Métodos de aislamiento - Departamento de Protección Vegetal

Métodos de aislamiento
Métodos de aislamiento
„ Técnicas de Aislamiento de hongos y
Aislamiento de hongos y bacterias
bacterias fitopatógenas.
„ Aislamiento de flora epifítica, de suelo,
rizosfera.
„ Fundamentos, aislamientos directos e
Unidad de Fitopatología
Dto. de Protección Vegetal
Facultad de Agronomía.
indirectos.
Dr. Pedro Mondino
„ Uso de medios selectivos.
„ Uso de cebos.
24 de abril al 5 de mayo de 2012
Aislamiento a partir de tejido vegetal
„ A partir del tejido vegetal enfermo es posible
aislar a los patógenos.
„ Se busca tomar trozos de la zona de avance
para incrementar las chances de aislar al
patógeno.
„ Los trozos de tejido vegetal se someten a una
desinfección superficial.
„ En el caso de bacterias es posible macerar un
trozo de tejido afectado y luego sembrar
Aislamiento a partir de trozos de tejido
vegetal
„ Trozos de tejido afectado de la zona de avance son
sembrados en medio de cultivo (ej. Madera)
Métodos de aislamiento
„ Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de
avance del patógeno .
„ Ej: a partir de frutos afectados
Aislamiento a partir de tejido vegetal
„ Sembrando trozos de tejido vegetal de la zona de
avance del patógeno .
Bisturí
Zona de avance
Hipoclorito 1%
Siembra en placa
Pinza
Agua estéril
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Aislamiento de bacteria a partir del
tejido infectado
„ Tocando con el ansa en la zona de avance
de la infección es posible aislar la bacteria.
Aislamiento directo a partir del signo.
„ Cuando la muestra vegetal presenta signo es
posible tomar una pequeña porción del
mismo y sembrar en una placa con medio de
cultivo.
Aislamiento de bacterias por macerado
del tejido vegetal
„ El tejido afectado es macerado en mortero y
luego el macerado es estriado en placa.
Aislamiento directo a partir del signo.
Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible
tomar una pequeña porción del mismo y sembrar en
una placa con medio de cultivo.
Aislamiento directo a partir del signo.
Aislamiento directo a partir del signo.
„ Cuando la muestra vegetal presenta signo es
„ Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible
posible tomar una pequeña porción del mismo y
sembrar en una placa con medio de cultivo.
tomar una pequeña porción del mismo y sembrar en
una placa con medio de cultivo.
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Aislamiento directo de zooglea
Aislamiento a partir del exudado
bacteriano
„ Un trozo de tallo de una planta afectada vascularmente es
colocado en agua en recipiente con agua o saline esteril.
Ansa
Flujo bacteriano
en agua estéril
Inducción del signo
„ La aparición de signo puede ser inducida mediante
cámara húmeda.
Uso de cebos
„ Trozos de manzana verde son utilizados para
capturar Phytophthora spp del suelo.
Estriado en placa
Inducción del signo
„ La aparición de signo puede ser inducida
mediante cámara húmeda.
Uso de cebos
„ Cebos utilizados para aislar Pythium:
„ pétalos de clavel (Dianthus caryophyllus L.)
„ Cañamones (Cannabis sativa L.) hervidos.
„ Trozos de zanahoria (Daucus carota L.)
„ Papa (Solanunt tuberosum L.) + agar-agua.
„ Trozos de tomate verde (Lycopersicon esculentum L)
„ Acículas de pino (Pinus spp.).
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Colonizadores de patógenos
Colonizadores de esclerotos
„ Se pueden encontrar antagonistas colonizando
naturalmente a los patógenos de plantas.
„ Se pueden utilizar a los patógenos como cebo
para capturar a sus antagonistas.
Aislamiento a partir de la flora
epifítica del fruto
Aislamiento de microorganismos del
suelo
„ La muestra de suelo se suspende en agua estéril.
„ Se hacen diluciones 10-1 a 10-10 veces.
„ De cada dilución se siembran por extensión dos
placas con 100 µL (0.1 ml) en medios de cultivo
(dependiendo del tipo de microorganismos que
queramos aislar) y luego se incuban.
„ Se aíslan colonias separadas de distinta morfología y
se purifican mediante repiques.
Aislamiento de microorganismos del
suelo
Microorganismos rizoféricos.
„ Microorganismos aislados de la rizosfera de
„ Esquema de la metodología utilizada para aislar a partir
plantas de tomate.
de suelo.
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Cultivos puros
„ para obtener un cultivo puro se debe inocular o
introducir, una sola célula o propágulo de un
microorganismo en un medio sólido o líquido,
esterilizado previamente.
Métodos de aislamiento
„ Para aislar células individuales, los
microorganismos han de ser diluidos, debido
al gran numero en que normalmente están
presentes.
„ La dilución se realiza, normalmente, por uno
de los siguientes sistemas:
„
„
„
Método de extensión en placa
„ Para que se pueda contar el número de
siembra por estría en placa
vertido en placa
extensión en placa.
Método de estriado en placa
„ Esquema práctico del aislamiento de bacterias
colonias en la placa debe estar entre 30 y
300.
Colonias aisladas
Método de extensión en placa
„ A partir de una suspensión concentrada de
microorganismos se realizan diluciones
seriadas.
Método de extensión en placa
„ 0,1 ml de la solución se siembra en superficie y
se esparce mediante rastrillo de vidrio.
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Aislamiento de bacterias
Método de extensión en placa
„ Aislamiento por estriado
„ 0,1 ml de la solución se siembra en superficie
y se esparce mediante rastrillo de vidrio.
Método de vertido en placa
Cultivos monospóricos
„ 0,1 ml de la solución se siembra en superficie
„ Para asegurarnos la homogeneidad genética de un
y se esparce mediante rastrillo de vidrio.
cultivo de hongos se recurre a la técnica de cultivo a
partir de una única espora.
„ Los cultivos monospóricos se pueden realizar:
„
„
Cultivos monospóricos
sembrando en superficie una suspensión de esporas
y luego observando bajo lupa o microscopio repicar.
Sembrando diluciones de forma que crezcan colonias
aisladas.mm
Metodología
„ Monospóricos de Venturia inaequalis.
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Metodología
Cultivo a partir de punta de hifa
„ Monospóricos a partir de colonias aisladas de una
„ Cuando no es posible disponer de esporas
siembra de una suspensión diluida.
se puede recurrir al cultivo de “punta de hifa”
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