La inflamación es un proceso caracterizado por la presencia de

Profesor Patrocinante
Dra. María Angélica Hidalgo
Instituto de Farmacología y
Morfofisiología
Facultad de Ciencias Veterinarias
Profesor Co-Patrocinante
Dr. Rafael Burgos A.
Instituto de Farmacología y
Morfofisiología
Facultad de Ciencias Veterinarias
EFECTO DE LA ESTIMULACIÓN DE NEUTRÓFILOS
HUMANOS SOBRE LA ACTIVACIÓN DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico.
PIA CAROLINA BURBOA SCHETTINO
VALDIVIA – CHILE
2012
“No estudio por saber más, sino por ignorar menos.”
(Juana Inéz de la Cruz)
Este trabajo es para ti mamá, hermana, hermano y sobrinas.
i
AGRADECIMIENTOS
Para comenzar, quiero agradecer a la Dra. María Angélica Hidalgo, por aceptarme
como su alumna y trabajar en un tema tan interesante, son buenas las lecciones
aprendidas en cada experimento, su apoyo en cada paso que dí, y también en su
consideración en cada error que cometí, ya que en esos momentos son en los que uno
suele tomar más atención y aprender mucho más. Por su paciencia infinita, en
esperarme, de eso me encuentro muy agradecida.
Le agradezco al Dr. Rafael Burgos por considerarme parte del instituto, por su
espontaneidad durante las jornadas de trabajo, de sus conversaciones y buena
disposición ante cualquier duda o requerimiento.
A mis amigos Pablo, Karin, Fabiana, Loretto, Ivan, Daniela, Jano y Evelyn por hacer
del trabajo en el laboratorio un lugar lleno de risas, conversaciones entretenidas,
interesantes, esa explosión de conocimiento dada por nuestra inexperiencia y
simultánea búsqueda de respuestas; por su apoyo en mis experimentos, sobre todo
Pablo y Jano quienes alguna vez me donaron sangre; a ustedes Karin, Fabiana y
Loretto mis amigas de siempre y gran apoyo en mi período de latencia por decirlo de
alguna manera, un gran abrazo y agradecimiento.
A Kathy, por tu inagotable espíritu servicial, siempre estuviste desde tu lugar
apoyándome en la impresión de los papers, visitándonos al laboratorio y dándonos
siempre ánimos, tu alegría siempre me trae muy buenos recuerdos.
ii
Quiero agradecer especialmente a mis amigos de Aysén, Angélica, Susana, Dorka,
Alejandro, Alex, Roberto y Jacquelinne, quienes formaron parte de un proceso quizás
de búsqueda importante, pero que dieron paso a que tomará la decisión de cerrar este
círculo. A mis amigos del laboratorio de inmunología; Patricia, Anita, Alejandra, Natalie
y la Dra. Fabiola quienes me han entregado meses de risas y buenas experiencias
durante mi regreso. Agradezco a mis amigos de siempre, Luisa, Bárbara, Anibal;
ustedes han estado en las buenas y en las malas; y en especial a Paula, quien vivió un
proceso similar al mío, sin su ayuda y comprensión, quizás este paso sería más difícil.
Agradezco a mi familia, mamá tu haz sido una persona luchadora y un gran ejemplo
para mí, eres el pilar fundamental de cada paso que he dado, te amo con toda mi alma.
Hermano, gracias por apoyarme y ser como un padre para mí, pero por sobre todas las
cosas por creer en mí. Sara, eres mi hermana, amiga, confidente, eres quien más ha
entendido mis decisiones, por eso te agradezco, el apoyo y fuerza que me haz dado
para poder finalizar esto.
Finalmente agradezco al instituto de farmacología y todos quienes de alguna manera
contribuyeron en mi tesis.
Esta tesis fue financiada gracias a los siguientes proyectos: DID-UACH S-200804 y
FONDEF D04I1240. Dirección de Investigación y Desarrollo, UACH.
iii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
1 RESUMEN
1
1.1 SUMARY
2
2 INTRODUCCIÓN
3
2.1 Inflamación
3
2.2 Neutrófilos
3
2.3 Señalización en neutrófilos
4
2.4 Factores de transcripción en neutrófilos
8
2.5 Producción de ROS en neutrófilos
10
2.6 Linfocitos T
11
2.7 Señalización en linfocitos
12
2.8 Interacción de neutrófilos con otras células en la respuesta
inmune
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
3.1.1 Material Biológico
13
17
17
17
iv
3.1.2 Reactivos Químicos
17
3.1.3 Equipos
18
3.2 Métodos
19
3.2.1 Aislamiento de neutrófilos y PBMC
19
3.2.2 Extracción de proteínas totales de co-cultivo
19
3.2.3 Separación de proteínas totales mediante electroforesis
22
3.2.4 Electrotransferencia
22
3.2.5 Western blot
23
3.2.6 Ensayo de inmunofluorescencia en co-cultivo
24
3.2.7 Producción de ROS en co-cultivo
26
3.2.8 Análisis estadístico
27
4 RESULTADOS
28
4.1 Efecto de TNF-α en la fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK en
neutrófilos
28
4.2 Efecto de co-cultivo neutrófilos-células mononucleares en la
fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK
31
v
4.3 Fosforilación de ERK1/2 en co-cultivo directo neutrófilos-células
mononucleares mediante inmunofluorescencia
34
4.4 Inmunocitoquímica de p65 NF-κB e IκBα en co-cultivo neutrófilosPBMC
36
4.5 Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP y cocultivados con PBMC
39
4.6 Estimación de la posible participación de vías de señalización en la
producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP y co42
cultivados con células mononucleares.
4.7 Efecto de Dexametasona sobre la producción de ROS en Neutrófilos
estimulados con fMLP.
45
4.8 Descripción del posible efecto de Dexametasona sobre la producción de
ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP y co-cultivados con PBMC.
47
5 DISCUSIÓN
51
6 BIBLIOGRAFÍA
61
vi
INDICE DE FIGURAS
FIGURA 1:
Esquema representativo del ensayo de co-cultivo mediante el
21
uso de placas transwell.
FIGURA 2:
Esquema representativo del ensayo de co-cultivo por contacto
25
directo.
FIGURA 3:
Cinética
de
fosforilación
de
ERK
1/2
para
neutrófilos
29
estimulados con TNF-α.
FIGURA 4:
Cinética
de
fosforilación
de
p38MAPK
para
neutrófilos
estimulados con TNF-α.
30
FIGURA 5:
Fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK en PBMC en co-cultivo.
32
FIGURA 6:
Fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK de neutrófilos en co- 33
cultivo.
FIGURA 7:
Fosforilación de ERK1/2 en co-cultivo neutrófilos-PBMC.
35
FIGURA 8:
Inmunocitoquímica de p65 NF-κB en co-cultivo neutrófilos- 37
PBMC.
FIGURA 9:
Degradación de IκBα en co-cultivo neutrófilos-PBMC.
FIGURA 10:
Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP y cocultivados con PBMC (Relación 2:1).
FIGURA 11:
38
40
Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP y cocultivados con PBMC (Relación 1:1).
41
vii
FIGURA 12:
Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados con PBMC y previamente incubados con el inhibidor
43
UO126.
FIGURA 13:
Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados con PBMC y previamente incubados con el inhibidor
44
SB203580.
FIGURA 14:
Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP
46
previamente incubados con dexametasona.
FIGURA 15:
Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados
con
PBMC
y
previamente
incubados
con
49
dexametasona 1nM
FIGURA 16:
Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados
con
PBMC
dexametasona 100nM
y
previamente
incubados
con
50
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AP-1
Proteína activadora 1
ASK
Quinasas reguladoras de la señal de apoptosis
CKII
Caseína quinasa 2
COX-2
Ciclooxigenasa 2
ERK
Quinasa regulada por señal extracelular
fMLP
N-formil-metionina-leucina-fenilalanina
FPR
Receptor de fMLP
GM-CSF
Factor estimulante de colonias granulocitos-macrófago
ICAM
Molécula de adhesión intracelular
IκB
Proteína inhibidora kappa B
IKK
IκB quinasa
IFN-γ
Interferón gamma
IL-1
Interleuquina 1
IL-8
Interlequina 8
JNK
Quinasa N-terminal jun
LPS
Lipopolisacárido
LTB-4
Leucotrieno B4
MAPK
Proteína quinasa activada por mitógenos
MEK o MKK
MAPK quinasa
MEKK o MLK
MAP quinasa quinasa quinasa
ix
MNK
Quinasa integradora de la señal de MAPK
MSK
Proteína quinasa activada por estrés y mitógenos
NADPH
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NFAT
Factor Factor nuclear de células T activadas
NF-κB
Factor nuclear kappa B
PAF
Factor activante plaquetario
PBMC
Células mononucleares de sangre periférica
PKC
Proteína quinasa C
ROS
Especies reactivas de oxígeno
RSK o MAPKAP-K1
Proteína quinasa 1 activada por MAPK
STAT
Transductor de señal y activador de la transcripción
TAK1
Quinasa
activada
por Factor
de
(TGF) β 1
TCR
Receptor de linfocito T
TNF-α
Factor de necrosis tumoral alpha
TNFR
Receptor del factor de necrosis tumoral
Crecimiento
Epidérmico
1
1 RESUMEN
La inflamación es un proceso caracterizado por la presencia de diversas células
inflamatorias como neutrófilos y células mononucleares de sangre periférica ( en sus
siglas en inglés PBMC). La activación de neutrófilos induce variadas respuestas como
liberación de especies reactivas de oxígeno (en sus siglas en inglés ROS) y citoquinas,
que amplifican el proceso inflamatorio. En este estudio se analizó si la estimulación de
neutrófilos con TNF , induce la activación de vías de señalización intracelular en PBMC
realizando ensayos de co-cultivo; y por otro lado evaluar la producción de ROS en
neutrófilos al estar cocultivados con PBMC. Se aisló neutrófilos y PBMC humanos
mediante gradiente de percoll. Los neutrófilos tratados con TNF-
y co-cultivados con
PBMC, evidenciaron la fosforilación de ERK1/2 en neutrófilos y PBMC mediante
western blot. El análisis de inmunocitoquímica mostró que el co-cultivo directo
neutrófilos-PBMC provocó una señal cercana al núcleo para p65 NF-κB, y una
disminución de la señal de IκBα en tiempos similares a los resultados de western blot.
Por otra parte, se demostró que mediante la estimulación de fMLP a neutrófilos en cocultivo con PBMC, hay una disminución en la producción de ROS en neutrófilos,
también se observó que al utilizar un inhibidor de las MAPKs como UO126 sugirió una
disminución más pronunciada. Al realizar ensayos con dexametasona no se logró
revertir el efecto de la disminución de ROS en neutrófilos al cocultivarlos con PBMC.
En conclusión proponemos que existe una comunicación entre neutrófilo-PBMC de
manera bidireccional, provocando efectos tanto en neutrófilos como en PBMC, ya sea
mediante la activación de vías de señalización en ambos tipos celulares, como en la
producción de ROS en neutrófilos.
2
1.1 SUMMARY
Inflammation is a process characterized by the presence of various inflammatory cells
such as neutrophils and peripheral blood mononuclear cell (PBMC). Neutrophils
activation induces stimulation of different responses such as reactive oxygen species
(ROS) and cytokines that amplify the inflammatory process. In this study we examined
whether stimulation of neutrophils with TNF-α induces the activation of intracellular
signaling pathways in PBMC, through coculture assays, and otherwise assessing ROS
production in neutrophils cocultured with PBMC.
It was isolated human neutrophils and PBMC by Percoll gradient. Neutrophils treated
with TNF-α and co-cultured with PBMC, showed the ERK1/2 phosphorylation in
neutrophils and PBMC, as assessed by western blot. Immunocytochemical analysis of
the different coculture of neutrophil-PBMC showed a signal near to the nucleus of NF-kB
p65, and a decrease of signal of IκBα similar to the results by western blot.
Moreover, it was shown that the fMLP stimulation of neutrophils in co-culture with
PBMC, decreased the ROS production by neutrophils. It was also observed that the use
of UO126, a MEK1/2 inhibitor, reduced the ROS production by neutrophils. The use of
dexamethasone did not reverse the effect of the decrease in ROS production in
coculture of neutrophils - PBMC.
In conclusion, we propose that there is a communication between neutrophil-PBMC
bidirectionally, causing effects on both neutrophils and PBMC, either by activating
signaling pathways in both cell types, or in ROS production in neutrophils.
3
2 INTRODUCCIÓN
2.1 Inflamación
La inflamación es, en palabras simples, un proceso de la respuesta inmune que
es gatillado por alguna agresión física (cirugía, golpe, etc), microorganismos y sus
metabolitos y agentes químicos tóxicos (Ward y Lentsch, 1999) su inicio involucra el
recrutamiento de diferentes células del sistema inmune, las primeras en aparecer son
las relacionadas a la respuesta inmune innata como macrófagos, neutrófilos, que son
asociadas a una inflamación de tipo aguda; posteriormente se presentan linfocitos T y B
que caracterizan una inflamación crónica (Ferrero-Miliani et al., 2006). Esto es
modulado por la presencia de citoquinas proinflamatorias como Factor de Necrosis
Tumoral
alpha
(TNF-α),
Interferón
Gamma
(IFN-γ),
Lipopolisacárido
(LPS),
Interleuquina 1 (IL-1) entre otros y quimioatractantes como Factor activador de
plaquetas (PAF), el péptido formil-Metionil-Leucil-Fenilalanina (fMLP) y Leucotrieno B4
(LTB4) que promueven la quimiotaxis de las células involucradas y el reclutamiento
ordenado de los leucocitos que van incorporándose al proceso inflamatorio (Barreiro et
al., 2010).
2.2 Neutrófilos
Los neutrófilos o polimorfonucleares constituyen la primera línea de defensa del
sistema inmune, abarcan alrededor del 40 al 60% de la población total de células
blancas; normalmente se encuentran en un estado de reposo, pero al ser activadas, ya
sea por agentes bacterianos, virales o citoquinas promueven su movilización al sitio de
inflamación (Wright et al., 2010). Este reclutamiento es gatillado en el sitio inflamatorio
4
por la liberación de citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α, Histamina e Interleuquina
8 (IL-8) generando cambios en las células endoteliales que promueven la adhesión de
polimorfonucleares a ellas mediado primeramente por selectinas y luego mediante la
unión de β integrinas, expresadas en neutrófilos, y moléculas de adhesión intercelular
(ICAMs), expresadas en la superficie endotelial inflamada. Todos estos eventos,
además de la producción local de quimioatractantes como IL-8 y LTB-4 facilitará la
transmigración de polimorfonucleares al sitio en cuestión; ya sea gatillado por bacterias
o la liberación de quimioatractantes derivados del mismo huésped (Puri et al., 2004).
2.3 Señalización en neutrófilos
Como se mencionó anteriormente, la activación de neutrófilos es llevada a cabo
por un sin número de citoquinas y quimioatractantes, lo cual genera la activación de una
variedad de vías de señalización involucradas.
TNF-α es una citoquina proinflamatoria ya que regula de manera importante la función
del neutrófilo durante la inflamación mediante la activación de la señal inflamatoria y la
supresión de la apoptosis del mismo, y de esta manera, prolongar la permanencia del
neutrófilo en la respuesta inflamatoria. El neutrófilo posee dos receptores para TNF, uno
de 55-56kDa (TNFR-1) y otro de 75-80kDa (TNFR-2); la señalización proinflamatoria y
antiapoptótica es mediada principalmente por el TNFR-1(Kilpatrick et al., 2006), que
gatilla activación de vías de señalización entre las cuales está implicada la vía de las
proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) (Rafiee et al., 1995). Esta vía
contempla a los miembros de las serina/treonina quinasas que convierten un estímulo
extracelular en un variado rango de procesos celulares como
crecimiento,
5
diferenciación, migración e inflamación entre otras. La familia de las MAPKs está
constituida por tres grupos de proteínas quinasas: las quinasas c-Jun N-terminal (JNKs)
(JNK 1/2/3), las quinasas reguladas por señal extracelular (ERKs) (ERK1/2 o p42/p44) y
la familia de las p38 MAPKs; compuesta por 4 isoformas (α, β, γ, y δ). La cascada de
señalización de las MAPKs está organizada como una vía modulada a través de
cascada de señales de tres componentes vinculados entre sí, en el cual las MAPK
quinasas quinasas (MAP3Ks o MAPK/ERK quinasa quinasa (MEKKs)) fosforilan y
activan río abajo las MAP2Ks, las cuales a su vez fosforilan y activan las MAPKs. Cada
grupo de MAPKs es activada por distintas cascadas de quinasas a través de una doble
fosforilación en treonina y tirosina, en un sitio consenso Thr-Xaa-Tyr, río arriba por
específicas MAPK quinasas (MAP2K o MAPK/ERK quinasas (MEKs)) (Coskun et al.,
2011). El aminoácido Xaa corresponde a un ácido glutámico (Glu), prolina (Pro) y glicina
(Gly) para ERK, JNK y p38 respectivamente; este motivo (Thr-Xaa-Tyr) se encuentra en
un loop de activación cercano al sitio de unión a sustrato y ATP. El tamaño de este loop
de activación difiere entre las tres familias de MAPK. La fosforilación ocurre mediante
una ordenada adición de fosfatos, a tirosina y luego a treonina; una vez activados, las
MAPKs pueden activar y fosforilar otras proteínas, como factores de transcripción en el
citoplasma o el núcleo (Herlaar y Brown, 1999).
La activación de p38 MAPKs, que es también denominada Proteína quinasa
activada por estrés (SAPK), es inducida por factores de estrés como luz UV, shock
osmótico (Herlaar y Brown, 1999), shock térmico (Niwa et al., 2003) y por citoquinas
proinflamatorias como TNF-α, IL-1β (Kim y Choi, 2010) y quimioatractantes como fMLP,
IL8 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Herlaar y
6
Brown, 1999). En la señalización de la vía de p38, una variedad de MAP2Ks como
MEK3, MEK4 y MEK6 activan p38, y a su vez estas MAP2Ks son activadas por una
variedad de MAP3Ks: Quinasa reguladora de la señal de apoptosis (ASK1/2), MEKK3/4,
Quinasa activada por Factor de Crecimiento Epidérmico (TGF) β 1(TAK1), ZAK1 y
Quinasa de linaje Mixto 3 (MLK3) (Coskun et al., 2011). Los blanco, río abajo de p38
pueden ser otras quinasas, factores de transcripción y citoquinas proinflamatorias. Entre
las quinasas se encuentran las proteínas quinasas activadas por MAPK (MAPKAPK
2/3/5) y quinasas activadas por mitógenos y estrés 1 (MSK1) (Herlaar y Brown, 1999),
entre los factores de transcripción blanco son NF-κB (p65), STATs (Transductores de
señal y activadores de transcripción) y Proteína activadora 1 (AP1). Finalmente esto
promueve la producción de citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α (Coskun et al.,
2011), IL-8, IL-1; y por otro lado producción de Ciclooxigenasa 2 (COX-2) (Thalhamer et
al., 2008), y en el estallido oxidativo a través de la producción de Especies reactivas de
oxígeno (ROS). En definitiva, p38 MAPK, juega un rol importante en la respuesta
inflamatoria ya sea en la adhesión y quimiotaxis de neutrófilos, estallido oxidativo y en la
producción de citoquinas pro-inflamatorias (Herlaar y Brown, 1999).
La otra vía perteneciente a la familia de las MAPK, es la ERK 1/2; que juega un
rol importante en los procesos celulares como inflamación, y en la homeostasis de
tejidos, como el control de crecimiento, proliferación, diferenciación, migración y
sobrevivencia (Coskun et al., 2011). La activación propiamente tal de ERK 1/2 es
llevado a cabo río arriba por una variedad de agentes extracelulares que operan a
través de varios receptores, en la mayoría de estos casos la activación de dichos
receptores es transmitida por variados mecanismos a las pequeñas Ras GTPasas, las
7
cuales son predominantemente activadas en la membrana plasmática. A su vez, Ras al
estar activada recluta las proteínas MAP3K (proteínas Rafs, mayormente Raf-1 y BRaf), a la cascada, en la membrana plasmática con el fin de inducir su activación, la
cual podría llevarse a cabo a través de la homo o heterodimerización o fosforilación. La
identidad de las quinasas que podrían estar involucradas en la activación por
fosforilación de Rafs, que serían denominadas MAP4Ks, podría incluir, bajo ciertas
condiciones a PKC y MLK3. Posteriormente, la señal a través de las Rafs es transmitida
a una MAPKKs, MEK 1 y MEK2 (MEK 1/2), mediante la fosforilación de dos residuos de
serina en su loop de activación. A su vez, la MEK 1/2 activada transmite su señal a ERK
1 y ERK 2 (ERK 1/2) fosforilando los residuos de treonina y tirosina en el dominio ThrGlu- Tyr en su loop de activación. Finalmente la señal continúa a los componentes
MAPKAPK (RSKs, MNKs y MSKs), y/o a michos otros substratos, que pueden estar
localizados tanto en el citoplasma, organelos celulares y núcleo (Plotnikov et al., 2011).
Formil-Met-Leu-Phe, fMLP, es un péptido formilado componente de la pared
celular de bacterias, que además de ser un quimioatractante (Kelher et al., 2003), se
han descrito otras funciones que incluyen el ensamblaje de actina, adherencia, flujo de
calcio, liberación de gránulos de enzimas, producción de superóxido (Nick et al., 1997) y
producción de citoquinas proinflamatorias como IL-8, TNF-α de manera conjunta a otros
quimioatractantes bacterianos como LPS (Chen et al., 2009). Los receptores de fMLP,
FPR, pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteína G, y están constituidos
por una sola cadena polipeptídica de entre 350 a 370 aminoácidos, que posee 7 sitios
transmembrana, en donde 3 loop y la zona N-terminal se cree es esencial para la
interacción con el ligando, mientras que la región carboxil terminal y tres loops más son
8
importantes en la señalización intracelular ya que se encuentran en el lado citosólico de
la membrana; en neutrófilos se expresan dos tipos de receptores, FPR y FPRL1 (Fu et
al., 2006).
fMLP al activar su receptor, gatilla una serie de señales intracelulares para
ejecutar las amplias funciones en las que está involucrado; por un lado se ha visto que
a través de MEK1/MEK2 y MKK3 activa las vías de MAPKs, ERK1/2 y p38 MAPK,
respectivamente, y que en esta última podría estar involucrada la producción de
superóxido (Nick et al., 1997), más tarde, se describió que fMLP, promueve el aumento
de calcio citosólico, lo que conlleva a la fosforilación de las MAPKs ERK1/2 y p38
MAPK, que directa o indirectamente activa una tirosina quinasa que fosforila Rel- 1 y
que activa río abajo a NF-κB, factor de transcripción involucrado en la producción de
varias citoquinas y quimoquinas, como IL-1β, IL-8 y TNF-α (Kelher et al., 2003). Otros
autores también sustentan que fMLP estaría involucrado en inflamación a través de la
activación de NF-κB (Chen et al., 2009), y en otras vías de señalización, como las
relacionadas a las tirosinas quinasas y vías de señalización mediadas por calcio, que
promueven la quimiotaxis de neutrófilos (Zen y Liu, 2008). Finalmente, cabe destacar
que se ha descrito que la liberación de calcio citosólico mediada por fMLP, promueve el
ensamblaje de la NADPH oxidasa, complejo enzimático involucrado directamente en la
producción de superóxido (Bréchard y Tshirhart, 2008).
2.4 Factores de Transcripción en neutrófilos
Una de las finalidades de promover la señalización intracelular en procesos
inflamatorios, y a través de las MAPKs, es la regulación de factores de transcripción que
9
actúan a nivel de transcripción de genes y gatillan la producción de proteínas
proinflamatorias, una función importante para mantener la respuesta inflamatoria
(Vancurova et al., 2001). Ahora bien, hay variados factores de transcripción implicados,
por ejemplo, la proteína activadora- 1 (AP-1), es una familia de factores de transcripción
diméricos que regula distintos procesos además de la inflamación, como diferenciación
celular, proliferación y apoptosis, pero sin duda, el más característico NF-κB (Coskun et
al., 2011).
El factor nuclear kappa B (NF-κB), es un factor de transcripción dimérico, que
pertenece a la familia “Rel” ya que posee un dominio altamente conservado homólogo a
Rel (RHB), el cual es responsable de la interacción con las proteínas inhibidoras kappa
B (IκB), translocación de NF-κB y unión al ADN. Las proteínas IκB (IκBα, β y γ), son
proteínas regulatorias que se unen a NF-κB e impiden su translocación nuclear y
consecuente actividad transcripcional. Se han caracterizado dos vías principales de
señalización de NF-κB; una vía clásica mediada por la degradación de IκB y la vía
alternativa mediada por p100. En condiciones normales, los dímeros de NF-κB están
unidos a la proteína IκB en el compartimento citosólico de la célula; en la vía clásica, la
activación se debe a estímulos inflamatorios como Interleuquinas, TNF-α o
lipopolisacáridos (LPS) que conllevan a la activación del complejo IκB quinasa (IKK) que
contiene las subunidades IKKα, β y γ, y evidencia que sugiere que IKKα y β poseen una
actividad catalítica, mientras que IKKγ (denominada también como NEMO) juega un rol
regulatorio. Una cascada de quinasas llevan a la activación del complejo IκB quinasa
(IKK) que resulta en la fosforilación de IκB, se ha demostrado que esto es llevado a
cabo por IKKβ. Después de esto, sigue una poliubiquitinación y degradación por el
10
proteosoma para una liberación de NF-κB. Una vez que se libera NF-κB, está libre para
moverse al núcleo e iniciar la transcripción de los genes blanco, incluyendo moléculas
de adhesión celular y factores proinflamatorios.
Algunos estímulos como linfotoxina-β y el factor activador de células B pueden activar la
vía alternativa de NF-κB, a través de la quinasa inductora de NF-κB (NIK) e IKKα. Cabe
mencionar, que se puede llegar a NF-κB por otros mecanismos, como la vía asociada a
luz UV que activa p65, vía p38 MAPK y caseína quinasa 2 (CKII). En la última vía, la
transmisión de la señal se inicia en el núcleo, seguido de la dislocación de NEMO
ubiquitinado al citoplasma, fosforilación de IκBα e IKK, translocación nuclear de la
unidad p65 de NF-κB, y la inducción de genes pro-sobrevivencia dependientes de p65.
En definitiva, NF-κB desempeña papeles fundamentales en procesos inflamatorios,
angiogénesis, inmunidad y apoptosis (Pamukcu et al., 2011).
2.5 Producción de ROS en neutrófilos
Una de las funciones predominantes en neutrófilos dado en la respuesta inmune
innata, es contener y destruir patógenos invasores, que se logra bajo una serie de
respuestas rápidas y coordinadas que culminan en la fagositosis y muerte del patógeno.
Los neutrófilos poseen un arsenal antimicrobial potente que incluye proteinasas
oxidantes y péptidos antimicrobianos. También producen importantes cantidades de
especies reactivas de oxígenos (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS), como
O
·
·
y NO a través de sistemas generadores de oxidantes como la NADPH oxidasa y la
Óxido nítrico sintasa (NOS) respectivamente. Durante la ingestión o fagocitosis de
patógenos invasores, los compuestos antimicrobianos contenidos en gránulos y el ROS
11
generado en la membrana del fagosoma son liberados directamente dentro del
fagosoma. Este proceso compartimentaliza tanto al patógeno como a los productos
citotóxicos, permitiendo de esta manera destruir bacterias y virus en un microambiente
dentro del mismo neutrófilo.
Si bien se le ha considerado a la producción de ROS una función característica que es
defensor contra los patógenos como factor antimicrobiano, también se ha visto como
efector en la regulación de eventos de señalización celular como homeostasis,
proliferación y diferenciación celular y en respuestas inmune e inflamatorias. La
producción de ROS altera el estado oxidativo celular, y se ha visto que este evento
promueve la activación reversible de cascadas de señalización en variados niveles, por
ejemplo, podría estar involucrada en las vías de las proteínas tirosinas quinasas, la
proteína quinasa C, en las MAPKs, y en la interacción de factores de transcripción.
Además, las ROS podrían actuar de manera paracrina e influenciar otras células debido
a que son permeables a la membrana celular (Fialkow et al., 2007).
2.6 Linfocitos T
Los linfocitos T son células monucleares muy versátiles, que son activadas de
una manera antígeno-específica asumiendo roles de regulador, efector y ayudante, de
esta manera adaptándose a los requerimientos inmediatos. Los linfocitos T determinan
la especificidad de la respuesta inmune subsiguiente y del desarrollo de la memoria
inmunológica. La activación y funciones de los linfocitos T están asociados a
infecciones virales, defensa en contra de tumores, el desarrollo y progresión de
procesos inflamatorios crónicos entre otros (Müller et al., 2009). Esta amplia
12
participación en la respuesta inmune, ha extendido el uso de glucocorticoides como
terapia para reducir el efecto de la respuesta de linfocitos (Franchimont et al., 2000).
2.7 Señalización en Linfocitos T
La activación de linfocitos T, es mediada por su receptor, denominado receptor
de célula T (TCR), que está compuesto por 6 diferentes cadenas polipeptídicas,
generado por la combinación a partir de dos TCR; TCRα y TCRβ, y que determinaran la
especificidad de la unión al ligando del receptor; además esto está asociado a cadenas
de CD3, que contienen un inmunoreceptor de activación por tirosina, que al ser
fosforilado inicia la señal del TCR. Pero la activación propiamente tal del TCR, se debe
a la unión a su ligando, algún pequeño péptido foráneo que esté asociado a una
proteína de superficie del complejo de histocompatibilidad, el tipo de respuesta depende
de múltiples factores que incluyen la afinidad y tiempo de interacción, y la presencia o
ausencia de varias señales coestimuladoras como las que proveen los coreceptores
CD4 y CD28. Esta activación promueve la estimulación de cascadas de señalización
interna como las MAPKs, y activación de factores de transcripción como NF-κB (Huang
Yanping 2004). La expresión génica de Interleuquina -2 (IL-2) es una señal inequívoca
de la activación de linfocitos T (Neto et al., 2007), en la cual están involucradas las
MAPKs, ya que se ha descrito que en la activación de linfocitos T, mediado por Thy-1,
las MAPKs están mediando los siguientes eventos de activación; producción de IL-2,
expresión del receptor de IL-2 (IL-2R), y proliferación de linfocitos T. Por un lado,
ERK1/2 podría estar involucrado en una mayor producción de IL-2, en vista de que la
inhibición farmacológica de ERK1/2 reduce tal producción y p38MAPK estaría
13
involucrado en la señalización del receptor de IL-2 (IL-2R) sin embargo estaría
inhibiendo la transcripción de IL-2, eventos cuya finalidad son promover la proliferación
de linfocitos T (Conrad et al., 2009). Finalmente, en un estudio que describe la
activación de linfocitos T mediada por integrinas, las cuales participan en numerosos
procesos como proliferación, activación y migración en los tejidos, demostró la
participación de ERK1/2, que a través de la vía de señalización de PI3K, modula la
expresión y actividad de c-fos, un componente del complejo transcripcional de la
proteína activadora 1 (AP-19 (Neto et al., 2007).
2.8 Interacción de neutrófilos con otras células en la respuesta inmune
Si bien ya se tienen relativamente esclarecidas las múltiples funciones de los
neutróflos en el sistema inmune y en inflamación, además de la producción de
citoquinas, quimoquinas y destrucción de agentes extraños, hay un aspecto importante
y emergente que consiste en la habilidad de los neutrófilos de interactuar con diferentes
leucocitos modulando su actividad (Costantini y Cassatella, 2011). Se ha visto que los
neutrófilos pueden modular el fenotipo inflamatorio de los macrófagos a través de la
liberación de un mediador soluble que
inhibe la liberación de citoquinas
proinflamatorias como TNF-α e IL-6 por macrófagos, actuando como un modulador
inflamatorio (Daley et al., 2005), pero también los neutrófilos pueden trabajar en
conjunto con los macrófagos para la inducción de la respuesta inmune adquirida,
liberando citoquinas y quimoquinas que atraen a los macrógafos y luego permiten la
atracción y activación de linfocitos T (Silva, 2010). Por otro lado, se ha documentado
que lo neutrófilos pueden modular la actividad de las células NK (Natural killers),
14
dependiendo de las condiciones experimentales y de mediadores solubles específicos
que sean producidos, como por ejemplo, la liberación de superóxido o ROS por parte de
los neutrófilos, pueden inhibir la actividad citotóxica de las células NK (Natural killers),
sin embargo, también puede haber una interacción inversa en que las células NK
puedan generar alguna respuesta en neutrófilos (Costantini y Cassatella, 2011).
Para la activación del neutrófilo en la respuesta inflamatoria, es importante la
interacción que exista entre ellos y les células endoteliales, de manera de promover la
quimiotaxis del neutrófilos al sitio de la inflamación, se ha descrito que la activación de
células endoteliales por citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-1, promueve la
producción de PAF que de alguna manera afecta al neutrófilo, activándolo y
promoviendo su adherencia al endotelio y por tanto facilitando la quimiotaxis (Takahashi
et al., 2001); por otro lado, para la función quimiotáctica del neutrófilo, también se ha
dilucidado que la liberación de péptidos de neutrófilos humanos (HNPs), que además de
cumplir su rol en la respuesta inmune innata en defensa de organismos extraños, están
involucrados en el incremento de la expresión de proteínas de superficie como ICAM-1
en células epiteliales del tracto respiratorio, lo que nos esclarece que los neutrófilos
poseen una gran capacidad de interactuar con variados tipos celulares (Quinn et al.,
2008).
También se ha ligado a los neutrófilos como efectores directos de la respuesta inmune
adaptativa al documentarse la interacción de éstos con linfocitos T, variadas citoquinas
derivadas de neutrófilos pueden provocar respuestas en linfocitos T como,
coestimuladores de la activación de linfocitos T e inhibición de su proliferación (Wagner
15
et al., 2005 y Wagner et al, 2008). También, los neutrófilos luego de destruir en primera
instancia los patógenos que puedan existir en el sitio de infección, pueden actuar como
presentadores de antígenos, derivados por ejemplo de las bacterias fagocitadas y que
fueron degradadas en el fagosoma del neutrófilo, para los linfocitos T, esto promueve
una interacción de contacto importante (Müller et al., 2009). Por otro lado, los linfocitos
T, también podrían estar modulando las respuestas de neutrófilos, por ejemplo se ven
diferentes respuestas dependiendo de la subpoblación de linfocitos T, CD4+ o CD8+,
por un lado, se ha descrito que al cocultivar los neutrófilos con el sobrenadante de
linfocitos T CD4+ estimulados previamente con Interferon γ (IFN-γ) o Factor estimulante
de colonias de granulocitos y macrófagos (CM-CSF) ejercen un retraso en la apoptosis
de neutrófilos y la expresión de moléculas de superficie como la molécula de
diferenciación en cluster 11b (CD11b), y por otro lado, al cocultivar los neutrófilos con
linfocitos T CD8+ estimulados previamente con IFN-γ, TNF-α o CM-CSF, se evidenció
una respuesta similar en neutrófilos, con lo cual evidenció que ambas subpoblaciones
de linfocitos T estarían mediando respuestas inflamatorias y de supervivencia en
neutrófilos (Pelletier et al., 2010); además se ha determinado la liberación de moléculas
a partir de la interacción célula-célula entre neutrófilos y linfocitos T CD4+, como la
lactoferrina, que al ser liberada por el neutrófilos, luego del contacto directo, ejerce una
modulación en la respuesta de los linfocitos CD4+ (Li et al., 2006).
De acuerdo a lo expuesto, los neutrófilos poseen una gran capacidad de interacción con
otras células del sistema inmune, lo que permite ejecutar de manera concertada la
respuesta inmune e inflamación. La interacción evidenciada entre neutrófilos y linfocitos,
sugiere un efecto mutuo, es decir, por un lado, un efecto de los neutrófilos sobre
16
linfocitos, actuando como presentadores de antígeno por ejemplo, y por otro lado, los
linfocitos ejerciendo un efecto sobre neutrófilos, al promover su supervivencia y modular
su participación en la respuesta inflamatoria; es por esto que este trabajo propone
dilucidar esta interacción a nivel de señalización celular, de acuerdo a la siguiente
hipótesis:
“La activación de neutrófilos por estímulos pro-inflamatorios induce la
fosforilación de las vías de señalización ERK1/2 y p38 MAPK y la activación del
factor de transcripción NF B en células mononucleares de sangre periférica
(PBMC), y modula la producción de ROS en neutrófilos co-cultivados con PBMC.”
Objetivo general:
Evaluar el efecto de la estimulación de neutrófilos con TNF-α y fMLP sobre la activación
de PBMC.
Objetivos específicos:
1. Determinar si la activación de neutrófilos con TNF-α induce una estimulación de
las MAPKs ERK1/2 y p38 en PBMC.
2. Determinar si la activación de neutrófilos con TNF-α induce una activación del
factor de transcripción NF-κB en PBMC.
3. Estudiar si la liberación de ROS en neutrófilos activados por fMLP genera algún
tipo de respuesta en PBMC.
17
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
3.1.1 Material Biológico
Se utilizaron neutrófilos y células mononucleares humanas obtenidas a partir de
donantes voluntarios, de acuerdo a los procedimientos establecidos por los comités de
bioética y bioseguridad de la Universidad Austral de Chile. Se utilizó como criterio de
inclusión personas voluntarias, sanas, hombres y mujeres, y que no estén recibiendo
medicamentos. Se excluyeron aquellos que presentaran, previo a la obtención de la
muestra de sangre, las siguientes características: 1. Presencia de enfermedades con
activación de respuesta inmune, como resfrío común, enfermedades de origen
bacteriano, alergias. 2. Administración de medicamentos permanente o 24 horas antes.
3. Ingestión de alcohol 24 horas antes. 4. Presencia de problemas de coagulación.
3.1.2 Reactivos Químicos
Cell Signaling (Beverly, MA, USA): Se utilizaron los siguientes anticuerpos fosfoERK1/2, fosfo-p38 MAPK, p-38, anti-conejo IgG-peroxidasa, anti-ratón IgG-peroxidasa.
Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA): Se obtuvieron los anticuerpos
ERK1/2 (sc-94), I B , p65 (NF- B), y CREB(sc-25785).
Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA): se utilizó lo siguiente, anticuerpo para -actina,
albúmina de suero de bovino, histochoice®.
18
Calbiochem (La Jolla, CA, USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: fMLP, UO126,
SB203580.
Invitrogen (Grand Island, NY, USA) se adquirieron los siguientes reactivos: medio
RPMI 1640, penicilina, estreptomicina, suero fetal bovino certificado (FBS), membrana
de nitrocelulosa, acrilamida, bisacrilamida, TEMED.
Roche Diagnostic (Indianápolis, IN, USA) se obtuvo lo siguiente: leupeptin, pepstatin,
aprotinin.
Amersham Bioscience (England) se obtuvo: Percoll®, Dextran-500.
Molecular Probes se obtuvo: yoduro de propidio.
Merck (Darmstadt, Germany) se obtuvo lo siguiente: DMSO, Tween-20, etanol, glicina,
SDS, tris, HCl, NaOH, 2-mercaptoetanol, Hepes y sales.
Winkler (Santiago, Chile) se obtuvo: estándar de peso molecular preteñido de
proteínas, reactivo de Bradford.
R&D Systems se adquirió el reactivo: TNF-α/TNFSF1A.
3.1.3 Equipos
Se utilizó: Centrífuga Eppendorf 5702, Centrífuga Mikro 22R, sistema de electroforesis
Mini Protean® III y sistema de transferencia Mini Trans Blot de BioRad, Incubador CO2
SANYO, Baño Termoregulado Memmert, Balanza analítica Scientech, Cámara de
Neubauer,
Luminómetro
OLIMPUS Bx51.
Luminoskan
Ascent,
Microscopio
de
Epifluorescencia
19
3.2 Métodos
3.2.1 Aislamiento de neutrófilos y PBMC
Los neutrófilos y PBMC fueron aislados a partir de sangre completa mediante gradiente
de Percol®. Brevemente, la sangre colectada en tubos Vacutainer® ACD fue mezclada
1:1 con 3% Dextran-500 e incubada durante 40 minutos. Luego, la capa superior fue
recuperada y centrifugada a 500 x g durante 5 min, el sobrenadante fue eliminado y el
pellet de glóbulos blancos fue resuspendido en PBS. La suspensión de células blancas
fue colocada en un gradiente discontinuo de Percoll (63:72%) y centrifugada a 500 x g
durante 25 min.
Se extraen las células de la interfase inferior, que corresponde a neutrófilos, y la
superior, que corresponde a la fracción restante de células mononucleares, se lava dos
veces con PBS centrifugando a 300 x g por 8 min. Esta última fracción es colocada en
un nuevo gradiente discontinuo de Percoll (45:56%) y centrifugada a 500 x g durante 25
min. Se extraen las células de la interfase inferior, que corresponde a la fracción más
pura de células mononucleares, se lavan dos veces con PBS centrifugando a 300 x g
por 8 min.
Finalmente cada tipo celular es resuspendido en medio RPMI 1640, son contadas y la
viabilidad analizada por exclusión de azul de tripán.
3.2.2 Extracción de Proteínas totales en co-cultivo
Los neutrófilos y células mononucleares se mantuvieron en medio RPMI 1640. Una
hora después del aislamiento, los neutrófilos fueron estimulados con TNF- α (10ng/mL)
o fMLP (0,1µM) por cinco minutos, se lavan dos veces con medio RPMI 1640 y son co-
20
cultivados en placas transwell durante diferentes tiempos (15, 30, 60 90 minutos) para
fosfo-ERK1/2 o fosfo-p38 MAPK, este paso se describe gráficamente en la figura 1.
Posteriormente, los extractos proteicos se obtuvieron resuspendiendo las células en
solución de lisis; para neutrófilos (Hepes 20mM, NaCl 150mM, Glicerol, Triton X1001,5%, NaF 25mM, NaVO4 1mM, PMSF 1mM; inhibidores de proteasas, (leupeptin,
aprotinin, pepstatin) 10 g/mL, y para células mononucleares (Tris-HCl 50 mM pH 7.4,
EDTA 50 mM, EGTA 1 mM, inhibidores de proteasas (leupeptin, aprotinin, pepstatin) 10
g/ml; NaF 25 mM; NaVO4 2 mM; PMSF 0,1 mM; DTT 25 mM y Triton X-100 1,5%. Las
proteínas se cuantificaron por el método de Bradford, y posteriormente se utilizó 40 g
de proteínas de neutrófilos y 60 g de proteínas de células mononucleares para los
análisis de fosforilación de proteínas mediante western blot.
21
Figura 1: Esquema representativo del ensayo de co-cultivo mediante el uso de placas
transwell.
22
3.2.3 Separación de proteínas totales mediante electroforesis
Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturantes (SDS-PAGE), mediante el sistema de electroforesis Mini Protean® III
(BIORAD
TM
). Tanto el gel separador como espaciador se preparó a partir de una
solución de 30%-0,8% de Acrilamida-bisacrilamida con un grosor de 1,5mm. El gel
espaciador se preparó al 4% de poliacrilamida, incluyendo Tris-HCl 125mM (pH 6,8),
0,1% de SDS, 1% de Persulfato de amonio y 0,04% de TEMED. El gel separador se
preparó al 12% de poliacrilamida, además de Tris-HCl 375mM (pH 8,8), 0,1% de SDS,
0,003% de Persulfato de amonio y 0,03% de TEMED. Se utilizó un volumen de muestra
correspondiente a la cantidad de proteínas totales, 60ug de proteínas totales
provenientes de células mononucleares y 40ug de proteínas totales provenientes de
neutrófilos, se les agregó 20% de SDS, β-mercaptoetanol y tampón muestra 5X (5% de
SDS, 50% de glicerol, 0,05% azul de bromofenol, 50mM de DTT y 0,125M de Tris-HCl
pH 6,8). Finalmente fueron cargadas en el gel realizando la separación electroforética
en solución de corrida (25mM de Tris, 190mM de glicina y 0,1% SDS) a voltaje
constante de 80V por aproximadamente 2 horas.
3.2.4 Electrotransferencia
Al finalizar la separación, las proteínas son transferidas a una membrana de
nitrocelulosa. Se coloca la membrana sobre el gel a transferir y se envuelve por ambos
lados con papel filtro y esponjas embebidas en solución de transferencia (25mM de Tris,
200mM de Glicina y 20% de Metanol). Luego se dispone en la cámara de
electrotransferencia con solución de transferencia, se aplica una intensidad de corriente
23
constante de 200mA por 2 horas. Transcurrido tal período, las membranas son
utilizadas para Western Blot.
3.2.5 Western Blot
Las membranas fueron incubadas con 15mL de solución de bloqueo (TBS1x, 0,1%
Tween-20, 5% de leche descremada), por una hora, bajo agitación constante. El
siguiente paso consiste en realizar 3 lavados a temperatura ambiente con TBS-T (TBS
1x, 0,1% de Tween-20) por 5 minutos cada uno. Luego, se realizó la incubación de las
membranas con 5mL de anticuerpo primario diluido por 16 horas a 4ºC y bajo agitación
constante. En base a las recomendaciones del fabricante, para fosfo-ERK 1/2 se
realizaba la dilución 1:2.000 en solución de bloqueo, y para fosfo-p38 MAPK, se utilizó
una dilución 1:1.000 en BSA (5% de BSA, TBS1x y 0,1% de Tween-20). Finalizado lo
anterior se procedió a lavar 3 veces con TBS-T por 5 minutos cada uno y a temperatura
ambiente, para luego incubar con 5mL de anticuerpo secundario, anti-ratón o anticonejo, conjugado con peroxidasa, por dos horas en dilución 1:2.000 en solución de
bloqueo y agitación constante. Transcurrida la incubación, las membranas se lavaron 3
veces con TBS-T por 5 minutos, a temperatura ambiente y en agitación constante. Las
membranas se revelan por el método de quimilumuniscencia utilizando un kit llamado
ECL. Posteriormente, las mismas membranas se utilizaron para detectar las proteínas
totales (independiente del estado de fosforilación). Para esto, las membranas se
incubaron en solución de “stripping” (2-mercaptoetanol 100mM, SDS 2%, tris-HCl
62,5mM pH 6,7) durante una hora a 50ºC en agitación constante, seguido de varios
lavados con TBS-T por 5 minutos a temperatura ambiente y en agitación constante.
24
Luego se realizaron los mismos pasos descritos anteriormente, salvo que para la
incubación del primer anticuerpo, se utilizó ERK cuya dilución se realizó solución de
bloqueo y p-38 cuya dilución se realizó en BSA.
3.2.6 Ensayo de Inmunofluorescencia en co-cultivo
Los neutrófilos y células mononucleares se mantuvieron en medio RPMI 1640. Un hora
después del aislamiento, los neutrófilos fueron estimulados con TNF-α (10ng/mL) por
cinco minutos, se lavan dos veces con medio RPMI 1640 y son cocultivados por
contacto directo, durante diferentes tiempos (15, 30, 60 minutos, luego las células se
resuspenden en 100uL de medio RPMI 1640, este paso se describe gráficamente en la
figura 2. Para disponer las células en portaobjetos, se adicionó 100 uL de BSA
60mg/mL, se centrifugó a 200 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente en
centrifuga CytoSpin, luego se fijaron con Histochoice®:Etanol (4:1) durante 10 minutos
a temperatura ambiente, después se realizan 3 lavados en PBS de 5 minutos cada uno
a temperatura ambiente. Se procedió a permeabilizar las células con Triton X-100 0,3%
durante 15 minutos, se realizan 3 lavados de 5 minutos a temperatura ambiente con
PBS. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron en solución de bloqueo (PBS1x,
BSA 1%, 5% leche descremada) por 30 minutos a temperatura ambiente, para luego
incubar con el primer anticuerpo por 16 horas a temperatura ambiente. De acuerdo a lo
recomendado por el fabricante para p65 (dilución 1:50), IkBα (dilución 1:50), y fosfoERK 1/2 (dilución 1:100) la dilución se realizó en solución de bloqueo. Finalizado lo
anterior, se procedió a lavar 3 veces los portaobjetos con PBS por 5 minutos cada uno a
temperatura ambiente, luego se incubaron con el anticuerpo secundario, antiratón o
25
Figura 2: Esquema representativo del ensayo de co-cultivo por contacto directo.
26
anticonejo (ambos en dilución 1:200), acoplados con el fluoróforo Alexa488 fluor por 2
horas a temperatura ambiente y en oscuridad, seguido de esto, se tiñeron los núcleos
con Ioduro de propidio (dilución 1:400) durante 1 minuto, después se realizaron 3
lavados de 5 minutos con PBS a temperatura ambiente. Finalmente, a los portaobjetos
se agregó 10uL de solución de montaje y se colocó el cubreobjeto, los cuales fueron
visualizados en el microscopio de epifluorescencia.
Como control negativo se realizó el mismo procedimiento pero en ausencia del primer
anticuerpo.
3.2.7 Producción de ROS en co-cultivo
Los neutrófilos y células mononucleares humanas se mantuvieron en medio RPMI
1640. Una hora después del aislamiento, son dispuestos en placas de 96 pocillos por
contacto directo y preincubados por 5 minutos a 37ºC con Luminol 10μM y luego
estimulados con fMLP 0,1μM midiendo 1000 cuentas (tiempo de integración 100ms). Se
realizaron controles sin estímulo y con las células por separado realizando el mismo
procedimiento descrito anteriormente. Además, se realizaron los mismos experimentos
en presencia de los inhibidores UO126 y SB203580, para ello, se realizó una incubación
de 30 minutos con los inhibidores luego de la incubación con luminol y posteriormente
se realizó la estimulación con fMLP 0,1µM; por otro lado, se realizaron ensayos en
presencia de dexametasona a diferentes concentraciones (100μM, 10μM, 1μM, 0,1μM
y 0,01μM), la incubación por 10 minutos se realizó previo a la incubación con luminol y
posteriormente se realizó la estimulación con fMLP.
27
3.2.8 Análisis Estadístico
Los experimentos fueron realizados a lo menos en triplicado. Los resultados fueron
expresados en gráfico de barras como veces sobre el control ± error estándar. El
análisis de los datos, se efectuó utilizando análisis de varianza (ANOVA) y un test de
comparaciones múltiples de Dunnett y el t de student, en donde se utilizó un nivel de
significancia del 5%. Todos los análisis fueron realizados con el software GraphPad
Prism versión 5.0 para Windows.
28
4 RESULTADOS
4.1 Efecto de TNF-α en la fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK en neutrófilos
Se evaluó la activación de neutrófilos mediada por TNF-α, mediante la detección
de la fosforilación de ERK1/2 y p38 MAPK por western blot.
Para esto, en primer lugar se realizó el aislamiento de neutrófilos mediante gradiente de
percoll, luego se realizó una cinética de estimulación con TNF-α (10ng/mL) a los
tiempos 0, 5, 15, 30, 60 y 90 minutos para, finalmente, realizar un western blot de las
proteínas ERK1/2 y p38 MAPK fosforiladas. En las figura 3 y 4, se puede apreciar que
hay fosforilación de ERK1/2 y p38 MAPK en neutrófilos al ser estimulados con TNF-α, lo
que se correlaciona con los antecedentes previamente documentados de la activación
de estas vías de señalización a través de una citoquina pro-inflamatoria como TNF-α.
Cabe mencionar que a partir de los 5 minutos de estimulación con TNF-α hay
fosforilación de ERK1/2 y p38 MAPK en neutrófilos, y, si bien hay fosforilación a los
tiempos posteriores, 15, 30, 60, y 90 minutos, el tiempo máximo fue registrado a los 5
minutos para ambas proteínas, de esta manera se establece este tiempo para estimular
los neutrófilos con TNF-α, los cuales posteriormente se someterán a co-cultivo con
células mononucleares para evaluar la interacción entre ambos tipos de células. Este
primer resultado, es crucial para continuar con el estudio de co-cultivo entre neutrófilos
y células mononucleares.
29
pERK1/2/ERK1/2
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
15
30
60
90
-
+
+
+
+
+
minutos
TNFp-ERK1/2
ERK1/2
Figura 3: Cinética de fosforilación de ERK 1/2 para neutrófilos estimulados con
TNF-α. Se determinó la cinética de fosforilación de ERK1/2 en neutrófilos estimulados
con TNF-α (10ng/ml) a diferentes tiempos. Los lisados celulares obtenidos son
separados por electroforesis y luego transferidos a membrana de nitrocelulosa
incubando con anticuerpo específico para p-ERK1/2, finalmente la membrana se
somete a “stripping” y se incuba con anticuerpo específico para ERK 1.
30
pp38MAPK/p38MAPK
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
15
30
60
90
-
+
+
+
+
+
minutos
TNFp-p38
p38
Figura 4: Cinética de fosforilación de p38 MAPK para neutrófilos estimulados con
TNF-α. Se determinó la cinética de fosforilación de p38 MAPK en neutrófilos
estimulados con TNF-α (10ng/ml) a diferentes tiempos. Los lisados celulares obtenidos
son separados por electroforesis y luego transferidos a membrana de nitrocelulosa
incubando con anticuerpo específico para p-p38 MAPK, finalmente la membrana se
somete a “stripping” y se incuba con anticuerpo específico para p38 MAPK.
31
4.2 Efecto de co-cultivo neutrófilos – células mononucleares en la fosforilación de
ERK1/2 y p38 MAPK
Para estudiar el efecto de cocultivar neutrófilos y PBMC; en primer lugar, se realizó el
aislamiento de neutrófilos y PBMC, luego los neutrófilos fueron estimulados con TNF-α
(10ng/mL) por cinco minutos, se lavaron una vez, para posteriormente ser cocultivados
con células mononucleares en placas transwell por 15, 30 y 60 minutos. Los lisados de
proteínas obtenidos de ambos tipos celulares fueron separados mediante electroforesis
y se detectó la fosforilación de ERK1/2 y p38 MAPK por western blot. En la figura 5A y
5B se observa que la activación de neutrófilos con TNF-α indujo la fosforilación de
ERK1/2 en células mononucleares, entre los 15 y 60 minutos de co-cultivo,
observándose el efecto máximo a los 60 minutos de manera significativa, sin embargo
no se evidenció un aumento considerable en la fosforilación de p38MAPK . En la figura
6A y 6B, en neutrófilos, también se observó un incremento significativo en la
fosforilación de ERK 1/2 a los 15 y 30 minutos de co-cultivo, pero no en la fosforilación
de p38MAPK.
32
A
pERK1/2/ERK1/2
2.0
**
1.5
1.0
0.5
0.0
Control
15
30
60
minutos
-
+
+
+
TNFpERK1/
2
ERK1/2
B
pp38MAPK/p38MAPK
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Control
15
30
60
-
+
+
+
minutos
TNFpp38
p38
Figura 5: Fosforilación de ERK1/2 y p38 MAPK en PBMC en co-cultivo. Los
neutrófilos fueron estimulados por 5 min. con TNF-α (10ng/ml), lavados y cocultivados
entre 15 a 90 minutos con PBMC en placas transwell, para el análisis de western blot.
(A) fosforilación de ERK1/2 en PBMC y (B) fosforilación de p38MAPK en PBMC. Cada
gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la señal
de pERK1/2/ERK1/2 o p-p38 MAPK/p38 MAPK. n=3; **, p<0,05 comparado con el
control.
33
A
pERK1/2/ERK1/2
2.0
*
**
1.5
1.0
0.5
0.0
Control
15
30
60
-
+
+
+
minutos
TNFpERK1/2
ERK1/2
B
pp38MAPK/p38MAPK
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Control
15
30
60
minutos
-
+
+
+
TNFpp38
p38
Figura 6: Fosforilación de ERK1/2 y p38 MAPK de neutrófilos en co-cultivo. Los
neutrófilos fueron estimulados por 5 min. con TNF-α (10ng/ml), lavados y cocultivados
entre 15 a 90 minutos con PBMC en placas transwell, para el análisis de western blot.
(A) fosforilación de ERK1/2 en neutrófilos y (B) fosforilación de p38MAPK en neutrófilos.
Cada gráfico de barras corresponde a la razón, a partir del análisis densitométrico, de la
señal de pERK1/2/ERK1/2 o p-p38 MAPK/p38 MAPK. n=3; Tratamiento 15 minutos con
TNF-α: **, Tratamiento 30 minutos con TNF-α p<0,05 comparado con el control.
34
4.3 Fosforilación de ERK1/2 en co-cultivo directo neutrófilos – células
mononucleares mediante Inmunofluorescencia
En base a los resultados anteriores, se evaluó la fosforilación de ERK1/2 al
cocultivar neutrófilos y PBMC, de manera directa, para esto, se realizó el aislamiento de
neutrófilos y células mononucleares, luego los neutrófilos fueron estimulados con TNF-α
(10ng/mL) por cinco minutos, se lavaron una vez y posteriormente fueron cocultivados
con PBMC por contacto directo por diferentes tiempos 15, 30, 60 y 90 minutos, más
tarde se realizó inmunofluorescencia para pERK1/2. Los núcleos fueron teñidos con
Ioduro de propidio.
En la figura 7, se observó un aumento de la fluorescencia entre los 15 y 60 minutos en
co-cultivo directo, de acuerdo a la conformación nuclear característica de neutrófilos
(lobulado) y células mononucleares (compacto), se distinguió que entre los 15 y 30
minutos existe una señal de fluorescencia de manera predominante en neutrófilos,
indicados en la figura por la flecha entera, y a los 60 minutos, persistió un leve aumento,
asociado a células mononucleares indicadas por la flecha punteada, lo cual presenta
una tendencia a relacionarse con los resultados anteriores por western blot.
35
Co 15min
Co 30min
Co 60min
Co 90min
Merge
pERK1/2
IP
Co control
Figura 7: Fosforilación de ERK1/2 en co-cultivo neutrófilos-PBMC. Los neutrófilos
fueron estimulados por 5 min. con TNF-α (10ng/ml), lavados y cocultivados entre 15 a
90 minutos con células mononucleares por contacto directo, para el análisis de
inmunofluorescencia de pERK 1/2; se incubó con el anticuerpo primario para pERK1/2
por 16 horas y el secundario marcado con alexa 488, por dos horas. Los núcleos fueron
marcados con Ioduro de propidio (IP). Se observan células mononucleares, indicadas
por las puntas de flecha y neutrófilos indicados por flecha entera. Abreviaciones; Co: cocultivo, min: minutos, IP: Ioduro de propidio, Merge: superposición de imágenes.
Aumento: 100X.
36
4.4 Inmunocitoquímica de p65 NF B e I Bα en co-cultivo neutrófilos-PBMC
La activación de las vías de señalización como las MAPKs, en procesos
inflamatorios generan variadas respuestas, entre las que se encuentran la regulación de
factores de transcripción como NF-κB, que pueden gatillar la producción de proteínas
proinflamatorias u otras moléculas de señalización que puedan generar una
prolongación de la respuesta inflamatoria y que promueva la interacción con otras
células. Para evaluar si la activación dada en co-cultivo entre neutrófilos y células
mononucleares puede generar una respuesta a nivel transcripcional; se analizó la
localización del factor de transcripción NF-κB y de la subunidad IκBα por
inmunofluorescencia; para esto se aisló neutrófilos y PBMC, luego los neutrófilos fueron
estimulados con TNF-α (10ng/mL) por cinco minutos para posteriormente ser
cocultivados con células mononucleares por contacto directo por diferentes tiempos 15,
30, 60 y 90 minutos, más tarde se realizó inmunofluorescencia para p65 (NF-κB) e IκBα,
finalmente los núcleos se tiñen con Ioduro de propidio. En las figura 8 se observó entre
los 15 y 60 minutos una señal más intensa para p65 en la zona que coincide con la
señal de ioduro de propidio, indicativo de la presencia de los núcleos, esto sugiere que
p65 NF-κB podría ubicarse en la región nuclear en los tiempos coincidentes a
resultados anteriores de fosforilación de ERK1/2.
Por otra parte en la figura 9, se observó una disminución de la señal de IκBα a los 60
minutos de co-cultivo, esto podría estar sugiriendo una posible degradación de IκBα,
evento importante en la activación de NF-κB.
37
Co 15min
Co 30min
Co 60min
Co 90min
Merge
p65NFκB
IP
Co control
Figura 8: Inmunocitoquímica de p65 NF-κB en co-cultivo neutrófilos-PBMC. Los
neutrófilos fueron estimulados por 5 min. con TNF-α (10ng/ml), lavados y cocultivados
entre 15 a 90 minutos con células mononucleares por contacto directo, para el análisis
en inmunocitoquímica, se incubó con el anticuerpo primario que detecta p65 por 16
horas y el secundario marcado con alexa 488, por dos horas. Los núcleos fueron
marcados con Ioduro de propidio. Se observan células mononucleares, indicadas por
las puntas de flechas como neutrófilos indicados por flecha entera. Abreviaciones; Co:
co-cultivo, min: minutos, IP: Ioduro de propidio, Merge: superposición de imágenes.
Aumento: 100X.
38
Co 15min
Co 30min
Co 60min
Co 90min
Merge
IκBα
IP
Co control
Figura 9: Degradación de IκBα en co-cultivo neutrófilos-PBMC. Los neutrófilos
fueron estimulados por 5 min. con TNF-α (10ng/ml), lavados y cocultivados entre 15 a
90 minutos con células mononucleares por contacto directo, para el análisis en
inmunocitoquímica. (A) Inmunofluorescencia de IκBα, se incubó con el anticuerpo
primario que detecta p65 por 16 horas y el secundario marcado con alexa 488, por dos
horas. Los núcleos fueron marcados con Yoduro de propidio. Se observan tanto células
mononucleares, indicadas por las puntas de flechas como neutrófilos indicados por
flecha entera. Abreviaciones; Co: co-cultivo, min: minutos, IP: Ioduro de propidio,
Merge: superposición de imágenes. Aumento: 100X.
39
4.5 Producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP y co-cultivados con
PBMC
La producción de ROS, es una respuesta importante en eventos inflamatorios,
realizado principalmente por neutrófilos que permite gatillar una respuesta inflamatoria
exacerbada y que es posible mantenerla por un cierto período de tiempo.
En vista de la interacción evidenciada entre neutrófilos y PBMC, se pretendió evaluar de
qué manera podría estar influyendo esta interacción en la producción de ROS en
neutrófilos, para ello, en primer lugar se realizó aislamiento de neutrófilos y células
mononucleares, luego son cocultivados en forma directa en placa, se pre-incuba con
luminol por 5 min a 37ºC, luego se estimula con fMLP (0,1μM) y se miden por 5 minutos
(300 segundos). En los resultados de la figura 10A y 10B, se observó la producción de
ROS en neutrófilos estimulados con fMLP, sin embargo, no hubo producción de ROS en
células mononucleares estimuladas con fMLP, finalmente al cocultivar los neutrófilos
con células mononucleares se apreció una disminución en la producción de ROS. Si
bien la relación utilizada entre neutrófilos y células mononucleares fue de 2:1 para este
experimento, se evaluó la producción de ROS en co-cultivo al disponer de una relación
1:1 y de esta manera verificar que la relación entre ambos tipos celulares no influyen en
esta disminución de producción de ROs, los resultados en la figura 11A y 11B, no
indican variaciones en la producción de ROS al realizar distintas diluciones. Todos los
análisis posteriores se realizaron en una relación neutrófilos – PBMC 2:1.
40
A
ROS
1500
Neutrófilos Control
Neutrófilos fMLP
1000
RLU
Linfocitos Control
Linfocitos fMLP
Cocultivo Control
500
Cocultivo fMLP
0
0
100
200
300
Tiempo (segundos)
B
1.5×10 6
#
AUC0-200
**
1.0×10 6
5.0×10 5
0
Neutrófilos
+
+
-
-
PBMC
-
-
+
+
-
+
+
fMLP
+
+
-
+
+
+
Figura 10: Producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP y cocultivados con PBMC (Relación 2:1). Neutrófilos y células mononucleare son
cocultivados en forma directa en placa en una relación 2:1, se pre-incuba con luminol
por 5 min a 37ºC, luego se estimula con fMLP (0,1μM) y se mide por 5 minutos (300
segundos). (A) Producción de ROS en los tratamientos, se muestran los primeros 100
segundos de medición.
(B) Gráfico comparativo de la producción de ROS de acuerdo
al área bajo la curva (AUC) de los tratamientos, n=3; **, p<0,05 tratamiento de
neutrófilos estimulados con fMLP comparado con el control, y n=3; #, p<0,05 tratamiento
de neutrófilos estimulados con fMLP comparado con co-cultivo estimulado con fMLP.
41
A
ROS
2500
Neutrófilos Control
Neutrófilos fMLP
2000
RLU
Linfocitos fMLP
1500
Cocultivo control
Cocultivo fMLP
1000
500
0
0
100
200
300
Tiempo (segundos)
B
AUC0-200
1.5×10 6
1.0×10 6
5.0×10 5
0
Neutrófilos
+
+
-
PBMC
-
-
+
+
fMLP
+
+
+
-
+
+
+
Figura 11: Producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP y cocultivados con PBMC (Relación 1:1). Neutrófilos y células mononucleares son
cocultivados en forma directa en placa en una relación 1:1, se pre-incuba con luminol
por 5 min a 37ºC, luego se estimula con fMLP (0,1μM) y se mide por 5 minutos (300
segundos). (A) Producción de ROS en los tratamientos, se muestran los primeros 100
segundos de medición.
(B) Gráfico comparativo de la producción de ROS de acuerdo
al área bajo la curva (AUC) de los tratamientos, n=1.
42
4.6 Estimación de la posible participación de vías de señalización en la
producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP y co-cultivados con
células mononucleares
De acuerdo a la interacción evidenciada en co-cultivo en la producción de ROS
en neutrófilos, se evaluó la producción de ROS en presencia de inhibidores de la vía de
las MAPKs,y verificar si existe la participación de ERK1/2 y p38 MAPK. Para esto, luego
de aislar neutrófilos y células mononucleares, cada tratamiento se incubó por 30
minutos con UO126; que es un inhibidor de las MEK1/2, quinasas río arriba de las
ERK1/2; y por otro lado, con SB203580; que es un inhibidor de las p38 MAPKs.
Posteriormente se estimula con fMLP (0,1µM) y se realiza la medición de ROS. En el
resultado correspondiente a las figuras 12A y 12B se observó que al preincubar con el
inhibidor UO126, por un lado, hubo una disminución de la producción de ROS en
neutrófilos, y por otro lado, al preincubar con UO126 en co-cultivo, hubo una
disminución más pronunciada de producción de ROS en neutrófilos, en comparación a
la disminución en la producción de ROS en el tratamiento de co-cultivo sin inhibidor;
esto podría indicar un efecto sumatorio en la disminución de la producción de ROS en
neutrófilos. Finalmente, el resultado que corresponde a las figuras 13A y 13B no se
apreciaron diferencias en la producción de ROS en neutrófilos preincubados con el
inhibidor SB203580 en comparación a la producción de ROS en neutrófilos sin utilizar el
inhibidor; de la misma manera, al cocultivar con células mononucleares si bien, se
aprecia una disminución en la producción de ROS en neutrófilos, que se relaciona a
resultados anteriores, esta disminución no parece variar al adicionar el inhibidor
SB203580.
43
ROS
A
400
Neutrófilos Control
Neutrófilos fMLP
RLU
300
Neutrófilos UO fMLP
Cocultivo Control
200
Cocultivo fMLP
Cocultivo UO Control
100
Cocultivo UO fMLP
0
0
25
50
75
100
Tiempo (segundos)
B
AUC0-25
1.5×10 4
1.0×10 4
5.0×10 3
0
Neutrófilos
+
+
+
PBMC
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
UO126
fMLP
+
+
+
+
+
Figura 12: Producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados con PBMC y previamente incubados con el inhibidor UO126. Neutrófilos
y células mononucleares son cocultivados en forma directa en placa, se pre-incuba con
UO126 por 30 minutos y luego con luminol por 5 min a 37ºC, finalmente se estimula con
fMLP (0,1μM) y se mide por 5 minutos (300 segundos) (A) Producción de ROS en los
tratamientos, se muestran los primeros 100 segundos de medición.
(B) Gráfico
comparativo de la producción de ROS de acuerdo al área bajo la curva (AUC) de los
tratamientos, n=1.
44
A
ROS
150
Neutrófilos Control
Neutrófilos fMLP
Ne SB fMLP
100
RLU
Cocultivo Control
Cocultivo fMLP
Cocultivo SB Control
50
Cocultivo SB fMLP
0
0
25
50
75
100
Tiempo (segundos)
B
5.0×10 3
AUC0-25
4.0×10 3
3.0×10 3
2.0×10 3
1.0×10 3
0
Neutrófilos
+
+
+
PBMC
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
SB203580
fMLP
+
+
+
+
+
Figura 13: Producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados con PBMC y previamente incubados con el inhibidor SB203580.
Neutrófilos y células mononucleares son cocultivados en forma directa en placa, se preincuba con SB203580 por 30 minutos y luego con luminol por 5 min a 37ºC, finalmente
se estimula con fMLP (0,1μM) y se mide por 5 minutos (300 segundos). (A) Producción
de ROS en los tratamientos, se muestran los primeros 100 segundos de medición. (B)
Gráfico comparativo de la producción de ROS de acuerdo al área bajo la curva (AUC)
de los tratamientos, n=1.
45
4.7 Efecto de Dexametasona sobre la producción de ROS en Neutrófilos
estimulados con fMLP
Los glucocorticoides son ampliamente utilizados en limitar el proceso inflamatorio
que de una u otra forma podría contribuir en alguna patología, la dexametasona, un
glucocorticoide sintético, evidencia funciones antiinflamatorias, y de disminución en la
respuesta inmune en células mononucleares, por lo tanto, es probable que al tratar con
dexametasona, la disminución en la producción de ROS en neutrófilos, al cocultivarlos
con células mononucleares, sea revertida debido a este efecto inhibitorio en células
mononucleares. Sin embargo, primero se debe descartar la posibilidad de que
dexametasona inhiba la producción de ROS en neutrófilos, para evaluar esto, primero
se realizó el aislamiento de neutrófilos, se pre-incuba con luminol por 5 min a 37ºC,
luego se incuba con Dexametasona por 10 minutos a diferentes concentraciones (1nM,
10nM, 100nM, 1µM, 10µM y 100µM) y finalmente, se estimula con fMLP (0,1μM) y se
miden 1000 cuentas. En las figuras 14A y 14B, se observó que hay un aumento en la
producción de ROS en neutrófilos, estimulados con fMLP y este aumento no se vió
afectado al estar en presencia de dexametasona en variadas concentraciones (1nM,
10nM, 100nM, 1µM y 10µM), lo que indicaría que dexametasona en las concentraciones
indicadas, no está ejerciendo efecto sobre la producción de ROS en neutrófilos. Sin
embargo, al utilizar una concentración de dexametasona de 100µM, existe una
disminución significativa en la producción de ROS en neutrófilos en comparación a la
producción de ROS sin la preincubación de dexametasona, esto podría indicar que a
concentraciones altas de dexametasona, podría existir un efecto inhibitorio en esta
producción de ROS.
46
A
ROS
2500
Ne control
Ne fMLP
2000
RLU
Ne Dex 1nM / fMLP
1500
Ne Dex 10nM / fMLP
Ne Dex 100nM / fMLP
1000
Ne Dex 1uM / fMLP
Ne Dex 10uM / fMLP
500
Ne Dex 100uM / fMLP
0
B
0
100
1.0×10 6
200
300
**
Tiempo (segundos)
AUC0-200
8.0×10 5
6.0×10 5
4.0×10 5
2.0×10 5
0
Neutrófilos
fMLP
[Dex]
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1nM 10nM 100nM 1uM 10uM 100uM
Figura 14: Producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP previamente
incubados con dexametasona. Neutrófilos son ubicados en forma directa en placa, se
pre-incuba con dexametasona a distintas concentraciones por 30 minutos y luego con
luminol por 5 min a 37ºC, finalmente se estimula con fMLP (0,1μM) y se mide por 5
minutos (300 segundos). (A) Producción de superóxido en los tratamientos, se
muestran los primeros 100 segundos de medición, abreviaciones; Ne: neutrófilos; Dex:
dexametasona. (B) Gráfico comparativo de la producción de ROS de acuerdo al área
bajo la curva (AUC) de los tratamientos; abreviaciones Dex: dexametasona; [Dex]:
concentración de dexametasona, n=3; **, p<0,05 para el tratamiento de neutrófilos con
fMLP y dexametasona 100µM comparado con el tratamiento de neutrófilos estimulados
con fMLP.
47
4.8 Descripción del posible efecto de Dexametasona sobre la producción de ROS
en Neutrófilos estimulados con fMLP y co-cultivados con PBMC
Al evidenciar que no existe efecto en la producción de ROS en neutrófilos al incubar con
dexametasona, se evaluó si dexametasona a concentraciones de 1nM y 100nM, podría
revertir la disminución de producción de ROS en neutrófilos al cocultivar con células
mononucleares. Para esto, primero se realizó el aislamiento de neutrófilos y células
mononucleares, luego son cocultivados en forma directa en placa, se pre-incuba con
luminol por 5 min a 37ºC, luego se incuba con Dexametasona por 10 minutos a las
concentraciones de 1nM y 100nM, y finalmente se estimula con fMLP (0,1μM) y se
miden 1000 cuentas.
En las figuras 15A y 15B, que corresponden al resultado utilizando dexametasona 1nM
en co-cultivo, no se observó una diferencia significativa en la producción de ROS entre
el co-cultivo tratado con dexametasona 1nM y fMLP, comparado con el co-cultivo sólo
tratado con fMLP, por lo tanto no se revertiría el efecto de disminución de producción de
ROS en neutrófilos. Asi mismo, no se evidenció una diferencia entre la producción de
ROS en neutrófilos al tratarlos con dexametasona y fMLP, comparado con los
neutrófilos tratados sólo con fMLP, esto se relaciona a los resultados anteriores.
Finalmente, cabe mencionar que, al igual que en experimentos ya descritos, se
evidencia una disminución significativa en la producción de ROS en co-cultivo tratado
con fMLP comparado con los neutrófilos tratados con fMLP.
Por otro lado, en las figuras 16A y 16B, correspondientes a la producción de ROS en
co-cultivo tratados con dexametasona 100nM y fMLP, tampoco se observaron
diferencias significativas entre éste tratamiento y el co-cultivo sólo tratado con fMLP, asi
48
mismo no hay diferencias en la producción de ROS en neutrófilos preincubados con
dexametasona 100nM y estimulados posteriormente con fMLP,
comparado con los
neutrófilos tratados sólo con fMLP, esto también se relaciona a los resultados obtenidos
anteriormente. Para finalizar, se observa igualmente, una disminución significativa en la
producción de ROS en co-cultivo tratado con fMLP comparado con los neutrófilos
tratados con fMLP.
49
A
ROS
2000
Ne control
Ne fMLP
RLU
1500
Ne Dex 1nM / fMLP
Co fMLP
Co Dex 1nM / control
Co Dex 1nM / fMLP
1000
500
0
0
100
B
200
300
Tiempo (segundos)
8.0×10 5
*
AUC(0-200)
6.0×10 5
4.0×10 5
2.0×10 5
0
Neutrófilos
+
+
+
PBMC
-
-
-
+
+
+
fMLP
Dex 1nM
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
Figura 15: Producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados con PBMC y previamente incubados con dexametasona 1nM.
Neutrófilos y células mononucleares son cocultivados en forma directa en placa, se preincuba con dexametasona 1nM por 30 minutos y luego con luminol por 5 min a 37ºC,
finalmente se estimula con fMLP (0,1μM) y se mide por 5 minutos (300 segundos). (A)
Producción de ROS en los tratamientos , se muestras los primeros 100 segundos de
medición, abreviaciones; Ne: neutrófilos; Co: co-cultivo, Dex: dexametasona. (B) Gráfico
comparativo de la producción de ROS de acuerdo al área bajo la curva (AUC) de los
tratamientos, abreviaciones Dex: dexametasona. n =3; **, p<0,05 para el tratamiento de
neutrófilos estimulados con fMLP y co-cultivo estimulado con fMLP.
50
A
ROS
800
Ne control
Ne fMLP
RLU
600
Ne Dex 100nM / fMLP
Co fMLP
400
Co Dex 100nM / control
Co Dex 100nM / fMLP
200
0
0
100
200
300
Tiempo (segundos)
B
5.0×10 5
AUC0-200
4.0×10
**
5
3.0×10 5
2.0×10 5
1.0×10 5
0
Neutrófilos
+
+
+
PBMC
-
-
-
+
+
+
fMLP
Dex 100nM
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
Figura 16: Producción de ROS en Neutrófilos estimulados con fMLP, cocultivados con PBMC y previamente incubados con dexametasona 100nM.
Neutrófilos y células mononucleares son cocultivados en forma directa en placa, se preincuba con dexametasona 100nM por 30 minutos y luego con luminol por 5 min a 37ºC,
finalmente se estimula con fMLP (0,1μM) y se mide por 5 minutos (300 segundos) (A)
Producción de ROS en los tratamientos realizados, se muestras los primeros 100
segundos medidos, abreviaciones; Ne: neutrófilos; Co: co-cultivo, Dex: dexametasona.
(B) Gráfico comparativo de la producción de ROS de acuerdo al área bajo la curva
(AUC) de los tratamientos, abreviaciones Dex: dexametasona; n=3; **, p<0,05 para el
tratamiento de neutrófilos estimulados con fMLP y co-cultivo estimulado con fMLP.
51
5 DISCUSIÓN
Los neutrófilos son la primera línea de defensa en la respuesta inmune y en
procesos inflamatorios, poseen la capacidad de ser atraídos al sitio de la inflamación
mediante quimioatractantes y ser activados por citoquinas proinflamatorias para
ejecutar variadas respuestas, como producción de citoquinas, liberación de ROS y otros
componentes citotóxicos, destrucción de patógenos foráneos entre otros. En primer
lugar, mediante western blot, se observó que los neutrófilos son activados por TNF-α, a
partir de los 5 minutos de exposición, ya que gatillan una inmediata activación de vías
de señalización intracelulares como las MAPKs, en vista de lo evidenciado en la
fosforilación de ERK1/2 y p38 MAPK2. Estos hallazgos ya se han descrito en la
literatura, en donde se ha evaluado la activación de neutrófilos al ser estimulados con
citoquinas proinflamatorias como GM-CSM, TNF-α y el quimioatractante fMLP (McLeish
et al., 2008 y Zu et al., 1998). La activación de éstas vía de señalización nos permite
aseverar que se está promoviendo la respuesta de neutrófilos en eventos inflamatorios,
ya que se ha visto que las MAPKs participan, por ejemplo en la producción de
citoquinas proinflamatorias que promueven el proceso inflamatorio (Cloutier et al.,
2007).
Para evaluar la
posible comunicación
entre
neutrófilos
activados
y
células
mononucleares, se realizaron variados análisis de co-cultivo, ya sea mediado por
transwell, como por contacto directo. Al estimular los neutrófilos por 5 minutos con TNFα, y luego cocultivarlos mediante transwell con células mononucleares, se observó
mediante western blot que se produjo un aumento significativo de la fosforilación de
ERK1/2 en células mononucleares a los 60 minutos de exposición al co-cultivo, sin
52
embargo, no se logró evidenciar la fosforilación de p38MAPK, por su parte, también
existe fosforilación de manera significativa de ERK1/2 en neutrófilos, entre los 15 y 30
minutos de exposición, en contraste a esto, no se determinó significativamente la
fosforilación de p38MAPK. Al realizar inmunofluorescencia de fosfo-ERK1/2 en donde
se sometieron ambos tipos celulares a co-cultivo por contacto directo, se evidencia un
aumento de la señal entre los 15 y 60 minutos de co-cultivo. Estos resultados de
western blot e inmunofluorescencia permiten evidenciar una posible interacción entre
neutrófilos y células mononucleares, a través de la activación de la vía de señalización
de ERK1/2 en ambos tipos celulares. Es interesante que, se haya descrito la activación
de vías de señalización en co-cultivo tanto por contacto directo, como mediado por
transwell; por una parte, se ha evidenciado que el contacto directo entre éstos tipos
celulares es importante para el control de la proliferación de los linfocitos T CD4+ por
neutrófilos en la respuesta inmune (Thewissen et al., 2011). Por otro lado, el contacto
directo no es determinante de que exista comunicación celular, ya que probablemente
los neutrófilos al ser activados promueven quizás la liberación de mediadores solubles
que estén activando directamente a los linfocitos y de esta manera promoviendo
cascadas de señalización. Se ha estudiado que los neutrófilos liberan quimoquinas que
atraen a los linfocitos al sitio de inflamación y además pueden liberar citoquinas que
promuevan la diferenciación de linfocitos, la liberación de IFN-γ, TNF-α, elastasa de
neutrófilos son capaces de incrementar la proliferación de linfocitos y producción de
citoquinas que en conjunto intensifican la respuesta inmune adaptativa (Tillack et al.,
2012).
53
Ahora bien, para verificar si esta interacción es llevada a niveles de transcripción de
genes, se realizó inmunofluorescencia del factor de transcripción p65 NF-κB, para esto
se estimularon los neutrófilos por 5 minutos con TNF-α y luego se sometieron a cocultivo con células mononucleares, esta vez por contacto directo; el resultado mostró
una señal intensa entre los 15 y 60 minutos de co-cultivo, y la distribución de esa señal
estaría de manera coincidente a la ubicación de los núcleos de neutrófilos y células
mononucleares, lo cual podría eventualmente indicar una posible activación de p65 NFκB, además se observó una disminución de la señal de inmunofluorescencia de IκBα a
los 60 minutos de co-cultivo, lo cual coincidiría con una factible activación del factor de
transcripción, ya que es necesaria la fosforilación y degradación de IκBα para la
liberación, y por tanto, activación de NF-κB. Si bien, llama la atención la diferencia entre
el tiempo de la degradación de IκBα, 60 minutos, y el cambio de localización de NF-κB,
entre 15 y 60 minutos, lo cual puede indicar por un lado, que en términos de tiempo, la
degradación de IκBα puede ser un evento más prolongado, en vista del proceso de
poliubiquitinación y derivación al proteosoma, versus la translocación al núcleo de NFκB; o por otro lado, cabe mencionar que además de la vía clásica o canónica, evaluada
en este estudio, existe la vía no canónica mediada por la quinasa inductora de NF-κB
(NIK) que activa la IkB-quinasa α (IKK-α), ésta fosforila la proteína p-100 permitiendo su
ubiquitinación y liberación de la porción activa del dímero de NK-κB que se transloca al
núcleo (Sun, 2011), por lo que, evaluar si la posible translocación de NF-κB dada por el
co-cultivo neutrófilos y células mononucleares es mediada por la vía no canónica, es
una alternativa a verificar y responder mejor de qué manera está involucrado este factor
de transcripción.
54
Es poco lo que se ha documentado con respecto a la interacción entre neutrófilos y
células mononucleares a nivel de factores de transcripción, si se ha visto que la
producción de péptidos neutrófilos humanos (HNPs), promueve la elevación de p50 NFκB y degradación de IκB en linfocitos CD4+, además que incrementa la adhesión de
linfocitos CD4+ a células alveolares humanas, con la consecuente liberación de
citoquinas proinflamatorias, como IL-2, IL-8 e IFN-γ. La activación del factor de
transcripción p50NF-κB, se vio a los 30 minutos de exposición con HNPs (Vaschetto et
al., 2007), esto nos permite indicar que en los resultados de este estudio, también se vió
posible ubicación nuclear de p65 NF-κB a los 60 minutos de exposición a co-cultivo con
neutrófilos pre-estimulados con TNF-α, y por tanto sugerir de que podría existir la
liberación de algún mediador por parte de los neutrófilos que ejerza activación sobre sí
mismo y en células mononucleares, a nivel de factores de transcripción. La activación
de NF-κB, promueve la síntesis de variadas citoquinas pro-inflamatorias, lo que estaría
permitiendo dar curso al proceso inflamatorio en sí, generando una interacción entre la
respuesta inmune innata y adquirida en vista de controlarlo o continuarlo, ya que esto
está dado por la condiciones experimentales, de estimulación en tiempos relativamente
cortos.
La producción de ROS es de crucial importancia en neutrófilos, para el control de
patógenos externos, y sea en procesos de respuesta inmune propiamente tal, como en
inflamación aguda, generada por agentes bacterianos (FAN et al., 2001), para
determinar que sucede en la producción de ROS de neutrófilos al interactuar con
células mononucleares, se cocultivaron ambas células en presencia de un estimulador
de ROS como fMLP y se midió mediante luminiscencia; los resultados arrojaron en
55
primera instancia de que hubo producción significativa de ROS en neutrófilos
estimulados con fMLP, sin embargo hubo una disminución también significativa de esta
producción cuando fueron cocultivados con células mononucleares; cabe mencionar
que se realizaron ensayos con distintas relaciones (1:1 y 2:1) de neutrófilos y células
mononucleares en donde no se vieron cambios en la disminución de producción de
ROS, por un lado, descartando que este efecto sea por un aumento de concentración
celular, y por otro lado, al utilizar una relación 2:1 entre neutrófilos y células
mononucleares, asemeja la proporcionalidad poblacional de éstas células en el sistema
inmune.
Si bien, hace bastante tiempo se documentó que en pacientes con mononucleosis,
linfocitos T supresores disminuyen la producción de superóxidos en neutrófilos a las 17
horas de exposición a co-cultivo (Niwa et al., 1984); resulta interesante que exista este
tipo de interacción rápida, probablemente la activación de neutrófilos es tal que genera
una respuesta casi inmediata en linfocitos en controlar la actividad de neutrófilos.
Luego, se evaluó si en esta disminución de producción de ROS en neutrófilos
cocultivados con células mononucleares, hay intervención de alguna vía de
señalización, se realizaron experimentos bajo las mismas condiciones mencionadas
anteriormente, pero en presencia de inhibidores tanto de la vía de la ERK1/2 como
UO126, como para la vía de la p38 MAPKs, SB203580, los resultados indicaron que,
por un lado, al preincubar con el inhibidor UO126, se vió una disminución en la
producción de ROS en neutrófilos, tanto al ser tratados solos con fMLP, como en cocultivo con células mononucleares y activados con fMLP y que ésta disminución sugirió
ser aún mayor en comparación a la producción de ROS en neutrófilos cocultivados con
56
células mononucleares y fMLP solamente, esto evidenció un efecto sumatorio en la
disminución de la producción de ROS en neutrófilos, en otras palabras, la incorporación
de ambas condiciones, co-cultivo con células mononucleares y uso del inhibidor UO126,
podrían ser dos factores sinérgicos
para la inhibición de ROS en neutrófilos, sin
embargo, cabe mencionar que no se puede determinar si esta posible participación de
la ERK1/2 provenga de neutrófilos o células mononucleares, lo que podría aclarar mejor
este paralelismo en la respuesta. Por otra parte, el tratamiento con el inhibidor
SB203580 no reveló diferencias importantes entre los tratamientos, esto nos podría
indicar que p38MAPK no estaría participando, bajo éstas condiciones experimentales
en la producción de ROS en neutrófilos. Es importante mencionar, que se ha descrito
que la liberación de ROS estaría involucrada en la activación de las proteínas de la vía
de las MAPKs, ERK1/2, p38MAPK y JNK, probablemente mediante la interacción de
ROS con proteínas río arriba que activan éstas MAPKs, ya que ROS provee un
ambiente oxidativo que provoca una modificación en las proteínas de señalización (Son
et al., 2011). Se ha evidenciado que probablemente la GTPasa RAS, que es un
activador de las ERKs, podría ser alterada directamente por ROS, debido a la oxidación
de una cisteína ubicada en el sitio de unión a guanina, resultando en su activación
(Torres y Forman, 2003). Si bien estos resultados no permiten aseverar una conclusión
acabada, si arrojan un acercamiento a dilucidar una posible interacción entre neutrófilos
y células mononucleares en eventos de inflamación, en donde existe una gran
producción de ROS.
Finalmente, y a manera de revertir el efecto de disminución de la producción de ROS en
neutrófilos por co-cultivo con células mononucleares, se evaluó la producción de ROS
57
en
presencia
de
un
glucocorticoide,
la
dexametasona,
que
posee
efectos
antiinflamatorios, enfocados en la inhibición de la respuesta inmune de células
mononucleares, se ha descrito que a través de la unión de dexametasona a su receptor,
el receptor de gucocorticoide, gatilla variados mecanismos que pueden significar en la
translocación al núcleo del complejo glucocorticoide y su receptor, activando elementos
de respuesta positivos o negativos, y suprimiendo por ejemplo la activación de factores
de transcripción, como NF-κB, el Factor nuclear de células T activadas (NFAT), y la
transcripción de citoquinas como IL-2, (Löwenberg, et al, 2007)
En primer lugar, se evaluó si dexametasona ejercía algún efecto en la producción de
ROS en neutrófilos sin ser cocultivados, para esto se preincubó con dexametasona a
diferentes concentraciones (1nM, 10nM, 100nM, 1µM, 10µM y 100µM) por 10 minutos
y luego se estimuló con fMLP para ver el efecto del glucocorticoide en la producción de
ROS en neutrófilos, en estos resultados se observó que hubo un aumento en la
producción de ROS en neutrófilos, estimulados con fMLP y previamente incubados con
dexametasona, en casi todas las concentraciones utilizadas (1nM, 10nM, 100nM, 1µM y
10µM), lo que indicaría que dexametasona en las concentraciones indicadas, no está
ejerciendo efecto sobre la producción de ROS en neutrófilos. Es importante destacar,
que cuando se utilizó una concentración de dexametasona de 100µM, se observó una
disminución significativa en la producción de ROS en neutrófilos en comparación a la
producción de ROS sin la preincubación de dexametasona, esto podría indicar que bajo
estas condiciones experimentales a concentraciones altas de dexametasona, podría
existir un efecto inhibitorio en esta producción de ROS. Se ha descrito que el uso de
glucocorticoides como dexametasona, podrían estar inhibiendo la apoptosis en
58
neutrófilos, y de esta manera permitiría la persistencia de la respuesta inmune innata,
en contraposición al efecto inhibitorio que provocarían los glucocorticoides en células de
la respuesta inmune adquirida, como linfocitos, (Saffar et al., 2011 y Stankova et al.,
2002), eso en parte podría explicar el porqué el uso de Dexametasona no afectó la
producción de ROS en neutrófilos.
En base a lo descrito anterior, se evaluó la producción de ROS en neutrófilos cocultivados con PBMC en presencia de dexametasona a concentraciones de 1nM y
100nM, si bien se esperaba disminuir el probable efecto de las células mononucleares
en la producción de ROS en neutrófilos, y por tanto restablecer ésta producción de
ROS, no se observaron cambios significativos, ya que persistió la disminución de la
producción de ROS en neutrófilos al cocultivarlos con células mononucleares, en
presencia de dexametasona a ambas concentraciones evaluadas anteriormente (1nM y
100nM). Probablemente faltó evaluar si esas concentraciones son las apropiadas como
para disminuir la respuesta inmune de PBMC. Se ha descrito que el uso de
dexametasona a 100nM inhibe la fosforilación del transductor de señal y activador de la
transcripción 4 (STAT4) que es inducido por la citoquina proinflamatoria IL-12
(Franchimont, et al., 2000),
y en concentraciones similares, la presencia de
dexametasona a tiempos cortos promueve la inhibición de proteínas tirosina quinasas
involucradas en la activación del receptor TCR (Löwenberg, et al., 2005), si bien, al
parecer las concentraciones utilizadas parecen ser las adecuadas, bajo estas
condiciones experimentales no se logró obtener lo que se esperaba. Existen
antecedentes que permiten aclarar la versatilidad en los efectos al utilizar
glucocorticoides como la dexametasona, tanto en eventos de activación como
59
supresión, por ejemplo, se ha descrito que dexametasona incrementa la producción de
ROS en macrófagos y que éstos tendrían un efecto supresor en la activación de
linfocitos T, y que en contraparte, en tiempos más prolongados de evaluación del efecto
y en condiciones in-vivo en ratas se logró distinguir que hay una activación de linfocitos
T reguladores (Kraaij et al., 2011). En otro estudio, se describió el efecto complejo que
ejerce dexametasona en linfocitos de sangre periférica de bovino, en donde se describió
una respuesta variada de acuerdo al aumento o disminución de las subpoblaciones de
linfocitos (Menge y Dean-Nystrom, 2008). Finalmente, otro antecedente, destaca que la
presencia de citoquinas proinflamatorias como IL-2 y TNF-α, suprimen el efecto de
proliferativo en linfocitos T que ejerce dexametasona (Creed et al., 2009).
De acuerdo a lo evidenciado en los resultados de este estudio, en promover en primera
instancia un aumento de la respuesta inflamatoria, a través de vías de señalización
como las MAPK, y vías de transducción de señal como NF-κB, en la situación en que
estén presentes citoquinas proinflamatorias como TNF-α, pero también podría estar
implicado en
la resolución de una inflamación aguda, en vista de sus efectos
inhibitorios en la producción de ROS por parte de los neutrófilos al ser expuestos a
células mononucleares, se ha descrito en un estudio que la transición de la respuesta
inmune innata a una adaptativa permite la resolución del proceso inflamatorio, y que
esto es promovido por citoquinas que promueven vías de señalización como IL-6 y
STAT3 respectivamente (Fielding et al., 2008). También se ha estudiado, que los
linfocitos T reguladores, estarían desactivando a neutrófilos, ya que se demostró que
hay un aumento en la producción de IL-10, TGF-β por neutrófilos al ser incubados con
linfocitos T reguladores activados con LPS (Lewkowicz et al., 2012), este efecto
60
antiinflamatorio, nos acerca a dilucidar mecanismos de control del sistema inmune en
eventos inflamatorios, y confirma que la comunicación entre estas células es crucial
para llevar a cabo tal proceso. Otro estudio, más antiguo, ha descrito que los neutrófilos
son capaces de intensificar la proliferación de linfocitos, promoviendo la capacidad de
respuesta del linfocito a IL-2 gatillado por anti-CD3 (Bentin et al., 1991).
En condiciones patológicas, se ha descrito por ejemplo, que existe una alteración en la
liberación de citoquinas por parte de linfocitos que al liberar IFN-γ, promueven el retraso
de la apoptosis en neutrófilos, por lo tanto prolongando su permanencia en el sitio de
inflamación; y quizás ligar el daño tisular en este tipo de enfermedades con la
permanencia de neutrófilos activados excesivamente, liberando contenido proteolítico y
citotóxico sean un potencial blanco terapéutico (Müller et al., 2009). También se ha
estudiado la participación de los linfocitos en procesos inflamatorios bacterianos, en
donde la citoquina IL-17 y linfocitos Tγδ serían importantes en la inducción del
reclutamiento de neutrófilos y la resolución de la infección por Nocardia asteroides.
(Tam et al., 2012), esto nos permite afirmar que la interacción entre células inmunes es
importante para un proceso inmune normal.
En conclusión, los resultados de este trabajo indican que la interacción entre neutrófilos
y células mononucleares, genera la fosforilación de la MAPK ERK1/2; y que esta
interacción neutrófilos-células mononucleares, está involucrada en la disminución de la
producción de ROS en neutrófilos estimulados con fMLP.
61
BIBLIOGRAFÍA
Barreiro, O., Martín, P., González-Amaro, R. and Sánchez-Madrid F. (2010). Molecular
cues guiding inflammatory responces. Cardiovascular Research, 54, 174-182.
Bentin, J., Koutsoukos, M., Pierart, M., Appelboom, T. and Ceuppens, J. (1991).
Polymorphonuclear Neutrophils Enhance anti-CD3-Induced T Cell Activation:
the Role of Polymorphonuclear FC-receptor. Cellular Immunology. 132, 339349.
Bréchard, S. and Tschirhart, E. (2008). Regulation of superoxide production in
neutrophils: role of calcium influx. Journal of leukocyte biology, 84(5), 12231237
Chen, L., Pan, W., Chen, M., Li, J., Liu, W., Che, G., Huang, S., Papadimos, T. and Pan,
Z. (2009). Synergistic induction of inflammation by bacterial products
lipopolisaccaride and fMLP: An important microbial pathogenic mechanism.
Journal of immunology, 182(4), 2518-2524.
Cloutier, A., Ear, T., Blais-Charron, E., Dubois, C. and Mcdonald, P. (2007). Differential
involvement of NF-κB and MAP kinase pathways in the generation of
inflammatory cytokines by human neutrophils. Journal of leukocyte biology, 81,
567-577.
Conrad, D., Furlong, S., Doucette, C., Boudreau, R. and Hoskin, D. (2009). Role of
mitogen-activated rotein kinases in Thy-1-induced T-lymphocyte activation.
Cellular signaling, 21(8), 1298-1307.
62
Coskun, M., Olsen, J., Seidelin, J.B. and Nielsen, O. (2011). MAP kinase in
inflammatory bowel disease. Clinica quimica acta., 412, 513-520.
Costantini, C. and Cassatella, M. (2011). The defensive alliance between neutrophils
and NK cells as a novel arm of innate immunity. Journal of leucocyte biology,
89(2), 221-233.
Creed, T., Lee, R., Newcomb, P., di Mambro, A., Raju, M. and Dayan, C. (2009). The
Effects of Citokines on Suppression of Lymphocyte Proliferation by
Dexamethasone. The journal of Immunology. 183, 164-171.
Daley, J., Reichner, J., Mahoney, E., Manfield, L., Henry, W., Mastrofrancesco, B. and
Albina, J. (2005). Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s)
released for neutrphils. The journal of immunology, 174, 2265-2272.
Fan, J., Ye, R. and Malik, A. (2001). Transcriptional mechanisms of acute lung injury.
American journal of physiology, 281(5), 1037-1050.
Ferrero-Miliani, L., Nielsen, O.H., Andersen, P.S. and Girardin, S.E. (2006). Chronic
inflammation: importance of NOD2 and NALP3 in interleukin-1β generation.
Clinical and Experimental Inmunology, 147, 227-235.
Fialkow, L., Wang, Y. and Downey, G. (2007). Reactive oxygen and nitrogen species as
signaling molecules regulating neutrophil function. Free radical biology &
medicine, 42(2), 153-164.
Fielding, C., McLoughlin, R., McLeod, L., Colmont, C., Najdovska, M., Grail, D., Ernst,
M., Jones, S., Topley, N. and Jenkins, B. (2008). IL-6 regulatesNeutrophil
trafficking during acute inflammation via STAT3. Journal of immunology, 181
(3), 2189-2195.
63
Franchimont, D., Galon, J., Gadina, M., Visconti, R., Zhou, Y., Aringer, M., Frucht, D.,
Chrousos, G. and O’Shea, J. (2000). Inhibition of Th1 Immune Response by
Glucocorticoids: Dexamethasone Selectively Inhibits IL-12-Induced Stat4
Phosphorylation in T Lymphocytes. The Journal of Immunology. 164, 17681774.
Fu, H., Karlsson, J., Bylund, J., Movitz, C., Karlsson, A. and Dahlgren, C. (2006). Ligand
recognition and activation of formyl peptide receptors in neutrophils. Journal of
leukocyte biology, 79, 247-256.
Herlaar, E. and Brown, Z. (1999). p38 MAPK signaling cascades in inflammatory
disease. Molecular medicine today, 5(10), 439-447.
Huang, Y. and Wange, R. (2004). T cell receptor signaling: Beyond complex complexes.
Journal of Biological Chemistry, 279(28), 28827-28830.
Kelher, M., Ambruso, D., Elzi, D., Anderson, S., Paterson, A., Thurman, G. and Silliman,
C.
(2003).
Formyl-Met-Leu-Phe
induces
calcium-dependent
tyrosine
phosphorylation of Rel-1 in neutrophils. Cell calcium, 34, 445-455.
Kilpatrick, L., Suan, S., Mackie, D., Baik, F., Li, H. and Korchak, H. (2006). Regulation of
TNF mediated antiapoptotic signaling in human neutrophils: Role of δ-PKC and
ERK1/2. Journal of leukocyte biology, 80, 1512-1521.
Kim, K. and Choi, E. (2010). Pathological roles of MAPK signaling pathways in human
diseases. BBA: Molecular basis of diseases, 1802(4), 396-405.
Kraaij, M., Van der Kooij, S., Reinders, M., Koekkoek, K., Rabelink, T., van Kooten, C.
and Gelderman, K. (2011). Dexamethasone increases ROS production and T
64
cell suppressive capacity by anti-inflammatory macrophages. Molecular
Inmunology, 49(3), 549-557.
Lewkowicz, N., Klink, M., Mycko, M. and
Lewkowicz, P. (2012). Neutrophil-
CD4+CD25+T regulatory cell interactions: A possible new mechanism of
infectious tolerance. Immunobiology, 1, 1-10.
Li, K., Lu, M., Hsieh, S., Wu, C., Yu, H., Tsai, C. and Yu, C. (2006). Release of surfaceexpressed lactoferrin from polymorphonuclear neutrophils after contact with
CD4+T cells and its modulation on Th1/Th2 cytokine production. Journal of
Leukocyte Biology, 80(2), 350-358.
Löwenberg, M., Vërhaar, A., van den Brink, G., Hommes, D., (2007). Glucocorticoid
signaling: a nongenomic mechanism fot T-cell immunosupression. Trends in
molecular medicine, 13, 158-163
McLeish, K., Knall, C., Ward, R., Gerwins, P., Coxon, P., Klein, J. and Johnson, G.
(1998). Activation of mitogen-activated protein kinase cascades during priming
of human neutrophils by TNF-α and GM-CSF. Journal of leucocyte biology, 64,
537-545.
Menge, C. and Dean-Nystrom, E. (2008). Dexamethasone Depletes γδ T Cells and
Alters the Activation State and Responsiveness of Bovine Peripheral Blood
Lymphocyte Subpopulations. American DairyScience Association. 91, 22842298.
Müller, I., Munder, M., Kropf, P. and Hänsch, G. (2009). Polymorphonuclear neutrophils
and T lymphocytes: strange bedfellows of brother in arms?. Trends in
immunology, 30(11), 522-530.
65
Neto, E., Coelho, A., Sampaio, A., Henriques, M., Marcinkiewicz, C., Freitas, M. and
Barja-Fidalgo C. (2007). Activation of human T lymphocytes via integrin
signaling induced by RGD-disintegrins. Biochimica et Biofysyca Acta, 1773,
176-184.
Nick, J., Avdi, N., Young, S., Knall, C., Gerwins, P., Johnson, G. and Worthen, S.
(1997). Common and Distinct Intracellular Signaling Pathways in Human
Neutrophils Utilized by Platelet Activating Factor and FMLP. Journal Clinical
Investigation, 99, 975-986.
Niwa, Y., Sakane, T., Miyachi, Y., Kanoh, T. and Somiya, K. (1984). Decrease in
generation of Reactive Oxygen Species by Neutrophils By Patients With
Infectious Mononucleosis: Role of Suppressor T Lymphocytes. The Journal of
the American Society of Hematology, 64, 994-999.
Niwa, M., Hotta, K., Kanamori, Y., Hatakeyama, D., Hirade, K., Katayama, M., Hara, A.,
Mori, H., Ito, H., Kato, K., Matsuno, H., Uematsu, T. and Kosawa, O. (2003).
Involvement of p38 mitogen-activated protein kinase in heat shock protein 27
induction in human neutrophils. European journal of farmacology, 466(3), 245253.
Pamukcu, B., Lip, G. and Shantsila, E. (2011). The nuclear factor – kappa B pathway in
atherosclerosis: A potencial therapeutic tagert for atherothrombotic vascular
disease. Thombosis Research, 128 (2), 117-123.
Pelletier, M., Micheletti, A. and Cassatella, M. (2010). Modulation of human neutrophil
survival and antigen expression by activated CD4+ and CD8+ T cells. Journal of
Leukocyte Biology, 88(6), 1163-1170.
66
Plotnikov, A., Zehorai, E., Procaccia, S. and Seger, R. (2010). The MAPK cascades:
Signaling components, nuclear roles and mechanisms of nuclear translocation.
BBA- Molecular cell research, 1813(9), 1619-1633.
Puri, K., Doggett, T., Douangpanya, J., Yonghao, H., Tino, W., Wilson, T., Graf, T.,
Clayton, E., Turner, M. and Diacovo, T. (2004). Mechanisms and implications
of phosphoinositide 3-kinase δ in promoting neutrophil trafficking into inflamed
tissue. The American Society of Hematology, 103, 3448-3456.
Quinn, K., Henriques, M., Parker, T., Slutsky, A. and Zhang, H. (2008). Human
neutrophil peptides: a novel potential mediator of inflammatory cardiovascular
diseases. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology,
295(5), 1817-1824.
Raffie, P., Lee, J., Leung, C. and Raffin, T. (1995). TNF-α induces Tyrosine
Phosphorilation of Mitogen-Activated Protein Kinase in Adherent Human
Neutrophils. The American association of Immunologists, 12, 4785-4792.
Saffar, A., Ashdown, H. and Gounni, A. (2011). The Molecular Mechanisms of
Glucocorticoids-Mediated Neutrophil Survival. Current Drugs Targets, 12, 556562.
Silva, M. (2010). Neutrophils and macrophages work in concert as inducers and
effectors of adaptative immunity against extracellular and intracellular microbial
pathogens. Journal of Leukocyte Biology, 87(5), 805-813.
Son, Y., Cheong, Y., Kim, N., Chung, H., Kang, D. and Pae, H. (2011). MitogenActivated Protein Kinases and Reactive Oxygen Species: How can ROS
activate MAPK Pathways?. Journal of signal Transduction, 2011, 1-6.
67
Stankova, J., Turcotte, S., Harris, J. and Rola-Pleszczynski, M. (2002). Modulation of
Leukotriene B4 Receptor-1 Expression by Dexamethasone:
Potencial
Mechanism for Enhanced Neutrophil Survival. The American Association of
Immunologists. 168, 3570-3576.
Sun, Shao-Cong. (2011). Non-canonical NF-κB signaling pathway. Cell Research. 21,
71-85.
Takahashi, T., H, F., Yamane, T., Fukumasu, H., Suzuki, K., Ogita, S., Nishizawa, Y.
and Kitagawa, S. (2001). Activation of Human Neutrophils by CitokineActivated Endothelial Cells. Circulation Research, 88, 422-429.
Tam, S., Maksaereekul, S., Hyde, D., Godinez, I. and Beaman, B. (2012). IL-17 and γδ
T-lymphocytes play a critical role in innate immunity against Nocardia
asteroides GUH-2. Microbes and Infection. 14, 1133-1143.
Thalhamer, T., McGrath, M. and Harnett, M. (2008). MAPKs and their relevance to
arthritis and inflammation. Rheumatology, 47, 409-414.
Thewissen, M., Damoiseaux, J., van de Gaar, J., Willem Cohen Tervaert, J. (2011).
Neutrophils and T cells: Bidirectional effects and functional interferences.
Molecular Immunology, 48, 2094-2101.
Tillack, K., Breiden, P., Martin, R. and Sospedra, M. (2012). T Lymphocyte Priming by
Neutrphil Extracellular Traps Links Innate and Adaptive Immune Responses.
The journal of Immunology, 188, 3150-3159.
Torres, M. y Forman, H. (2003). Redox Signaling and the MAPK pathways. Biofactors
IOS press, 17, 287-296.
68
Vancurova, I., Miskolci, V. and Davidson, D. (2001). NF-κB Activation in Tumor Necrosis
Factor α-stimulated Neutrophils Is Mediated by Protein Kinase Cδ. Correlation
to nuclear IκBα. The Journal of Biological Chemistry, 276(23), 19746-19752.
Vaschetto, R., Grinstein, J., Del Sorbo, L., Khine, A., Voglis, S., Tullis, E., Slutsky, A.
and Zhang, H. (2007). Role of human neutrophil peptides in the initial interation
between lung epithelial cells and CD4+ lymphocytes. Journal of Leukocyte
Biology, 81, 1022-1031.
Ward, P. and Lentsch, A. (1999). The Acute Inflammatory Response and Its Regulation.
Archives Surgery, 134, 666-669.
Wright, H., Moots, R., Bucknall, R. and Edwards, S. (2010). Neutrophil function in
inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology, 49, 1618-1631.
Zen, K. and Liu, Y. (2008). Role of different protein tyrosine kinases in fMLP-induced
neutrophil transmigration. Immunobiology, 213, 13-23.
Zu, Y., Qi, J., Gilchrist, A., Fernandez, G., Vasquez-Abad, D., Kreutzer, D., Huang, C.
and Sha’afi, R. (1998). P38 Mitogen-Activated Protein Kinase Activation Is
Requires for Human Neutrophil Function Triggered by TNF-α or fMLP
Stimulation. The Journal of Immunology. 160, 1982-1989.