Curso de Certificación de Microbiología (OPS) Recuento
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Curso de Certificación de Microbiología (OPS) Recuento heterotrófico en placas Donald J. Reasoner, Ph.D. División de Contaminantes Microbiológicos, WSWRD, NRMRL Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos Cincinnati, Ohio 45268 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------1. Introducción A. Historia de la técnica de recuento en placas a. Medio gelatina nutritiva b. Medio agar B. Métodos más recientes a. Recuento en placa estándar s b. Recuento heterotrófico en placas 1. Definición de bacterias heterótrofas 2. Medios selectivos versus no selectivos para el crecimiento de bacterias heterótrofas II. Usos del recuento heterotrófico en placas III. Métodos alternativos A. Método de placa fluida (MPF) B. Método de placa difusa (MPD) C. Método de filtración por membrana (PPM) IV. Consideraciones y beneficios del monitoreo V. Referencias -------------------------------------------------------------------------------------------------------------Resumen: La medición de bacterias heterótrofas en el agua potable puede proporcionar información útil a los operadores de plantas de agua, ingenieros sanitarios, supervisores de la calidad del agua y analistas de laboratorios de calidad del agua. Durante el tratamiento la densidad bacteriana varía y en la red de distribución se puede monitorear el deterioro de la calidad a través de los métodos de recuento heterotrófico en placas (RHP). La aplicación constante del método de RHP seleccionado proporcionará datos básicos para evaluar cambios en la calidad bacteriana del agua potable. A continuación se presenta un resumen de los métodos disponibles en los Estados Unidos e información para optimizar el RHP a través de la elección de procedimientos, medios y tiempo y temperatura de incubación. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------Revisado el 7 de agosto de 1998 para el Curso de Certificación de Microbiología (OPS) USEPA, AWBERC, Cincinnati, Ohio. 1. Introducción A. Historia de la técnica de recuento en placas En los Estados Unidos se han usado métodos para detectar y enumerar las bacterias en el agua desde el inicio de la microbiología sanitaria a principios del siglo XX. Además de enumerar las bacterias indicadoras (coliformes totales y fecales, Escherichia coli), se ha usado un procedimiento del recuento de bacterias para calcular la densidad general de la población bacteriana en el agua. a. Gelatina nutritiva. El Dr. Robert Koch (1876) usó la gelatina como el primer agente gelificante para solidificar el medio líquido usado en el cultivo de las bacterias. También desarrolló el método de estriado, el método de recuento en placas para el aislamiento de bacterias y el método de sesgado para sembrar cultivos puros. El uso de la gelatina como agente de solidificación permitió obtener muestras para el cultivo en placas, directamente o en alícuotas diluidas, en el medio gelificado, lo que facilitó el crecimiento de colonias individuales y el desarrollo de cultivos puros. La gelatina se podía obtener fácilmente y a un bajo costo pero presentaba dos desventajas. En primer lugar, se debe incubar por debajo de 28 °C para mantenerla solidificada; el uso de temperaturas de incubación inferiores de 28 °C no es adecuado para muchas bacterias. En segundo lugar, muchas bacterias pueden descomponer la gelatina, lo que hace que se licúe e impida la reproducción de las colonias. Actualmente, la gelatina nutritiva se usa principalmente para determinar si una bacteria aislada de un cultivo puro puede producir gelatinasa y licuar la gelatina como una característica bioquímica. b. Medio agar. Fue por sugerencia de Frau Hesse, esposa de un antiguo auxiliar del Dr. Koch, que el agar se introdujo como un agente gelificante para el medio de cultivo. En el Oriente el agar, derivado de algunas algas marinas, se usó como un agente gelificante. El agar entra en solución a 100 °C y permanece en estado líquido a una temperatura aproximada de 40 °C. Por lo tanto, una vez gelificado, permanece en estado sólido y se puede incubar a diferentes temperaturas para cultivar bacterias. Además, como el agar es un carbohidrato complejo atacado solo por algunas bacterias, el problema de la licuefacción no es muy frecuente Por lo tanto, el uso del agar como agente de solidificación en medios de cultivo selectivo y no selectivo ha permitido obtener mayor flexibilidad y capacidad para detectar y enumerar bacterias en todo tipo de muestras, incluidas las muestras clínicas, de alimentos, agua ambiental y potable, suelos, sedimentos y superficies (cocinas y áreas de preparación de alimentos, superficies de hospitales, etc.). B. Métodos más recientes a. Recuento en placa estándar En los Estados Unidos, los Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (1), desde su primera edición en 1905 (con el título Standard Methods of Water Analysis), han incluido un medio para medir la población general bacteriana en el agua. En el procedimiento de recuento en placas se emplearon placas de gelatina nutritiva incubadas a 20 °C. La segunda edición de los métodos estándar (1912) introdujo el recuento en placas a 37 °C, por 24 h con agar nutritivo, pero también consideró el recuento en placas a 20 °C por 48 con gelatina nutritiva. La inclusión del recuento en placas a 20 °C continuó hasta la 12a. edición de los métodos estándar (1965) pero se le excluyó en las ediciones de la 13a. a la 15a. (1980). En la 16a. edición (1985) se volvió a introducir el recuento en placas a 20 °C con medio agar y se cambió el nombre de recuento en placa estándar s (REP) a recuento heterotrófico en placas (RHP). El procedimiento actual del recuento en placa estándar (RPE) evolucionó de la metodología anterior que aplicaba una incubación a 37 °C para el “recuento a temperatura corporal" especificada en los métodos estándar de la 3a. edición (1917), hasta la 8a. edición (1936), en la 9a. edición (1946) se especificó una incubación por 24± 2 h a 35-37 °C. b. Recuento heterotrófico en placas Durante los últimos años, el interés por medir la densidad bacteriana de las muestras de agua potable ha dado lugar a algunos cambios en el procedimiento aceptado. Mientras que en el pasado el recuento de bacterias en placas era conocido como el “recuento total en placas” o el “recuento en placa estándar”, la terminología cambió en la 16a. edición (1985) de los métodos estándar a “recuento heterotrófico en placas” (RHP). Al adoptar este nombre, se reconoce que el procedimiento de recuento de bacterias en placas no puede obtener una medición total del recuento de las bacterias y que, mientras se requieran condiciones estándares, deberá haber alguna libertad para elegir las condiciones estandarizadas de modo que la medición se adapte a las necesidades de información del usuario. La sección 9215, recuento heterotrófico en placas, 19a. edición de los métodos estándar (1995), ofrece al usuario varias alternativas para determinar la densidad de bacterias presentes en el agua. La 16a. edición de los métodos estándar volvió a establecer la opción de incubación a 20 °C e introdujo la filtración por membrana y los procedimientos de placas difusas para la enumeración bacteriana. También reconoció el uso de un medio con bajo contenido de nutrientes para el recuento heterotrófico en placas, así como cambios en el tiempo de incubación para obtener una enumeración óptima a 20 °C o 28 °C. Estos cambios en el procedimiento del recuento en placas se realizaron debido a investigaciones iniciadas a mediados de la década de 1970. 1. Definición de bacterias heterótrofas Las bacterias heterotróficas (heterótrofas) se definen como aquellas bacterias que usan compuestos del carbono orgánico como fuente de energía y el carbono para su crecimiento, en contraposición con las bacterias autotróficas que utilizan los compuestos inorgánicos como fuente de energía y el C02, como fuente de carbono. Esta definición de bacteria heterótrofa es amplia e incluye tanto a las bacterias saprofíticas como a las patógenas. Por lo tanto, tanto las bacterias que causan como las que no causan enfermedades son heterótrofas. 2. Medios selectivos versus no selectivos para la reproducción de bacterias heterótrofas Los medios RHP empleados para enumerar los heterótrofos encontrados en el agua se consideran medios no selectivos porque no tienen compuestos inhibitorios ni selectivos para un determinado grupo de bacterias. Algunos compuestos que se usan en los medios selectivos son las sales biliares, sulfato de laurilo de sodio o desoxicolato de sodio (usado en medios para la detección de coliformes), azida de sodio (selectiva para enterococcos), colorantes (verde brillante) y antibióticos. Las condiciones de incubación, incluida la temperatura, pueden ser selectivas y por consiguiente tales condiciones deben estar especificadas para las bacterias particulares que se procura detectar o enumerar. II. Usos del recuento heterotrófico en placas El recuento heterótrofico en placas (RHP) es un procedimiento sencillo que se puede realizar por el método de placa fluida, difusa o filtración por membrana (FM) y es una herramienta muy útil. Aunque no es esencial para evaluar la seguridad del agua potable, los resultados del RHP proporcionan información que complementa los resultados de los coliformes totales. El RHP se puede usar para indicar la composición bacteriana general del agua de la fuente y la eficacia y eficiencia de los procesos de tratamiento del agua, como la sedimentación, coagulación, filtración y cloración. El monitoreo del RHP en el agua distribuida puede proporcionar información sobre la limpieza del sistema de distribución, desarrollo de bacterias después del tratamiento, efectos de los cambios de temperatura en el agua y del cloro residual en la población bacteriana. III. Métodos alternativos El cuadro I presenta un resumen de los métodos alternativos de RHP incluidos en la 16a. edición de los métodos estándar. Por primera vez, los métodos estándar ofrecen al analista tres métodos opcionales y dos medios nuevos para el procedimiento del RHP. El cuadro 2 muestra la preparación de medios para el RHP. A. Método 9215 B, método de placa fluida (MPF) El método de placa fluida para el análisis del RHP de las muestras de agua presenta algunas desventajas que limitan la recuperación de las bacterias. Como usa agar licuado a una temperatura de 44 a 46 °C, las bacterias en la muestra de agua están expuestas a la presión del calor, lo cual puede hacer que los microorganismos no sean viables. Además, como se emplea un medio rico en nutrientes, es probable que las bacterias fisiológicamente estresadas o dañadas no se desarrollen debido a alguna forma de inhibición metabólica. Tanto la presión del calor como el medio de crecimiento rico producen una recuperación reducida de las bacterias. Otra desventaja es que mediante este método sólo se puede analizar un máximo de 1,0 ml de muestra. B. Método 9215 C, método de placa difusa (MPD) Este método, que es un procedimiento alternativo al RHP, evita la tensión del calor del agar licuado temperado usado en el método de placa fluida. Las colonias de bacterias crecen en la superficie del agar en lugar de estar contenidas en el agar, como sucede en el procedimiento de placa fluida, lo cual favorece la reproducción de bacterias aerobias que no se podrían desarrollar bien o no se desarrollarían del todo si estuvieran contenidas en el agar. Por lo general, cuando se aplica un período de incubación no mayor de 3 días, se produce un mejor desarrollo de la pigmentación en las colonias de bacterias, independientemente del medio usado. Las placas se pueden preparar previamente y almacenar hasta por una semana mientras que el escape de agua por placa no exceda los 2 ó 3 g. El volumen máximo de muestra que se puede examinar es 1,0 ml, pero generalmente es recomendable examinar un volumen de 0,1 ml a 0,5 ml. Cuando se dispone de medios de crecimiento más ricos, el crecimiento disperso de colonias de algunos tipos de bacterias puede ser un problema, pero esto no sucede si se usa el medio R2A (2). El método de placa difusa no es un procedimiento nuevo. Ha sido utilizado por muchos años y se ha demostrado que permite recuentos mayores de placas que el procedimiento de placa fluida. En una comparación de los resultados de 571 muestras de agua recolectadas de tuberías finales de agua durante la descarga normal, la razón promedio de los resultados de la placa fluida a 35 °C en relación con la placa difusa fue de 0,24 (3). Es decir, el resultado del método de la placa difusa fue aproximadamente cuatro veces mayor que el resultado de la placa fluida. Además, se observó que el método de la placa difusa era más exacto que el de la placa fluida. Al examinar la distribución de los recuentos bacterianos de la misma muestra obtenidos con ambos métodos, se halló que aproximadamente 90% de los recuentos de la placa fluida estaban en una categoría de < 500/ml en comparación con solo 49% de los recuentos de la placa difusa (cuadro 3). Además, solo 6,3% de los recuentos de la placa fluida estaban en > 1.000/ml en comparación con aproximadamente 35% de los recuentos de la placa difusa. Esto es una prueba más de que el método de la placa fluida es muy ineficiente y puede subestimar significativamente el número de bacterias en una muestra de agua tratada. Hay dos efectos que contribuyen a reducir los recuentos obtenidos con el método de la placa fluida. En primer lugar, el agar licuado temperado causa daños irreparables a algunas bacterias. En segundo lugar, el crecimiento de bacterias altamente aerobias se dificulta cuando los organismos están dentro del agar y no en la superficie. C. Método 9215 D, método de filtración por membrana (MFM). Este método se introdujo por primera vez para determinar el RHP en la 16a. edición de los métodos estándar (4,5). La técnica de filtración por membrana es una de las herramientas más versátiles para un microbiólogo del agua y la mayoría de los analistas conocen el procedimiento de filtración por membrana para la determinación de coliformes totales. El uso del método de filtración por membrana para el RHP permite examinar grandes volúmenes de aguas turbias y es particularmente útil cuando el RHP es bajo, como generalmente sucede con el efluente clorado de agua clarificada o el efluente de una unidad de ósmosis inversa. Con el medio m-RHP, el crecimiento difuso de algunos tipos de bacterias puede ser un problema; este caso es menos frecuente con el medio R2A con bajo contenido de nutrientes. Como el medio m-RHP no es un medio estéril, puede haber contaminación y las placas se deben usar un día o dos después de la preparación; las placas de m-RHP se deben almacenar a la temperatura del refrigerador hasta el momento de usarlas. El medio R2A se prepara como un medio estéril y no tiene este inconveniente. Las ventajas del procedimiento de la filtración por membrana es que requiere menos tiempo y espacio para la incubación y materiales. El recuento de colonias en los filtros de membrana blancos puede ser un problema debido al tamaño pequeño de la colonia para algunas bacterias y la falta de contraste entre las colonias no pigmentadas y la membrana blanca. Este problema se puede resolver al ajustar la fuente de luz en un ángulo bajo a fin de crear un efecto de sombreado o al inclinar la placa y volver a enfocar el microscopio. Esta última manipulación requiere un reajuste continuo del microscopio pero funciona bien para los filtros de membrana con cuadrículas. IV. Consideraciones y beneficios del monitoreo La información obtenida de la prueba bacteriológica del agua se debe interpretar juntamente con el conocimiento minucioso de las condiciones de la fuente de suministro durante todo el proceso de tratamiento y en el sistema de distribución. Una única prueba de laboratorio, aunque sea favorable, no justifica la conclusión de que todo sea satisfactorio. El valor de las pruebas bacteriológicas depende de la aplicación frecuente y examen regular de los resultados. El examen frecuente con una prueba bacteriológica simple como el análisis de RHP, además de la prueba requerida de coliformes totales, proporcionará una base referencial para la calidad bacteriológica. Es posible determinar los cambios en la tendencia de la calidad bacteriológica y si el cambio no es bueno, se deben tomar medidas correctivas. También es importante observar el mejoramiento de la calidad bacteriológica e identificar los factores responsables de modo que se puedan mantener las condiciones. Por lo general, es necesario realizar la prueba de coliformes para saber si ha habido contaminación, pero el RHP puede proporcionar información importante. Cuando hay un aumento repentino en el RHP, el analista debe alertar al operador de la planta de tratamiento e indicar los pasos que se deben seguir para tratar de determinar la causa del RHP mayor. Si no se observa ningún cambio en la calidad del agua que proviene de la planta de tratamiento pero el RHP muestra una mayor tendencia en algunos lugares del sistema de distribución, es probable que haya problemas como bajo cloro residual, presión baja, retrosifonaje o fugas en las tuberías y reservorios de servicio. La figura 1. muestra las diferencias características en los resultados del RHP obtenidos con los medios y alternativas del método de la 16a. edición de los métodos estándar para examinar muestras de agua potable. Con el recuento en placa en agar (SMA), independientemente del método empleado, se obtuvieron los peores resultados a 35 °C con todos los medios usados. La incubación a 35 °C, independientemente del medio/método empleado para el RHP, también produjo los recuentos en placa más bajos. La figura 2. compara los resultados del RHP después de siete días de incubación para muestras de aguas de fuente no clorada y de agua potable clorada. Los recuentos de colonia se obtuvieron mediante los métodos estándares y medio agar R2A con los procedimientos de la placa difusa, del filtro de membrana y del filtro de membrana mRHP. Esta cifra muestra que la incubación a 20 °C produjo los recuentos más altos en todos los medios para los dos tipos de muestras, también indica que los resultados a 35 °C fueron muy bajos en comparación con los resultados a 20 °C para el agua clorada. Además, el método usado para el RHP del agua clorada a 35 °C fue más importante que para el RHP a 20 °C. Estos datos sirven para resaltar el hecho de que la combinación de métodos/medios de RHP se debe determinar experimentalmente mediante pruebas de comparación y no se debe suponer que todas las combinaciones de medios/métodos van a producir resultados equivalentes. Para usar la información del RHP en la evaluación de la eficacia del tratamiento general y las condiciones del sistema de distribución, los datos básicos del RHP se deben recolectar con la misma combinación de medios/métodos desde el principio hasta el final. A pesar de que el RHP es muy lento, el método del filtro de membrana proporciona un medio de medir la población bacteriana al usar volúmenes de muestras mayores de un mililitro. Como se puede observar en el cuadro 1, una subpoblación más pequeña de bacterias heterótrofas se mide a 35 °C en lugar de a 20 ó 28 °C; de hecho, en la mayoría de los casos es solo aproximadamente < 10%. Para los datos básicos, es mejor medir la población más grande posible y esperar una tendencia creciente como signo de que ha sucedido algo (o está sucediendo) que aumenta la población del RHP. El aumento o disminución en la tendencia se debe interpretar a partir de los cambios estacionales en la calidad del agua, temperatura y otros factores. Una vez que haya recolectado los datos básicos adecuados, el operador podrá identificar fácilmente los factores estacionales que afectan la calidad bacteriológica de su producto. Al conocer los cambios que se producen estacionalmente, o asociados con lluvias fuertes, el operador de la planta podrá predecir o prever cuándo aumentará el RHP a fin de alterar el tratamiento de modo que pueda minimizar el cambio bacteriológico. Además de los cambios estacionales, se pueden relacionar recuentos mayores del RHP con la duración de la carrera de los filtros en las plantas que aplican la filtración rápida de arena. En la práctica, la necesidad de limpiar un lecho de filtro rápido de arena se basa en la pérdida de carga y el retraso para obtener los resultados bacteriológicos dificultarían, a corto plazo, el manejo de la operación del filtro rápido de arena. Sin embargo, a largo plazo, el conocimiento sobre los cambios en el RHP relacionado con la operación de la filtración rápida de arena ayudaría al operador o ingeniero de la planta a entender e interpretar los datos bacteriológicos. En el caso del tratamiento con filtración de carbono activado granular (CAG), el monitoreo del RHP en el efluente del lecho del filtro CAG puede ser muy beneficioso. Los filtros de CAG desarrollan poblaciones muy grandes de bacterias (> 108 células/g húmedad ph. CAG) y los cambios en las características de los afluentes, como cambios de temperatura, pH y cloro residual pueden desarrollar un mayor número de bacterias que se vierten en el filtro de CAG del contratista que trata el efluente. Como actualmente no hay ningún requisito legal en las normas primarias del agua potable para la medición del RHP, la decisión de monitorear el RHP y la elección de la metodología dependen estrictamente del servicio de agua. Se espera que un manejo bien informado y progresivo por parte del servicio de agua determine el uso del RHP como una herramienta complementaria de información para realizar una operación óptima del proceso de tratamiento y producir un producto de alta calidad para sus clientes. Referencias 1. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19a. Edición. APHA, AWWA, y WPCF. Washington, D.C. (19a. ed., 1995). 2. Reasoner, D. J. y E. E. Geldreich. 1985. A New Medium for the Enumeration and Subculture of Bacteria from Potable Water. Appl. Environ. Microbiol., 49: 1-7. 3. Taylor, R. H., M. J. Allen y E. E Geldreich. 1983. Standard Plate Count: A Comparison of Pour Plate and Spread Plate Methods. Jour. AWWA, 75 (1):35-37. 4. Taylor, R. H. y E. E. Geldreich. 1979. A New Membrane Filter Procedure for Bacterial Counts in Potable Water and Swimming Pool Samples. Jour. AWWA, 71 (7):402-405. 5. Haas, C. N., M. A. Meyer, y M. S. Paller. 1992. Analytical note: Evaluation of the m-SPC Method as a Substitute for the Standard Plate Count in Water Microbiology. Jour. AWWA, 74(6):322. 6. Fiksdat, L., E. A. Vik, A. Mills y J. T. Staley. 1982. Nonstandard Methods for Enumerating Bacteria in Drinking Water. Jour. AWWA, 74(6) : 313-318. Cuadro 1. Resumen de las alternativas para el recuento heterotrófico en placas (RHP) en los métodos estándares, 19a. Edición. Sección 9215. Subsección Medio 9215B, método de TGE placa fluida (MPF) PCA R2A Incubación °C/tiempo Volumen muestra de 35 ± 0,5 °C/48 ± 3 h. “ “ /72 ± 4 h. 1 ml. máximo la 35 ± 0,5 °C/72 ± 4 h.; de preferencia de 5 a 7 días 28 °C ó 20 °C/5-7 días 9215C, método de Igual que Igual que 9215B placa difusa (MPD) 9215B 9215D, método de m-RHP filtración por membrana (MFM) R2A # = Agua embotellada. 35 ± 0,5 ° C/48 ± 3 h. “ “ /72 ± 4 h. # Igual que 9215B 1 ml, pero generalmente se usa de 0,1 a 0,5 ml Variable pero se puede filtrar ≥ 1 L, según la turbiedad de la muestra Cuadro 2. RHP Ingredientes de los medios (g/litro) Caseína soluble Agar del recuento en R2A placa (ARP) - Triptona 5,0 Glucosa Extracto de levadura Ingrediente Agar m-RHP Agar NWR1 - 0,5 - - - 1,0 0,5 - - 2,5 0,5 - - 0,5 - - Proteosa peptona #3 o polipeptona Ácidos casaminos - 0,5 - - Almidón soluble - 0,5 - - K2HPO4 - 0,3 - 0,2 MgSO⋅7H2O - 0,05 - 0,05 Piruvate de sodio - 0,3 - - Cloruro férrico - - - 0,001 Peptona - - 20,0 3,0 Gelatina - - 25,0 - Glicerol - - 10,0 - Agar 15,0 15,0 15,0 15,0 PH 7 ± 0,2 7,2 7,1 7,2 Agua destilada 1,0 L 1,0 L 1,0 L 1,0 L Todos los medios, a excepción del m-RHP se esterilizan en el autoclave a 121 °C por 15 minutos después de hervir para disolver todos los ingredientes. Para preparar el agar mRHP se mezclan todos los ingredientes, excepto el glicerol, se ajusta el pH con 1,0 N NaOH, se calienta para disolver, se añade glicerol y se coloca en el autoclave a 121 °C por cinco minutos. Cuadro 3. Distribución de los recuentos de bacterias de la misma muestra tanto con el procedimiento de placa líquida como con el de la placa difusa. Recuento de placas/mL Procedimiento <500 500-1000 >500 No. de muestras 570 26 33 Porcentaje 88,8 4,9 6,3 No. de muestras 259 85 185 Porcentaje 49,0 16,1 34,9 Placa fluida Placa difusa Observación: Las diapositivas (no incluidas en el paquete) indican que no tienen una copia impresa correspondiente porque no fue posible escanearlas. Por ejemplo, las diapositivas 27-30 se presentarán durante la conferencia pero no se dispone de la copia impresa. Todas las copias impresas están enumeradas al reverso para coincidir con la lista. Tampoco se dispone de una versión electrónica debido al tamaño del archivo; se tendría que utilizar un disquete por cada diapositiva.
