Biología de las células madre

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Biología de las células madre
Antonio Bernard
Departamento de Cardiología Regenerativa
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)
Resumen
Dos características son definitorias de una
células madre (CM), permitiendo además diferenciarlas de la gran mayoría de las células
constitutivas de un organismo adulto: a) poseer
una capacidad muy importante de proliferación,
pero manteniendo su estadio indiferenciado (automantenimiento), y b) ser capaces de generar
progenie, perteneciente a varios linajes celulares
del organismo (pluripotencia). El control de su
capacidad de proliferación versus diferenciación
se produce en localizaciones especializadas, denominadas nichos, y alteraciones de este mecanismo básico pueden estar implicadas en muchas
patologías humanas. El potencial terapéutico
que encierra el concepto de célula madre –en
su conjunto– es enorme, pero debemos de ser
capaces de explotarlo adecuadamente.
Introducción
¿Qué es una célula madre? ¿Dónde podemos
encontrar las células madre? ¿Para qué sirven las
células madre en el individuo adulto? ¿Cuantas
tenemos? ¿Qué podemos esperar de la revolución tecnológico-terapéutica que se nos avecina? Buenas preguntas que tienen una respuesta
cambiante cada semana que transcurre.
El misterio de la vida se concreta, desde una
perspectiva meramente biológica, en cómo la
complejidad de un organismo se encuentra pre-
programada en un minúsculo embrión (zigoto).
Cuanto más ampliamos nuestro conocimiento
molecular y celular, más lejos nos parece estar
del maravilloso modelo de regulación (a corto, medio y largo plazo) que se encierra en esa
célula.
El zigoto, tras su implantación, y con la ayuda del ambiente propicio aportado por las estructuras maternas, desarrolla todo su potencial
biológico, generando una constelación estructurada de tipos celulares cuyo resultado final es
un nuevo organismo.
Durante los estadios tempranos del desarrollo embrionario se pueden identificar y aislar
células con capacidad «totipotencial», término
que se emplea para indicar que a partir de ellas
se pueden generar todos los tipos celulares del
organismo adulto. Estas células totipotenciales embrionarias se denominan células madre
(también conocidas como células stem –del
inglés–, o células troncales). En ratón, hace más
de 20 años (Martín, 1981; Evans et al., 1981;
Bradley et al., 1984) aislaron y caracterizaron
líneas celulares (fig. 1) con estas características
(embryonic stem cells, ES), obtenidas de la masa
interna de embriones en estadios tempranos
de desarrollo, denominado blastocisto (Bongso
et al., 1994).
La caracterización inicial de estas células madre permitió el establecimiento indefinido in vitro de líneas celulares capaces de dar origen a un
ratón indistinguible de sus congéneres, siendo
además capaces de trasmitir su información en
Biología de las células madre
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la línea germinal. Posteriormente se demostró
la posibilidad de su manipulación génica convirtiéndose en células clave para la generación de
modelos animales capaces de desarrollar enfermedades análogas a las presentes en humanos
para el estudio de enfermedades humanas y en
una herramienta insustituible para desvelar la
función de los genes in vivo. La trascendencia de
este cuerpo de trabajo para el desarrollo de la
biomedicina moderna ha sido reconocida mediante la concesión del premio Nobel de Fisiología o Medicina (2007) a los doctores Mario R.
Capecchi, sir Martin J. Evans y Oliver Smithies.
Sin embargo, el concepto de CM se origina
mucho antes (Ferrebee et al., 1958), y deriva
de los trabajos pioneros que permitieron desarrollar el trasplante de médula ósea y salvar
muchas vidas. La médula ósea es el órgano don-
Ovocito fertilizado (129Svj)
Línea de ratón manipulada
genéticamente:
• Estudios básicos
• Modelos de enfermedad
Transmisión
a línea
germinal?
Hembra seudopreñada
receptora CD I–blanco–
Blastocistos
Implantación
ES (129Svj)
Blastocistos (CD I)
Microinyección
o agregación
Masa interna
del blastocisto
Manipulación
genética/
caracterización
Línea de células ES (129Svj)
–pardo–
Figura 1. Esquema de la obtención de animales manipulados genéticamente mediante la utilización de
células stem embrionarias (mES).
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9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana
de se producen las células sanguíneas a partir
de distintos «progenitores» mediante una organización piramidal (fig. 2) que, tras ejecutar un
complejo programa de desarrollo, originan los
cientos de millones de células funcionales que
necesita el organismo diariamente en su sangre
y órganos linfoides secundarios (donde madura
la respuesta inmunitaria).
El «truco» es que el funcionamiento de por
vida de este dinámico sistema (linfohematopoyético) está garantizado si se consigue mantener un pequeño número de células madre
(0,01-0,1% de la celularidad de la médula ósea)
alojadas en lo más íntimo de los huesos del individuo. Si conseguimos extraer y trasplantar
un número suficiente de estas células madre
hematopoyéticas, conseguiremos que el organismo receptor pueda reconstituir y mantener
su sistema linfohematopoyético totalmente funcional durante el resto de la vida. Estos trabajos
pioneros merecieron la concesión del premio
Nobel de Fisiología o Medicina (1990) a E. Donnall Thomas.
En este sentido amplio, y desde la década de
1960, el estudio del sistema linfohematopoyético y el transplante de medula ósea ha sido la
escuela donde se han creado y desarrollado la
gran mayoría de los conceptos que hoy día se
manejan sobre la biología y fisiología de las células madre. En términos generales, el trasplante
de médula ósea, la reparación de cartílago articular y el trasplante de piel artificial a grandes
quemados (fig. 3) se pueden considerar los verdaderos antecedentes de la actual revolución
en medicina megenerativa.
Definición
de célula madre
Las características más impor tantes que
permiten definir a las CM y diferenciarlas de
la gran mayoría de las células constitutivas
de un organismo adulto son dos. La primera
es que en condiciones de cultivo adecuadas,
Figura 2. Esquema de la organización piramidal del sistema linfohematopoyético.
Biología de las células madre
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tienen una capacidad ilimitada de dividirse;
así una CM es capaz de generar un número
inmenso de células, manteniendo sus mismas características –por el contrario, todas
las demás células de las que todos estamos
constituidos, las denominadas células somáticas, poseen un número limitado de divisiones (se calcula que sólo pueden dividirse
alrededor de cincuenta veces, al cabo de las
cuales mueren)–. La segunda es que las CM
son capaces de generar varios de los linajes
celulares de los que está constituido un individuo: células de corazón, de hígado, de riñón,
neuronas, músculo, etc.
Hasta el momento se han identificado células con características de CM de 4 orígenes
distintos: de origen embrionario, células madre
germinales, células madre procedentes de carcinomas embrionarios (terato-carcinomas) y
células madre procedentes de tejidos somá-
ticos, y aisladas de individuos adultos, las que
denominaremos CMA (células madre adultas).
En la actualidad, aunque todavía se encuentran
en fase de estudio y evaluación, estas fronteras
estrictas han desaparecido debido al desarrollo
de la tecnología de reprogramación genética.
Esto permite obtener células con propiedades
muy similares a las embrionarias (iPS; induced
Pluripotent Stem Cells) a partir de numerosos
tipos celulares adultos (p. ej., Park et al; 2008)
que incluyen fibroblastos, queratinocitos, MSC,
etc. Aunque las posibilidades abiertas son
enormes, quedan por resolver varios temas
técnicos y garantizar su bioseguridad. Pero aun
más interesante es el hecho de que con esta
misma técnica de reprogramación genética
se han conseguido obtener de forma directa
cardiomiocitos a partir de fibroblastos (Ieda et
al., 2010) Claramente, el sinfín de posibilidades
que se abren está aún por desarrollarse.
Medicina regenerativa: de la realidad clínica actual a un futuro prometedor
Transplante de médula ósea
Reparación cartílago
Piel. Quemados
Sistema linfohematopoyético
Figura 3. Antecedentes de la medicina regenerativa.
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Hasta hace una década, las únicas CMA de
mamíferos cuya existencia había sido demostrada de forma concluyente eran las células madre hematopoyéticas (CMH, o HSC, del inglés
Hematopoietic Stem Cells), responsables de la
producción de todos los linajes sanguíneos. Se
postulaba la existencia de CMA en otros tejidos
altamente proliferativos, como la piel y el hígado, pero el concepto genérico de «célula madre
adulta» como tipo celular existente en todos los
tejidos es un paradigma bastante reciente. En la
actualidad, sabemos que la diversidad de CMA
equivale prácticamente a la variedad de tejidos
del organismo adulto. De hecho, probablemente
es mayor, pues algunos tejidos, cómo la médula
ósea, contienen más de un tipo de CMA.
En la división celular típica, las dos células hijas
generadas son equivalente entre sí y a la célula
progenitora de la que derivan (división simétrica). Posteriormente, las células descendientes
(progenie) pueden evolucionar por distintas vías,
bien siguiendo unos programas determinados
de diferenciación o bien pueden mantener su
potencial inicial. El mantenimiento de una relación adecuada entre la tasa de proliferación y diferenciación permite en la mayoría de los tejidos
establecer un control homeostático de su forma
d
d
p
d
y tamaño, evitando un crecimiento descontrolado que se asocia, p. ej., con los procesos tumorales. Por el contrario, las CM parece que están
reguladas por un mecanismo de división conservador (asimétrico), de forma que en su división
se genera una célula equivalente a la original y
otra que da cuenta del resto del programa de
diferenciación. Este mecanismo de «automantenimiento» (en inglés, self-renewal) permite controlar de forma estricta el número de CM que
existe en un determinado órgano (fig. 4).
Se ha asumido que las CM presentes en el
organismo adulto (CMA) deben de poseer, en
términos generales, un menor potencial que las
presentes durante el desarrollo embrionario y
fetal. Sin embargo, aunque en lógica es fácil asumir este principio, demostrarlo es mucho más
complicado. Además, al menos en el organismo
adulto, no todas las células madre de un órgano
participan activamente en el proceso de regeneración y mantenimiento de la funcionalidad.
Sólo unas pocas están contribuyendo de forma
simultánea a la creación de un tejido, en un momento dado. La mayoría se encuentra en un estado de reposo (conocido como quiescencia),
lo que las protege tanto de agresiones externas,
físicas o químicas, como del proceso de enve-
p
GI/S
División simétrica
d
G0
División asimétrica
Figura 4. Esquema comparativo de la división simétrica en comparación con la división asimétrica.
Biología de las células madre
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jecimiento celular. Cuando las CMA responsables en un momento dado de la regeneración
tisular agotan sus posibilidades, son sustituidas
paulatinamente por la progenie de otras nuevas.
Las nuevas células así generadas representan diferentes clones y el fenómeno responsable del
proceso se denomina «sucesión clonal».
En definitiva, una CM se define, funcionalmente, como una célula capaz de «automantenerse» (mediante el mecanismo de división
asimétrica) y con potencial de generar (mediante diferenciación de sus células descendientes)
varios linajes celulares (pluripotencia) o todo un
organismo (totipotencia). Por lo tanto, no todas
las CM son equivalentes y aunque la mayoría
de las veces se definen por su origen (embrionarias, adultas, etc.) no siempre estos términos
equivalen necesariamente a un mayor potencial
de desarrollo o, incluso, de potenciales aplicaciones biomédicas. Los mecanismos por medio
de los cuales ocurre esta diferenciación, los genes implicados y la posibilidad de incrementar la
eficiencia en su aislamiento y/o caracterización
constituyen una de las áreas más relevantes en
la actualidad de la biología y de la biomedicina.
Células madre adultas.
Tipos y origen
El origen embrionario de todos los tipos de
CMA es, en última instancia, el mismo que el de
los restantes tipos de células somáticas presentes en el organismo adulto, es decir, las células
pluripotentes de la masa interna del blastocisto.
Sin embargo, es muy poco lo que se conoce
de los precursores específicos de cada tipo de
CMA, más allá de la hoja embrionaria a la que
pertenecen (ectodermo, mesodermo o endodermo).
En el organismo adulto la inmensa mayoría
de sus células se encuentran en un estado, que
denominamos «postmitótico», en el que raramente se dividen y multiplican. Están ejerciendo
las funciones para las que han sido programa44
das y sólo en casos excepcionales (daños de
diversa índole) salen de su letargo y, en la medida que les permita su entorno y su propio
potencial, repararán el daño producido. A esta
regla general sólo escapan cuatro órganos que
se encuentran en una situación de alta actividad
fisiológica: a) la médula ósea, por la exigente demanda de células sanguíneas y mediadoras de la
respuesta inmune; b) las gónadas, que generan
constantemente células germinales; c) el hígado,
que tiene una gran capacidad de regeneración,
y d) los epitelios, sobre todos el intestinal y el
epidérmico, que están en una continua renovación. En los cuatro órganos existen poblaciones
con características de CM, específicas de tejido,
que dan justificación a dicho potencial. En los
últimos años el panorama respecto al cerebro
ha cambiado dramáticamente. Se creía que el
número de neuronas y la estructura cerebral
quedaba determinado en los primeros años de
vida, y que posteriormente sólo se producían
re-estructuraciones y perdida de conexiones
(plasticidad neuronal). Sin embargo, actualmente
sabemos que el cerebro es también un órgano
muy activo que puede generar nuevas neuronas (se ha estimado que puede llegar a producir
105 al día). Estas células tienen que producirse a
partir a células madre alojadas en el cerebro.
De manera transitoria, en el momento del parto una gran proporción de células hematopoyéticas se encuentran en la sangre contenida en el
cordón umbilical y en la placenta. Si se recoge
entonces adecuadamente la sangre placentaria
se puede obtener una población muy sustancial
de células madre hematopoyéticas, con la que
se han establecido los denominados Bancos de
Sangre de Cordón. Esta fuente es ideal para el
trasplante en niños o adultos de bajo peso con
enfermedades hematológicas severas.
Células madre linfohematopoyéticas (CMH)
Como ocurre con muchos otros aspectos de
su biología, el origen embrionario de las CMH
es el mejor estudiado de todos los tipos de
9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana
CMA. Desde principios del siglo XX se cree
que las CMH derivan de un precursor más primitivo, común con el linaje endotelial, al que se
denomina hemangioblasto, cuya existencia ha
sido confirmada por diversos estudios experimentales en distintos estadios de desarrollo
(Pelosi et al., 2002). La hematopoyesis se inicia
en el embrión de mamífero en el saco vitelino
(semana 5 de gestación en humanos; d7-7,5 en
ratón). Sin embargo, los precursores hematopoyéticos del saco vitelino sólo son los responsables de la hematopoyesis embrionaria, y no dan
origen posteriormente a las CMH presentes en
el adulto. De hecho, la capacidad de los progenitores primitivos (CD34+/CD117+) aislados del
saco vitelino para contribuir a la hematopoyesis
en adultos es limitada. Las CMH responsables
de la hematopoyesis definitiva en adultos se originan en la región del mesodermo denominada
aorta-gónada-mesonefros (AGM), derivada de
la esplacnopleura para-aórtica. Tras el saco vitelino, la hematopoyesis tiene lugar en el bazo,
hígado y nódulos linfáticos, hasta el momento
en que se desarrolla la médula ósea, que eventualmente asume la tarea de producir células
sanguíneas para todo el organismo adulto.
Las CMH de la médula ósea se hallan en
una concentración aproximada de 1 por cada
10.000 células mononucleares; también pueden
obtenerse de la sangre periférica, ya que son
capaces de abandonar la médula ósea y pasar
a la circulación sanguínea, en un proceso denominado movilización. Las CMH se caracterizan por su pequeño tamaño, una gran relación
núcleo:citoplasma, la ausencia de marcadores
de linaje (Lin-), un bajo marcaje con tintes vitales como Hoechst 33342 y la presencia de
varios marcadores de superficie, entre los que
se encuentran (humano): CD34, CD90, CD117
(c-kit) y CD133. Una población celular altamente enriquecida con CMH puede obtenerse mediante selección por citometría de flujo de células que expresan alguno de dichos marcadores
(tradicionalmente CD34). Sin embargo, ninguno
de ellos por sí solo, ni en combinaciones simples,
permite identificar específicamente una CMH.
CMA no-linfohematopoyéticas
El mayor problema actual al que se enfrenta
el biotecnólogo, el ingeniero genético o celular,
o el clínico, que pretenden utilizar CM con fines
terapéuticos, es que, en la mayoría de los casos (hay notables excepciones), estas CM una
vez extraídas de su entorno natural tienen una
gran tendencia a «diferenciar» perdiendo, total
o parcialmente, su «toti- o pluripotencia». Este
problema parece estar relacionado con el bajo
nivel de conocimiento de su regulación. En el
momento que obtengamos la información adecuada, se podrán mantener ex vivo en mejores
condiciones que permitan preservar su potencial, aspirando incluso a expandir su número
para llegar a situaciones óptimas para su aplicación clínica. Esto debería de ser posible para todos los tipos de CMA que se conocen (fig. 5).
Células madre mesenquimales (CMM)
Además de CMH, la médula ósea contiene
al menos otro tipo de CMA, denominadas células madre mesenquimales (CMM, o MSC, del
inglés Mesenchymal Stem Cells), las cuales son
células fibroblastoides precursoras de todos
los tipos de tejidos conectivos no hematopoyéticos (hueso, grasa, cartílago, etc.) (Pittenger
et al., 1999). Las CMM no se encuentran sólo
en la médula ósea, sino también en el estroma
de virtualmente todos los órganos, por ejemplo en el tejido adiposo subcutáneo (Zuk et al.,
2002) o el cartílago articular (De la Fuente et
al., 2004). Las CMM se obtienen generalmente
mediante selección por adherencia a plástico de
cultivo celular, pues son capaces de adherirse y
crecer en condiciones en las que otros tipos celulares habitualmente no proliferan. No poseen
ningún marcador específico, pero presentan un
perfil homogéneo y reproducible de antígenos de superficie, que habitualmente se define
como: CD9+/CD13+/CD29+/CD14–/CD34–/
CD44+/CD45–/CD90+/CD105+.
Debido a su relativamente sencilla obtención, su elevada capacidad de proliferación ex
vivo (a diferencia de las CMH) y a su amplio
Biología de las células madre
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Tejidos embrionarios o adultos
Tejidos extraembrionarios
potencial de diferenciación, las CMM son uno
de los tipos de CMA más empleados en terapia celular. Además, en determinadas condiciones experimentales, las CMM han mostrado
la capacidad de diferenciarse en linajes celulares no conectivos, tales como el endotelial y
el neuronal. Por último, una propiedad especialmente interesante de las CMM, es que son
capaces, tanto in vitro como in vivo, de inhibir la
respuesta inmunitaria (Rasmusson et al., 2006).
Esta capacidad de inmunorregulación incluye la
inhibición de la activación de células T, B, NK
y de la maduración de células dendríticas, así
como la protección frente a patologías inflamatorias y/o autoinmunes, incluido el rechazo
a trasplantes.
CM
Líquido amniótico
CM
Membrana amniótica
CM
embrionarias
Células madre epidérmicas (CME)
Fuera de la médula ósea, uno de los tejidos donde se suponía desde hacía décadas la
existencia de CM, dado su carácter altamente
proliferante, era la epidermis. En la actualidad
sabemos que existen células madre epidérmicas
(CME o EpSC, del inglés Epidermal Stem Cells)
al menos en dos localizaciones distintas. En primer lugar, en la membrana basal interfolicular se
estima que entre el 1 y el 2% de las células son
CME, con fenotipo p63+, las cuales son capaces
de generar queratinocitos que, al migrar hacia la
superficie, dan lugar a la formación de la epidermis (Pellegrini et al., 2001). En segundo lugar, en
el interior de los folículos pilosos, en concreto
CM
Sangre de cordón umbilical
CM
Cordón umbilical
CM
fetales
CM
adultas
Nacimiento
CM linfohematopoyéticas
CM mesequimales
CM epiteliales
CM neuroepiteliales
CM germinales
CM intestinales
CM neurales
CM de músculo esquelético
(satélite)
CM hepáticas (ovales)
CM endoteliales
CM cardiacas
CM pancreáticas
CM renales
CM de neumocitos
MAPC?
?
CM tumorales
Figura 5. Células madre. Origen, ontogenia y tipos.
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9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana
en la región denominada bulge, se ha descrito la
existencia de una población de células madre
más primitivas, con fenotipo CD34+/queratina
15+/integrina α6+, capaces de dar lugar no sólo
a la epidermis propiamente dicha, sino también
a los folículos y a las glándulas sebáceas. En el
hombre, sin embargo, la identificación de las
CME interfoliculares resulta más difícil, y se han
propuesto varios fenotipos diferentes para las
CME del bulge, siendo uno de ellos CD200+/
CD34–/CD24–/CD71–/CD146– (Ohyama et
al., 2006). Al igual que ocurre con otros tipos de
CMA, existen estudios que indican que las CME
muestran plasticidad en determinadas condiciones experimentales (Toma et al., 2001).
Células madre neurales (CMN)
Al contrario que la médula ósea o la epidermis, ambos tejidos con una elevada tasa de
recambio (turnover) celular, el descubrimiento
de CM en el SNC constituyó sin duda una de
las mayores sorpresas de la biología en los inicios del presente siglo (Doetsch et al., 1999).
Las células madre neurales (CMN o NSC, del
inglés Neural Stem Cells) presentes en el cerebro adulto de mamíferos tienen su origen en
células de la cresta neural, y se localizan principalmente en la región subventricular y en la
región subgranular del giro dentado del hipocampo. El principal marcador de estas células
es la nestina, y su aislamiento se realiza mediante el cultivo celular en presencia de los factores de crecimiento EGF y bFGF, condiciones
en las que crecen en forma de agregados esféricos en suspensión, denominados neuroesferas. Los cultivos de neuroesferas permiten
obtener grandes cantidades de CMN, capaces
de diferenciarse tanto a neuronas como a glía
(astrocitos y oligodendrocitos).
Otras CMA
Las CM hematopoyéticas, mesenquimales,
neurales y epidérmicas son las más estudiadas
y mejor conocidas hasta el momento, pero no
son los únicos tipos de CM demostrados en
los tejidos somáticos del adulto. Otros tipos de
CMA que han despertado un especial interés
en medicina regenerativa son los siguientes:
•Células madre endoteliales. Se ha descrito la
existencia de precursores endoteliales (que
algunos autores consideran células madre)
tanto en médula ósea como circulantes (Asahara et al., 1997). Estas células están relacionadas con las CME y han despertado un gran
interés por sus posibles usos en el tratamiento de la patología isquémica.
•Células madre de músculo esquelético. Tradicionalmente se han denominado células
satélite, y se definen por la expresión del
factor de transcripción Pax3. En ratón se ha
demostrado que esta población posee el fenotipo CD34+/CD45–/Sca1– (Montarras et
al., 2005).
•Células madre pancreáticas. La evidencia experimental sugiere la existencia de uno o varios tipos de células madre en el páncreas. Las
CM capaces de diferenciarse a células beta
parecen ser células presentes en los islotes y
en los ductos pancreáticos positivas en neurogenina-3 (Seaberg et al., 2005).
•Células madre cardiacas. Diversos grupos han
comunicado en los últimos años el aislamiento a partir de miocardio de células capaces
de diferenciarse a cardiomiocitos, endotelio
y músculo liso, aunque aún existe controversia sobre su relevancia, origen y fenotipo. La
mayor parte de los trabajos identifican como
células madre cardiacas a las CD117+/Sca-1+
(Barile et al., 2007).
Por último, diversos trabajos han descrito la
existencia de CMA «pluripotentes» (o, al menos, con una extensa multipotencia) en diversos
tejidos de mamíferos. Destacan en este campo
los trabajos de la doctora Catherine Verfaillie,
en los que se describe el aislamiento a partir
de la médula ósea y otros tejidos de diversas
especies de mamíferos de células capaces de
diferenciarse tanto in vitro como in vivo a prácticamente todos los linajes celulares somáticos, a
las cuales denominan MAPC (Multipotent Adult
Biología de las células madre
47
Progenitor Cells), y que son similares a las CMM
pero negativas para los marcadores CD44 y
HLA-I (Jiang et al; 2002). Dichos trabajos, sin
embargo, no han podido ser adecuadamente
reproducidos por muchos grupos y, en la actualidad, las MAPC se consideran en general
más como el resultado de algún tipo de modificación inducida por las condiciones de cultivo
ex vivo que como un tipo celular presente en
condiciones fisiológicas in vivo.
El concepto de nicho
y el control
de la autorrenovación
Las CM son, junto con las células tumorales,
las únicas células de mamíferos capaces de proliferar y mantener su potencial de diferenciación
indefinidamente. Esta capacidad de dividirse de
forma ilimitada para dar lugar a otras CM equivalentes a ellas es lo que se denomina automantenimiento o autorrenovación (self-renewal).
La autorrenovación es un proceso biológico
de enorme relevancia, pues encierra las claves
tanto de la regeneración y homeostasis tisular
como del desarrollo, el envejecimiento y el cáncer. A pesar de ello, nuestra comprensión de dicho proceso es aún muy limitada. La mayoría de
lo que conocemos acerca de los mecanismos de
autorrenovación se ha averiguado en el modelo
de células madre embrionarias (ESC, del inglés
Embryonic Stem Cells). En dicho modelo se han
identificado una serie de señales extracelulares
(LIF, BMP, FGF, etc.) que contribuyen a mantener
la expresión de varios factores de transcripción
(Oct4, Nanog, Sox2 y otros), los cuales a su vez
actúan como genes maestros que mantienen el
estado pluripotente de las células (Rao et al.,
2004). No se comprende muy bien el posible
papel de los mencionados genes de pluripotencia en la autorrenovación de las CMA, pero
todas las evidencias indican que son bastante
específicos de ESC y que la autorrenovación en
CMA es regulada principalmente por otros fac48
tores. Sin embargo, algo que tienen en común
los mecanismos de autorrenovación de todas
las CM, es que todos ellos dependen de un conjunto específico de señales extracelulares, que
es distinto para cada tipo de CM y que incluye:
señales solubles, tanto paracrinas como autocrinas, interacciones con la matriz extracelular, e
interacciones célula-célula. Según su efecto sobre las células, dichas señales mantenedoras de
la autorrenovación pueden clasificarse en:
•Señales de proliferación: inducen la división
celular.
•Señales de quiescencia: inducen la ralentización del ciclo celular en G0, estado en el cual
la célula puede mantenerse durante periodos
prolongados sin diferenciarse ni sufrir daños
genéticos.
•Señales inhibidoras de la diferenciación: contribuyen a mantener la expresión de genes que
inhiben los procesos de diferenciación celular.
•Señales de supervivencia: proporcionan una
señal sin la cual la CM entraría en senescencia/apoptosis, o bien protegen de la acción de
otras señales capaces de inducir dicha apoptosis.
El conjunto de todas estas señales que constituyen el microambiente especializado de una
determinada CM es lo que se denomina nicho.
El concepto de nicho, derivado de nuevo del
estudio del sistema hematopoyético (fig. 6) es
fundamental para la comprensión de la biología
de las CM.
En el nicho adecuado, las CM son capaces de
autorrenovarse; fuera de él, las CM se diferencian o mueren. Por tanto, las características del
nicho fisiológico son dominantes y controlan
el equilibrio proliferación/quiescencia/diferenciación, así como determinantes de la «expresión» de potencial que se le permite a esa CM
en dicha localización anatómica. Cada tipo de
CMA reside por tanto sólo en localizaciones
anatómicas muy precisas dentro del organismo,
donde se dan las señales que constituyen su correspondiente nicho. Este estricto control de la
9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana
autorrenovación es una de las diferencias esenciales entre una CM y una célula tumoral, la cual
no parecen presentar dichas restricciones.
Los nichos de algunos tipos de CMA han sido
localizados de forma precisa, y ya han sido mencionados anteriormente, como por ejemplo los
de las CME (capa basal de la epidermis y bulge
de los folículos), las CMN (región subventricular
y giro dentado) y las CM intestinales (fondo de
las criptas). En otros tipos de CMA, sin embargo,
la localización del nicho es aún poco precisa. En
el caso de las CMH, se ha descrito que se localizan mayoritariamente cerca de la superficie
ósea, pero también asociadas con el endotelio
sinusoidal (Wilson et al., 2006). Aún no se comprende bien la relación entre ambos tipos de
nicho, ni su probable función diferencial en la
biología de las CMH.
Las principales rutas de señalización reguladoras de la autorrenovación conocidas en CMA
son Wnt, Notch y Hedgehog (Blank et al., 2008).
Una característica común de todas estas señales
es que pueden regular la autorrenovación en distintos sentidos (induciéndola o inhibiéndola) dependiendo del contexto, y probablemente como
resultado de equilibrios cuantitativos. Así, por
ejemplo, la activación de Notch es esencial para la
autorrenovación de las CMH, pero en CMN puede promover tanto la autorrenovación en algunos
casos como la diferenciación a glía en otros.
La señalización por Wnt a través de la ruta
canónica (ß-catenina) promueve la autorrenovación en CMH, CMM, CMN, CME y en las CM
intestinales. Sin embargo, en las CMH la deleción de ß-catenina no afecta a la capacidad de
autorrenovación, por lo que, o bien la señaliza-
Autorrenovación frente a diferenciación («el nicho»)
Mφ
Self-renewal
TGF-ß
pEEDCK
–
Commitment differentiation
IL-I
TNF
etc.
IL-I
TNF
IL-6
+
–
+
ECM-b GF
+
CSF’s
SCF
IL-3
sGF
IL-6
mb-GF
IL-II
etc. IL-6
–
LIF
TGF-ß
etc.
CAM
Stromal cell
MSC
Figura 6. Definición y estructura funcional del «nicho» hematopoyético.
Biología de las células madre
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ción por Wnt no es necesaria, o bien señaliza
por medio de la vía no canónica en estas células.
De forma contraria, la acumulación de Wnt-3a
en el suero plasmático del ratón se ha asociado
recientemente al fenómeno de envejecimiento
fisiológico, al menos de las células satélite musculares (Brack et al., 2008)
Por su parte, Sonic Hedgehog también promueve el mantenimiento de las CMH, CMN y
CME. Al menos en las CMH, dicha actividad tiene lugar a través de un mecanismo dependiente
de BMP-4. La ruta de señalización de TGF-ß/
BMP (mediada por Smads) se ha estudiado
extensamente en CMH, y se sabe que TGF-ß
es uno de los más potentes inhibidores de la
autorrenovación de CMH. Debido al alto nivel
de redundancia de las proteínas Smad, su papel
en el automantenimiento de las CMA aún no se
comprende de forma completa.
Los programas genéticos específicos responsables del control de la autorrenovación de CMA
son considerablemente menos conocidos que
las señales extracelulares que los regulan. Hasta
el momento, los genes de autorrenovación mejor
estudiados en CMA pertenecen a la familia de
las proteínas Polycomb. Las proteínas del grupo
Polycomb (PcG) se asocian en grandes complejos que reprimen la trascripción de otros genes
mediante modificaciones de la estructura de la
cromatina. Entre los genes PcG se han identificado varios que participan en la regulación de la
autorrenovación de CMA. Entre ellos, el mejor
conocido es Bmi1 (Park et al., 2003), cuya expresión es necesaria para el mantenimiento de las
CME y CMN. Bmi1 promueve la proliferación de
las CMA principalmente reprimiendo la ruta de
senescencia celular inducida por p16Ink4a y p19Arf.
Plasticidad de las CMA
En los últimos 7-8 años ha existido una amplia
polémica, que todavía persiste en algunos extremos, sobre el novedoso concepto de la «plasticidad» celular, principalmente establecido sobre
experimentación realizada con CMH (fig. 7). Por
SNC
PEC (médula ósea)
Sistema nervioso
Tumor in situ
Célula oval
Hígado
Célula satélite
SCE
Músculo
Folículo
piloso
Criptas
intestinales
Figura 7. Plasticidad de células madre hematopoyéticas (CMH).
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9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana
Queratinocitos-epidermis
plasticidad celular entendemos el fenómeno por
el cual una CMA, extraída de su nicho natural,
manipulada o no ex vivo, y trasplantada en otro
entorno fisiológico, es capaz de dar lugar a otros
linajes celulares no previstos según su programa
de desarrollo estándar.
En este proceso se han implicado diferentes
mecanismos, no totalmente clarificados, y que
incluyen dediferenciación, transdiferenciación
y reprogramación. Hoy en día algunos de los
postulados iniciales no se han confirmado, pero
otros sí (Rovó y Gratwohl, 2008). En la actualidad se está investigando la terapia celular con
CMH como posible procedimiento terapéutico
para el tratamiento de muy diversas patologías
no relacionadas con el sistema linfohematopoyético. Las principales aplicaciones en este sentido son la reparación/regeneración hepática y el
tratamiento de la isquemia.
La capacidad de las CMH para generar nuevas células hepáticas se ha demostrado en varios modelos animales de insuficiencia hepática
(Lagasse et al., 2000), y su posible aplicación en
clínica ofrece una importante promesa terapéutica en este tipo de patologías. Sin embargo, la
formación de nuevos hepatocitos no se debe a
la diferenciación de las CMH, sino a un proceso
de fusión de dichas células (u otros tipos derivadas de ellas, como los macrófagos) con los
hepatocitos preexistentes (Wang et al., 2003).
Este descubrimiento, no obstante, no invalida la
posibilidad de tratar eficazmente enfermedades
metabólicas o infecciosas hepáticas mediante
el trasplante de CMH, y se están investigando
activamente las propiedades biológicas de las
células resultantes de la fusión.
La isquemia cardiaca es otra de las patologías
que se está abordando mediante el trasplante de CMH. Los trabajos iniciales en roedores
(Orlic et al., 2001) promovieron el desarrollo
de numerosos estudios preclínicos y clínicos de
terapia celular motivados por la hipótesis de
que las CMH poseen una plasticidad suficientemente elevada cómo para transdiferenciarse
a células del linaje cardiomiocítico. Sin embargo,
estudios posteriores parecen descartar que di-
cha transdiferenciación tenga lugar en una proporción significativa en las condiciones experimentales habituales (Murry et al; 2004) aunque
la transdiferenciación in vivo se ha sustanciado
en diferentes estudios realizados sobre varones
que recibieron un trasplante de corazón cuyo
donante era una mujer, sin la aparente mediación de mecanismos de fusión (Angelini et al.,
2007). Por tanto, sigue la polémica. Por otra
parte, la posible capacidad proangiogénica está
siendo investigada en el tratamiento de la isquemia periférica (Pearce et al., 2008).
De forma análoga, el potencial de las CMH
para la transdiferenciación in vivo en células del
sistema nervioso central también se ha sustanciado en diferentes estudios realizados sobre
mujeres que recibieron un trasplante de médula ósea cuyo donante era un varón (Cogle
et al., 2007).
En definitiva, la plasticidad celular de diferentes CMA es una nueva opción terapéutica que
necesitará mucho más tiempo para ser evaluada
con solidez, lo cual no la descarta cómo plausible –aunque complicada en términos de eficacia– en algunas indicaciones.
Células madre
embrionarias humanas
Recientemente (Thomson et al., 1998; Reubinoff et al., 2000) se han conseguido las primeras
líneas de células madre embrionarias humanas
(hES), aunque por el momento las condiciones
de cultivo y expansión in vitro no están definidas al nivel de sus homólogas de ratón. No
obstante, dada la amplia experiencia que se ha
adquirido con las células ES de ratón (mES), el
mero hecho de su existencia ha abierto un gran
debate social y científico-ético sobre lo que
puede y/o debe ser investigado al amparo de
la financiación pública, y sobre reformas en las
leyes correspondientes que regulen la actividad
general y económica en torno a este nuevo potencial terapéutico.
Biología de las células madre
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Como hemos comentado anteriormente,
la gran ventaja teórica de partir de hES es que
éstas células deben de poseer el potencial (por
definición) de generar cualquier tipo celular humano. Esta premisa, sin embargo, es difícil de confirmar experimentalmente. De hecho, no existe
una prueba formal de que las células hES que se
manejan sean totalmente equivalentes a las mES;
en este sentido, ambas células tienen diferentes
requerimientos de crecimiento y parecen ser
bastante más inestables genéticamente (Baker et
al., 2007). Sin duda es necesario acumular mucha más experiencia sobre el comportamiento
de éstas células en cultivo, antes de plantearse su
empleo en procedimientos clínicos.
En todo caso, la utilización de hES obliga a controlar, de forma reproducible, su capacidad de diferenciación a células o progenitores del linaje celular de interés. Así, se han realizado avances muy
significativos (p. ej., Narazaki et al., 2008), aunque
también se ha evidenciado que la identificación y
caracterización de las células derivadas ha de ser
exhaustiva, ya que los marcadores simples que
sirven en células primarias somáticas, pueden no
ser equivalentes sobre estas células obtenidas artificialmente (Martin et al., 2008).
Finalmente, la utilización generalizada de técnicas basadas en hES obligaría a disponer bien de
un panel amplio de líneas celulares que pudiesen
cubrir los haplotipos más comunes en una determinada población humana, o bien a desarrollar
una tecnología eficaz para conseguir el clonado
terapéutico. Ninguna de las dos situaciones son
posibles en la actualidad, aunque pueden convertirse en una realidad (Cibelli et al., 2007). En todo
caso, el traslado de esta tecnología a ensayos clínicos requerirá muy probablemente el disponer
las líneas equivalentes en algún modelo animal
grande, cómo recientemente se ha conseguido
en el perro (Schneider et al., 2008).
La tercera vía
Se han identificado recientemente, tanto en
ratón como en el hombre, varias combinacio52
nes de genes cuya expresión exógena en una
célula diferenciada puede, por sí sola, promover
su reprogramación y desdiferenciación a célula
pluripotente (Takahashi et al., 2007). Este resultado ha sido ya validado por numerosos grupos
y abre definitivamente una nueva vía (la tercera
vía) para obtener células pluripotenciales humanas. Evidentemente, este nuevo tipo celular, iPS,
debe poseer muchas de las propiedades/cualidades de las hES, pero con la ventaja de poder
obtener «fácilmente» una línea autóloga de un
ser humano concreto. Los resultados relacionados con la inducción selectiva de diferentes linajes todavía es muy reducida, pero prometedora
(p. ej., Park et al., 2008), y habrá que acumular
más experiencia sobre estas células para evaluar
su interés final como dianas de procedimientos
de ingeniería tisular. En todo caso, la mayoría de
las reflexiones realizadas en el apartado anterior (hES) se aplicarían también a ésta nueva
opción terapéutica.
Una realidad incipiente.
Una nueva visión de algunas
patologías humanas
Hay que seguir alimentando el entusiasmo y
el soporte social que las nuevas posibilidades
terapéuticas basadas en la utilización de CM han
resucitado, pero manteniendo paralelamente un
gran rigor y una extremada cautela. Es necesario transmitir a la población la información de
forma equilibrada, y explicando que cualquier
avance significativo en el laboratorio tardará
más de 10 años en convertirse en una realidad
clínica establecida.
Las expectativas que generó en su día la
posibilidad de introducir en el organismo vivo
nuevas versiones «correctas» de los genes que
contenían mutaciones asociadas a enfermedades genéticas humanas (terapia génica) fueron
extraordinarias. La realidad sin embargo se
mostró mucho más exigente que la voluntad, y
9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana
han sido necesarios más de 25 años para que
los primeros beneficios clínicos (y no exentos
de problemas) hayan sido una realidad. Las consecuencias las hemos sufrido todos, incluyendo
investigadores, clínicos y pacientes. Sinceramente, esperamos que no ocurra lo mismo con las
infinitas posibilidades que la combinación de
terapia celular/génica pueden abrir al arsenal
terapéutico de la humanidad.
Debemos reconocer que aunque los avances
en el conocimiento de la biología de las CM
han sido enormes en la última década, todavía
estamos lejos de controlar completamente los
sistemas. Sin ir más lejos, en los últimos años
han surgido del genoma humano «nuevos jugadores» que eran completamente desconocidos en mamíferos hace unos años; nos estamos
refiriendo a los RNA de corto tamaño y no
codificantes (microRNA; miRNA) que parecen
jugar un papel importante en el control fino de
las transcripción/traducción (Garzon y Croce,
2008). Su papel en cáncer humano es indudable, pero su potencial papel sobre la biología de
CMA es todavía muy mal conocido. Por tanto,
debemos de ser humildes, y avanzar al ritmo
que el conocimiento básico nos permita, sabiendo aprovechar, al máximo, las opciones realistas
que existan en cada momento.
Por último, no todo son bondades en el nuevo universo de la célula madre, y su estudio nos
ha abierto los ojos a nuevos conceptos que
hace unos años eran pura especulación. Se ha
demostrado que ciertas poblaciones celulares,
originarias de la médula ósea, pero que pueden
pasar a la circulación en determinadas circunstancias, tienen un papel importante en el desarrollo de lesiones arterioscleróticas, así como en
el establecimiento de la vasculatura tumoral en
varios modelos. Los mecanismos moleculares
que activan esta movilización patológica de células madre no se conocen en detalle, pero esta
realidad fisiológica se está intentando explotar
para generar nuevas posibilidades terapéuticas;
precursores angioblásticos, aislados de sangre
periférica o de médula ósea, se intentan utilizar
como «vehículos celulares» para conseguir pro-
ducir biomoléculas de interés terapéutico en
zonas localizadas del cuerpo (tumores secundarios, pre-lesiones malignas o arterioescleróticas,
etc.). Estas estrategias de terapias combinadas
(celular-génica) están dando sus primeros frutos
en un nivel básico.
Más aún, una vieja teoría se va convirtiendo
en una realidad clínica día a día. Los tumores
sólidos son aglomeraciones de células muy heterogéneas genética y funcionalmente. En varios
modelos de tumores sólidos humanos se ha podido constatar que dentro de los tumores existe
una población muy minoritaria de células que es
la responsable de garantizar la propiedades del
tumor y su agresividad (su trasplante en modelos animales es capaz de reestablecer el tumor).
Esto ha reabierto la discusión sobre la existencia de las «células madre tumorales» (CMT o
CSC, del inglés Cancer Stem Cells), inicialmente
propuesto desde la hematoncología, y las implicaciones que esto tiene sobre la efectividad de
las terapias (Glinsky, 2008). La realidad es que
las células tumorales y ciertas poblaciones de
células madre poseen ciertas propiedades muy
asimilables y pueden estar relacionadas (fig. 8);
los próximos años nos depararán con seguridad
nuevas sorpresas y, probablemente, una nueva
visión de muchas de las patologías humanas.
Homeostasis
de los tejidos
y los órganos
Fisiología normal
Positivos
Negativos
Nuevas
Nuevas Células madre adultas
implicaciones
posibilidades
fisiopatológicas
terapéuticas
Cáncer (stem cells)
Figura 8. Equilibrios funcionales en células madre adultas.
Biología de las células madre
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Aislamiento celular/caracterización
Implantación
alogénica
Reimplantación
autóloga
Diferenciación controlada
¿ex vivo?
Cultivo
ex vivo
¿Biomateriales?
¿Modificación genética?
Expansión
ex vivo
Figura 9. Estructura de un ensayo de terapia celular típico.
Un futuro prometedor
El potencial terapéutico de las células madre
es enorme. Basta pensar en la cantidad de personas que todavía mueren a la espera de un
trasplante de órgano vital, a sabiendas que de
conseguir un donante adecuado, esto les ofrecería unos cuantos años con calidad de vida.
En otros casos, algunos órganos del paciente
sufren daños debidos a procesos traumáticos,
patológicos o causados por hábitos insanos,
que solamente pueden ser aliviados mediante
complejos procedimientos clínico-quirúrgicos.
La tecnología asociada a la manipulación de
células madre empieza a ofrecer un futuro en
todos estos campos. Poniendo por delante
que estamos hablando casi siempre de resultados obtenidos en modelos animales de experimentación (rata, ratón y, en el mejor de los
casos, cerdo) y que su traslado al ser humano es abismal, el futuro es muy prometedor.
Prácticamente a diario se hacen públicos en las
revistas científicas más prestigiosas resultados
espectaculares. Como ejemplo citemos solamente los primeros resultados de seguridad/
factibilidad (fase I) de empleo de células de
medula ósea (movilizadas a sangre periférica)
en el tratamiento del fallo hepático crónico
(Levicar et al., 2008).
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Sin embargo, cualquier revolución técnica, y
no digamos médica, requiere su tiempo de acumulación de experiencia, reflexión y evaluación
en una muestra significativa de la población. En
todas las diferentes etapas implicadas en el desarrollo de cualquier aplicación clínica de CM
(fig. 9) se esperan avances significativos y, muy
probablemente, el formato de la producción
celular asociada a los ensayos clínicos en los
próximos años se parecerá poco a los actuales.
Démosle tiempo al tiempo y dejemos que este
valor absoluto ponga a cada uno en su lugar.
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