los viroides
identificados en los cítricos. Se determinó que los porcentajes de eficacia,
sensibilidad, especificidad, repetibilidad y reproducibilidad fueron superiores al
97%. La aplicación de dicha técnica en la detección de viroides permitió
determinar que el Banco de Germoplasma y los viveros multiplicadores se
encontraron libres de viroides, lo que confirma la calidad del sistema de
producción de material de propagación certificado. Sin embargo, en áreas
citrícolas se detectó la presencia de viroides, con porcentajes de plantas
infectadas entre 10 y 37.5%.
Palabras claves: cítricos, viroide, NASH y quimioluminiscente.
Introducción
Los viroides son los fitopatógenos más pequeños que existen, compuestos
únicamente por una molécula de ácido ribonucleico (ARN) de pequeño tamaño,
que carece de proteína de cubierta (Flores et al., 1998). En cítricos se ha
informado la presencia de cinco especies de viroides, que han sido catalogadas
según sus propiedades biológicas y moleculares. De ellas, el viroide de la
exocortis de los cítricos (CEVd) y variantes específicas de cítricos (variantes tipo
CVd IIb) del viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) son responsables de las
enfermedades exocortis y cachexia de los cítricos, respectivamente. Otra variante
del HSVd (variante tipo CVd IIa), el viroide de la hoja curvada de los cítricos
(CBLVd), el viroide enanizante de los cítricos (CDVd) y el viroide IV de los
cítricos (CVd IV) se asocian a efectos enanizantes en combinaciones sensibles
(Duran-Vila, 2000). Posteriormente, se informó en Japón un nuevo viroide al que
se le denominó CVd-OS (Viroide de los cítricos original sample) (Ito et al., 2001).
En la mayoría de las áreas citrícolas del mundo, las pérdidas económicas debido
a viroides no han sido muy importantes ya que la citricultura se ha basado
mayoritariamente en el empleo del patrón naranjo agrio (Citrus aurantium L.), que
es tolerante a los viroides. Sin embargo, luego de la aparición de la tristeza de los
cítricos, muchos países han reemplazado este patrón, por otros que, si bien
toleran a esta enfermedad, algunos resultan sensibles a los viroides. Esto ha
ocasionado pérdidas considerables en varios países, como Belice y Venezuela
debido al establecimiento de plantaciones con material no certificado
contaminado con viroides (Ochoa et al., 1995; Roistacher et al., 1996). En Cuba a
finales de los años 70 fueron afectadas plantaciones establecidas con yemas
infectadas con viroides sobre los patrones citrange Troyer y Carrizo (Poncirus
trifoliata x Citrus sinensis L. (Obs.)) (del Valle et al., 1978). Para evitar estas
pérdidas, resulta imprescindible disponer de técnicas de diagnóstico rápidas,
sensibles y confiables en los sistemas de producción de material de propagación
certificado de cítricos. Por tal motivo en el presente trabajo se validó la
hibridación de ácidos nucleicos múltiple para la detección de viroides en áreas
citrícolas de Cuba.
Materiales y Métodos
Determinación de los parámetros de desempeño de la NASH.
Las evaluaciones se realizaron utilizando mezclas de las sondas
correspondientes a cinco especies de viroides de cítricos (CEVd, CBLVd, HSVd,
CDVd y CVd IV) (Palacio et al., 1999). Los indicadores de desempeño se
determinaron siguiendo la metodología de Peralta y Villoch, (1999).
Controles de plantas sanas e infectadas.
Se utilizaron 135 controles negativos, que incluyeron plantas de cidro sanas e
infectadas con el virus de la psorosis de los cítricos (CPsV), virus de la tristeza
de los cítricos (CTV), Concave Gum, así como extractos de ARN del viroide de la
mancha soleada del aguacate (ASBVd), el viroide del enanismo del crisantemo
(CSVd) y el viroide del tubérculo ahusado de la papa (PSTVd). La confirmación
de la presencia del CTV y CPsV se determinó mediante ensayos
inmunoenzimáticos ELIS A-DASI con el empleo de anticuerpos específicos para
cada patógeno (Alioto et al., 1999; Batista, 2001). Mientras que la presencia de
Concave gum se determinó por ensayos biológicos en naranjo dulce Pineapple
(Citrus sinensis Obs.) (Pérez y Vega, 1986) y o
l s viroides mediante sPAGE
(Rivera-Bustamante et al., 1986).
Los 200 controles positivos comprendían 189 plantas de cidro Etrog Arizona 861
S1 injertados sobre el patrón Citrus volkameriana o citrange Troyer, de ellas 126
fueron inoculadas con aislados de composición de viroides conocida y el resto
con muestras procedentes de árboles de campo infectados. La presencia de
viroides en los controles se determinó mediante síntomas en cidro y análisis de
los ácidos nucleicos por sPAGE. Además, se incluyeron 11 plásmidos con la
secuencia completa de cada especie de viroide, comprobada por secuenciación.
Purificación de ácidos nucleicos.
La extracción de los ácidos nucleicos totales se realizó según el procedimiento
de Semancik et al. (1975).
Hibridación de ácidos nucleicos.
El procedimiento de hibridación de ácidos nucleicos utilizado fue el descrito por
Palacio et al. (1999).
Estimación preliminar de la repetibilidad.
Se realizaron dos ensayos en días diferentes, donde se analizaron 13 controles
infectados y seis controles no infectados replicados tres veces en cada
membrana. Se determinó la densidad óptica (DO) de la señal de cada muestra
con el programa Molecular AnalystTM, Versión 1.4.1, Biorad Laboratories 19921995. Los valores de DO obtenidos se analizaron mediante un análisis de
varianza para la comparación de medias (ANOVA) empleando el paquete
estadístico SPSS (Statistical Package for Social Science, versión 9.0, 1998) y se
determinaron los coeficientes de variación (Netter et al., 1996).
Se evaluó además la distribución de los viroides en las plantas para analizar su
influencia en la repetibilidad. Para ello se muestrearon 6 plantas infectadas y se
tomaron de cuatro a cinco ramas en cada una. En todos los casos la muestra de
una de las ramas estaba compuesta exclusivamente por hojas, otra sólo por
corteza y el resto contenían corteza y hojas. Las muestras fueron evaluadas por
NASH individualmente y se replicaron dos veces en cada ensayo.
Determinación de la sensibilidad analítica.
Se utilizaron cinco extractos purificados a partir de cidros infectados, uno por
cada especie de viroide independiente, así como uno con la mezcla de todas
ellas y uno no infectado. Se emplearon extractos de ácidos nucleicos puros y
diluidos siete veces hasta 5x10-4 y de cada dilución se realizaron dos
repeticiones en dos membranas. Se midió la DO de la señal obtenida para cada
muestra con el programa Molecular AnalystTM. Se analizó la normalidad de los
datos mediante un gráfico de percentiles de los residuos con respecto a la
distribución normal, se realizó un análisis de varianza de clasificación simple y se
aplicó el método de comparaciones múltiples HSD-Tukey para determinar la
última dilución que mostró diferencias significativas con el control negativo
mediante el programa Stadistica 5.1. Además, se realizaron curvas de mejor
ajuste mediante un análisis de regresión.
Especificidad analítica.
Se evaluó la posible reacción cruzada de las sondas con otros patógenos
empleando en el análisis plantas de cidro infectadas con el CPsV, concave gum
y el CTV, así como extractos de ARN del PSTVd, ABSVd y del CSVd, replicados
dos veces en una membrana.
Precisión del ensayo.
Para evaluar la repetibilidad se realizó un ensayo donde se analizaron 12
controles de plantas infectadas con viroides y uno no infectado, replicados dos
veces en la membrana. Los extractos se analizaron en dos ensayos realizados en
días diferentes. Se evaluó la reproducibilidad en dos ensayos realizados por
laboratorios y operarios diferentes. Para ello, se analizaron 11 controles de
plantas infectadas, así como cinco controles negativos, replicados tres veces por
membrana. Se midió la DO de la señal con el programa Molecular AnalystTM, los
valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante un ANOVA
utilizando el paquete estadístico SPSS y se determinaron los coeficientes de
variación (Netter, et al., 1996).
Parámetros de desempeño.
Se determinaron los indicadores de validación propuestos por Peralta y Villoch
(1999). Se realizaron análisis independientes para los resultados obtenidos con
la población (todos los controles), las especies de viroides individuales y las
combinaciones presentes en los aislados. En los cálculos de los indicadores se
emplearon las siguientes fórmulas:
w
w
w
w
w
Sensibilidad diagnóstica: D-SN=Vp/(Vp+Fn).
Especificidad diagnóstica: D-SP=Vn/(Vn+Fp).
Eficacia: E=Vp+Vn/(Vp+Vn+Fp+Fn).
Valor predicitivo de positividad: Vpp=Vp/(Vp+Fp).
Valor predicitivo de negatividad: Vpn=Vn/(Vn+Fn).
Donde Vp: Verdaderos positivos, Vn: Verdaderos negativos, Fp: Falsos positivos, Fn:
Falsos negativos.
Determinación de la presencia de viroides en áreas citrícolas de Cuba.
Se realizó un muestreo para la detección de viroides en siete empresas citrícolas
del país. Para ello se seleccionó un cuadrante de 400 plantas de un campo de
cada empresa y se muestreó al azar el 10% de los árboles. Se analizaron
además, el 100% de los cultivares cítricos de la colección de variedades de la
Estación de Jagüey Grande y el Banco de Germoplasma Protegido del IIFT,
ubicado en la Estación de Alquízar, así como el 10 % de las diferentes variedades
presentes en los viveros multiplicadores de las empresas Cítricos Ceiba,
Troncoso, Victoria de Girón y la Estación de Alquízar. En la Tabla 1 se muestran
datos de las áreas evaluadas.
Tabla 1. Descripción de las áreas citrícolas analizadas.
Empresa
Cítricos Ceiba
Patrón
naranjo agrio
Variedad
pomelo Ruby Red (Citrus paradisi Macf.)
Guane
Jesús Montané
UCTB Alquízar
(Germoplasma)
UCTB Jagüey Grande
(Colección)
Cítricos Ciego
América Libre
Arimao
Victoria de Girón
naranjo agrio
citrange Carrizo
Varios
pomelo Marsh
naranjo Valencia 121 (Citrus sinensis (L.))
Varios
Varios
Varios
naranjo agrio
naranjo agrio
citrange Troyer
citrange Carrizo
naranjo Olinda
limero Persa (Citrus limonia Osb.)
naranjo Valencia 121
naranjo Valencia
Vivero multiplicador
Victoria de Girón
Vivero multiplicador
Cítricos Ceiba
Vivero multiplicador
Enrique Troncoso
Vivero multiplicador
UCTB Alquízar
Citrus volkameriana naranjo Valencia criolla y Olinda Valencia,
pomelo Ruby Red y Marsh Jibarito, Limero
Persa
Citrus volkameriana naranjo Valencia Criolla, 121 y Olinda
Valencia
Citrus volkameriana naranjo Valencia 121
Citrus volkameriana naranjo Valencia criolla, 121, ENMC 27,
pomelo Henderson, Ruby Mejorado
En los viveros multiplicadores se injertaron yemas certificadas de cidro en dos
plantas de cada variedad cítrica. En el caso de los árboles de campo y
colecciones se inocularon en plantas de cidro Etrog Arizona 861 S1, injertado
sobre el patrón Citrus volkameriana. A los tres meses después de su inoculación
estas plantas se purificaron según el procedimiento de Semancik et al. (1975).
Los extractos de ácido nucleicos obtenidos se analizaron mediante NASH
múltiple y los que resultaron positivos con la mezcla de sondas fueron analizados
con sondas específicas para cada especie de viroide (Palacio et al., 1999). La
presencia de viroides se determinó teniendo en cuenta el porcentaje de plantas
de cidro positivas detectadas con respecto al total de las analizadas.
Resultados y Discusión
Estimación preliminar de la repetibilidad.
Los resultados obtenidos en los ensayos realizados para determinar la
repetibilidad intra e intermembrana de los diferentes controles se muestran en la
Figura 1. Como se aprecia, por la longitud de las cajas, en general se observó
poca variabilidad, que fue ligeramente superior el día 2. Además, al comparar los
coeficientes de variación que se muestran en la Tabla 2 se observó que las
réplicas del mismo día mostraron valores menores al 10% para todos los
controles y en días diferentes inferiores al 20%. Estos límites se encuentran dentro
de los establecidos por Jacobson (1996), por lo que los valores obtenidos en este
ensayo indican que la técnica presenta una buena repetibilidad. Esta alta
concordancia de los análisis de hibridación ya había sido planteada por González
et al. (2001) al validar la NASH para la detección de PSTVd.
70
60
50
40
30
DIA
P/N
20
1
10
2
N=
3 3
1
3 3 3 3
2
3
3 3
3 3
3 3
3 3
3 3
4
5
6
7
8
3 3 3 3
9
10
3 3
3 3
3 3
11
12
13
CONTROLES POSITIVOS
Figura 1. Evaluación de la repetibilidad preliminar de la NASH múltiple con 13
controles positivos en días diferentes. Los resultados están expresados como
relaciones positivo/negativo.
Tabla 2. Resultados de la evaluación de la repetibilidad preliminar de la NASH
múltiple en días diferentes.
Control
Día 1
Día 2
Media
S
CV
Media
S
P/N
P/N
E-L-1 151
26.76
2.38 8.88
22.92
1.74
E-9 195
16.50
0.09 0.55
13.45
0.69
E-1036 178
56.95
1.27 2.23
51.61
0.71
E-937 169
29.04
0.96 3.31
25.91
1.99
E-937 141
66.95
1.38 2.06
52.56
0.33
E-937 173
25.09
0.27 1.08
20.20
1.94
Cl 14-24 144
46.62
0.83 1.79
37.15
0.52
Cl 14-24 21
15.49
0.33 2.11
14.07
0.03
E-1036-T-I.4
67.88
1.32 1.95
53.71
0.69
Val 18-15 18
27.78
0.09 0.33
24.04
0.16
E-937 149
23.31
0.11 0.47
22.06
0.04
E-9 196
53.86
2.01 3.74
42.64
0.56
E-937 172
45.29
0.27 0.60
35.86
0.85
S: Desviación estándar.
CV: Coeficiente de variación.
P/N: Relación positivo/negativo.
CV
7.60
5.16
1.37
7.68
0.62
9.59
1.41
0.19
1.29
0.65
0.18
1.32
2.37
Días 1 y 2
Media P/N
S
24.84
14.98
54.28
27.47
59.76
22.65
41.88
14.78
60.80
25.91
22.69
48.25
40.58
2.72
2.15
3.77
2.21
10.17
3.45
6.69
1.00
10.02
2.65
0.88
7.93
6.67
CV
10.93
14.38
6.95
8.06
17.02
15.26
15.98
6.76
16.48
10.22
3.87
16.44
16.44
Los resultados de la evaluación de la distribución de los viroides en las plantas de
cidro mostraron un porcentaje elevado de detección de los viroides en las ramas
(75-100%). No obstante, se encontraron tres casos con ramas negativas,
correspondientes a los aislados E-1020, E-10 y E-937. Estos resultados pudieran
deberse a la distribución irregular de los viroides en la planta y al tipo de muestra
analizada, debido a que en estos casos el material vegetal estuvo constituido por
hojas a diferencia del resto que contenían además, corteza.
Varios autores han informado que los viroides en árboles cítricos se encuentran
en mayor concentración en la corteza que en las hojas, donde en algunas
ocasiones no se ha sido detectado viroides en una planta infectada (Palacio,
1999; Barbosa et al., 2001). En el caso de los aislados E-9 y E-L-1 las muestras
de hojas resultaron positivas, lo cual probablemente se deba a que estos aislados
contenían al viroide CEVd. En estudios previos se determinó que este viroide
alcanza concentraciones elevadas en cidro que posibilitan su detección a partir
de hojas (Li et al., 1995).
Determinación de la sensibilidad analítica.
En la Figura 2 se muestran los resultados de la sensibilidad analítica de todas las
especies de viroides y la mezcla de ellas en la NASH múltiple. Como se puede
apreciar con el aumento de la dilución, disminuyen los valores de DO. Los valores
de los coeficientes de determinación obtenidos para cada especie y la mezcla de
ellas estuvieron cercanos a 1, lo que indica una buena calidad en el ajuste de los
datos.
LD Mezcla
y = 0,285Ln(x) + 3,26
DO
4
MEZCLA
2
R = 0,9945
CN
2
Logarítmica
(MEZCLA)
0
0
0,5
1
1,5
1/Dilución
Figura 2. Resultados del límite de detección (LD) de la NASH múltiple para la
mezcla de los cinco viroides.
El análisis de varianza de clasificación simple entre los niveles de log DO de las
diluciones, mostró diferencias significativas entre ellas para P< 0.01, y el método
de comparaciones múltiples HSD-Tukey permitió definir que la dilución 10-2 fue la
máxima que mostró niveles significativamente distintos del control negativo. Estos
resultados corroboraron que la hibridación posee un límite de detección que
resulta suficiente para el diagnóstico de rutina en material vegetal de cidro, similar
al determinado por otros autores (Romero et al., 1995).
El límite de detección se encontró en la dilución 10-2, tanto para el aislado que
contenía la mezcla de los cinco viroides, como los que tenían cada viroide
individual, excepto para el CEVd, que pudo ser detectado hasta la dilución 10-3.
Estos resultados confirman lo señalado por Palacio (1999) con respecto a que
esta especie alcanza concentraciones superiores en cidro, en comparación con
el resto que en general alcanzan concentraciones similares una vez que la
infección está establecida.
Especificidad analítica.
El sistema evaluado no detectó reacción positiva de las sondas frente a
patógenos que se encuentran en el cultivo de los cítricos como CTV, CPsV y
Concave gum. Igualmente mostró su especificidad de reacción frente a los
viroides ASBVd y CSVd. La especificidad de algunas de las sondas de estas
especies de forma independiente ha sido demostrada por otros autores (Astruc
et al., 1996; Nakahara et al., 1999). En el caso de PSTVd, existió una reacción
positiva aunque muy débil, que se debe a la alta homología de secuencia
compartida entre el CEVd y el PSTVd. Esta reacción cruzada ha sido
determinada por Schwnghamer y Broadbent (1987) y Albanese et al. (1988) al
evaluar sondas de ADNc de PSTVd y CEVd frente a estos viroides.
Precisión del ensayo.
Los resultados obtenidos al evaluar la repetibilidad mostraron que la variabilidad
entre las réplicas en la misma membrana es mínima como se puede apreciar por
los coeficientes de variación, que se muestran en la Tabla 3, que resultaron
inferiores al 7%. Sin embargo, se encontraron diferencias entre los días para
algunos controles, lo que provocó que existieran valores superiores al 10%, que
es lo recomendado por Jacobson (1996) para esta fase de la validación. No
obstante, estos coeficientes de variación fueron cercanos al 10%, con la
excepción de un control cuyo valor fue de 18.3. Estos resultados pudieran
deberse a las variaciones en el fondo de las películas como ha sido determinado
por Caciagli y Bosco (1996).
Tabla 3. Resultados de la evaluación de la repetibilidad de la NASH múltiple en
días diferentes.
Día 1
Día 2
Media
S
CV
Media
S
CV
(P/N)
(P/N)
M 1-1
40.55
0.62 1.53
41.80
0.67 1.60
M 1-2
13.85
0.18 1.26
15.00
0.20 1.35
M 1-3
7.93
0.00 0.03
10.29
0.02 0.18
M 1-4
5.90
0.40 6.71
7.25
0.43 5.94
E-1024-1
36.15
0.26 0.71
37.07
0.28 0.74
E-1024-2
15.24
0.37 2.40
16.61
0.43 2.56
E-1024-3
14.69
0.38 2.57
17.73
0.18 1.00
E-1024-4
10.39
0.36 3.48
11.24
0.31 2.78
E-937-1
115.54
0.15 0.13
121.89 0.16 0.13
E-937-2
127.26
0.36 0.28
144.31 0.38 0.26
E-937-3
86.34
0.25 0.29
103.94 0.49 0.47
E-937-4
42.93
0.24 0.56
45.93
1.21 2.64
S: Desviación estándar.
CV: Coeficiente de variación.
P/N: Relación positivo/negativo.
Control
Día 1 y 2
Media
S
(P/N)
41.17
0.88
14.43
0.81
9.11
1.67
6.58
0.96
36.61
0.65
15.92
0.96
16.21
2.15
10.82
0.60
118.72
4.49
135.78
12.06
95.14
12.45
44.43
2.12
CV
2.15
5.61
18.30
14.53
1.79
6.05
13.26
5.55
3.78
8.88
13.08
4.78
Por otra parte, se determinó que la NASH presentó alta reproducibilidad, como
se puede apreciar en el diagrama de caja en la Figura 3. Los coeficientes de
variación obtenidos en este ensayo, que se muestran en la Tabla 4, fueron
inferiores al 9% en las réplicas intramembranas. No obstante, el operario 2 de
forma general obtuvo mayores valores en la relación P/N, lo que indicó
variabilidad entre los operarios, obteniéndose valores cercanos a 20% en uno de
los controles. Sin embargo, el análisis de varianza no mostró diferencias
significativas entre ellos. La variación en los valores obtenidos en algunos de los
controles, probablemente se deba a diferencias en el fondo seleccionado para
medir la DO de los controles en las películas.
140
120
100
80
60
40
20
OPERARIO
P/N
0
1
2
-20
N=
3 3
3 3
3 3
3 3
3 3
3 3
3 3
1
2
3
4
5
6
7
3
3
8
3 3
3 3
3 3
9
10
11
CONTROLES POSITIVOS
Figura 3. Evaluación de la reproducibilidad de la NASH múltiple. Los resultados
están expresados como relaciones positivo/negativo (P/N).
Tabla 4. Resultados de la evaluación de la reproducibilidad de la NASH múltiple.
Operario 1
Operario 2
Operarios 1 y 2
Media
S
CV
Media
S
CV
Media
S
CV
(P/N)
(P/N)
(P/N)
E-9
93.71
0.13 0.14
111.52 1.24 1.11
102.62
12.59 12.27
E-1036
37.34
1.04 2.79
41.91
3.76 8.97
39.62
3.23
8.14
E-10
6.60
0.24 3.62
6.88
0.43 6.25
6.74
0.20
2.94
E-2
71.31
1.54 2.16
82.23
3.57 4.34
76.77
7.72 10.05
E-1020
91.42
2.53 2.76
103.75 0.77 0.74
97.59
8.72
8.94
MS
62.15
2.61 4.20
73.27
0.57 0.78
67.71
7.87 11.62
E-265
30.11
0.41 1.36
30.64
0.35 1.13
30.38
0.37
1.22
E-9 213
31.89
0.12 0.39
30.38
0.06 0.21
31.13
1.07
3.44
E-7
4.37
0.38 8.60
5.66
0.23 4.14
5.01
0.92 18.26
E-9 456
48.12
0.32 0.66
46.29
0.27 0.58
47.20
1.29
2.73
E-L-1
109.28
2.60 2.38
123.11 1.22 0.99
116.19
9.78
8.42
S: Desviación estándar.
CV: Coeficiente de variación.
P/N: Relación positivo/negativo.
Control
Parámetros de desempeño.
Los resultados de la evaluación de los controles de la hibridación dot-blot
múltiple, tanto de la población general, como de las especies individuales y las
diferentes combinaciones presentes en los aislados se presentan en la Tabla 5.
Como se puede apreciar no existen falsos positivos, sin embargo, se detectaron
tres falsos negativos, que correspondieron a un aislado de HSVd (E-10), uno de
CVd IV (E-1020) y otro de la combinación HSVd y CDVd (E-937).
Tabla 5. Resultados de la evaluación de una población de controles positivos y
negativos mediante NASH múltiple.
Resultados Positivo
NASH
Negativo
Controles de Referencia
Infectado
No infectado
197 (Vp)
0 (Fp)
3 (Fn)
135 (Vn)
Vp: Verdaderos positivos, Vn: Verdaderos negativos, Fp: Falsos positivos, Fn: Falsos
negativos.
La presencia de falsos negativos pudiera deberse no sólo al desempeño de la
técnica, sino a la dificultad del diagnóstico de viroides cuando éstos se
encuentran en bajas concentraciones o se distribuyen irregularmente, lo que
coincide con los resultados de otros autores (Duran-Vila et al., 1991; Roistacher,
1991).
Los indicadores de validación determinados para la NASH con la mezcla de las
cinco sondas se muestran en la Tabla 6. Los resultados obtenidos demostraron
una alta eficacia de la técnica para el diagnóstico de todos los viroides de cítricos
evaluados, tanto para las especies independientes como para las mezclas entre
ellas, con parámetros evaluativos estimados por encima del 97 % para la
población en general.
Tabla 6. Parámetros de desempeño obtenidos para la NASH quimioluminiscente
en la detección de viroides de cítricos.
Indicadores de desempeño
Sensibilidad diagnóstica (D-SN)
Especificidad diagnóstica (D-SP)
Eficacia (E)
Valor predictivo de positividad (Vpp)
Valor predicitvo de negatividad (Vpn)
NASH Múltiple
98.5%
100%
99.1
100%
97.82
Al evaluar las especies de viroides CEVd, CBLVd, CDVd, las combinaciones
CEVd-CDVd, HSVd-CVd IV, CEVd-HSVd-CDVd y la mezcla de todos los
viroides se obtuvo un 100 % para todos los parámetros evaluados. Mientras que,
al analizar los viroides HSVd, CVd IV y la combinación HSVd-CDVd los
indicadores fueron superiores al 92 %. Los resultados obtenidos permiten la
aplicación de la técnica en el diagnóstico de rutina de los viroides con alta
confiabilidad y con valores en los indicadores comparables a los obtenidos por
otros autores (Batista, 2001; González et al., 2001).
El análisis de muestras inoculadas con aislados que contenían un único viroide o
mezclas de ellos, así como plantas no infectadas demostró que la mezcla de las
cinco sondas ADN fue capaz de discriminar entre plantas infectadas y plantas
libres de viroides, lo que había sido demostrado previamente por Palacio et al.,
(1999).
Determinación de la presencia de viroides en áreas citrícolas de Cuba.
En la Tabla 7 se muestran los resultados de la determinación de la presencia de
viroides en las áreas citrícolas del país que fueron evaluadas. Como se puede
apreciar, a excepción del Banco de Germoplasma Protegido y los viveros
multiplicadores, en el resto de las áreas se detectó la presencia de diferentes
especies de viroides.
Tabla 7. Resultados del análisis mediante NASH múltiple de plantas procedentes
de diferentes áreas citrícolas.
Empresa
Jesús Montané
Guane
Cítricos Ceiba
UCTB de Jagüey
Grande (Colección)
Victoria de Girón
Arimao
Cítricos Ciego
América Libre
UCTB de Alquízar
(Germoplasma)
Viveros multiplicadores*
TOTAL
Mezcla
10
17.5
7.89
18.38
Porcentaje de plantas infectadas
CEVd CBLVd HSVd
CDVd
0
0
0
10
7.5
0
12.5
5
0
0
5.26
5.26
9.56
2.21
11.76
9.56
CVd IV
0
2.5
2.63
4.41
37.5
17.5
20
34.21
0
2.5
2.5
7.5
21.05
-
0
0
0
0
-
22.5
7.5
15
15.79
-
12.5
5
2.5
13.16
-
5
2.5
5
2.63
-
0
14.39
5.09
0.53
8.25
5.96
2.46
*Comprende los viveros multiplicadores de la Estación de Alquízar, Empresa Cítricos
Ceiba, Victoria de Girón y Enrique Troncoso).
El 14.39% del total de los árboles analizados estaban infectados con viroides.
Los mayores porcentajes de infección se encontraron en los campos
correspondientes a las Empresas Victoria de Girón (37.5%) y América Libre
(34.21%). El resto de los campos, presentaron porcentajes más bajos (10-20%),
correspondiendo el menor porcentaje al campo de la Empresa Jesús Montané.
Los viroides identificados en las áreas citrícolas fueron CEVd, CBLVd, HSVd,
CDVd y CVd IV, de ellos los más frecuentes fueron CEVd (35.37%), HSVd
(57.32%) y CDVd (41.46%). Los viroides CBLVd y CVd IV se detectaron en
menor porcentaje (3.66 y 17.07, respectivamente). Este constituye el primer
informe de la presencia del viroide CBLVd en áreas citrícolas de Cuba.
Los estudios realizados en áreas citrícolas de otros países coinciden con lo
determinado en este trabajo. Por ejemplo, Villalobos et al. (1997) y Škoric et al.
(2001) determinaron que en áreas citrícolas de Costa Rica y Croacia más del
60% de las muestras analizadas contenían viroides y los más ampliamente
diseminados fueron el CEVd, HSVd y CDVd.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo permitieron contar con un sistema
de diagnóstico con indicadores de validación superiores al 97%, lo que permite
validar el trabajo de las empresas citrícolas del país. La aplicación de este
sistema de diagnóstico ha permitido identificar las especies de viroides
presentes, así como detectar por primera vez al viroide CBLVd en el país. El
conocimiento de la presencia de viroides en las plantaciones es indispensable
para el manejo de estos patógenos, cuya importancia se ha incrementado con la
introducción de nuevos patrones, que si bien toleran al CTV, algunos resultan
sensibles a los viroides.
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Agradecimientos: Le agradecemos la gentileza de la Dra. Lien González de la
Facultad de Biología, Universidad de la Habana por proporcionarnos los extractos
de los viroides ASBVd y CSVd. Al Téc. Rudy Peral del Centro de Ingeniería
Genética y Biotecnología (CIGB) por cedernos los extractos de PSTVd y realizar
junto al Lic. Raidel Rodríguez del CIGB los ensayos de reproducibilidad. Al equipo
de trabajo del laboratorio de Virología Vegetal del CIGB por su apoyo en la
realización de las hibridaciones. Al Lic. Leonardo Gómez del CIGB por su ayuda
en las mediciones de las películas. Al Lic. Luis Izquierdo por el procesamiento
estadístico. A Ana María Aldana y María del Carmen Torres por su ayuda en el
procesamiento de las muestras.