Extracción y Cuantificación de ADN Extracción y Cuantificación de
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Extracción y Cuantificación de ADN Tecnología Básica 9Extracción y Cuantificación 9Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction) 9Separación: Electroforesis 9Detección 9Análisis Extracción de ADN: Múltiples maneras!! 1 EXTRACCION DE ADN ORGANICA CHELEX PAPEL FTA OTRAS Extracciones basadas en estuches QIAamp, GeneClean, etc. Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra Preparación de Muestra Extracción de ADN Orgánica Extracción por Chelex Extracción de ADN utilizando papel FTA Estuches QIAamp para separar ADN Equipo basados en robótica pueden requerir otros métodos EXTRACCION ORGANICA DE ADN PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI) PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores) 2 EXTRACCION ORGANICA DE ADN COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K) AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos Particiona macromoléculas basedo en propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA RECUPERACION DE ADN Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto EXTRACCION POR CHELEX 1991 Laboratorios Bio-Rad RESINA QUELANTE REMUEVE MAGNESIO (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN) ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA CELULA UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla) EXTRACCION POR CHELEX AÑADA MUESTRA AL TUBO AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX 100°C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS ADN ES DENATURADO A CADENAS SENCILLAS UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN PCR 3 EXTRACCION CON PAPEL FTA™ PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS Tecnología FTA® Rompe células y membranas de organelos -Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN) Preserva y Proteje Acidos Nucleicos -Previene Daño por radicales libres/UV -Previene Daño Enzimático -Inhibe crecimiento de hongos y bacterias Provee Seguridad al Usuario -Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos Preparación de ADN Rápida y Eficiente 4 FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva Convencional versus FTA 240 Tarjetas = 240 muestras Temp de almacenaje = Temp ambiente 240 Tubos = 240 muestras* Temp de almacenaje= -200C 10 Platos = 240 muestras Temp de almacenaje = -200C Costo $75/gabinete de archivo Costo $2,000/congelador/año Archivado a Temperatura Ambiente Perfil de STR de sangre archivada en 1989 y analizada en 2003 100 120 140 6 Blue 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 Blood-B-Pro 4000 3000 2000 1000 6 Green Blood-B-Pro 1500 1000 500 • Muestras archivadas en ambientes diferentes, selladas en sobre de aluminio 6 Yellow Blood-B-Pro 2000 1500 1000 500 • Proceso normal de colección de muestra 6 Red Blood-B-Pro • 10 µL de reacciones de Profiler™ añadido a muestras, 24 ciclos 600 400 200 EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™ Sangre o saliva seca en papel FTA Células se ROMPEN al contacto UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al TUBO LAVE para remover HEME y otros inhibidores de PCR Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR 5 EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™ CUANTIFICACIÓN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes Posible AUTOMATIZACIÓN ORGÁNICA Papel FTA CHELEX SDS, DTT, EDTA y Mancha de sangre proteinase K ENCUBAR (56 oC) Mancha de sangre Aplicar sangre al papel y dejar que se seque Agua ROTO Centrifugar ENCUBAR (ambiente) Phenol, chloroform, isoamyl alcohol Centrifugar REMOVER sobrenadante VORTEX Centrifugar 5% Chelex TRANSFER aqueous (upper) phase to new tube LAVAR Múltiples veces con buffer de extracción REMOVER sobrenadante ENCUBAR (56 oC) TE buffer CONCENTRAR muestra (Centricon/Microcon-100 or ethanol precipitation) Centrifugar CUANTIFICAR ADN Reactivos de PCR ENCUBAR (100 oC) Centrifugar (NO CUANTIFICACIÓN) CUANTIFICAR ADN PREPARAR PCR PREPARAR PCR PREPARAR PCR Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press CUANTIFICACIÓN DE ADN ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS ABSORBENCIA A 260 nm TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO Cuantificación comparada a marcador estándar 6 Cuantificación por "Slot Blot" Procedimiento Común Específico para primates Ha sido modificado para utilizar quimioluminiscencia en vez de radioactivida Puede detectar cantidades menores que nanogramos Puede detectar ADN de cadena doble y cadena sencilla CUANTIFICACIÓN DE ADN CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT" ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE PRIMATE D17Z1 RADIOACTIVO COLORIMÉTRICO QUIMIOLUMINISCENTE CUANTIFICACIÓN DE ADN CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN AÑADIR PRUEBA D17Z1 INTENSIDAD DE LA MUESTRA COMPARADA A ESTÁNDARES SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50 copias de ADN genómico 7 Ventajas Slot Blot Desventajas Puede ser sensitivo Reemplaza radioactividad Puede detectar cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado. Cantidad dada es sólo de ADN humano Estándares de Calibración 20 ng 10 ng 5 ng 2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng Consume tiempo Labor intensiva Muestras Desconocidas ~2.5 ng Estándares de Calibración 0.63 ng 1.25 ng 2.5 ng 5 ng 10 ng 20 ng Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press Fluorometría vs Espectrofotometría 8 Fluorometría *Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o PicoGreen -- aumento en emisión a 458 nm cuando enlazado a ADN de doble cadena *Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla o ARN --se enlaza al surco menor, rico en A-T *Muestra es comparada a curva estándar de ADN cuya concentración es conocida --utilize estándar con composición similar para lecturas más precisas Cuantificación de ADN por espectrofotometría Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0. Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml A260 = 1 50 µg/ml Pureza de ADN: Proporción A260/A280 *Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.) *ADN puro tiene una proporción de 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5 *Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN) --imita alta pureza y producción --aumenta el valor A260 9 PCR utilizando 'Real time' (qPCR) Continuará!! 10
