La eritropoyetina (Epo) es una hormona glicoproteica que activa la

Materia: LABORATORIO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
Tema: RELACIÓN ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA ERITROPOYETINA
Lugar de trabajo: Laboratorio de Análisis Biológicos, Dpto. de Qca. Biológica
Tutores: Dras. Alcira Nesse y Daniela Vittori
Introducción
La eritropoyetina (Epo) es una hormona glicoproteica que activa la eritropoyesis y mantiene
el nivel óptimo de la masa eritroide (Krantz, 1991).
La cadena proteica de la Epo tiene una Mr de, aproximadamente, 18 K pero la glicoproteína
con elevado contenido de carbohidratos puede alcanzar valores de Mr de 34 K (Robert et al,
1994). La Epo consiste en una mezcla heterogénea de isoformas que difieren principalmente
en la gran variedad de glicanos asociados a la cadena proteica. Contiene cuatro cadenas de
carbohidratos, tres unidas a N-asparraginas (24, 38 y 83) y una, unida a O-serina (126).
El uso farmacéutico con Epo recombinante humana (rhuEpo) para el tratamiento de la
anemia asociada a distintas enfermedades ha ido en aumento en los últimos 20 años
(Eschbach, 1987). Diferentes eritropoyetinas recombinantes han sido obtenidas para su uso
con fines clínicos empleando células CHO (Chinese hamster ovary) o células BHK (baby
hamster kidney) (Deicher et al, 2004; Storring et al, 1998).
Es importante destacar que el proceso de glicosilación post-traduccional, que tiene un
importante efecto sobre la actividad biológica, solubilidad y vida media de la rhuEpo en la
circulación sanguínea, depende del tipo celular y de las condiciones de cultivo. Así, ha sido
descripta la Darboepoetin- o NESP, análoga a la Epoetin que difiere en dos glicanos
adicionales (Balaguer et al 2006). La asialoeritropoyetina (asialoEpo) fue obtenida por
remoción completa del ácido siálico, lo que provoca una disminución de la vida media de la
hormona en circulación sin cambios en su actividad (Erbayraktar et al, 2003).
Otras modificaciones fueron introducidas en la molécula de la hormona con el fin de
modificar su función, por ejemplo, la carbamilación de residuos lisina. Se obtiene, así, una
eritropoyetina carbamilada (CEPO) que pierde su actividad hematopoyética pero conserva
su acción protectora de otros tejidos (Leist et al 2004).
Con respecto a la función de la Epo, actualmente se reconoce que no sólo constituye el
principal factor de regulación de la producción de glóbulos rojos sino que ejerce también un
efecto protector en otros tejidos, como el neuronal (Siren et al 2000).
En nuestro laboratorio estudiamos mecanismos de activación celular y los involucrados en la
acción antiapoptótica de la rhuEpo sobre líneas celulares eritroides (Vittori et al 2005) y
neuronales (Pregi et al 2006).
Datos de la bibliografía indican variaciones en la interacción ligando-receptor de las
moléculas modificadas con respecto a su receptor específico (EpoR) localizado en la
superficie celular, interacción que constituye el paso inicial de la activación celular por Epo
(Leist et al,2004).
Objetivo:
El objetivo de este proyecto consiste en evaluar la actividad de la rhuEpo modificada por
desialilación o carbamilación sobre células eritroides y neuronales, comparando la actividad
residual con la de la rhuEpo intacta.
Actividades
I. Modificación del contenido de carbohidratos unidos a la Epo por digestión enzimática.
a)
Digestión enzimática: Tratamiento de muestras de Epo por digestión enzimática
(neuraminidasa, N-gliconasas y O-gliconasas). Optimización del período de
tratamiento y de las concentraciones enzimáticas (Kimura et al 1996, Skibeli et al
2001, Erbayraktar et al 2003). Los productos de digestión parcial y total de la
hormona serán purificados por ultrafiltración (tubos Centricón de cut-off variable) y
cromatografía. La homogeneidad será confirmada por isoelectroenfoque.
b)
Grado de glicosilación: determinación del ácido siálico liberado.
c)
Isoelectroenfoque: Determinación del perfil de pI de las isoformas de Epo con distinto
grado de glicosilación. Empleo de metodología de rutina en el laboratorio, utilizando
isoelectroenfoque en gradiente natural de pH, de rangos 3-10 y 3-6. Determinación
del pI de las isoformas por comparación con estándares de pI (Andrews 1992).
II. Obtención de eritropoyetina carbamilada.
Carbamilación de la eritropoyetina mediante tratamiento controlado con KOCN durante 24
h (Lauricella et al, 2000; Leist et al, 2004). Diálisis y concentración de la proteína por
Centricón. Evaluación por electroforesis.
III. Investigación del efecto de las modificaciones de la molécula de eritropoyetina
(desialilación y carbamilación) sobre su función.
a) Efecto de activación sobre la proliferación y viabilidad de células de la línea UT-7,
dependientes de Epo. Condiciones de cultivo estandarizadas en el laboratorio. La
actividad de la Epo sobre esta línea celular ha sido estudiada previamente en el
laboratorio (Vittori et al 2005).
b) Efecto protector de la Epo sobre células de la línea neuronal SH-SY5Y inducidas a
apoptosis por staurosporina. Las condiciones de los cultivos celulares, de los ensayos de
inducción de apoptosis por staurosporina y de la determinación del efecto antiapoptótico
de la Epo han sido determinadas previamente en el laboratorio (Pregi et al 2006).
Referencias
 Andrews AT. Electrophoresis, Oxford Science Publications, Londres, 1992.
 Balaguer E wt al. Electrophoresis 27:2638-2650, 2006.
 Deicher R, Hörl W. Drugs 64:499-509, 2004.
 Erbayraktar S et al. Proc Natl Acad Sci 100:6741-6746, 2003.
 Eschbach JW. Kidney Int 35:134-148, 1989.
 Kimura et al. J Biol. Chem 271:14452-14461, 1996
 Krantz S. Blood 77:419-434, 1991.
 Lauricella A, Elbert A, Beresán H, Nesse A. Nefrol Latinoamer 7:27-34, 2000.
 Leist M et al. Science 305:239-242, 2004.
 Pregi N, Vittori D, Pérez G, Pérez Leirós C, Nesse A. Biochim Biophys Acta 1763:238-246,
2006.
 Robert D, Smith DJ. J Mol Endocrinol 12:131-149, 1994.
 Siren A et al. Proc Ntl Acad Sci 98:4044-4049, 2000.
 Skibelli et al. Blood 98:3626-3634, 2001
 Storring P, et al. Brit J Haematol 100:79-89, 1998.
 Vittori D, Pregi N, Pérez G, Garbossa G, Nesse A. Biochim Biophys Acta 1743:29-36,
2005.
Organización del trabajo
1) Lectura y discusión de trabajos relacionados con el tema.
2) Búsqueda bibliográfica y selección de metodología apropiada para la determinación
de ácido siálico y para la purificación de la eritropoyetina desialilada (separación de
Epo y neuraminidasa).
3) Preparación de las eritropoyetinas modificadas.
4) Aprendizaje del trabajo en condiciones de esterilidad y cultivos celulares.
5) Ensayos de evaluación de la funcionalidad de las Epo modificadas en comparación
con la Epo intacta.
6) Discusión de los resultados.
7) Redacción del trabajo final.
Factibilidad
Se dispone de las líneas celulares UT-7 y SH-SY5Y y del material y equipamiento para
trabajar en condiciones de esterilidad y realizar los cultivos celulares.
Se cuenta con centrífuga refrigerada, espectrofotómetro UV-Vis y freezers de -20 y -70 C,
así como fondos para adquirir los reactivos necesarios para realizar el proyecto. La
eritropoyetina es donada gentilmente por la Empresa Biosidus.