preparación de medios de cultivo y métodos de siembra

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y MÉTODOS DE SIEMBRA
(INFORME)
2004
INTRODUCCIÓN
Se entiende por medios de cultivos a los alimentos o nutrientes en el que crecen
los microorganismos, en este caso bacterias. Para conseguir un medio de cultivo
óptimo es necesario tener condiciones adecuadas de temperatura, grados de
humedad, presión de oxigeno, grados de acidez o alcalinidad. Debe tener como
mínimo carbono, hidrógeno, oxigeno y sales inorgánicas.
Los medios de cultivos se pueden clasificar de acuerdo a su consistencia en
líquidos, sólidos y semisólidos, y según su composición
nutricional en
enriquecidos, de enriquecimiento, sintéticos, generales, entre otros. Los medios de
cultivos, además deben de tener ciertos requisitos o condiciones para poder
permitirle a los microorganismos su desarrollo, de ahí que la constitución de estos
deben tener los suficientes nutrientes y sustratos que le brinden condiciones para
realizar sus funciones metabólicas
Las técnicas de cultivos bacterianos, nos permiten aislar un tipo de bacteria
específico de una fuente natural, incrementar su numero de poblaciones o
mantener en condiciones estables el cultivo, así como cuantificar el numero de
bacterias que se encuentran en el material de estudio.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Preparar medios de cultivo mediante diferentes métodos de siembra.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Preparar los diferentes medios de cultivos indicados.
 Realizar siembras aplicando las diferentes técnicas de cultivo microbianos.
 Analizar el desarrollo y crecimiento microbiano en cada una de las siembras
realizadas.
1. TEORÍA RELACIONADA
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: consistencia adecuada del medio, luz
ambiental, esterilidad del medio, temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La clasificación de los medios es:
a. Según su consistencia:
 Sólidos: que llevan una sustancia que se llama agar, que es un polisacárido
acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa
a una concentración del 1,5%, da consistencia sólida y va a ser el soporte de los
compuestos necesarios en la nutrición de las bacterias.
 Semisólidos: tienen menos agar, una proporción de 0.1% a 0.5%.
 Líquidos: se llaman caldos.
b. Según su composición:
 Medios sintéticos o químicamente definidos: que son medios de cultivo de
composición conocida o definida, llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno,
sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son
estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus), se utilizan muy poco
y suelen hacerse para cultivar una especie de bacterias determinada.
 Medios generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de
organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales
como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios
para el crecimiento de las bacterias, tienen una composición en la que crecen la
mayor parte de los microorganismos. (Agar Sangre, Schaeadler, PCA, APHA, etc)
 Medios enriquecidos: son medios generales a los que se les añade sustancias que
aumentan su poder nutritivo, además enlentecen/suprimen el crecimiento de la
flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito,
medio con Vitamina K).
 Medios selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se le adicionan
al agar nutritivo, sustancias que inhiben el crecimiento de un grupo de
microorganismos, sin aceptar el desarrollo de otras. Es de gran utilidad para el
aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta.
Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac
Conkey, Kanamicina-Vancomicina)
 Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que
el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.
Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos,
acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios
de mantenimiento
 Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes
como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc.
que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la
composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
 Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos
adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
(particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o
extractos de tejidos de animales y plantas.
c. Medios para identificación:
 Medios diferenciales: Formulaciones especiales en las que se estudian las
peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las
bacterias. Seleccionando los medios adecuados y por medio de los reactivos que
llevan nos permiten diferenciar entre todos las bacterias crecidas unas de otras.
(Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia
lactosa + de lactosa -)
 Medios de caracterización: se utilizan para identificar bacterias, dan lugar a una
respuesta concreta al metabolismo bacteriano.
 Medios aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que
satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su
identificación (Lowenstein).
La composición de los medios y caldos:
Todos los medios llevan agua, peptonas (que son compuestos intermedios de hidrólisis de
las proteínas), extracto de carne (se prepara a partir de carne de vaca troceada y
macerada, suministra componentes nitrogenados, también no nitrogenados y alguna
vitamina), extracto de levadura (se somete la levadura a una extracción con agua y se
evapora, luego a sequedad y tiene la misma función que el extracto de carne pero es
mucho más barata), gelatina (agente solidificante, se prepara hidrolizando colágeno en
agua hirviendo, se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su
licuación), agar (componente para dar consistencia a los medios, se extrae de esta alga,
la Gelidium corneum. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de
las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él), cloruro sódico (para
mantener la presión osmótica), sustancias inorgánicas (Na, K, Ca, etc.). En los diferentes
medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos
de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por
dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero
y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes, productos fermentables (monosacáridos, disacáridos y tienen dos
funciones: producir energía y para la identificación y clasificación de los
microorganismos). También se añaden colorantes que actúan como indicadores para
detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico
y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).
Inoculación de los medios de cultivo
En microbiología se entiende por "siembra" la operación que consiste en depositar un
germen asépticamente en un medio de cultivo.
Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales:
1 . Practicarla en medios de cultivo favorables y previamente esterilizados.
2. Emplear instrumentos asépticos.
3. No contaminar ni destruir el inóculo,
4. Depositarla asépticamente en los medios elegidos.
5. Esterilizar los instrumentos empleados antes y después de cada operación.
Los medios de cultivo, como ya se ha dicho, pueden ser sólidos, semisólidos o líquidos, y
estar contenidos en tubos, placas o frascos.
La técnica general de las siembras variará según el estado físico del material a sembrar y
del medio de cultivo.
Métodos de cultivo de uso rutinario
Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero Bunsen (30 cm.), o,
en el ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente
de aire que va por la llama, o la corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo y otras
partículas con el aire hacia arriba, o hacia afuera; impidiendo la contaminación del medio
de cultivo.
El asa o pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el
inóculo, o el medio de cultivo.
1. Siembra en placas
2. Siembra en tubos de agar tendido
3. Siembra por picadura
4. Siembra en superficie y picadura
5. Siembra en profundidad
6. INCUBACION: Los medios de cultivo pueden ser: inoculados en estufa a 35°C en
aerobiosis, anaerobiosis o en atmósfera de C02.
Para aerobiosis se incuban las placas y tubos en estufa de cultivo a 35°C.
Para anaerobiosis se colocan las placas y tubos dentro de una jarra Anaerobia y luego
ésta se coloca en estufa de cultivo a 35°C. con un sobre productor de atmósfera
anaerobia. Para incubar en atmósfera de C02 se colocan las placas y tubos dentro de la
Jarra de C02 y ésta se coloca en la estufa de cultivo a 35°C con un sobre productor de
atmósfera microaerófila.
2. FLUJOGRAM AS
Preparación de medios de cultivo
Medios de cultivo sólidos
1. verificar materiales
2. leer etiqueta
3. pesar la cantidad
4. medir agua
5. adicionar la mitad
6. agitar
7. adicionar la otra mitad
8. terminar la disolución
9. homogenizar a calor
10. agitar
esterilizar
enfriar
verter en cajas de petri
Hasta disolver
solidificar
prueba de esterilidad
refrigerar
Medios de cultivo líquidos
seguir los pasos del 1-8 del 2.1.1
servir en tubos
esterilizar
enfriar
refrigerar
Medios de cultivo semisólido
seguir los pasos del 1-8 del 2.1.1
verter en tubos
esterilizar
enfriar
solidificar
refrigerar
3 ml de caldo
Métodos de siembra de microorganismos
Inoculación de un caldo a otro
1. rotular los tubos
2. encender el mechero
3. flamear asa
4. tomar un inoculo de cepa
5. introducirla en el caldo
6. flamear la boca del tubo
7. flamear el asa
8. incubar
Siembra de medio sólido a líquido, semisólido e inclinado
rotular los tubos
encender el mechero
flamear asa
enfriar
tomar una colonia
introducirla en el tubo
girar 180º
en caso de
Semisólido
Inclinados
realizar picadura
realizar por método de estrías.
Seguir con pasos 6-8 del 2.2.1
Siembra de medio líquido a sólido
1. Siembra masiva o método clásico
1. rotular los tubos
2. encender el mechero
3. flamear asa
4. extraer un inoculo
5. colocarlo en extremos de la caja
6. extender la muestra
7. flamear el asa
8. incubar
En zigzag
2. Siembra por agotamiento o método francés
seguir los pasos del 1-5 del 2.2.3.1
extender la muestra
flamear el asa y enfriarlo
hacer 4 o 5 estrías
incubar
3. CÁLCULOS
 Para la preparación del SIM el frasco pone una concentración 30g/1000ml, como
nos pidieron preparar 50ml, entonces:
30g
x
1000ml
50ml
x = 1.5g de SIM que se utilizó para preparar el medio.
 Para la preparación del LIA el frasco pone una concentración 32g/1000ml, como
nos pidieron preparar 40ml, entonces:
32g
x
1000ml
40ml
x = 1.28g de LIA que se utilizó para preparar el medio.
 Para la preparación del ASM el frasco pone una concentración 111g/1000ml, como
nos pidieron preparar 100ml, entonces:
111g
x
1000ml
100ml
x = 11.1g de ASM que se utilizó para preparar el medio.
 Para la preparación del caldo nutritivo el frasco pone una concentración
8g/1000ml, como nos pidieron preparar 30ml, entonces:
8g
x
1000ml
30ml
x = 0.24g de ASM que se utilizó para preparar el medio.
4. RESULTADOS
4.1 Preparación de medios de cultivo
Se observó la perfecta gelificación de las placas y tubos sin la formación de grumos,
burbujas o fisuras en el gel.
4.2 Métodos de siembra de microorganismos
4.2.1 Desarrollo de un medio de cultivo líquido
Utilizando el medio de cultivo SIM y por medio de la siembra del Bacillus subtillis, después
de las 24h presentaron las siguientes características:
Para los tubo 1y 2. se vió una coloración amarillo claro con un precipitado de color blanco
en el fondo, además se notó un poco espeso.
Con la misma siembra y con la bacteria Proteus sp, después de las 24h las características
vistas fueron:
Para los tubos 3 y 4. Presentó turbidez, con una coloración amarilla y un precipitado en el
fondo de color blanco.
Después de las 48h todas las muestras presentaron un precipitado en la parte inferior del
tubo.(ver anexo 1)
4.2.2
Desarrollo de un medio de cultivo semisólido
Utilizando el medio de cultivo SIM y por medio de la siembra del S. faecium las
características que presentaron a las 24h son:
Para el tubo 1. coloración amarillo claro, con turbidez y con una capa superficial blanca.
Para el tubo 2 y 3. coloración amarillo claro, formación de un pequeño precipitado blanco
en la parte inferior y de una capa superficial blanca, y presencia de unas gotas
gelatinosas adheridas en las paredes del tubo.
Para el tubo 4. coloración amarillo claro, presencia de una capa superficial de color
blanco, un anillo por debajo de la mitad, de un color amarillo opaco, con una mayor
turbidez en esta parte.
Después de las 48h, los cambios que presentaron algunos tubos son:
Para el tubo 1. hubo cambio de color de amarillo a verde con negro, en la parte superior
se vió una capa superficial, hubo formación de precipitado.
Para el tubo 4. la parte inferior se encontró más blanca, en esta hay una pequeña nata.
Después de 5 días, los cambios que se vieron son:
Para el tubo 3. color amarillo, formación de anillo en la parte inferior, con precipitado
blanco.(ver anexo2)
4.2.3
Desarrollo de un medio de cultivo inclinado
Utilizando el medio de cultivo LIA y por medio de la siembra del S. faecium las
características que presentaron a las 24h son:
Para los tubos 1 y 2. Presencia de dos fases: en la parte inferior presentó un color
amarillo transparente, mientras que en la superior un morado transparente. En la parte
superior presenta una capa superficial, en las paredes del tubo hay como especie de
humedad.
Para los tubos 3 y 4. tiene una coloración miel, formación de capa superficial y presencia
de humedad. Para el 4 tenia un color más fuerte y menos humedad.
Después de las 48h presentaron los siguientes cambios:
Para los tubos 3 y 4. hubo cambio de color, se vieron de color naranja fuerte, hay un
precipitado donde empieza la inclinación, los otros tubos no presentaron cambio.
Después de 5 días se observaron otros cambios:
Para los tubos 1 y 2 color púrpura totalmente.
Para los tubos 3 y 4 color naranja totalmente. (ver anexo 3)
4.2.4
Desarrollo de un medio de cultivo sólido
Utilizando el medio de cultivo EMB y ASM, y por medio de la siembra del Bacillus subtillis
las características que presentaron a las 24h son:
Para la caja 1. con EMB, Bacillus subtillis y el método de estrías, algunas colonias están
de color morado y rosado.
Para la caja 2. con ASM, Bacillus subtillis y método francés, no hubo ningún cambio.
Para la caja 3. con EMB, Bacillus subtillis y método de estrías las colonias tornaron de
color rosado.
Para la caja 4. con ASM, Proteus sp y método francés las colonias se vieron amarillas.
Para la caja 5. con EMB, Proteus sp y método de estrías las colonias se vieron rosadas.
Para la caja 6. con EMB y Bacillus subtillis y método francés color rosado.
Para la caja 7 y 8 . con ASM, Bacillus subtillis no hubo cambio alguno.
Después de 5 días los cambios dados fueron los siguientes:
Para la caja 1 y 3. colonia morada-azul.
Para la caja 2 colonias blancas-amarillas.
Para la caja 4: colonias blancas-amarillas.
Para la caja 5: colonias morada-rosada-azul.
Para la caja 6: colonia azul-moradas-rosadas.
Para la caja 7 y 8: colonia blancas amarillas.(ver anexo 4)
5
ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1 Preparación de medios de cultivo
Se realizó el procedimiento de acuerdo como lo indicó la guía de laboratorio, lo cual arrojó
resultados positivos ya que no se presentó el crecimiento de ningún tipo de
microorganismos, lo cual nos dió a entender que los medios estaban completamente
estériles.
5.2 Métodos de siembra de microorganismos
5.2.1
Desarrollo de un medio de cultivo líquido
Para este tipo de siembra los resultados fueron satisfactorios ya que se observó un
crecimiento con base a la cantidad de desarrollo moderado; se dió la formación de
turbidez, de películas membranosas y formación de floculos, anillos y sedimentos.
5.2.2
Desarrollo de un medio de cultivo semisólido
Hubo movilidad a lo largo de la línea de inoculación, lo cual nos indica que hubo
crecimiento bacteriano.
5.2.3
Desarrollo de un medio de cultivo inclinado
Se da un crecimiento bacteriano lo cual se puedo percibir a través del cambio de color del
medio. El desarrollo del medio de cultivo se dió en forma de rizoide.
5.2.4
Desarrollo de un medio de cultivo sólido
Hubo formación de spreaders, es decir colonias esparcidas incontables las cuales se
debieron a la mucha presencia de humedad o, a demasiada cepa bacteriana.
El desarrollo de las colonias en las cajas petri se dió de forma puntiforme, según la
elevación eran convexas.
6
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
6.1 Fundamento de las cepas de microorganismos sembradas y de los medios de
cultivo preparados
El Proteus
Son bacilos Gram negativos, móviles, aerobios, anaerobios facultativos, con catalasa
positiva, fermentadores positivos, producen gases, hidrólisis de la urea en ocasiones, son
oxidasas negativos y ureasas positivos, licuan la gelatina, son sulfhídricos positivos
excepto el morgagnii.
Bacillus subtilis
El Bacillus subtilis , una bacteria inofensiva gram-positiva, que es capaz de producir los
endosporas resistentes a las condiciones ambientales adversas tales como calor y
desecación, y se utiliza extensamente para la producción de enzimas y de productos
químicos de la especialidad.
Medio de cultivo SIM
Medio de cultivo de ensayo, para comprobar la formación del sulfuro, la producción de
indol y la motilidad en el marco del diagnostico del Enterobacteriaseas.
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor
del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido
exclusivamente a lo largo de dicho canal. La producción de H2S se reconoce por el
ennegrecimiento de la zona de crecimiento.
Agar Lisina Hierro
Agar de ensayo para la demostración simultanea de lisina-descarbioxilasa(L-D) y de la
producción de ácido sulfhídrico(H2S) para la identificación de Enterobacteriaseas, sobre
todo de salmonella y arizona.
Los microorganismos L-D negativos, pero fermentadores de la glucosa producen un viraje
amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar
una alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y, en consecuencia se
produce un viraje al violeta.
La producción de H2S da coloración negra debida al sulfuro de hierro que se forma.
La cepa del grupo Proteus providencia, con excepción de algunas cepas de Proteus
morganii, desaniman a la lisina a ácido alfa cetocarbonico. Este último, con la sal de hierro
y con la influencia del oxígeno forma combinaciones pardo rojizas en la región superficial
del medio de cultivo.
CALDO NUTRITIVO
Se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo
sólido, donde se ha sembrado un volumen conocido de agua, transcurrido un tiempo y a
una temperatura de incubación determinados.
Transcurridas las 72 h (± 3 h) o las 48 h, según proceda en cada caso, contar todas las
colonias desarrolladas en cada placa. Si se ha sembrado más de una dilución se
seleccionará la que contenga entre 30 y 300 colonias, descartando las demás. El
recuento no se efectuará en placas que contengan menos de 30 colonias, excepto en
aquellas sembradas con agua sin diluir. El resultado se expresa como número de
bacterias aerobias totales en 1ml en 72 h a 22°C o en 48 h a 37°C
AGAR SALADO DE MANITOL
Es un medio selectivo y diferencial. AMS es selectivo porque contiene 7.5% de sal. Una
alta concentración de sal promueve el crecimiento de algunos organismos mientras inhibe
el crecimiento de otros. AMS es un medio diferencial porque contiene el azúcar manitol y
el indicador de pH rojo de fenol. Los organismos que pueden fermentar el manitol liberan
subproductos ácidos, que causan un cambio de color. El rojo de fenol presenta un color
rojo cereza por arriba de pH 8.5, un color amarillo rojizo desde un pH 6.9 a 8.5, y un
amarillo brillante por debajo de un pH de 6.9. Aunque tanto el Staphylococcus epidermidis
y Staphylococcus aureus puede tolerar el alto contenido de sal en el AMS, solamente S.
aureus puede fermentar el manitol, causando que el rojo de fenol vire al amarillo.
6.2 Cuál de los métodos de siembra en caja de petri, considera el mejor y porque?
Se considera como el mejor de los métodos al método francés o siembra por agotamiento,
ya que esto nos permite observar el crecimiento de los microorganismos en colonia y
también de forma aislada debido a la distribución que se hace de los mismos al momento
de realizar la siembra en el medio sólido.
CONCLUSIÓN
A partir del anterior laboratorio y a través de la bibliografía citada podemos concluir los
siguientes puntos:
 La utilización de medios de cultivos es de gran importancia en la industria de
alimentos, nos permite conocer las condiciones en las cuales se desarrolla los
microorganismos tales como bacterias, hongos, algas, levaduras, etc.
 La esterilidad es uno de los requisitos necesarios que deben cumplir los medios de
cultivos para que se de el crecimiento adecuado de las bacterias.
 Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante
 En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación
de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa
se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos
resistentes.
BIBLIOGRAFÍA
 http://html.rincondelvago.com/microbiologia_15.html
 http://www.geocities.com/lorigardeweg/page14.html
 http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html
 http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema06.html
Manual De Microbiologia. Ed Merck