Especificación de los destinos celulares por interacciones de

ESPECIFICACION DE LOS DESTINOS CELULARES POR INTERACCIONES
DE LAS CELULAS
En deusterostomados (erizo de mar y todos los vertebrados) el destino de las
células depende más de su posición en el embrión que del citoplasma del
ovocito que hayan incorporado.
Se podría decir que hay dos tipos de “proceder” en el desarrollo embrionario
uno “desarrollo autónomo” a partir del destino que tenga cada blastómera de
acuerdo con el contenido citoplasmático que incorporan y entonces hablamos
de linajes celulares. Otra estrategia en el desarrollo es cuando hay una buena
equivalencia entre las células y entonces el destino de cada una estará
determinado por el lugar que ocupen o sea dependerán de las vecinas que
tengan. En estos embriones hasta avanzado el desarrollo cada célula tiene la
capacidad de originar un embrión completo y las células restantes pueden
sustituir las faltantes y generar también un embrión, por ejemplo: los gemelos.
Este tipo de desarrollo se denomina especificación condicional (o dependiente)
y se trata entonces de un “desarrollo regulativo” o regulado.
Regulación durante el desarrollo de Anfibios:
En 1918, Hans Speman realizó sus experimentos en embriones de Salamandra
y sus aportes a la embriología fueron claves. Uno de sus experimentos más
famosos fue aquel en que estrangulaba con un pelo de bebé un huevo
fertilizado en la etapa de dos células. Primero el lazo lo pasó en el mismo plano
de la primera división dejando los núcleos de un solo lado, al cabo de unas
divisiones algún núcleo pudo pasar para el lado en que sólo había citoplasma y
se desarrollaron dos embriones completos. En otra instancia el lazo estranguló
perpendicularmente al plano de la primera división. El resultado es bien
diferente al del experimento anterior, ya que del sector que incluye la presuntiva
región ventral del embrión se obtiene una masa de células ectodérmicas,
mesodérmicas y de la mucosa gástrica y de la otra región un embrión completo.
La diferencia entre un lado y otro es que en uno está incluido el labio dorsal del
blastoporo y el otro no. En este caso Speman observó cuán crítico era el
material incluido en la blastómera que se hallaba donde se formaba la media
luna gris. Este lugar tendría la función de iniciar la gastrulación y cómo tal
desencadenaría los cambios cruciales que ocurren durante dicha etapa.
Otro aporte clave hecho por Speman fue el resultante de sus experimentos
hechos con injertos de un embrión de Salamandra pigmentada, Triturus
taeniatus, en un embrión de Salamandra albina Triturus cristatus. Describió que
las células son totipotentes y se diferencian según el entorno en que se hallen
durante un tiempo determinado, que es hasta ahora la gastrula media. Las
células extraídas de las gastrulas tardías ya estaban determinadas y se
diferenciaban en un tipo celular, independientemente del lugar en que se
realizara el injerto.
Quedó demostrado que hay cambios “operacionales” en las células aunque aún
no se vislumbren en su fenotipo y es así cómo las células sin diferenciar ya
están determinadas o sea tienen destino.
Speman y Hilde Mangold describieron cómo el primer tejido diferenciado “al
labio dorsal del blastoporo”, hicieron transplante de esta región de la gastrula
temprana de T. taeniatus en T. cristatus y vieron cómo indujo un segundo lugar
de inicio de la gastrulación resultando dos embriones unidos por la región
ventral. El injerto fue colocado en la región donde surgirían las células
endodérmicas, allí el nuevo labio dorsal indujo la formación de una notocorda y
una placa neural adicional y finalmente se originó otro embrión. Las células
injertadas originarán células que integrarán la notocorda, el piso del tubo neural
nuevo y habrá células intercaladas con las del huésped en los somites. Fue así
como se observó y se demostró la capacidad de la notocorda para inducir la
placa neural a partir de células ectodérmicas. Fue así también como Speman
definió al labio dorsal del blastoporo como“organizador” porque 1) Induce el
tejido ventral del huésped a formar le placa neural y mesodermo dorsal. 2)
organiza el tejido del huésped y el del donador en un embrión secundario con
los ejes antero-posterior y dorso-ventral.
Auto-diferenciación del labio dorsal del blastoporo. (A) El labio dorsal tomado de una gastrula
temprana es injertado en otra gastrula temprana, en la región que normalmente será epidermis
ventral. (B) Ocurre una segunda invaginación que origina un segundo arquenterón y por lo tanto
un segundo eje embrionario. (C) Eventualmente, se puede formar un segundo embrión unido al
ta
huésped (tomado de Developmental Biology. S. Gilbert Editorial Sinauer, 1997, 5 edición).
Definiremos inducción entonces, cómo el evento donde una región del embrión
interactúa con otra región del embrión influenciando la diferenciación de esta
segunda región.
Hay numerosas inducciones durante el desarrollo embrionario, pero la inducción
clave es la que ocurre cuando del labio dorsal del blastoporo induce el eje
dorsal y el tubo neural, lo que tradicionalmente se denomina “inducción
embrionaria primaria”.
Los mismos resultados se obtienen al transplantar el Nodo de Hensen de un
embrión de ave en otro, por ejemplo de codorniz en pollo. Realmente el Nodo
actúa como el labio dorsal.
Inducción de un nuevo eje embrionario por el Nodo de Hensen. (A) El nodo de Hensen de un
embrión de pato es injertado en un embrión huésped de pollo. (B) Un tubo neural accesorio
surge en el sitio del injerto (tomado de Developmental Biology. S. Gilbert Editorial Sinauer,
ta
1997, 5 edición).
Centro de Nieuwkoop:
En la inducción hay por lo menos cuatro pasos claves. 1° ocurre en el momento
de la fertilización. Cuando el espermatozoide entra en el ovocito y provoca que
el contenido citoplasmático de la zona vegetal se mezcle con el de la zona
animal, en la región de la media luna gris. Esto activa factores determinantes de
la región dorsal en el sitio donde habrá células vegetales, este lugar se
denomina centro de Nieuwkoop.
Peter Nieuwkoop entre 1969-1977 realizó estratégicos experimentos que lo
llevaron a definir dicho centro. Los más representativos son aquellos en que
quitaba las células ecuatoriales y mantenía separado el polo animal del vegetal.
Así veía cómo no había inducción de células mesodérmicas, mientras que si
juntaba los polos, las presuntivas células ectodérmicas diferenciaban en células
mesodérmicas.
En segundo lugar las células del centro de Nieuwkoop o más bien las células
descendientes de él inducen a las células que tienen por encima a ser
organizador de Speman y Mangold. Las restantes células vegetales inducen a
las células que están encima a ser mesodermo ventral y lateral. No olvidemos
que esta última etapa en un comienzo fue descrita como la primera inducción.
El tercer paso es cuando el organizador convierte al mesodermo que lo rodea
en en mesodermo dorsal e instruye al ectodermo dorsal a ser tejido neural.
El cuarto paso en la inducción consiste en dar las características regionales al
tubo neural (cerebro anterior, medio y cuerda espinal, etc.)
En 1996 Jakai deleteó el citoplasma vegetal de un huevo antes de que
ocurrieran los movimientos ocasionados por la entrada del espermatozoide y
como consecuencia no se formó el eje dorsal del embrión. Así es como con otro
abordaje experimental se comprobó que los factores dorsalizantes son
activados y acomodados en la rotación del citoplasma.
A) Resumen de los experimentos de Nieuwkoop, Nakamura y Takasaki, mostrando la inducción
del mesodermo por el endodermo ventral. Las células del polo animal aisladas se tornan una
masa de células epidérmicas ciliadas, las células vegetales aisladas generan tejido semejante a
los tejidos del intestino de origen endodérmico, y las células ecuatoriales (zona marginal) se
tornan mesodermo. Si las células del polo animal se combinan con las células del hemisferio
vegetal muchas de las células del hemisferio animal formaran tejido mesodérmico. (tomado de
ta
Developmental Biology. S. Gilbert Editorial Sinauer, 1997, 5 edición).
B) Modelo de la inducción del mesodermo en Xenopus. Una señal ventral (probablemente FGF2
o BMP4) es liberada en la región vegetal del embrión. Esta induce las células marginales a
diferenciar en mesodermo. BMP4 puede inducir a las células marginales a formar mesodermo
posterior. En las células de la región dorsal (enfrente de donde entró el esperma), una señal
(probablemente iniciada por Vg1 y propagada por las proteínas activina Nogina y wnt) es
liberada por las células vegetales del centro de Nieuwkoop. Esta señal dorsal induce la
formación del organizador de Spemann en las células que están por encima de la zona marginal
ta
(tomado de Developmental Biology. S. Gilbert Editorial Sinauer, 1997, 5 edición).
Bases moleculares en la inducción del mesodermo:
β-catenina es una proteína multifuncional que puede actuar cómo un ancla para
las cadherinas de membrana o bien como factor de trascripción. En Xenopus se
ha demostrado que esta proteína luego de la rotación se acumula en la
presuntiva región dorsal. Luego se detecta en los núcleos de las células de la
presuntiva región dorsal y no en los de la presuntiva región ventral. En la
primera etapa de la división celular se observa a la β-catenina en los núcleos
de la región que será el organizador y en el centro de Nieuwkoop. Luego sobre
el final de la etapa de segmentación aparecerá solo en el centro de Nieuwkoop.
Esta proteína es crucial en la inducción del eje dorsal, ya que el bloqueo de su
síntesis con una microinyección de ARN antisentido impide la formación del
organizador. La microinyección de la proteína en la región vegetal provoca la
inducción de un segundo eje dorsal.
La kinasa glicógeno sintaza 3 (GSK-3) regula negativamente β-catenina,
impidiendo su actividad al fosforilarla. Se ha determinado que en el comienzo
hay β-catenina en toda la región vegetal. Esta es sintetizada a partir del ARNm
almacenado en el citoplasma del ovocito y probablemente comience a
degradarse al ser fosforilada por GSK-3 y entonces no habrá β-catenina en las
células vegetales. Si se bloquea experimentalmente GSK-3 en el polo vegetal,
con un mensajero antisentido, se genera un segundo eje dorsal. No se sabe
aún que es lo que causa las diferencias regionales en el contenido de GSK-3,
en las últimas comunicaciones científicas se habla de la proteína Dishelved,
presente en la zona de la media luna gris y que lo inactiva.
β-catenina es un factor de trascripción lo que quiere decir que se une al ADN y
provoca la expresión diferencial de determinados genes. Puede lograr que las
células respondan de distintas maneras luego de que la expresión génica es
activada en la blástula media. Esta proteína una vez en el núcleo de las células
vegetales dorsales activa un gen con homeobox denominado siamois el que se
expresa en el centro de Nieuwkoop luego de la blástula media. Si este gen es
colocado en las células de la región vegetal, surgirá un nuevo eje dorsal. Si se
previene la rotación cortical siamois no se expresa
Veg-1 actúa sinergísticamente con β-catenina induciendo la diferenciación del
mesodermo dorsal y la notocorda. Debe ser activada por alguno de los
productos de la expresión de Siamois. Los experimentos hechos in vitro
muestran que una pequeña concentración de veg-1 activada, ofrecida a las
células de PA de la blástula media, induce mesodermo. Esta inducción se
demuestra evidenciado la expresión del gen Brachyury (marcador general del
mesodermo) mediante la detección de la proteína o del ARNm. Si se sube un
poco la concentración de veg-1 se logra inducir mesodermo lateral, estas
células expresan los marcadores actina y Xwnt8. Si las células de polo animal
son expuestas a altas concentraciones de veg-1 entonces habrá mesodermo
dorsal y sus marcadores goosecoid y nogina estarán presentes. Veg-1 también
se expresa en la región marginal posterior de la blástula de aves que es
equivalente al centro de Nieuwkoop y tiene los mismos roles.
Hay un gran debate para tratar de identificar el inductor general del mesodermo
que se halla en las células vegetales laterales y centrales. Factor de crecimiento
fibroblástico (FGF) y sus mensajeros se hallan en el huevo de Xenopus y en el
embrión y se proponen como los “responsables” de que las células marginales
respondan a veg-1. La función de FGF quedó demostrada al destruir los
receptores de este factor por mutaciones negativas en huevos recién
fecundados de Xenopus. Estos embriones resultantes carecerían de
mesodermo lateral y ventral.
EL FGF es esencial para la producción del mesodermo ventral y lateral. Cuando los
huevos de Xenopus son inyectados con dominantes negativos de receptores de FGF, el
embrión no es capaz de responder al FGF. En ausencia de la señal de FGF, no se forma ni el
mesodermo ventral ni lateral y el embrión carece de tronco y cola (B) (tomado de
ta
Developmental Biology. S. Gilbert Editorial Sinauer, 1997, 5 edición).
Las células que integran el organizador estarán en el mesodermo dorsal
(mesodermo de la cabeza, notocorda, mesodermo paraxial) y se hallará debajo
del ectodermo, estas células inducirán luego el sistema nervioso central (SNC).
El organizador es inducido por un factor o factores sintetizado por células del
centro de Nieuwkoop, las cuales luego integrarán el endodermo.
El organizador tiene entonces cinco funciones principales:
1 Se diferencia en mesodermo dorsal.
2 Dorsaliza el mesodermo circundante en mesodermo lateral, ya que de otro
modo será mesodermo ventral.
3 Dorsaliza el ectodermo en ectodermo neural.
4 Inicia los movimientos de la gastrulación.
5 Provoca que la placa neural se diferencie en tubo neural.
Las evidencias experimentales que llevaron a buscar factores difusibles que
desencadenaran tales funciones surgieron de experimentos hechos en la
década del 70.Estos consistían en colocar, por medio de micro manipulación,
en un lado de un filtro el labio dorsal del blastoporo de un embrión de
salamandra y del otro ectodermo competente de gastrular. Luego de varias
horas se observaron estructuras neurales en el tejido ectodérmico. Estos
experimentos cuidaron estrictamente que por el filtro no pasaran más que
moléculas, ningún proceso celular.
Obviamente los efectores de estas actividades son provocados por distintos
factores secretados por distintas células en distintos tiempos. Así fue cómo
comenzó una búsqueda intensa que tuvo resultados positivos con la puesta a
punto de las técnicas de ADN recombinante. Esto permitió a los investigadores
hacer clones de cDNA del mRNA del labio dorsal y ver cual de esos clones
codificaba factores que podrían dorsalizar el embrión. La formación del
mesodermo dorsal involucraría la activación de varios genes. Las proteínas
secretadas por el centro de Nieuwkoop activarían un set de factores de
trascripción en las células mesodérmicas encima del. Estos factores de
trascripción podrían activar los genes que codifican los productos secretados
por el organizador.
Algunas proteínas secretadas:
Cordina y Nogina: Bloquean el factor ventralizante BMP4 en la región de
mesodermo dorsal. Cordina comienza a secretarse en la zona dorsal marginal
aproximadamente una hora antes de la gastrulación. Luego se expresa en la
placa precordal (mesodermo de la cabeza) y en la notocorda. La proteína
Nogina (in vitro) induce tejido neural en el ectodermo de la gastrula, en
ausencia total de mesodermo dorsal. Cuando se la agrega al ectodermo de una
gastrula las células ectodérmicas expresan marcadores específicos de cerebro
anterior. Nogina no induce ni notocorda, ni células musculares. Juega un rol
importante en la dorsalización del mesodermo y en la neuralización del
ectodermo.
El mRNA de Nogina está también en la célula huevo, lo cual hace pensar que
también funcione cómo parte del centro de Nieuwkoop.
Folistatina: Es una proteína de unión a la activina y se halla presente en el labio
dorsal del blastoporo y luego se restringe a la notocorda. Originalmente se
pensó que sólo se unía a la activina, hoy hay evidencia de que también inhibe
BMP7, por medio de la activación de BMP4. Folistatina también previene la
ventralización del mesodermo y tiene participación en la dorsalización del
ectodermo.
Sonic Hedgehog: Esta proteína esta en escena después que la mayoría de los
eventos de la neurulación han tenido lugar. Su función es establecer el patrón
del nuevo tubo neural formado. Es sintetizada por la notocorda y su porción
amino terminal secretada. También previene la ventralización antagonizando a
BMP4.
Cerberus: Induce las estructuras más anteriores de la cabeza, cómo placodas
olfatorias los ojos. Su trascripción es activada por Nogina, Cordina y Folistatina.
Se expresa en las células de la región del mesodermo que involucionan cerca
del organizador.