Prevalencia de Polimorfismos de base única de alto riesgo en el

Prevalencia de Polimorfismos de base única de alto riesgo en el gen Lisil oxidasa
like 1 LOXL1 en población mexicana y su asociación positiva con el síndrome de
Pseudoexfoliación y Glaucoma pseudoexfoliativo.
Pseudoexfoliación una enfermedad genética…
RESUMEN
Introducción: El síndrome de pseudoexfoliación es una enfermedad con características
oftalmológicas, sistémicas y alto riesgo de complicaciones quirúrgicas así como la
primera causa de glaucoma secundario y recientemente se ha asociado a alteraciones
genéticas.
Propósito: Describir la prevalencia de
polimorfismos (SNP) del gen LOXL1 en la
población mexicana en pacientes sanos y con pseudoexfoliación (PEX) y el riesgo de
enfermedad al presentarlos.
Métodos: 98 pacientes con PEX y 98 controles. Secuenciación de SNPs: rs2165241,
rs1048661, y rs3825942 y análisis estadístico de asociación con PEX.
Resultados: Se describen las características demográficas y oftalmológicas. Se
encuentran valores estadísticamente significativos (p<0.05) de OR para PEX con el
SNP rs1048661 de 0.49 (alelo GG) y 3.01 (alelo GT).
Respecto a rs3825942 el alelo GG estuvo presente en el 100% de los PEX y en el
95.8% de sanos (p=0.0470) indicando riesgo para PEX. El OR para PEX con
rs2165241 fue de 0.33 (alelo CC) y 2.16 (alelo TT).
Discusión: la prevalencia de los alelos de alto riesgo se ha demostrado en otras
poblaciones también está presente en población mexicana.
Conclusión: Los alelos rs1048661 GT, rs3825942 GG y rs2165241 TT confieren mayor
riesgo de presentar PEX, algo nunca antes demostrado para la población mexicana.
Palabras
clave:
síndrome
de
pseudoexfoliación,
glaucoma
pseudoexfoliativo,
polimorfismos de base única, riesgo genético, genética de poblaciones.
SUMMARY
Introduction: Pseudoexfoliation syndrome (PEX) is a disease with ophthalmologic and
systemic characteristics and with a high risk of surgical complications and is the leading
cause of secondary glaucoma. Recently, it has been associated with genetic alterations.
Purpose: To describe the prevalence of single base polymorphisms (SNP) of the LOXL1
gene in Mexican population in healthy subjects and PEX and the risk of the disease with
the polymorphism association.
Methods: 100 patients with PEX diagnosis and 98 healthy subjects. We performed
SNPs sequencing analysis of the rs2165241, rs1048661, y rs3825942 polymorphisms
and a statistical association analysis.
Results: We describe demographic and ophthalmologic characteristics. We found
statistically significant differences (p<0.05) and an OR for PEX with rs1048661 SNP of
0.49 (GG allele) and 3.01 (GT allele). GG allele was present in 100% of PEX patients in
rs3825942 and in 95.8% of healthy subjects (p=0.0470) that supposes a high risk
polymorphism for PEX. PEX OR with rs2165241 was 0.33 (CC allele) and 2.16 (TT
allele).
Discussion: high risk alleles have been demonstrated in other populations and are also
present in mexican population.
Conclusion: rs1048661 GT, rs3825942 GG y rs2165241 TT alleles confers high risk for
PEX syndrome. This association has never been proved in mexican population.
Key words: pseudoexfoliation syndrome, pseudoexfoliation glaucoma, single base
polymorphisms, genetic risk, population genetics.
INTRODUCCIÓN
El síndrome de Pseudoexfoliación (PEX), descrito por primera vez en 1917 por
Lindberg14, es un trastorno de la formación de matriz extracelular relacionado a la edad
que se asocia a formación de catarata y glaucoma secundario. Afecta hasta al 30% de
la población mayor de 60 años y se diagnostica biomicroscópicamente por la presencia
de depósitos fibrilares en estructuras oculares del segmento anterior.1, 12, 14
Las alteraciones características observadas en el síndrome PEX predisponen a los
tejidos a un amplio espectro de complicaciones intraoculares como facodonesis,
subluxación de cristalino, glaucomas de ángulo cerrado y glaucoma de ángulo abierto
secundario, dispersión de melanina, midriasis anormal, disfunción de la barrera
hematoacuosa, sinequias posteriores y descompensación endotelial. Además se ha
relacionado a complicaciones quirúrgicas como dehiscencia zonular, ruptura de cápsula
posterior, hemorragia intraocular proveniente del iris e inflamación postoperatoria.
Además de las manifestaciones oculares, el síndrome PEX es un proceso sistémico,
que se asocia a un incremento de morbilidad cardiovascular y cerebrovascular.
1, 17, 18
El síndrome es un reto diagnóstico y terapéutico dadas las altas tasas de morbilidad
ocular a las que se asocia. Actualmente, el síndrome PEX es el único factor
clínicamente identificable como causante de glaucoma de ángulo abierto. En algunas
poblaciones la presencia de glaucoma secundario a PEX es mayor que la forma
crónica de glaucoma de ángulo abierto. Por ejemplo, en la península arábica, el
síndrome PEX es causa de 77% de los glaucomas de ángulo abierto.1, 19
El síndrome PEX ocurre en todas las regiones geográficas en el mundo, con una
prevalencia reportada en promedio de 10 a 20% de la población mayor de 60 años.
Existe una tendencia clara del padecimiento a agruparse geográficamente y en ciertos
grupos raciales y étnicos, que se cree que se deben a variabilidad genética. Otras
líneas de evidencia que sugieren un origen genético de PEX son la agregación familiar,
transmisión entre generaciones, alta tasa de concordancia en gemelos monocigóticos,
incremento del riesgo de PEX en parientes afectados, pérdida de heterocigocidad y
estudios que se han realizado genes del antígeno leucocitario humano (HLA). 1
Se ha demostrado que PEX es el único factor clínicamente identificable como
agente causal de glaucoma secundario en muchas poblaciones. En el Reykjavik Eye
Study, se identificó que el 40% de los individuos mayores de 80 años tenían PEX. 3 En
otros estudios se ha encontrado que el riesgo de desarrollar características clínicas
compatibles con PEX en 15 años es cerca del 60% en algunas poblaciones.4
La prevalencia de PEX varía ampliamente, con la prevalencia más alta en países
nórdicos europeos (hasta 25%) y 5-15% en población del centro de Europa.
5
Estudios
epidemiológicos recientes en algunos países han sugerido que la prevalencia de
síndrome PEX es de magnitud mayor a la que se había reportado previamente en
población mayor y en pacientes con glaucoma.
6
Fisiopatología de la pseudoexfoliación
El modelo actual de PEX describe a la condición como un tipo específico de
elastosis inducida por estrés, una microfibrilopatía elástica asociada a producción
excesiva de microfibrillas elásticas y su agregación a fibrillas típicas de PEX.
Existe también evidencia de que condiciones de estrés celular, como estrés
oxidativo e isquemia/hipoxia son mecanismos implicados en la patología de PEX. Se
han encontrado niveles bajos de ácido ascórbico e incremento de marcadores de
estrés oxidativo que sugieren una falla en el sistema antioxidante de defensas y estrés
oxidativo en cámara anterior de ojos con PEX.1
Estos hallazgos hacen evidente que la fisiopatología del síndrome PEX se
asocia con producción excesiva de componentes del sistema de microfibrillas elásticas,
procesos de entrecruzamiento enzimático, sobreexpresión de (factor de crecimiento
transformante 1 (TGF-1), una mala regulación proteolítica entre metaloproteinasas
de matriz (MMP) e inhibidores tisulares de metaloproteinasas de matriz (TIMP),
procesos inflamatorios, incremento del estrés celular y oxidativo, alteración de la
respuesta celular al estrés que se refleja en la disminución de expresión de enzimas
antioxidantes, enzimas conjugadas con ubiquitina, clusterina y proteínas de reparación
de DNA.1
Mucha de la evidencia reciente sugiere que el síndrome PEX es una
fibrilinopatía. La fibrilina-1, el componente principal de microfibrillas elásticas y de las
microfibrillas de PEX. Esta proteína es capaz de múltiples interacciones moleculares
con componentes de matriz como fibulina-1,2, versican y LTBP-1, que se encuentran
presentes en el material PEX. La acumulación anómala y su agregación se pueden
deber a disfunción del sistema ubiquitina-proteasoma y por una deficiencia de
clusterina, que actúa como chaperona de matriz extracelular y previene la precipitación
y agregación de proteínas.24
Estudios realizados mediante inmunohistoquímica han demostrado que el
material PEX es un complejo de glicoproteínas y proteoglicanos que comparten
epítopes de membrana basal y sistema fibrilar elástico. Entre sus componentes se
encuentra elastina, tropoelastina, amiloide P, vitronectina y componentes de
microfibrillas elásticas como fibrilina-1, glicoproteína asociada a microfibrillas (MAGP1), LTBP-1 y 2. Estudios de análisis directo con cromatografía líquida han hecho
evidente que el material PEX consiste de componentes de microfibrillas elásticas como
fibrilina-1, fibulina-2, vitronectina, sindecan, versican, clusterina, lisil oxidasa like y otras
proteínas.21
Se han hecho avances significativos en nuestro conocimiento de la naturaleza
molecular del material PEX y glaucoma secundario a PEX a nivel de transcriptoma,
proteoma y genoma. Los estudios de expresión diferencial de genes han identificado
transcritos que presentan una regulación negativa y positiva en ojos de pacientes de
glaucoma por pseudoexfoliación comparados con controles sin glaucoma. Muchos de
estos genes que presentan regulación diferencial están involucrados con metabolismo
y estructura de matriz extracelular así como las respuestas a estrés e inflamación. El
análisis proteómico del material PEX sugiere que la matriz extracelular y las proteínas
de respuesta al estrés se asocian con glaucoma secundario a PEX. Más
recientemente, LOXL1 (que está involucrado en la estabilidad y formación de matriz
extracelular) se ha descrito como el primer gen asociado con riesgo de desarrollar
glaucoma secundario a PEX. Para explicar todos los hallazgos fisiopatológicos,
finalmente se ha propuesto un modelo de “absorción” de proteínas que toma en cuenta
a las múltiples proteínas asociadas con material PEX y describe la formación molecular
de este material en el ojo.26, 27
Factores genéticos y síndrome de pseudoexfoliación
Aparentemente el patrón de herencia del síndrome PEX es autosómico
dominante, con inicio tardío y penetrancia incompleta, lo que hace difícil el análisis
genético.
Se
han
localizado
regiones
cromosómicas
que
están
asociadas
tentativamente con PEX. Estudios de ligamiento han identificado 3 locus genéticos, en
2p15, 2q35-36, 3q13-q21. Además, se ha encontrado una alta incidencia de lesiones
genéticas en cromosoma 7 en el 60 a 80% de los pacientes con PEX por pérdida de
heterocigocidad en regiones microsatélite en estos pacientes. A la fecha, no se han
realizado estudios epidemiológicos en grandes zonas del planeta, como África central y
América del Sur.1 Se ha identificado asociación con HLA y síndrome PEX,
específicamente existen 14 antígenos fuertemente asociados, que confieren una razón
de momios (OR, por sus siglas en inglés) de 7.5 en sujetos con PEX.6
Se ha concebido que un defecto en la dinámica del humor acuoso o involucro
adicional de un “gen de susceptibilidad” a glaucoma puede predisponer al desarrollo de
glaucoma en ojos con PEX.1 Existen 3 genes, MYOC, OPTN, WDR36 que se han
encontrado mutados en algunos pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto,
pero son de frecuencia baja a moderada y sólo explican una pequeña fracción de casos
de glaucoma. 28, 29, 30
Un estudio de escaneo del genoma ha encontrado 1000 marcadores
microsatélite en una familia finlandesa con PEX, demostrando un patrón de herencia
autosómico dominante con penetrancia incompleta y se sugiere que la región de riesgo
se encuentra en 18q12.1-22.33 y regiones del cromosoma 21, 17p y 19q.31
Pseudoexfoliación y LOXL1
Recientemente se han descrito 3 polimorfismos de un base única (SNP)
localizados en el gen de la lisil oxidasa like-1 que han mostrado tener una alta
asociación a glaucoma asociado a PEX. Éstos se han descrito como rs2165241, que se
localiza en el primer intrón del gen que se encuentra en 15q24.1. Los otros dos SNP se
encuentran en el primer exón y se han descrito como rs1048661 (R141L) y rs3825942
(G153D).2
Estos SNP han mostrado una fuerte asociación con glaucoma en el alelo T de
rs2165241, confiriendo un OR para glaucoma secundario a PEX de 3.40 con p=4.3x1012
en población de Islandia y también en población sueca, presentando un OR de 3.78
con p=3.1x10-17. Al combinar estas poblaciones el OR se mantiene en 3.62 con
p=1.0x10-27. De forma interesante, el alelo T de rs2165241 se encuentra en casos de
PEX con y sin glaucoma con la misma frecuencia. Estos resultados indican que la
variante de susceptibilidad conferida por este SNP es una variante de riesgo para PEX
y glaucoma por PEX.2
Los SNP rs1048661 (R141L) y rs3825942 (G153D) que se localizan en el primer
exón del gen LSXL1 tienen también una asociación fuerte con glaucoma secundario a
PEX, con un OR de 2.46 con p=2.3x10-12 para el alelo G de rs10948661 y OR de 20.10
con p=3.0x10-21 para el alelo G de rs3825942.2
Dentro de los 3 haplotipos encontrados en esta población, los genotipos (G,A) y
(G,G) tienen un OR de 27.05 con p =4.0x10-27 y el haplotipo (T,G) un OR de 8.90 con
p=1.6x10-8.2
En un estudio realizado en población de Europa Central, se encontró que la
frecuencia de los 2 SNP exónicos fue significativamente mayor en los sujetos con PEX
que en los pacientes control, presentando un OR de 52.1 y 14.67 respectivamente para
los haplotipos de alto riesgo GG y TG comparado con el haplotipo GA. 9 En otros
estudios se ha demostrado que las secuencias GG y GT se encuentran altamente
asociados con fenotipos PEX y el efecto combinado de estos SNP muestran que el
haplotipo GGT tiene una frecuencia de 66% de los casos de PEX y por lo tanto
constituye un factor de riesgo mayor para el desarrollo de PEX. De la misma forma, el
haplotipo GAC en casos de síndrome PEX es muy poco frecuente y tiene un potencial
efecto protector para esta condición con una reducción aproximada de riesgo atribuible
de 457%. La combinación de los 3 haplotipos se asocia con 91% de los casos con
síndrome PEX.10
En individuos japoneses con PEX y glaucoma secundario a PEX también se han
identificado los SNP exónicos del gen de LSXL1 y su asociación significativa con este
padecimiento, sin embargo, se encontró una inversión de frecuencia de alelos
comparado con población caucásica, lo que indica que se necesitan más estudios
genéticos y funcionales para clarificar los mecanismos genéticos involucrados en la
formación de PEX.12
El gen LOXL1 es un miembro de la familia de proteínas lisil oxidasa, que cataliza
la deaminación oxidativa de residuos de lisina de la tropoelastina, lo que induce su
entrecruzamiento espontáneo y formación consecutiva de polímeros de elastina. El
proceso de elastogénesis también requiere microfibrillas que contienen fibrilina que
actúan como moldes para guiar el proceso de entrecruzamiento y el depósito de
elastina. La familia de lisil oxidasa tiene 5 miembros, que codifican el prototipo de la
proteína LOX y LOX-like LOXL1 a 4. Todos los miembros de la familia tienen una
estructura similar en los 7 exones que las componen, de los cuales 5 (2 a 6) tienen
gran homología y codifican el dominio catalítico carboxilo terminal de estas proteínas.
La diferencia de secuencia de los genes LOX reside principalmente en el exón 1, que
codifica un pro-péptido que se libera después de que LOXL1 ha adquirido su
conformación de molde para producir la activación catalítica de la enzima. Existen
estudios que han demostrado que el pro-péptido LOXL1 se une a la tropoelastina y
fibulina-5 y que estas interacciones son esenciales para dirigir el depósito de la enzima
en las fibras elásticas.11
Aunque el papel de LOXL1 en la formación de matriz extracelular en el ojo no se
ha documentado, se sabe que su expresión ocurre en tejidos oculares como lámina
cribrosa, epitelio anterior del cristalino, córnea, músculo ciliar y malla trabecular, que
están involucrados en la formación de matriz extracelular.32
La demostración de 2 SNP codificantes, rs1048661 y rs3825942 en pacientes
con PEX que lleva a un cambio en aminoácidos en la posición 141 (Arg → Leu) y 153
(Gly → Asp) de la porción amino terminal de la proteína LSXL1 puede afectar la
actividad catalítica a través de modificaciones del sitio de ruptura del propéptido y la
capacidad de unión a sustratos como tropoelastina y fibulina-5. Se ha identificado una
menor expresión de LSXL1 en tejido adiposo de sujetos con PEX y se cree que los
bajos niveles de expresión tisular pueden predisponer a la formación de material de
PEX. En Islandia y Suecia, el haplotipo de alto riesgo es muy común con una
frecuencia promedio de 50% en la población general y cerca del 25% de los individuos
en la población general son homocigotos para el haplotipo de alto riesgo y su riesgo de
tener glaucoma secundario a pseudoexfoliación se estima 700 veces mayor que el de
los individuos que tienenen el haplotipo de bajo riesgo o 2.47 veces el riesgo de la
población promedio. De esta forma, ambos polimorfismos explican más del 99% de los
casos de pacientes con glaucoma secundario a pseudoexfoliación. 2
Recientemente se ha instituido en Islandia la prueba genética de riesgo de PEX
basada en el análisis e los 3 SNP de alto riesgo de PEX encontrados en el gen de
LOXL18 pero se necesitan más estudios genéticos en otro tipo de poblaciones con PEX
y glaucoma secundario a PEX para determinar el riesgo mundial asociado con los SNP
del gen de LOXL1, la presencia de PEX y glaucoma secundario a PEX.8
La teoría más actual que intenta explicar la formación de material PEX es el
modelo protéico de “absorción”, que propone una nucleación aberrante de proteínas o
complejo de nucleación protéica, en el que las proteínas se unen en el humor acuoso.
Estas proteínas forman un complejo proteína-matriz que eventualmente se precipita y
forma el material PEX.8
A nivel molecular, el modelo protéico de “absorción” requiere de una proteína
aberrante o un complejo aberrante proteína-proteína (por ejemplo, una LOXL1 mutada),
la nucleación aberrante se une secuencialmente a proteínas normales (el dominio Cterminal de fibulina-5 que puede unirse directamente al dominio catalítico de LOXL1)
para formar n complejo mayor. La fibulina 5 interactúa a su vez con fibrilina-1 y este
complejo grande de proteínas se desestabiliza formando proteínas con nucleación
aberrante y se precipita. En esta conformación, proteínas chaperonas como la
clusterina se precipita en el complejo y forma el material PEX. Esto resulta a su vez en
menor expresión de clusterina en el humor acuoso y forma un “absorción” protéica y
precipita otras proteínas de matriz extracelular normal en estructuras del segmento
anterior. Finalmente, la fuga de vasos del iris permite la entrada de proteínas normales
en el humor acuoso que interactúan con las proteínas ya acumuladas y participan en la
formación de PEX.8
MATERIAL Y MÉTODOS
Se reclutaron 98 sujetos sanos y 100 pacientes con diagnóstico de síndrome PEX (57
con glaucoma secundario y 43 sin glaucoma) que aceptaron participar en el estudio.
Cada paciente firmó carta de consentimiento bajo información y se parearon las
muestras para evitar variación respecto a la edad de los sujetos con diagnóstico de
PEX y los sujetos sanos. Se recolectaron datos demográficos y oftalmológicos de los
pacientes: Edad, género, agudeza visual, visión en PL o NPL, presión intraocular,
excavación del nervio óptico, presencia de catarata significativa (>N1C1P1, LOCS III),
afaquia, ojos con tratamiento médico o quirúrgico (facoemulsificacion o extracción
extracapsular de catarata).
A todos los sujetos de les tomó una muestra de sangre periférica con el fin de
obtener DNA genómico e identificar los 3 polimorfismos de interés por PCR y
secuenciación nucleotídica. Se utilizaron los oligonucleótidos 5′-AGG CGC GGC ACC
CAT TCG GCT T -3’ (sentido) y 5′-TAG GAG GGC TGC TGG CGG TAG GT-3’
(antisentido) para amplificar un segmento del exón 1 del gen LOXL1 que contiene los 2
SNPs exónicos rs1048661 (R141L) y rs3825942 (G153D) en una longitud de 178 pdb.
Además se utilizó un segundo par de oligonucleótidos para amplificar un segmento del
intrón 1 que contiene el SNP rs2165241: 5′-TAG AAT GCA AGA CCT CAG CAT-3′
(sentido) y 3′-CCT TAA GAA CTA ACA GCC CAA-5′ (antisentido) en un producto de
170pdb.
Cada reacción de amplificación de PCR tuvo un volumen final de 25 microlitros y
tenía buffer para PCR 1X, de 50-100 ngs de DNA genómico, 0.2 mM de cada uno de
los cuatro dNTP’s, 2.5 unidades de enzima Taq polimerasa, 1mM del oligonucleótido
correspondiente (sentido y antisentido), MgCl2 entre 1 y 3 mM y agua bidestilada c.b.p.
25 microlitros. Se utilizó un programa de temperaturas que incluye 1 ciclo de 3 min a
95°C para la desnaturalización inicial, 35 ciclos con 1 min de desnaturalización a 95°C,
1 min de alineamiento a temperaturas específicas para cada par de oligonucleótidos y 1
min a 72°C para la extensión. Por último, se realizó 1 ciclo a 72°C por 10 min para la
extensión final.
Los
productos
obtenidos
de
la
amplificación
se
separaron
mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1.2% con tinción de bromuro de etidio para
identificar las bandas específicas con el producto amplificado, utilizando como
referencia un marcador estándar de peso molecular de 100 pb (Figura 1 y 2). Se
reconocieron las bandas de interés y se escindieron del gel para la purificación del
producto de DNA amplificado utilizando el método de purificación por columna
(Qiagen). La concentración del DNA amplificado obtenido de la purificación se
determinó por medio de la comparación de la intensidad de las bandas obtenidas con
respecto a un marcador de masa estándar (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen) en un
gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio.
Figura 1. Imagen del gel de electroforesis en el cual se observa el amplificado del exón
1 de LOXL1 de 178 pares de bases.
Figura 2. Imagen del gel de electroforesis en el cual se observa el
amplificado del exón 1 de LOXL1 de 170 pares de bases.
Secuenciación automatizada de los productos de PCR: Se realizaron nuevas
reacciones de PCR para la secuenciación nucleotídica de cada uno de los fragmentos
génicos. Cada reacción de 10 microlitros contenía 0.5 microlitros de BigDye Terminator
Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) que contiene los cuatro dideoxinucleótidos
trifosfatados (ddNTPs) marcados por fluorescencia, deoxionucleótidos trifosfatados
(dNTPs) no marcados, Tris-HCl (Ph 9.0), MgCl2 y la enzima ampliTaq polimerasa; se
agregó además 1 microlitro del oligonucleótido correspondiente a una concentración
de 10 micromolar, 10-20 ngs del DNA de cada producto de PCR como templado, 3.5
microlitros de buffer de secuenciación y agua bidestilada para un volumen final de 10
microlitros. Para esta reacción de PCR se utilizó un programa de 25 ciclos que incluye
30 segundos a 95°C para la desnaturalización, 15 seg a 50°C para el alineamiento y 4
min a 60°C para la extensión.
Los productos de esta segunda amplificación de PCR se purificaron por medio
de
columnas
Centri-Sep
(Applied
Biosystems)
para
eliminar
el
exceso
de
oligonucleótido y de ddNTPs fluorescentes. Cada muestra se resuspendió en 20 L de
formamida y posteriormente se desnaturalizó a 95°C por 5 min. Los productos se
analizaron por electroforesis capilar en un secuenciador automático ABI Prism 310
(Applied Biosystems) y las secuencias de DNA obtenidas en sujetos enfermos se
compararon con las secuencias silvestres del gen LOXL1 para identificar las variantes
alélicas de interés (Figura 3,4 y5 ).
Figura 3: imagen en donde se muestra la doble señal de la heterocigocidad C/T en el
SNP rs2165241
Figura 4: Imagen donde se muestra la doble señal de la heterocigocidad T/G en el SNP
rs1048661
Figura 4: Imagen donde se muestra la doble señal de la homocigocidad G/G en el SNP
rs3825942
ANALISIS DE RESULTADOS
Los resultados fueron expresados en frecuencias simples y porcentajes. Para
cada variante específica se efectuó una prueba de X2 para identificar significancia
estadística. Se considerarán valores significativos de p aquellos <0.05. Los resultados
serán comparados con los datos disponibles en la literatura del estudio de diversos
grupos étnicos. De mismo modo, se analizó el efecto aditivo de dos o más
polimorfismos entre cada grupo y se analizaron las diferencias mediante X2. La
determinación de la razón de momios o razón de probabilidades (odds ratio) para cada
variante o haplotipos específicos se realizó por medio de tablas de contingencia de 2 x
2 con la formula:
Se identificaron las variantes o haplotipos que confieren mayor riesgo para el desarrollo
de la enfermedad. Para la confirmación de la asociación entre la enfermedad y
haplotipos específicos se realizó análisis multivariado con un modelo de regresión
logística. Se utilizó el programa SPSS (versión 12.0) y se consideraron significativos los
valores de p menores a 0.05. a
RESULTADOS.
La edad promedio de los diferentes grupos fue de 70.48±7.5 en el grupo de controles
sanos, de 73.4±7.6 en el grupo de PEX sin glaucoma y de 75.87±8.26 para el grupo de
GPEX, la diferencia entre ellos no fue estadísticamente significativa.
De los 98 pacientes control, 59 fueron mujeres y 39 varones, en el grupo de PEX
fueron 37 mujeres y 6 varones y en el grupo de GPEX fueron 30 mujeres y 27 varones.
Las diferencias entre estos grupos no fueron significativas.
Las agudezas visuales (logMAR) fueron estadísticamente más bajas en el grupo de
GPEX (OD: 0.58±0.74, OI: 0.64±0.35) comparadas con las de PEX (OD:0.27±0.32 OI:
0.35±0.51 ) y Controles (OD: 0.32±0.50 OI: 0.33±0.54 ).
Las Presiones intraoculares fueron significativamente más altas en el grupo de GPEX
(OD: 17.34±8.26, OI: 16.98±8.56) comparadas con las de PEX (OD: 14.02±2.5 OI:
15.4±7.4 ) y Controles (OD: 14.27±3.3 OI: 14.68±3.89 ).
Las excavaciones del NO (relación copa/disco) fueron significativamente más grandes
en el grupo de GPEX (OD: 80.2±19.04 OI: 76.75±17.3) comparadas con las de PEX
(OD: 35.8±11.5 OI: 35.35±12.5) y Controles (OD: 40.11±18.38 OI: 40.56±17.80 ).
El 32% (64/196 ojos) de los ojos del grupo control presentaron algún tipo de catarata
significativa (>N1C1P1, LOCS III). El 61.6% (53/86 ojos) de los ojos del grupo PEX
presentaron algún tipo de catarata significativa. El 61% (70/114 ojos). El porcentaje de
ojos con catarata no fue significativamente diferente entre grupos.
El grupo control resulto tener significativamente (p <0.05) un mayor número de ojos
pseudofacos 56.1% (110/196 ojos) comparado con el grupo PEX 38% (33/86 ojos) y
grupo GPEX 63% (36/114 ojos).
El 0.5% (1/196 ojos) de los ojos del grupo control presentaron afaquia. El 2.3% (2/86
ojos) de los ojos del grupo PEX presentaron afaquia y el 4.3% (5/114 ojos) de los ojos
en GPEX presentaron afaquia. El porcentaje de ojos con afaquia en el grupo GPEX fue
significatimente mayor con respecto a los otros grupos.
El 4% (8/196 ojos) de los ojos del grupo control presentaron visión de percepción de luz
(PL) o no percepción de luz (NPL). El 6.9% (6/86 ojos) de los ojos del grupo PEX
presentaron visión de PL o NPL y el 23% (27/114 ojos) de los ojos en GPEX
presentaron visión de PL o NPL. El porcentaje de ojos con visión de PL o NPL en el
grupo GPEX fue significativamente (p <0.05) mayor con respecto a los otros grupos.
El 2.5% (5/196 ojos) de los ojos del grupo control requirieron de tratamiento hipotensor.
El 3.4% (3/86 ojos) de los ojos del grupo PEX requirieron de tratamiento hipotensor y el
23% (27/114 ojos) de los ojos en GPEX requirieron de tratamiento hipotensor. El
porcentaje de ojos con tratamiento hipotensor GPEX fue significativamente (p <0.05)
mayor con respecto a los otros grupos.
El 0.5% (1/196 ojos) de los ojos del grupo control requirieron de tratamiento quirúrgico
para controlar la presión intraocular. Ninguno de los ojos del grupo PEX requirieron de
tratamiento quirúrgico y el 4.38% (5/114 ojos) de los ojos en GPEX requirieron de
tratamiento quirúrgico hipotensor. El porcentaje de ojos operados fue significativamente
(p <0.05) mayor en el grupo GPEX con respecto a los otros grupos.
Ninguno de los pacientes del grupo de controles sanos ni del grupo de PEX requirió de
tratamiento médico y quirúrgico para controlar la presión intraocular, sin embargo 16
pacientes del grupo GPEX si requirieron de tratamiento combinado médico quirúrgico
para el control de la hipertensión ocular.
El 67% (66/98 pac) de los ojos del grupo control habían sido operados de cirugía de
facoemulsificación en algún ojo. El 48% (21/43 pacientes) de los ojos del grupo PEX
requirieron facoemulsificación y el 42% (24/57 pacientes) de los ojos en GPEX
requirieron de facoemulsificación. El porcentaje de ojos operados de facoemulsificación
entre los 3 grupos no mostró diferencias estadísticamente significativas.
El 3% (3/98 pac) de los ojos del grupo control habían sido operados de cirugía de
extracción extracapsular de catarata (EECC) en algún ojo. El 4.6% (2/43 pacientes) de
los ojos del grupo PEX requirieron EECC y el 5.2% (3/57 pacientes) de los ojos en
GPEX requirieron de facoemulsificación. La diferencia en el porcentaje de ojos
operados de EECC entre los 3 grupos no fue estadísticamente significativa.
Con respecto a la frecuencia de los alelos en los diferentes grupos se obtuvieron los
siguientes resultados:
El SNP rs1048661 presento las siguientes frecuencias de alelos: el TT en grupo control
7 (9.7%) pacientes, en grupo PEX 2 (5.1%) y en grupo GPEX 2 (3.7%). El TG en grupo
control 12 (16.7%) pacientes, en grupo PEX 16 (41%) y en grupo GPEX 19 (35.2%)
Estos dos últimos mostraron diferencia estadísticamente diferente con respecto a los
otros grupos por prueba de X2. El alelo GG se presento en el en grupo control en 53
(73.6%) pacientes, en grupo PEX 53 (73.6%) y en grupo GPEX 33 (61.1%).
El SNP rs3825942 presento las siguientes frecuencias de alelos: el AA en grupo control
1 (1.4%) pacientes, en grupo PEX 0 (0%) y en grupo GPEX 0 (0%). El AG en grupo
control 2 (2.8%) pacientes, en grupo PEX 0 (0%) y en grupo GPEX 0 (0%). El alelo GG
se presento en el en grupo control en 69 (95.8%) pacientes, en grupo PEX 39 (100%) y
en grupo GPEX 54 (100%).
El SNP rs2165241 presentó las siguientes frecuencias de alelos: el CC en grupo control
13 (21.3%) pacientes, en grupo PEX 4 (9.5%) y en grupo GPEX 4 (9.5%). El alelo CT
se presento en el en grupo control en 29 (47.5%) pacientes, en grupo PEX 18 (47.6%)
y en grupo GPEX 22 (41.5%). El TT en grupo control 19 (31.1%) pacientes, en grupo
PEX 20 (42.9%) y en grupo GPEX 27 (50.9%). Esta última frecuencia mostro diferencia
estadísticamente significativa con respecto a los otros dos grupos (p<0.05).
Con las frecuencias antes mencionadas se hicieron las comparaciones entre grupos y
los resultados que se arrojaron fueron los siguientes:
Al comparar frecuencias de alelos entre la población control y el grupo de PEX mas
GPEX (al cual denominaremos PEX total (TPEX)) mediante el cálculo de OR y
utilizando X2 para la significancia, se obtuvo lo siguiente
Grupo Control Vs TPEX. Exon 1 – SNP rs1048661
Para el alelo TT de Control vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 11.5%,
en TPEX 4.3%. Ausente en 88.5% de los sanos y ausente en 95.7% de los TPEX(
p=0.1662, con un OR=0.41).
Para el alelo TG de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 16.7%,
en TPEX 37.6%. Ausente en 83.3% de los sanos y ausente en 62.4% de los TPEX
(p=0.0031, con un OR =3.01). Por lo que este valor implica un riesgo estadísticamente
significativo asociado a síndrome de pseudoexfoliación.
Para el alelo GG de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 73.6%,
en TPEX 56.88%. Ausente en 26.4% de los sanos y ausente en 43.2% de los TPEX,
(p=0.0253, con un OR =0.49). Por lo que este valor implica una diferencia de
presentación estadísticamente significativa.
Grupo Control Vs TPEX. Exon 1 SNP rs3825942
Para el alelo AA de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en 1.4%, en
TPEX 0%. Ausente en 98.6% de los sanos y ausente en 100% de los TPEX
(p=0.2543).
Para el alelo AG de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 2.7%, en
TPEX 0%. Ausente en 97.3% de los sanos y ausente en 100% de los TPEX
(p=0.1131). En este caso dado que en la tabla de contingencia hay valores en cero, no
se pudo calcular un OR, sin embargo queda claro que el alelo AG solo estuvo presente
en gente sana.
Para el alelo GG de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 95.8%,
en TPEX 100%. Ausente en 4.2% de los sanos y ausente en 0% de los TPEX. Con una
(p=0.0470). En este caso dado que en la tabla de contingencia hay valores en cero, no
se pudo calcular un OR, sin embargo queda claro que el alelo GG solo estuvo ausente
en gente sana.
Grupo Control Vs TPEX. Intron 1 – SNP s2165241
Para el alelo CC de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 21.3%,
en TPEX 8.4%. Ausente en 78.7% de los sanos y ausente en 91.6% de los TPEX. Con
(p=0.0213, con un OR = 0.33).
Para el alelo CT de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 47.5%,
en TPEX 47.1%. Ausente en 52.5% de los sanos y ausente en 52.9% de los TPEX.
(p=0.9120, con un OR:0.80).
Para el alelo TT de Sanos vs. TPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 31.1%,
en TPEX 49.5%. Ausente en 68.9% de los sanos y ausente en 50.5% de los TPEX.
(p=0.0238, con un OR=2.16). Por lo que este valor implica un riesgo estadísticamente
significativo asociado a síndrome de pseudoexfoliación.
Al comparar frecuencias de alelos entre la población control y el grupo de PEX
mediante el cálculo de OR y utilizando X2 para la significancia, se obtuvo lo siguiente:
Grupo Control Vs PEX. Exon 1 – SNP rs1048661
Para el alelo TT de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 9.7%, en
PEX 5.1%. Ausente en 90.3% de los sanos y ausente en 94.9% de los PEX. (p=0.3973,
con un OR =0.50).
Para el alelo TG de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 16.7%, en
PEX 41%. Ausente en 83.3% de los sanos y ausente en 59% de los PEX. (p=0.004,
con un OR =3.47). Por lo que este valor implica un riesgo estadísticamente significativo
asociado a síndrome de pseudoexfoliación.
Para el alelo GG de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 73.6%, en
PEX 53.8%. Ausente en 26.4% de los sanos y ausente en 46.2% de los PEX
(p=0.0350, con un OR =0.41). Con diferencia estadísticamente significativa de
frecuencia de alelo asociado PEX.
Grupo Control Vs PEX Exon 1 SNP rs3825942
Para el alelo AA de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 1.4%, en
PEX 0%. Ausente en 98.6% de los sanos y ausente en 100% de los PEX. Con una
(p=0.2543).
Para el alelo AG de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 2.8%, en
PEX 0%. Ausente en 97.2% de los sanos y ausente en 100% de los PEX. (p=0.2936).
Para el alelo GG de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 95.8%, en
PEX 100%. Ausente en 4.2% de los sanos y ausente en 0% de los PEX. Con una
(p=0.1962).
Grupo Control Vs PEX
Intron 1 – SNP s2165241
Para el alelo CC de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 21.3%, en
PEX 9.5%. Ausente en 78.7% de los sanos y ausente en 90.5% de los PEX. (p=0.1133,
con un OR=0.38).
Para el alelo CT de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 47.5%, en
PEX 47.6%. Ausente en 52.5% de los sanos y ausente en 52.9% de los PEX. Con una
(p=0.9938, con un OR =1.0).
Para el alelo TT de Sanos vs. PEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 31.1%, en
PEX 42.9%. Ausente en 68.9% de los sanos y ausente en 57.1% de los PEX.
(p=0.2235, con OR=1.65).
Al comparar frecuencias de alelos entre la población control y el grupo de GPEX
mediante el cálculo de OR y utilizando X2 para la significancia, se obtuvo lo siguiente:
Grupo Control Vs GPEX Exon 1 – SNP rs1048661
Para el alelo TT de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo p resente en sanos en un 9.7%,
en GPEX 3.7%. Ausente en 90.3% de los sanos y ausente en 96.3% de los GPEX.
(p=0.244, con un OR=0.35).
Para el alelo TG de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo p resente en sanos en un 16.7%,
en GPEX 35.2%. Ausente en 83.3% de los sanos y ausente en 64.2% de los GPEX.
(p=0.0169, con un OR 2.71). Por lo que este valor implica un riesgo estadísticamente
significativo asociado a GPEX.
Para el alelo GG de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo p resente en sanos en un 73.6%,
en GPEX 61.1%. Ausente en 26.4% de los sanos y ausente en 38.9% de los GPEX.
(p=0.1358, con un OR=0.56).
Grupo Control Vs GPEX Exon 1 SNP rs3825942
Para el alelo AA de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 1.4%, en
GPEX 0%. Ausente en 98.6% de los sanos y ausente en 100% de los GPEX
(p=0.3846).
Para el alelo AG de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 2.8%, en
GPEX 0%. Ausente en 97.2% de los sanos y ausente en 100% de los GPEX.
(p=0.2936).
Para el alelo GG de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 95.8%,
en GPEX 100%. Ausente en 4.2% de los sanos y ausente en 0% de los GPEX.
(p=0.1290).
Para estas tres comparaciones no fue posible realizar un cálculo de OR dado que un
valor en las tablas de contingencia era cero.
Grupo Control Vs GPEX Intron 1 – SNP s2165241
Para el alelo CC de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 21.3%,
en GPEX 7.5%. Ausente en 78.7% de los sanos y ausente en 92.5% de los GPEX
(p=0.0396, con un OR=0.30). Esto implica una diferencia significativa en cuanto a la
presencia del alelo CC en pacientes sanos comparados con GPEX.
Para el alelo CT de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 47.5%,
en GPEX 41.5%. Ausente en 52.5% de los sanos y ausente en 58.5% de los GPEX.
(p=0.5183, con un OR=0.78).
Para el alelo TT de Sanos vs. GPEX: El alelo estuvo presente en sanos en un 31.1%,
en GPEX 50.9%. Ausente en 68.9% de los sanos y ausente en 49.1% de los GPEX.
(p=0.0317, con un OR 2.29). Por lo que este valor implica un riesgo estadísticamente
significativo asociado a GPEX.
Al comparar frecuencias de alelos entre la población PEX y el grupo de GPEX
mediante el cálculo de OR y utilizando X2 para la significancia, se obtuvo lo siguiente:
Grupo PEX Vs GPEX Exon 1 – SNP rs1048661
Para el alelo TT de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 5.1%, en
GPEX 3.7%. Ausente en 94.9% de los PEX y ausente en 96.3% de los GPEX. Con una
X2=0.11, y una p=0.7383, con un OR=0.71
Para el alelo TG de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 30.8%, en
GPEX 35.2%. Ausente en 69.2% de los PEX y ausente en 64.2% de los GPEX. Con
una X2= 0.20, y una p=0.6558, con un OR=0.78
Para el alelo GG de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 53.8 %, en
GPEX 61.1%. Ausente en 46.2% de los PEX y ausente en 38.9% de los GPEX. Con
una X2=0.49, y una p=0.4835, con un OR=1.34
Grupo PEX Vs GPEX Exon 1 SNP rs3825942
Para el alelo AA de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 0%, en
GPEX 0%. Ausente en 100% de los PEX y ausente en 100% de los GPEX. La prueba
de X2 no fue valorables pues dados los valores de la tabla de contingencia, se
presentaba una división sobre cero.
Para el alelo AG de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 0 %, en
GPEX 0%. Ausente en 100% de los PEX y ausente en 100% de los GPEX. La prueba
de X2 no fue valorables pues dados los valores de la tabla de contingencia, se
presentaba una división sobre cero.
Para el alelo GG de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 100%, en
GPEX 100%. Ausente en 100% de los PEX y ausente en 0% de los GPEX. La prueba
de X2 no fue valorables pues dados los valores de la tabla de contingencia, se
presentaba una división sobre cero.
Intron 1 – SNP s2165241
Para el alelo CC de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 9.5%, en
GPEX 7.5%. Ausente en 90.5% de los PEX y ausente en 92.5% de los GPEX. Con una
X2=0.12, y una p=0.7304, con un OR=
Para el alelo CT de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 51.3 %, en
GPEX 41.5%. Ausente en 48.7% de los PEX y ausente en 58.5% de los GPEX. Con
una X2=0.86, y una p=0.3524, con un OR
Para el alelo TT de PEX vs. GPEX: El alelo estuvo presente en PEX en un 42.9%, en
GPEX 50.9%. Ausente en 57.1% de los PEX y ausente en 49.1% de los GPEX. Con
una X2=0.61, y una p=0.4331, con un OR
DISCUSIÓN.
Se describen las características demográficas y oftalmológicas dentro de las cuales
resalta que son grupos demográficamente homogéneos lo que los hace comparables.
Es de llamar la atención que la capacidad visual, la presión intraocular y la excavación
del nervio óptico fueron peores en el grupo de GPEX comparado con los otros dos
grupos. La aparente mejor visión del grupo control podría atribuirse al mayor número de
pseudofacos, sin embargo es razonable también que los pacientes con PEX y GPEX
cursen con una peor capacidad visual. De igual manera el grupo de GPEX curso con
un mayor descontrol de presión intraocular, como era de esperarse, y los pocos
pacientes que tuvieron aumento de la presión intraocular en el grupo PEX y control, no
tuvieron daño glaucomatoso demostrado.
Se encuentran valores estadísticamente significativos (p<0.05) de OR para TPEX con
el SNP rs1048661 de 0.49 (alelo GG) y 3.01 (alelo GT).
Respecto a rs3825942 el alelo GG estuvo presente en el 100% de los PEX y en el
95.8% de sanos (p=0.0470) indicando riesgo para PEX, o visto de otra manera el tener
el alelo AA o AG es protector, sin embargo no se pudo calcular un valor de OR por la
presencia de un cero en la tabla de contingencia.
El OR significativo para TPEX con rs2165241 fue de 0.33 (alelo CC) y 2.16 (alelo TT).
Al comparar pacientes control vs PEX, se encontraron valores estadísticamente
significativos (p<0.05) de OR para PEX con el SNP rs1048661 de 0.41 (alelo GG) y
3.47 (alelo GT).
Al comparar pacientes control vs GPEX, se encontraron valores estadísticamente
significativos (p<0.05) de OR para GPEX con el SNP rs1048661 de 2.71 (alelo GT) y
para el SNP s2165241 un OR de 0.30 (alelo CC) y 2.29 (alelo TT).
Todas las demás comparaciones no alcanzaron significancia estadística.
No hay reportes en la literatura mexicana sobre estudios de genética de poblaciones
que involucren el estudio de población con PEX y su relación con algún polimorfismo
de riesgo.
Estos resultados son similares a lo reportado por otros autores en otras poblaciones,
por lo que en la población mexicana de manera similar tener estos alelos es factor de
riesgo para padecer PEX o GPEX según sea el alelo presente.
CONCLUSIÓN
Este estudio describe la asociación entre los polimorfismos de alto riesgo del gen
LOXL1 en el síndrome de pseudoexfoliación con y sin glaucoma en población
mexicana, una población nunca antes estudiada para esta asociación. Se señala una
asociación positiva tanto con PEX y GPEX dependiendo el alelo. Estos hallazgos son
similares a los descritos en otras poblaciones de norte América y Europa. De cualquier
manera se necesitan más estudios como este en otras poblaciones para continuar
determinando la influencia de LOXL1 en el síndrome de pseudoexfoliación.
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