autoinmunidad humana
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AUTOINMUNIDADHUMANA Título original: Autoinmunidad Humana Autores: Federico Navajas Luque. Facultativo Especialista de Área de Laboratorio de Diagnóstico Clínico Joaquín Cano Medina. T.S.S. de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Edita e imprime: FESITESS ANDALUCÍA C/ Armengual de la Mota 37 Oficina 1 29007 Málaga Teléfono/fax 952 61 54 61 www.fesitessandalucía.es ISBN: 978-84-694-4545-7 Diseño y maquetación: Alfonso Cid Illescas Edición Octubre 2011 ÍNDICE UNIDADDIDÁCTICAI PRESENTACIÓNYMETODOLOGÍADELCURSO 1.1 Sistema de Cursos a Distancia 9 11 1.2 Orientaciones para el estudio 12 1.3 Estructura del Curso 14 UNIDADDIDÁCTICAII SISTEMAINMUNE.INTRODUCCIÓN 17 2.1 Introducción Sistema Inmune 19 2.2 Respuesta Inmune inespecífica 19 2.3 Respuesta inmune específica 20 2.4 Concepto de antígeno y hapteno 24 2.5 Inmunopatología 24 UNIDADDIDÁCTICAIII CÉLULASINMUNOCOMPETENTES 3.1 Introducción células inmunocompetentes 29 31 3.2 Linfocitos T y B 31 3.3 Células asesinas naturales (NK) 37 3.4 Células mielomonocíticas 38 3.5 Distribución de las Células Inmunocompetentes 41 UNIDADDIDÁCTICAIV INMUNOGLOBULINA 4.1 introducción Inmunoglobulina 47 49 4.2 Estructura de las Inmunoglobulina 50 4.3 Características de los distintos tipos de Inmunoglobulina 52 4.4 Estructura espacial de las Inmunoglobulina 55 4.5 Subclases de Inmunoglobulina 56 4.6 Distribución de las Inmunoglobulina 57 4.7 Superfamilias de las Inmunoglobulina 57 4.8 Función de las Inmunoglobulina 57 4.9 Propiedades y función de cada una de las Inmunoglobulina 62 UNIDADDIDÁCTICAV GENÉTICADELASINMUNOGLOBULINA 5.1 Introducción genética de las Inmunoglobulina 65 67 5.1 Genes implicados en la síntesis de Inmunoglobulina 67 5.2 Reordenamiento de los segmentos génicos de las Inmunoglobulina 68 5.3 Causas de la diversidad de las Inmunoglobulina 72 5.4 Exclusión alélica en la síntesis de Inmunoglobulina 73 5.5 Anticuerpos monoclonales producidos por Hibridomas 74 UNIDADDIDÁCTICAVI SISTEMADEHISTOCOMPATIBILIDAD 6.1 Introducción sistema de histocompatibilidad 77 79 6.2 Estructura de las moléculas de histocompatibilidad 79 6.3 Genética del complejo mayor de histocompatibilidad 83 6.4 Método serológico 86 6.5 Métodos de bilogía molecular 87 6.6 Métodos celulares 87 6.7 Mecanismos de generación del polimorfismo 88 6.8 Función de las moléculas de histocompatibilidad 89 UNIDADDIDÁCTICAVII PROCESAMIENTODEANTÍGENOS 91 7.1 Introducción procesamiento de antígenos 93 7.2 CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO 93 7.3 Captación y procesamiento de antígeno 95 7.4 Biosíntesis de las moléculas del MHC 96 UNIDADDIDÁCTICAVIII RECEPTORDECÉLULAST 8.1 Introducción receptor de células T 8.2 Enfermedades asociadas al complejo TCR/CD3 UNIDADDIDÁCTICAIX MOLÉCULASDEADHERENCIA 9.1 Introducción moléculas de adherencia 101 103 105 107 109 9.2 Moléculas de adhesión celular 110 9.3 Interacción leucocito-endotelio en la inflamación 111 UNIDADDIDÁCTICAX CITOCINASYQUIMIOCINAS 10.1 Introducción 117 119 10.2 Citocinas 119 10.3 Quimiocinas 126 10.4 Receptores de las citocinas 127 UNIDADDIDÁCTICAXI ACTIVACIÓNLINFOCITOST 135 11.1 Introducción activación linfocitos T 137 11.2 Fenómenos de interacción celular 137 11.3 Transmisión de señales 138 UNIDADDIDÁCTICAXII ACTIVACIÓNCÉLULASNK 145 12.1 Introducción 147 12.2 Función citotóxica de las células NK 147 12.3 Función secretora de las células NK 148 12.4 Receptores activadores de células NK 148 12.5 Activación NK y respuesta inmune innata 152 UNIDADDIDÁCTICAXIII SISTEMADELCOMPLEMENTO 13.1 Introducción sistema del complemento 157 13.2 Activación del complemento 157 13.3 Receptores para factores del complemento 161 13.4 Funciones del complemento 162 UNIDADTEMÁTICAXIV CITOTOXICIDAD 165 14.2 Fase de adhesión intercelular 166 14.3 Fase de activación de células efectoras 167 14.4 Fase lítica 167 14.5 Lisis mediada por macrófagos 168 171 15.1 Introducción 173 15.2 Tolerancia central en linfocitos T 175 15.3 Tolerancia periférica (postímica) de linfocitos T 176 15.4 Tolerancia central de linfocitos B 176 15.5 Tolerancia periférica de linfocitos B 176 UNIDADDIDÁCTICAXVI FILOGENIASISTEMAINMUNE 163 14.1 INTRODUCCIÓN CITOTOXICIDAD UNIDADTEMÁTICAXV TOLERANCIAINMUNOLÓGICA 155 177 16.1 Introducción 179 16.2 Mecanismos de defensa 180 UNIDADDIDÁCTICAXVII MÉTODOSBASADOSENUNIÓNANTÍGENO‐ANTICUERPO 183 17.1 Introducción 185 17.2 Técnicas de precipitación 185 17.3 Técnicas de aglutinación 187 17.4 Técnicas de inmunofluorescencia 187 17.5 Técnica de radioinmunoensayo 189 17.6 Técnica de enzimoinmunoensayo 190 17.7 Técnicas nefelométricas 190 17.8 Selección de células unidas a un anticuerpo 191 17.9 Técnicas usadas en el aislamiento de anticuerpos o antígenos puros 191 17.10 Inmunoprecipitación e inmunoblotting 191 17.11 Otras técnicas basadas en la unión antígeno-anticuerpo 192 17.12 Técnicas de biología molecular útiles en inmunología 193 UNIDADDIDÁCTICAXVIII AUTOINMUNIDAD 195 18.1 Introducción 197 18.2 Criterios que definen las enfermedades autoinmunes 197 18.3 Clasificación de enfermedades autoinmunes 199 18.4 Mecanismos patogénicos en las enfermedades autoinmunes 201 UNIDADDIDÁCTICAXIX ENFERMEDADESAUTOINMUNES 209 19.1 Tiroiditis de Hashimoto 211 19.2 Anemia perniciosa (Anemia por déficit de vitamina B12) 213 19.3 Anemia por déficit de ácido fólico 215 19.4 Enfermedad de Addison 216 19.5 Diabetes tipo I 217 19.6 Artritis Reumatoide 217 19.7 Lupus Eritematoso Sistémico 219 19.8 Dermatomiositis 227 19.9 Síndrome de Sjögren 227 19.10 Síndrome de Reiter 229 19.11 Síndrome de Goodpasture 230 19.12 Síndrome de Guillain-Barré 230 19.13 Esclerosis Múltiple 231 19.14 Miastenia grave 231 19.15 Enfermedad de Graves 232 19.16 Artritis Psoriásica (Psoriasis) 232 19.17 Granulomatosis de Wegener (GW) 233 19.18 Esclerodermia 234 19.19 Enfermedad celíaca 234 19.20 Mixedema primario (Hipotiroidismo severo) 235 19.21 Gastritis Atrófica Autoinmune 235 19.22 Anemia Hemolítica Autoinmune (AHAI) 236 19.23 Pénfigo Vulgar 236 UNIDADDIDÁCTICAXX ESTUDIODELOSAUTOANTICUERPOS 20.1 Estudio de los Auto-Anticuerpos 239 20.2 Estructuras nucleares y citoplasmáticas más relevantes 240 20.3 Orgánulos subcelulares más relevantes 243 20.4 Componentes de órganos más relevantes 245 20.5 Pruebas de laboratorio 249 CUESTIONARIO Cuestionario 237 259 261 UNIDADDIDÁCTICAI PRESENTACIÓNYMETODOLOGÍADELCURSO AutoinmunidadHumana Presentación,normasyprocedimientosdetrabajo. Introducción Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el método que se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introducción. Presentación 1. Sistema de Cursos a Distancia En este apartado aprenderá una serie de aspectos generales sobre las técnicas de formación que se van a seguir para el estudio. 2. Orientaciones para el estudio. Si usted no conoce la técnica empleada en los Cursos a Distancia, le recomendamos que lea atentamente los epígrafes siguientes, los cuales le ayudarán a realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, sólo tiene que seguir los pasos que se indican en el siguiente índice: Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente. 3. Estructura del Curso Mostramos cómo es el Curso, las Unidades Temáticas de las que se compone, el sistema de evaluación y cómo enfrentarse al tipo test. 1.1SistemadeCursosaDistancia 1.1.1RégimendeEnseñanza La metodología de Enseñanza a Distancia, por su estructura y concepción, ofrece un ámbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseñada para adaptarse a las disponibilidades de tiempo y/o situación geográfica de cada alumno. Además, es participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solución de problemas clínicos. La Formación a Distancia facilita el acceso a la enseñanza a todos los Técnicos Especialistas/Superiores Sanitarios. 1.1.2CaracterísticasdelCursoydelalumnadoalquevadirigido Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos, debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarán (lo que saben y lo que aún no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se ajustará a sus intereses y capacidades. Un buen Curso producirá resultados deficientes si lo estudian personas muy diferentes de las inicialmente previstas. Los Cursos se diseñan ajustándose a las características del alumno al que se dirige. 11 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 1.1.3OrientacióndelosTutores Para cada Curso habrá, al menos, un tutor al que los alumnos podrán dirigir todas sus consultas y plantear las dificultades. Las tutorías están pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se realiza en esta formación es totalmente individual y personalizado. El tutor responderá en un plazo mínimo las dudas planteadas a través de correo electrónico exclusivamente. Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores: Académicos. Serán aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso, planteamientos sobre cuestiones test y casos clínicos. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico. Orientadores y de apoyo metodológico. Su labor se centrará fundamentalmente en cuestiones de carácter psicopedagógicas, ayudando al alumno en horarios, métodos de trabajo o cuestiones más particulares que puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico. 1.2Orientacionesparaelestudio Los resultados que un estudiante obtiene no están exclusivamente en función de las aptitudes que posee y del interés que pone en práctica, sino también de las técnicas de estudio que utiliza. Aunque resulta difícil establecer unas normas que sean aplicables de forma general, es más conveniente que cada alumno se marque su propio método de trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento. Por tanto, aún dando por supuestas la vocación y preparación de los alumnos y respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente exponer algunos patrones con los que se podrá guiar más fácilmente el desarrollo académico, aunque va a depender de la situación particular de cada alumno y de los conocimientos de la materia del Curso: Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana. 12 Elegir el horario más favorable para cada alumno. Una sesión debe durar mínimo una hora y máximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo que se necesita de preparación, mientras que más de tres horas, incluidos los descansos, puede resultar demasiado y descendería el rendimiento. Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminación adecuada, espacio suficiente para extender apuntes, etc. Estudiar con atención, sin distraerse. Nada de radio, televisión o música de fondo. También es muy práctico subrayar los puntos más interesantes a modo de resumen o esquema. AutoinmunidadHumana a) Fase receptiva. Observar en primer lugar el esquema general del Curso. Hacer una composición de lo que se cree más interesante o importante. Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a otro sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen cuestiones no útiles. Anotar las palabras o párrafos considerados más relevantes empleando un lápiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean claras y significativas. Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la Unidad. Completar el esquema con el texto. Estudiar ajustándose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse. Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos. Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema. Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos detenidamente. No insistir de momento más sobre ellos. b) Fase reflexiva. Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografía recomendada y la utilizada en la elaboración del tema que puede ser de gran ayuda. Seguir paso a paso el desarrollo de los temas. Anotar los puntos que no se comprenden. Repasar los conceptos contenidos en el texto según va siguiendo la solución de los casos resueltos. c) Fase creativa. En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolución de pruebas de autoevaluación y a los casos concretos de su vivencia profesional. Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a solucionarla. Consultar la exposición de conceptos del texto que hagan referencia a cada cuestión de la prueba. Solucionar la prueba de cada Unidad Temática utilizando el propio cuestionario del manual. 13 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 1.3EstructuradelCurso 1.3.1ContenidosdelCurso Guía del alumno. Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test. FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario. ENCUESTA de satisfacción del Curso. 1.3.2LosCursos Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseñado en Unidades Didácticas. 1.3.3LasUnidadesDidácticas Son unidades básicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de material educativo distinto: Texto propiamente dicho, dividido en temas. Bibliografía utilizada y recomendada. Cuestionario tipo test. Los temas comienzan con un índice con las materias contenidas en ellos. Continúa con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la redacción del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad práctica. El apartado de preguntas test serán con los que se trabajen, y con los que posteriormente se rellenará el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo test se adjuntan al final del temario. Cuando están presentes los ejercicios de autoevaluación, la realización de éstos resulta muy útil para el alumno, ya que: Tienen una función recapituladora, insistiendo en los conceptos y términos básicos del tema. Hacen participar al alumno de una manera más activa en el aprendizaje del tema. Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar posteriormente el resultado de las respuestas. Son garantía de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo. Dentro de las unidades hay distintos epígrafes, que son conjuntos homogéneos de conceptos que guardan relación entre sí. El tamaño y número de epígrafes dependerá de cada caso. 1.3.4SistemadeEvaluación Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluación a distancia que se encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio 14 AutoinmunidadHumana del Curso, y enviada al tutor de la asignatura, con un plazo máximo de entrega para que pueda quedar incluido en la edición del Curso en la que se matriculó y siempre disponiendo de 15 días adicionales para su envío. Los tutores la corregirán y devolverán al alumno. Si no se supera el cuestionario con un mínimo del 80% correcto, se tendrá la posibilidad de recuperación. La elaboración y posterior corrección de los test ha sido diseñada por el personal docente seleccionado para el Curso con la intención de acercar el contenido de las preguntas al temario asimilado. Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envío de las respuestas para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso. 1.3.5Fechas El plazo de entrega de las evaluaciones será de un mes y medio a partir de la recepción del material del curso, una vez pasado este plazo conllevará una serie de gestiones administrativas que el alumno tendrá que abonar. La entrega de los certificados del Curso estará en relación con la fecha de entrega de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalización del Curso. 1.3.6Aprendiendoaenfrentarseapreguntastipotest La primera utilidad que se deriva de la resolución de preguntas tipo test es aprender cómo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensación que algunos alumnos tienen de “se me dan los exámenes tipo test”. Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolución de las mismas está más dirigida y el planteamiento es más específico. Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a conocimientos muy concretos y exigen un método de estudio diferente al que muchas personas han empleado hasta ahora. Básicamente todas las preguntas test tienen una característica común: exigen identificar una opción que se diferencia de las otras por uno o más datos de los recogidos en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresión de dos hechos fundamentales con respecto a las preguntas tipo test: Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no consiga recordad de memoria una serie de datos que aprendió hace tiempo; seguro que muchos de ellos los recordará al leerlos formando parte del enunciado o las opciones de una pregunta de test. El hecho de que haya que distinguir una opción de otras se traduce en muchas ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se les pide recordar un dato que se diferencia de otros por ser el más frecuente, el más característico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o situaciones son los que hay que estudiar. 15 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma completa y fijándose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la resolución de la pregunta. La utilidad de las preguntas test es varia: Acostumbrarse a percibir errores de conceptos. Adaptarse a los exámenes de selección de personal. Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad. 1.3.7Envío Una vez estudiado el material docente, se contestará la encuesta de satisfacción, la cual nos ayudará para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya cumplimentado la evaluación, envíe las respuestas a la dirección indicada. 16 UNIDADDIDÁCTICAII SISTEMAINMUNE.INTRODUCCIÓN AutoinmunidadHumana 2.1IntroducciónSistemaInmune Los seres superiores están defendiendo constantemente su integridad biológica frente a agresiones, esencialmente externas. De no ser así, morirían como consecuencia de tumores e infecciones de bacterias, virus, hongos, etc. Para que estos fenómenos de defensa se lleven a cabo, los organismos disponen de un conjunto de elementos especiales, conocido como sistema inmune. La capacidad de defensa se adquiere antes de nacer y se madura y consolida en los primeros años de la vida fuera del seno materno. La inmunología es la ciencia que estudia los procesos moleculares y celulares implicados en la defensa de la integridad biológica del organismo a través de la identificación de las sustancias propias y detección de las sustancias extrañas y su destrucción. En cada organismo, los mecanismos de defensa son muy diversos y heterogéneos, aunque siempre existe una actuación integrada de todos ellos. Los mecanismos de defensa pueden ser de tipo inespecífico y específico. Los mecanismos inespecíficos están constituidos por las barreras naturales, tales como la piel, mucosas y otros que están protegiendo constantemente al individúo de contagios externos. Otros elementos naturales de actuación son la lisozima de la saliva, lágrimas y secreciones nasales que tienen capacidad de romper la unión de azúcares en las paredes bacterianas, lo que puede inducir su lisis. También entre estos mecanismos inespecíficos se encuentra la respuesta inmune inespecífica que están constituida fundamentalmente por los componentes de la respuesta inmune específica. Entendemos por respuesta inmune todos aquellos eventos desarrollados por el sistema inmune al objeto de defender la integridad biológica del individuo frente a cualquier agresión (estimulo antigénico). La respuesta inmune puede ser, pues, de tipo inespecífica o innata y específica. La respuesta inespecífica o innata es la primera barrera defensiva del organismo y no requiere sensibilización previa. La respuesta específica o adquirida se desarrolla solo frente a la sustancia extraña que indujo su iniciación y en ella participan prioritariamente los linfocitos y las sustancias liberadas por los mismos, Anticuerpos y citocinas. El sistema inmune se encuentra ubicado en los órganos linfoides y en su acción participan una serie de células, células inmunocompetentes, y moléculas, entre las que destacan las Inmunoglobulina, linfocinas y otras. Todas las sustancias que tienen la capacidad de estimular al sistema inmune, se conocen como antígenos y las partes del mismo que tienen capacidad inmunógena, se conocen como determinantes antigénicos o epítopos. Generalmente el sistema inmune responde de forma unitaria, por lo que la división en respuesta inespecífica y específica es más teórica que real. Lo que sí ocurre es que, dependiendo de las circunstancias, en unos casos predomina una u otra de estas modalidades de respuesta inmune. La Inmunología es una ciencia de gran amplitud que comprende diversas áreas: Inmunogenética, Inmunobiología, Inmunopatología o Inmunología clínica, Inmunofarmacología, Inmunología veterinaria, etc., todas ellas en continua expansión. 2.2RespuestaInmuneinespecífica La finalidad de la respuesta inmune tanto inespecífica como especifica es la defensa de la integridad biológica del individuo, actuando como un sistema de mantenimiento de la homeostasis del organismo, al igual que lo hace, por ejemplo, el sistema respiratorio o el sistema nervioso. La respuesta inespecífica forma parte de los mecanismos inespecíficos de defensa y representa el primer sistema defensivo del 19 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico organismo y es de especial significación frente a la protección del mismo ante infecciones y cáncer. Las células que mediatizan esta respuesta inespecífica, son los PMN neutrófilos, macrófagos y células NK que son células que se caracterizan por activarse de forma inmediata siempre que cualquier sustancia extraña penetra en el organismo, como, por ejemplo ocurre, tras una herida. En este caso todas estas células se movilizan a dicho foco, reconocen y toman contacto con la sustancia extraña, que destruyen mediante el proceso de fagocitosis y citotoxiciadad natural. En este tipo de respuesta participa también el complemento (C), que está formado por una gran variedad de proteínas que se encuentran en el plasma. Los distintos componentes del complemento interactúan en un determinado orden para ejercer su acción en la defensa del organismo. Probablemente la fagocitosis es el principal elemento que actúa en este tipo de respuesta. La fagocitosis se lleva a cabo en varias fases, aproximación, fagocitosis y lisis. Los mecanismos de defensa inespecíficos aportan un buen sistema de protección. Sin embargo, en muchas ocasiones no son suficientes para defender eficazmente al organismo, pero por fortuna éste dispone de la respuesta inmune específica. 2.3Respuestainmuneespecífica La respuesta inmune específica se caracteriza porque es efectiva ante aquellos antígenos frente a los cuales se ha iniciado y desarrollado. Este tipo de respuesta es mediada por linfocitos y otras células como células dendríticas, macrófagos etc. Los linfocitos son de dos tipos: linfocitos B y linfocitos T. Los linfocitos T, a su vez, pueden ser linfocitos T colaboradores (Th), linfocitos T citotóxicos (Tc) y por algunos autores también se han propuesto los linfocitos T supresores/reguladores (Ts). La respuesta inmune específica, se considera que puede ser de dos tipos: humoral y celular. Aunque la separación de ambos tipos de respuesta es mas de tipo didáctico que real, en general se considera que cuando los elementos implicados son los linfocitos B, se trata de una respuesta tipo humoral mientras que cuando participan prioritariamente los linfocitos T tanto colaboradores (Th) como citotóxicos (Tc), se trata de una respuesta tipo celular. 2.3.1Reconocimientodelantígeno Para que se inicie la respuesta inmune específica, se requiere el reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos y subsiguiente activación de los mismos. Los linfocitos B reconocen el antígeno mediante Inmunoglobulina de membrana (mIg) mientras que los linfocitos T lo reconocen mediante el receptor de linfocitos T (TCR). La activación de los linfocitos B conduce a la síntesis de Inmunoglobulina por los mismos mientras que cuando lo que se activan son los linfocitos Th o Tc su función prioritaria es la producción de linfocinas o la de lisar células respectivamente. Las Inmunoglobulina (Ig) son glicoproteínas formadas, al menos, por cuatro cadenas mientras que el receptor de los linfocitos T (TCR) es también una glicoproteína pero de solo dos cadenas. Ambos tipos de moléculas tienen la propiedad de reconocer y unirse al antígeno. Cada Inmunoglobulina tiene la propiedad de unirse específicamente al antígeno que indujo su formación. 2.3.2RespuestaInmuneCelular La respuesta inmune de tipo celular cubre una importante función como mecanismo inmunológico de defensa, actuando principalmente frente a virus, así como 20 AutoinmunidadHumana evitando la aparición y desarrollo de células tumorales. En ella participan esencialmente los linfocitos T colaboradores (Th) y citotóxicos (Tc). 2.3.3Presentacióndelantígeno Para que los linfocitos T, tal como se ha dicho anteriormente puedan reconocer el antígeno, éste debe ser debidamente presentado. Esta función se realiza por las células presentadoras de antígeno (APC) y sus determinantes antigénicos son expuestos en la superficie de estas células en el seno de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad son glicoproteínas presentes en las membranas de la mayoría las células nucleadas, entre las que se encuentran las células inmunocompetentes. Estas moléculas son esencialmente de dos tipos, tipo I y tipo II y tienen entre otras funciones las de presentar el antígeno a los linfocitos así como participar en el proceso de maduración de los linfocitos T en el timo. Las células presentadoras de antígeno (APC) tienen como misión captar, procesar proteolíticamente en el interior de estas células y después presentar el antígeno a los linfocitos T conjuntamente con las moléculas de histocompatibilidad. 2.3.4InteracciónCelular Para que la activación del Ag se lleve a cabo se requiere que previamente se haya producido la interacción entre las células presentadoras y las respondedoras. Este fenómeno se lleva a cabo prioritariamente por las moléculas de adhesión que son un grupo muy heterogéneo de sustancias que se encuentran en la superficie de las células presentadoras y respondedoras y que como se ha dicho hacen posible la adherencia entre ellas y en consecuencia permiten la unión entre el receptor de las células T y el complejo MHC-Ag de la APC. De igual manera, estas moléculas participan en todo tipo de interacción celular tanto en la respuesta celular como humoral. 2.3.5InmunomoduladoresdelaRespuestaInmune La respuesta inmune es regulada por moléculas conocidas como linfocinas, que son sustancias producidas por linfocitos en respuesta a una gran variedad de estímulos y que son capaces de regular el funcionamiento de otras células del sistema inmune. Las linfocinas actúan como señal complementaria facilitando la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos y en general de todas las células implicadas en la respuesta inmune. 2.3.6ActivaciónThyTc Aunque existen excepciones, la separación de las funciones de los linfocitos Th y Tc viene dada por el origen de los antígenos que reconocen. Los linfocitos Tc reconocen a los antígenos presentados en superficie por moléculas MHC de clase I, mientras que los linfocitos Th interaccionan con el antígeno en el contexto de moléculas MHC de clase II. Asociados a las dos cadenas polipeptídicas polimórficas que constituyen el TCR se encuentra un grupo de moléculas monomórficas de membrana llamado colectivamente CD3, formando así el complejo TCR/CD3 y que sabemos que es imprescindible para la transmisión de la señal del reconocimiento antigénico al interior celular. En consecuencia se desencadena una cascada de reacciones bioquímicas en el citoplasma de la célula T, dando así lugar al proceso de activación, proliferación y diferenciación celular. Estos mecanismos implican la participación de una serie de sustancias intracitoplasmáticas, conocidas como segundos mensajeros. Como consecuencia de estos eventos se producirá 21 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico finalmente la trascripción de los genes implicados en la síntesis de la proteína y factor implicado en una determinada función. La activación de las células Th es el núcleo central de la respuesta celular que a su vez actúa sobre, macrófagos, células NK y linfocitos Tc que adquieren entonces la capacidad de lisar las células que portan el antígeno que indujo su activación. 2.3.7RespuestaInmuneHumoral La ausencia de este tipo de respuesta deja al individuo tan indefenso frente a toda clase de gérmenes patógenos y otras agresiones, que es incompatible con la vida si no se instaura a tiempo un tratamiento adecuado. En la respuesta inmune humoral intervienen los linfocitos B, que como se ha dicho anteriormente reconocen al antígeno a través de las Inmunoglobulina de membrana. Sin embargo este estímulo no es suficiente para que se inicie y desarrolle la respuesta inmune humoral. Para ello es necesario que los linfocitos B, además del estímulo antigénico, reciban el estímulo de ciertas citocinas producidas por los linfocitos T colaboradores. Sólo cuando confluyen estos estímulos, el antigénico y el mediado por las citocinas, se produce la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos B hasta la formación de células memoria y células plasmáticas productoras de Inmunoglobulina, que serán el elemento efector final de la respuesta humoral. 2.3.8CaracterísticasRespuestaInmuneEspecífica La respuesta inmune específica se caracteriza por ser de carácter clonal, reconocer unos antígenos y no otros (especificidad), desarrollar memoria y ser auto regulable. 2.3.8.1Especificidad Se sabe que cada antígeno estimula solo a aquel linfocito o grupo de linfocitos que han desarrollado y en consecuencia poseen en su membrana los receptores capaces de reconocer y unirse específicamente a él. Estos receptores, tal como se ha indicado anteriormente, son las Inmunoglobulina de superficie cuando se trata de linfocitos B o el TCR cuando se trata de linfocitos T. 2.3.8.2Clonalidad Cuando un linfocito o grupo de linfocitos es activado, este prolifera y se diferencia en múltiples células derivadas, todas ellas con idénticos receptores de superficie. Se dice entonces que todas estas células constituyen lo que se denomina clon celular. Tanto la especificidad como la clonalidad de la respuesta inmune fueron originariamente definidos en los años cincuenta por varios inmunólogos entre los que se encontraba Burnet y se conoció después por la teoría de selección clonal de Burnet. Esta teoría decía que cada antígeno estimulará a aquel linfocito o grupo de linfocitos que poseen en su membrana receptores capaces de reconocer y unirse específicamente a él y que como consecuencia se producía su proliferación y diferenciación en células con las mismas características de reconocimiento que los linfocitos originales. Este carácter clona, le confiere a este tipo de respuesta el carácter de gran eficiencia en cuanto que cada individuo solo pone en marcha aquellos elementos, celulares y moleculares, que le son necesarios para una determinada acción. 22 AutoinmunidadHumana 2.3.8.3MemoriaInmunológica Otra característica importante de este tipo de repuesta es que el organismo mantiene memoria de un estímulo a otro cuando son de la misma índole. Eso se debe a la permanencia de linfocitos sensibilizados de larga vida después de un estímulo antigénico. 2.3.8.4Autorregulación Este tipo de respuesta dispone de mecanismos internos de control, de tal forma que la intensidad de la misma se regula por acción de diversos tipos de moléculas entre las que destacan las Inmunoglobulina y sobre todo las citocinas. 2.3.8.5Respuestaprimariaysecundaria. Cuando por primera vez un antígeno se pone en contacto con el organismo, se produce una respuesta inmune que se denomina respuesta primaria. Por el contrario, cuando al cabo de un tiempo el mismo antígeno vuelve a activar al sistema inmune, se produce una respuesta que denominamos respuesta secundaria o adaptativa. Ambas respuestas son, cualitativa y cuantitativamente, diferentes. Las diferencias esenciales son: - En la respuesta primaria los niveles máximos de Inmunoglobulina se alcanzan tras un largo período de latencia después del estímulo antigénico, mientras que en la respuesta secundaria se alcanza más rápidamente. - La respuesta primaria es de menor intensidad que la secundaria. - La respuesta primaria predomina la IgM, mientras que en la secundaria predomina la IgG. - La respuesta secundaria, al predominar en ella la IgG de vida media más larga que la IgM, es más permanente en su acción que la primera. Ello se debe a que cuando un antígeno activa por primera vez a los linfocitos B, éstos necesitan tiempo para diferenciarse en las células plasmáticas responsables de la síntesis de Inmunoglobulina, mientras que cuando se trata de la respuesta secundaria, gracias a la permanencia de las células memoria, se alcanza mucho antes el nivel de células plasmáticas. Resulta así, que la respuesta será de menos intensidad que tras un segundo estímulo en que ha aumentado el número de linfocitos sensibles gracias a la permanencia de células memoria con receptores idóneos para tal antígeno. Estos sistemas funcionan de forma secuencial, enviándose información entre ellos para una eficaz eliminación del patógeno. Así, una vez que entra el patógeno superando las barreras físico-químicas, se pone en funcionamiento el sistema inmune innato, con células y factores solubles que van a tratar de eliminarlos. Tras la activación de este sistema, es únicamente en los vertebrados donde puede ponerse en marcha el sistema inmune específico adaptativo, aunque coordinado con los componentes del sistema inmune innato. Como ejemplos de esta cooperación se encuentran el papel desempeñado por los macrófagos como células presentadoras de antígeno a los linfocitos T; los Anticuerpos IgM e IgG son capaces de activar el sistema del complemento por la vía clásica; o la citotoxicidad dependiente de Anticuerpo por parte de las células natural killer. 23 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 2.4Conceptodeantígenoyhapteno Se entiende por antígeno toda sustancia con capacidad para generar una respuesta inmune, esto es que posee capacidad de ser reconocida como extraña por el sistema inmune. Sabemos que prácticamente cualquier tipo de molécula biológica, incluyendo azúcares, lípidos, hormonas, metabolitos intermediarios, carbohi­dratos complejos, fosfolípidos, ácidos nucléicos y proteínas pueden ser antígenos. Si se quiere producir Anticuerpos contra pequeñas moléculas, éstas deben unirse antes de la inmunización a una macromolécula. En este sistema, la molécula pequeña recibe el nombre de determinantes antígenos. Los Anticuerpos frente a un antígeno se unen a sus grupos determinantes. Esta capacidad de unión antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac), es la característica más importante y común de todas las Inmunoglobulina. Esta unión es no covalente y débil, de tal forma que la reacción es reversible, encontrándose los antígenos y los Anticuerpos libres en equilibrio dinámico con los unidos. En general los antígenos son de mayor tamaño que la zona que participa en la unión con el Anticuerpo, de modo que un Anticuerpo solo se une a una zona muy restringida del antígeno. A esta zona del antígeno que participa en la unión con el Anticuerpo se le denomina epitopo o determinante antigénico. La mayoría de los antígenos poseen múltiples epítopos, con lo que pueden unir múltiples Anticuerpos a la vez siempre que los epítopos estén suficientemente alejados entre ellos para que no existan interferencias estéricas que lo impidan Clásicamente se llamaba antígeno a toda molécula capaz de generar un Anticuerpo. En la actualidad sin embargo, se considera antígeno a cualquier molécula capaz de unirse a un Anticuerpo independientemente de que pueda, por si sola, generarlo. Aquellas moléculas que además sean capaces de generar un Anticuerpo se les denomina inmunógenas. En este sentido existen moléculas demasiado pequeñas que llamamos haptenos, que para generar Anticuerpos necesitan ir unidas a moléculas más grandes llamadas carrier. Una vez que se han generado de este modo, Anticuerpos contra el hapteno, éste puede unirse a los Anticuerpos. El hapteno es por tanto, una molécula antigénica pero no inmunógena. Tras la unión antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac), las sustancias extrañas (o antígenos) son neutralizadas y posteriormente destruidas por las inmuno­globulinas a través de mecanismos, que pueden ser diferentes según el tipo de inmuno­globulina que participa. 2.5Inmunopatología Hay multitud de casos en los que los sistemas de defensa son en sí causa de enfermedad. Esto es, por ejemplo, lo que ocurre cuando el individuo reacciona incluso frente a sustancias que en principio son inocuas, como es el polen de plantas, etc. Entonces se habla de reacciones de hipersensibilidad. En otros casos, por razones todavía no muy bien conocidas, el sistema inmune reacciona frente a componentes propios, que destruye, ocasionando graves trastornos, o incluso la muerte. Se trata de enfermedades por auto inmunidad, que pueden presentarse frente al sistema nervioso central, frente a casi todas las glándulas endocrinas, frente a componentes musculares, etc. 24 AutoinmunidadHumana También a veces, las células encargadas de la defensa inmune, comienzan a proliferar en grandes cantidades, llegando a producir auténticos cánceres de células libres como son las leucemias, que incluso en tan sólo meses pueden terminar con la vida del individuo. La Inmunología, en consecuencia, debe estudiar no sólo el papel que tiene el sistema inmune en el mantenimiento de la salud sino tam­bién en la génesis y evolución de la enfermedad. 2.5.1AportacionesdelaInmunología La Inmunología ha contribuido de forma notoria al progreso de la ciencia actual, primero por aportaciones sobre bases empíricas y después sobre fundamentos sólidos, fruto del intenso esfuerzo desplegado en el estudio de los mecanismos de actuación del sistema inmune. Durante la fase empírica que podemos considerar anterior al comienzo del presente siglo, la inmunología ofreció la solución a uno de los grandes problemas que ha azotado a la humanidad, las pandemias. Ello fue posible gracias a Jenner quien a finales del siglo XVIII y a Pasteur quien a su vez a finales del siglo XIX, prepararon las vacunas de la viruela y de la rabia respectivamente. Posteriormente se desarrollarían, entre otras, las vacunas antitifoidea (1898), anticólera (1892) y antidiftérica (1913). Después, en lo que podríamos denominar fase científica, y debido a un mejor conocimiento de las bases biológicas y celulares del sistema inmune, la inmunología se ha desarrollado ampliamente, siendo una de las ciencias que más ha evolucionado en los últimos años. Hasta aproximadamente los años sesenta los aspectos inmunológicos conocidos aparecían, en el contexto de la Microbiología, como el sistema capaz de defender al organismo frente a las infecciones. Desde entonces, los continuos avances en el conocimiento de los mecanismos implicados en la respuesta inmune han dotado a esta disciplina de un sólido cuerpo de conocimientos. A este desarrollo han contribuido de manera especial la puesta a punto de técnicas modernas, tales como los cultivos celulares, obtención de líneas celulares puras e híbridos celulares, posibilidad de obtener animales trangénicos, disponibilidad de las técnicas de biología molecular tales como clonaje de genes, técnica de PCR, el uso del láser y la microscopía electrónica. En consecuencia, hoy día la Inmunología posee su propia contextura interna y puede ser firmemente considerada como ciencia independiente al tiempo que hace posible el desarrollo de otras áreas gracias a la aplicación de reactivos y técnicas puramente inmunológicas, adquiriendo así una amplia proyección en Medicina, Veterinaria, Biología, Bioquímica, Agronomía y Farmacia. En resumen, la Inmunología ha influido en las siguientes áreas: Enfermedades infecciosas. Haciendo posible la profilaxis de la mayoría de las enfermedades infecciosas mediante un progresivo y espectacular perfeccionamiento de las técnicas de vacunoterapia durante el presente siglo. Es de destacar a modo de ejemplo el descenso drástico que se observan en las tasas de morbilidad declaradas por poliomielitis, por sarampión o que la viruela ha sido completamente erradicada. Transfusiones sanguíneas. La Inmunología hizo posible el descubrimiento de los grupos sanguíneos y los Anticuerpos séricos frente a los mismos, gracias a lo cual se pueden realizar las transfusiones sanguíneas sin riesgo para el enfermo. 25 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Trasplantes de órganos. Haciendo posible la prevención del rechazo de muchos de los órganos trasplantados. Eso se ha debido a un perfeccionamiento de las técnicas quirúrgicas pero, sobre todo, al descubrimiento de los antígenos responsables del rechazo (antígenos de histocompatibilidad) y a un mejor conocimiento de los mecanismos inmunológicos responsables del rechazo del trasplante, que están permitiendo la utilización de modernas terapias inmunosupresoras de gran efectividad en la actualidad. Los avances más recientes indican que pronto será posible el trasplante de animales al hombre (xenotrasplante) con lo cual se podrá dar solución a la escasez de donaciones de órganos. Oncología. En donde la inmunología ha permitido un mejor conocimiento de la interrelación célula cancerosa-huésped. Estos conocimientos ya comienzan a repercutir en una mayor supervivencia de ciertos pacientes cancerosos y existen fundadas esperanzas de que en un futuro inmediato la inmunología pueda contribuir aún más, ofreciendo nuevas vías de solución a esta enfermedad. El descubrimiento reciente, por un lado, de oncogenes responsables de la malignización celular y, por otro, de los mediadores químicos de la respuesta inmune, entre los que cabe destacar las linfocinas y los interferones, ofrecen una amplia esperanza en la terapia de muchos cánceres y de sus metástasis. En la actualidad se encuentran en vía de ensayo varias vacunas terapéuticas con resultados verdaderamente alentadores. Inmunopatología. En donde el conocimiento del sistema funcional, ha hecho posible conocer la etiología y patogenia de una gran variedad de enfermedades surgidas por alteración del propio sistema inmune, tales como inmunodeficiencias, alergias, auto enfermedades, etc. Sin embargo, quedan problemas pendientes sin resolver, como es el reto que actualmente tiene planteada la Inmunología con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), de una extraordinaria capacidad expansiva y alta mortalidad, y frente al cual no se dispone de un remedio eficaz que elimine de manera definitiva el virus HIV. Métodos analíticos. Una gran variedad de métodos analíticos de gran precisión y sensibilidad se han desarrollado gracias a los conocimientos inmunológicos. Entre estas técnicas las más importantes que se pueden destacar son la inmunoelectroforésis, radioinmunoensayo, hemoaglutinación, etc. Hoy se puede considerar que, por ejemplo, la endocrinología moderna se ha podido desarrollar gracias a la aparición de un método, el radioinmunoensayo, capaz de medir los niveles de las distintas hormonas Biotecnología, industria y farmacia. Esto está siendo realmente posible gracias al extraordinario grado de cooperación existente entre los inmunólogos y científicos dedicados a la bioquímica, biología molecular, genética y farmacia, cuyos métodos como, por ejemplo, la tecnología del DNA recombinante, hibridaciones celulares, etc., están permitiendo la obtención de manera industrial, de sustancias y factores de gran interés farmacológico, entre los que podemos destacar, como mas sobresaliente, los Anticuerpos monoclonales (AcMo). Otras aportaciones. Además de lo indicado anteriormente, la inmunología ha contribuido a la solución de otros muchos problemas. Citemos, por ejemplo, la prevención de la eritroblastosis fetal en casos de incompatibilidad Rh entre la madre y el feto. Otra sensible y reciente aportación de la inmunología ha sido el esclarecimiento de la etiología de múltiples enfermedades, al descubrir una estrecha relación entre el padecimiento de las mismas y ciertos factores genéticos relacionados con el control del sistema inmune. También la inmunología ha aportado conocimientos y técnicas de gran utilidad en la 26 AutoinmunidadHumana Medicina Legal, alguna de cuyas áreas, como por ejemplo la identificación, se benefició ampliamente después del descubrimiento de los grupos sanguíneos y también durante la última década, gracias al descubrimiento de los antígenos de histocompatibilidad. La inmunología es una ciencia que actualmente se encuentra en pleno desarrollo, por lo que es de suponer que en el futuro siga aportando nuevos conocimientos para la solución de muchos de los problemas que tiene planteado la medicina y biología. 27 UNIDADDIDÁCTICAIII CÉLULASINMUNOCOMPETENTES AutoinmunidadHumana 3.1Introduccióncélulasinmunocompetentes La acción del sistema inmune es posible gracias a la participación e interrelación de diferentes poblaciones celulares, conocidas como células inmunocompetentes. Estas células son fundamentalmente los linfocitos T y B, las células NK, células dendríticas, macrófagos y polimorfonucleares, (ver tabla): TIPOS DE CÉLULAS INMUNOCOMPETENTES Y SUS FUNCIONES PRINCIPALES Célula Función B Producción de igs y presentación ag. Th Producción de linfocinas Tc Citotoxicidad NK Citotoxicidad y producción de linfocinas Macrófagos Fagocitosis y presentación de ag Dendríticas Presentación de antígenos Neutróficlos Fagocitosis Las células inmunocompetentes se encuentran distribuidas por toda la economía, como epitelios y mucosas, pero su concentración es máxima en los ganglios linfáticos y bazo. En estos tejidos se dan las condiciones óptimas para su estimulación antigénica gracias a que a ellos afluyen con facilidad las sustancias extrañas (antígenos) a través de los vasos linfáticos y es posible la interrelación celular, óptima para que se pueda iniciar y desarrollar la respuesta inmune. En este capítulo estudiaremos las características morfológicas y fenotípicas más importantes de estas células inmunocompetentes, así como también el sistema linfático, especialmente la estructura funcional de los ganglios linfáticos, bazo y timo. 3.2LinfocitosTyB Los linfocitos son células de tamaño pequeño con un núcleo muy voluminoso y provisto de una membrana citoplasmática de especial importancia en la regulación de su funcionalidad. Estas células se dividen en linfocitos T y linfocitos B. Ambos tipos de linfocitos al igual que todas las células sanguíneas derivan de una célula progenitora pluripotencial que en el feto se encuentra en el hígado y después del nacimiento en la médula ósea. A esta célula precursora común se le denomina CFU-LH o Unidad formadora de colonias linfoides y hematopoyéticas. Posteriormente esta célula se diferenciará para dar lugar, por un lado, a la célula madre hematopoyética pluripotencial (CFU-GMEM) para 31 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico las series eritrocítica, granulo­cítico-macrofágica y megacariocítica. Por otro lado, dará lugar a una célula progenitora unipotencial (CFU-L), específica para la serie linfoide. Cada una de estas células progenitoras continuará diferenciándose hacia otras células inmaduras, originándose así las CFU-E (precursor eritrocítico), CFU-GM (precursor mielomonocítico) y CFU-Meg (precursor megacariocítico) a partir de la célula precursora hematopoyética. De la célula madre linfoidea derivarán dos células precurso­ras, CFU-T y CFU-B, que tras un proceso de maduración, conocido como linfopoyesis, originarán los linfocitos T y B respectivamen­te. En sangre periférica la proporción de linfocitos T es aproxi­madamente de un 70% mientras que la proporción de linfocitos B es de un 15%. En la imagen siguiente se muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido de un linfocito B (a) y un linfocito T (b) donde pueden observarse las diferencias en su superficie. Existen otras células de estirpe linfoide que no presentan características de linfocitos T ni B, denominadas células NK que poseen actividad citotóxica y secretora de ciertas citocinas. 3.2.1Linfopoyesis En los mamíferos, y entre ellos el hombre, Las células pluripotentes, se diferencian y transforman en células también inmaduras estos procesos se realizan en el timo (linfocitos T) y en la propia médula ósea (linfocitos B). 3.2.1.1LinfopoyesisT El timo es un órgano situado en la parte superior del mediastino anterior, donde maduran los linfocitos T. El timo presenta su máximo desarrollo en el feto y en el niño, mientras que a partir de los 10-12 años comienza un proceso atrófico y degenerativo con gran invasión grasa, de tal forma que en el adulto sólo quedan residuos del mismo. 32 AutoinmunidadHumana Los precursores de los linfocitos T, durante el proceso de maduración intratímica, reciben el nombre de timocitos. Durante esta fase mueren muchos timocitos, aproximadamente el 95 por 100 de ellos, debido a que se eliminan aquellos que reconocen los antígenos propios del organismo. El resto de las células abandonan el timo, vía sanguínea, como linfocitos T maduros. Estos linfocitos colonizan los órganos linfoideos secundarios, situándose en la zona paracortical de los ganglios linfáticos y vainas paracorticales linfocíticas del bazo. Se han identificado algunos factores de transcripción que son imprescindibles para la diferenciación de los linfocitos a lo largo de la linfopoyesis. En el timo se han identificado células precursoras que poseen capacidad de generar células T, NK, B y células dendríticas del timo, y a lo largo de su diferenciación los precursores mas evolucionados van perdiendo paulatinamente la capacidad de generar células B, NK y células dendríticas en este orden. Durante el proceso de maduración intratímico, los timocitos adquieren una serie de moléculas nuevas en su superficie. Estas moléculas van apareciendo secuencialmente en los diferentes estadíos de maduración intratímica así como, en general, en todos los procesos de maduración y diferenciación hematopoyéticos. Se les denomina marcadores de diferenciación hematopoyética ya que son propios de los diferentes estadíos madurativos y pueden ser utilizados para definirlos. Se denominan con las siglas CD (cluster of differentiation o grupo de diferenciación) seguido de un número ordinal. La CFU-T, no expresa todavía en su superficie ninguna de los marcadores de los linfocitos T. Posteriormente estas células, ya en el timo, maduran distinguiéndose varios estados diferenciativos con la presencia de diferentes marcadores de superficie. Así en los timocitos inmaduros aparecen los marcadores CD7 y CD2, añadiéndose en un estadio posterior de maduración (timocito común), el marcador CD1. Ya en el timo va a ocurrir una especialización funcional, distinguiéndose dos subpoblaciones de timocitos maduros: Una es aquella que expresa en su superficie el marcador CD4 y que será el precursor inmediato de los linfocitos T colaboradores que aparecen en sangre periférica. La otra expresa en la superficie el marcador CD8 y dará origen a los linfocitos T citotóxicos/supresores circulantes. En ambas subpoblaciones se pierde la expresión de la molécula CD1 (Figura). En la Tabla se muestran algunos de los marcadores de diferenciación de las células linfoides de estirpe T. 33 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Marcadores propios de las células de estirpe linfocitaria T Marcador Pm (daltons) Función CD7 40.000 Activación células T con TCR CD2 50.000 Receptor para CD58 o LFA-3 y adhesión celular CD5 67.000 Ligando para CD72 CD1 a, b, c 45.000 Asociado a β-2-microglobulina CD3 γ25.000 Asociado al TCR y transmisión señal activación δ20.000 ε20.000 55.000 CD4 α34.000 Unión al MHC- II en el fenómeno de presentación Ag CD8 β34.000 Unión al MHC- I en el fenómeno de presentación Ag CD44 80.000 Modulación de la apoptosis de linfocitos T. CD27 55.000 Señal coestimuladora para activación linfocitos T Los timocitos más inmaduros no expresan CD3, CD4 ni CD8, por lo que son conocidos como células triples negativas. A medida que van madurando, en estas células se produce la reorganización del TCR, la expresión del complejo CD3 y de las moléculas CD4 y CD8 conjuntamente (células dobles positivas), para después perder una u otra quedando bien como CD4-CD+ o como CD+CD8-. En el proceso de diferenciación de los timocitos a linfo­citos maduros se destruyen gran número de células, tal como se ha indicado con anterioridad. Esto se debe a un proceso de selección tímica que se realiza en dos fases y está condicionado por el grado de afinidad del TCR con las moléculas del MHC de las células epiteliales del timo. En una de las fases tanto los timocitos CD4-CD8+ como CD8-CD4+ se seleccionan positivamente, es decir, solo aquellos timocitos que poseen capacidad de reconocer las moléculas del MHC presentes en las células epiteliales del timo se van a diferenciar y crecer mientras que el resto mueren. Por el contrario, en el proceso de selección negativa se destruyen los timocitos que ahora poseen la capacidad de reconocer las moléculas del MHC presentes en el timo, con lo que se eliminan los clones celulares autorreactivos. No se conoce bien cuando se efectúa uno u otro proceso, aunque todo parece indicar que se relaciona con la afinidad del TCR de los timocitos con las moléculas del MHC, de tal manera que cuando la afinidad es alta se efectuaría una selección negativa, mien­tras que cuando es baja la selección sería positiva. 3.2.1.2LinfopoyesisB En los mamíferos la maduración de los linfocitos B se realiza en la médula ósea. El proceso de diferenciación conducente a la formación de linfocitos B es independiente de todo estímulo antigénico y se regula por factores presentes en el microambiente de los órganos linfoideos primarios. Durante el proceso de maduración de los linfocitos B, a partir de la célula progenitora (CFU-B), se distinguen varios estadios de diferenciación, que incluyen las células pre-pre-B, las células pre-B, células B inmaduras y linfocitos B maduros. En cada uno de estos estadíos de maduración las células expresan distintas moléculas en la superficie, utilizadas como marcadores de diferenciación. 34 AutoinmunidadHumana En la Tabla siguiente se detallan los pesos moleculares y función de algunos marcadores de diferenciación de las células B, que están siendo utilizados para estudiar y clasificar las enfermedades originadas por alteraciones en el proceso de diferenciación linfocítica B (leucemias y linfomas). Marcadores diferenciación de linfocitos B CD Pm (daltons) Función reguladora CD19 95.000 Proliferación cel. B CD20 35.000 Activación cel. B CD24 35.000 Diferenciación cel. B CD10 100.000 Endopeptidasa CD21 130.000 Receptor de C3d/EBV CD22 145.000 Ligando de CD45Ro CD37 45.000 Desconocida CD40 50.000 Activación/diferenciación Ya en las células pre-B se detecta la presencia de cadena pesada m intracitoplasmática, adquiriéndose en la siguiente fase madurativa la capacidad de sintetizar las cadenas ligeras y pesadas de las Inmunoglobulina IgM e IgD, detectables en la superficie celular. En consecuencia, la mayoría de los linfocitos B expresan estos dos tipos de Inmunoglobulina en su superficie. Posteriormente estos linfocitos, mediante un proceso de reordenamiento génico, se especializarán en la producción de una sola clase de las Inmunoglobulina IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. 3.2.2LinfocitosB Morfológicamente los linfocitos B son indistinguibles de los linfocitos T. Sin embargo, es posible establecer diferencias de tipo molecular que justifican su distinta función (Tabla). La característica más importante de los linfocitos B, por contribuir a su actividad funcional, es el hecho de que poseen Inmunoglobulina unidas a su membrana citoplasmática. Estas Inmunoglobulina son los receptores específicos para los antígenos, de tal forma que cuando se realiza la unión del antígeno a la Inmunoglobulina de superficie, se va a producir la activación del linfocito B y su posterior transformación en célula plasmática. Éstas, son células más grandes que los linfocitos, muy ricas en retículo endoplásmico, y especializadas en la síntesis y secreción de grandes cantidades de Inmunoglobulina. También los linfocitos B poseen receptores para mitógenos y para el virus Epstein-Barr (EBV). Precisamente el tratamiento de linfocitos con EBV es el procedimiento de elección para la prepa­ración de líneas celulares de tipo B (inmortalización de una población celular) de gran utilidad en la actualidad para el estudio de estas células. El receptor que utiliza el EBV en la superficie del linfocito B es el mismo receptor que la fracción C3d del sistema del complemento o CD21. 35 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Algunas características diferenciales de las células de estirpe linfocítica Marcador B T NK CD2 (Receptor de LFA-3) CD3 (Asociado a TCR) CD19 CD16 CD56 (N-CAM) CD11b (Recep. C3bi) CD11a (LFA-1) Ig de superficie HLA-clase I HLA-clase II +++ -++++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ ++ +++ +++ - 3.2.3 LinfocitosT Los linfocitos T son una población celular muy heterogénea formada por, al menos, tres tipos diferentes de células. Entre los marcadores de diferenciación que definen los linfocitos cabe destacar el marcador CD2 que actúa de receptor para la molécula LFA-3, fundamental para la unión entre el linfocito y la célula diana. En la Figura 2.2b se muestra una imagen de un linfocito T al microscopio electrónico de barrido. Los linfocitos T poseen receptores específicos para los antígenos. Estas moléculas conocidas como receptores T o TCR, han sido identificadas, utilizando tecnología de DNA recombinante, resultando ser altamente polimórficas y de gran importan­cia funcional. Estructuralmente constan de dos cadenas glicoproteícas ancladas en las membranas celulares y unidas por puentes disulfuro. El receptor T se encuentra asociado estrechamente en la superficie celular al complejo molecular CD3. 3.2.3.1TiposdelinfocitosT No todos los linfocitos T son idénticos entre sí. Analizando las características funcionales de los linfocitos T, se observan al menos tres comportamientos muy distintos entre sí que deben basarse en diferencias moleculares y estructurales de estas células. Los tres tipos de linfocitos T funcionalmente distintos son: Células T de colaboración (T helper cells). Células T citotóxicas (T cytotoxic cells). Células T supresoras/reguladoras (T suppressor cells) Células T de colaboración (Th) Esta subclase de linfocitos T participa de forma importante en la iniciación y desarrollo de la respuesta inmune, tanto humoral como celular, debido a su capacidad de producción de linfocinas, entre las que destacan la interleucina-2 (IL-2), la interleucina-4 (IL-4) y interferón gamma. Fenotípicamente, la característica esencial de esta subpoblación linfocitaria viene definida por la presencia de la molé­cula CD4 en la superficie celular. Esta molécula es de gran importancia funcional y también se utiliza para la cuantificación de esta subpoblación. Se distinguen dos poblaciones diferentes de estas células, Th1 y Th2. La Th1 produce IL-2 e intererón gamma mientras que la Th2 produce IL-4, 5y 6. 36 AutoinmunidadHumana Células T citotóxicas (Tc). Una vez activada esta subclase de linfocitos T, adquiere capacidad citotóxica, siendo, por tanto, los principales responsables de los fenómenos de citotoxicidad de la respuesta inmune celular. Estas células se caracterizan por expresar el marcador CD8 y, al igual que lo hacen los linfocitos Th, el com­plejo TCR-CD3 y otras moléculas importantes funcionalmente tales como CD2 y LFA-1. Células T supresoras (Ts) y/o reguladoras. Estos tipos de células poseen acción reguladora de la respuesta inmune. La regulación de la actividad del sistema inmune es de gran importancia en todo el comportamiento del mismo y, sobre todo, en el desarrollo de tolerancia frente a los componentes propios del organismo. Estas células expresan en su membrana moléculas CD8 al igual que lo hacen los linfocitos T citotóxicos y su mecanismo de acción no solo no es muy bien conocido en la actualidad sino que también la propia presencia de estas células se está cuestionando. 3.3Célulasasesinasnaturales(NK) En la década de los años 70 Herberman observó que los linfocitos obtenidos de individuos sanos eran capaces de destruir células tumorales sin que existiera sensibilización previa. La citotoxicidad mediada por estas células se denominó citotoxicidad natural, y a las células encargadas de desarrollar esta actividad se las denominó Natural Killer (NK) o células asesinas naturales. Estas células representan aproximadamente el 10% de las células mononucleares de sangre periférica y fenotípicamente no poseen marcadores ni de los linfocitos T ni de los linfocitos B y corresponden con un tercer tipo de células linfoides conocido anteriormente como linfocitos nulos o tercera población. Desde el punto de vista morfológico la mayoría de las células con actividad NK corresponden con los linfocitos granulares grandes (LGL) por su gran tamaño y la presencia de abundantes gránulos citoplasmáticos. Aunque hoy se sabe que los linfocitos pequeños también pueden desarrollar esta acción citotóxica. Las células NK se definen como linfocitos que no reorganizan los genes de las Inmunoglobulina ni tampoco los del TCR y que, por tanto, no expresan sus productos así como tampoco el complejo CD3 completo. Por el contrario, expresan en su superficie las moléculas CD16 y CD56 y para su acción citolítica no requieren la expresión de moléculas del MHC en la célula diana. Estas células son responsables de la citotoxicidad celulomediada dependiente de Anticuerpos (ADCC), es decir, destruyen células con antígenos extraños en su superficie frente a los que se han producido Anticuerpos. 37 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Las células NK contribuyen a la defensa frente a células infectadas por virus, bacterias, hongos y parásitos. Pero la principal actividad de la célula NK es su capacidad de actuar frente al crecimiento de células tumorales impidiendo su expansión y la formación de metástasis. El síndrome de Shediack-Higashi es una deficiencia selectiva de actividad NK y cursa con una alta incidencia de tumores. Las células NK derivan de células hematopoyéticas stem cell presentes en el hígado fetal o en médula ósea del adulto. Su proceso de maduración se efectúa fuera del timo en órganos lin­foides periféricos, desconociéndose los procesos requeridos para que esta diferenciación se produzca, y el órgano donde se des­arrolla. Esto explica que no se afecten sustancialmente los niveles de células NK en animales atímicos y en inmunodeficiencia severa combinada observada tanto en animales como el hombre. También las células NK podrían derivar directamente, de las células doble negativas que sabemos son también CD16 positivas que se encuentran en el timo y que son precursoras de las células T. 3.4Célulasmielomonocíticas Las células inmunocompetentes de estirpe mielomonocítica son los macrófagos y los granulocitos. Ambos tipos de células proceden de un precursor común, la CFU-GM o Unidad formadora de colonias granulocítico-macrofágicas, de la médula ósea. Esta célula progenitora, mediante un proceso de diferenciación, dará lugar a dos series de células sanguíneas: a) La serie mieloide, cuyo último eslabón madurativo son los granulocitos. b) La serie monocítica, cuyo elemento diferenciativo final lo constituyen los macrófagos. El proceso de diferenciación y maduración de las células monocíticas en médula ósea se denomina monopoyesis y al proceso de formación y maduración de las células mieloides se le conoce como mielopoyesis, 3.4.1Monopoyesis Durante el proceso de maduración de los macrófagos, a partir de la célula progenitora (CFU-GM) de médula ósea, se distinguen varios estadíos diferenciativos, que incluyen los monoblastos, promonocitos, monocitos y macrófagos. En cada uno de estos estadíos de maduración las células expresan distintas moléculas en su superficie, cuya función, en la mayoría de los casos, es aún desconocida. Las mejor caracterizadas son las moléculas CD16 y CD11b que, como ya hemos indicado, actúan como receptores para el extremo Fc de la IgG y para la fracción C3bi del complemento respectivamente. 38 AutoinmunidadHumana En la Tabla se detallan algunas características de estos marcadores, muchos de los cuales están siendo utilizados para clasificar las leucemias de estirpe monocítica. Marcadores de células mielopoyéticas CD Pm* Función CD33 67 Desconocida CD34 120 Desconocida CD35 190 Receptor C3b CD14 55 Receptor LPS/LBP CD15 - Adhesión neutrófilos CD16 50 Receptor FcgIII CD11a 180 Adhesión celular CD11b 160 Receptor C3bi CD13 150 *103 dalton 3.4.2Mielopoyesis El proceso de diferenciación de los granulocitos en médula ósea incluye varios estadíos madurativos: mieloblasto, promielocito, mielocito, metamielocito y granulocito. En cada uno de estos eslabones diferenciativos las células mieloides expresan distintas moléculas de superficie. Los marcadores de diferenciación son compartidos, en su mayoría, con células de la serie monocítica ya que, como hemos indicado anteriormente, ambas estirpes celulares tienen un origen común. En la Tabla se resumen algunas de las características diferenciales de los macrófagos y granulocitos. Se observa que los granulocitos carecen de la propiedad de sintetizar interleucina 1 y además no poseen la molécula CD14 ni los antígenos de histocompatibilidad clase II. Algunas características diferencialesde las células de estirpe mielomonocítica Características Macrófago Granulocito Fagocitosis +++ +++ Producción de Il-1 +++ - Recep. FcgII(CD16) + +++ Recep. C3bi (CD11b) +++ + Receptor Il-2 +++ - CD14 +++ - CD17 + +++ HLA- clase I +++ +++ HLA- clase II +++ - 39 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 3.4.2.1Macrófagos La denominación de macrófagos engloba, en realidad, a una serie de células con características ligeramente distintas y con funciones similares, distribuidas en varios lugares del organismo. Así, los macrófagos van a recibir diferentes denominaciones según los diferentes tejidos donde se encuentren (Tabla). A este conjunto de células hísticas, se le da la denominación genérica de sistema retículo endotelial o sistema mononuclear fagocítico. Denominación macrófagos según su localización Localización Denominación Sangre Monocitos Tejido conectivo Histiocitos Hígado Células de kupffer Pulmón Macrófagos Hueso Osteoclastos Sistema nervioso Células microglía Cavidad peritoneal Macrófagos peritoneales Los macrófagos son células grandes con un solo núcleo, un aparato de Golgi muy desarrollado, gran cantidad de lisosomas y muy ricos en enzimas de diferentes tipos, entre los que destacan proteasas, peroxidasas y lipasas. Estas células poseen, además de la capacidad fagocítica ya indicada, capacidad de adherencia a los tejidos, al vidrio y al plástico, así como una gran movilidad en estas superficies (quimiotaxis). Los macrófagos tienen una vida media de varios meses. Poseen también gran actividad meta­bólica, sobre todo en lo que se refiere a síntesis de proteínas, incluso cuando se encuentran en reposo. Los macrófagos poseen en su membrana una serie de receptores de gran importancia funcional, como son los receptores para la fracción Fc de la IgG, receptores para las fracciones C3bi y C3b del complemento que se conocen como CD-11b y CD-35 y los receptores para interleucinas e interferones, todos ellos, de gran interés en la iniciación de la respuesta inmune. 3.4.2.2Granulocitos El otro grupo de células, los granulocitos neutrófilos, se caracterizan por poseer una vida muy corta (vida media de menos de 48 horas) por lo que se encuentran en continua renovación, para mantener los niveles sanguíneos. Son células de gran tamaño cuya característica más llamativa es la segmentación del núcleo en varios lóbulos. Se les denomina también polimorfonucleares neutrófilos. En la sangre estas células se encuentran en período de tránsito hacia los tejidos, donde esencialmente ejercen sus funciones, al igual que ocurre con los otros tipos de polimorfonucleares: eosinófilos y basófilos. 3.4.2.3Otrascélulas Además de las células tratadas hasta el momento, hay otras células que pueden intervenir como células inmunocompetentes. Estas son los eosinófilos, basófilos, células cebadas, células dendríticas y células de Langerham. 40 AutoinmunidadHumana Las células dendríticas, son de gran importancia en la presentación antigénica a los linfocitos y se encuentran en los ganglios linfáticos y en el bazo. Fenotípicamente estas células se caracterizan por poseer en su membrana una gran densidad de moléculas de histocompatibilidad de clase II. Las células de Langerham de la epidermis, cuya característica morfológica más llamativa es la presencia de gránulos en raqueta de tenis denominados gránulos de Birbeck, también son ricas en antígenos MHC-clase II. Su misión es captar y transportar los antígenos extraños hasta los ganglios linfáticos de la proximidad, a través de los vasos linfáticos. Durante su paso por los vasos linfáticos estas células se adaptan y cambian de morfo­logía denominándoselas células a vela. Una vez en el ganglio linfático las células a vela se introducen en la paracorteza que es el área de las células T, se interdigitan y presentan el antígeno a los linfocitos T. Ahora estas células presentadoras reciben la denominación de células interdigitadas reticulares por su particular disposición en los ganglios. 3.4.2.4AntígenosdeDiferenciación En la membrana plasmática de los linfocitos se han podido identificar múltiples moléculas, gracias al empleo de la tecnología de los Anticuerpos monoclonales (AcMo). A estos antígenos y se les denominan antígenos de diferenciación. La celebración periódica de talleres (workshops) internacionales, donde los investigadores remiten sus AcMo para la realización de estudios multicéntricos, ha propiciado la progresiva sistematización de la abundante información obtenida. Estos se adscriben, según su especificidad, a grupos de diferenciación conocidos como CD ó clusters of differentiation, cada uno de los cuales incluye a todos aquellos AcMo que reconocen una misma molécula o, en casos excepcionales, un complejo molecular (ej. CD3). Los antígenos de diferenciación leucocitaria son estructuras cuya distribución no está necesariamente restringida a estos tipos celulares; no obstante, algunos pueden llegar a constituir, por su patrón selectivo de expresión, marcadores de diferentes propiedades de la célula, tales como: la estirpe de diferenciación a la que pertenece, su estadio madurativo, el estado de activación metabólica o, incluso, su especialización funcional. La secuencia habitual seguida en la caracterización de un antígeno de diferenciación se inicia con el análisis de su distribución celular y tisular, habitualmente realizado por técnicas de inmunofluorescencia, combinadas con la citometría de flujo, y métodos inmunohistoquímicos. El aislamiento para su análisis electroforético se realiza por medio de técnicas de inmunoprecipitación, a partir de lisado de células radiomarcadas, que permiten valorar algunas de las principales características bioquímicas tales como su masa relativa (Mr), punto isoeléctrico (pI), la presencia de uniones covalentes intercatenarias, y determinadas modificaciones postraduccionales (ej. glicosilación, fosforilación), así como explorar el proceso de biosíntesis. 3.5DistribucióndelasCélulasInmunocompetentes Las células que componen el sistema linfoide se agrupan formando órganos discretamente encapsulados o bien acúmulos difusos de tejido linfoide. Los órganos linfoides contienen linfocitos en estado variable evolutivo y se clasifican en primarios (órganos centrales) y en secundarios (órganos periféricos). 41 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Los órganos linfoides primarios constituyen el principal origen de la linfopoyesis, es decir, donde los linfocitos se diferencian a partir de células madre linfoides y proliferan y maduran hacia células con capacidad efectora. En mamíferos, incluyendo al hombre, los linfocitos T son producidos en el timo, mientras que los linfocitos B se producen en el hígado fetal y en la médula ósea fetal y adulta. En los órganos linfoides primarios, los linfocitos adquieren sus receptores antigénicos específicos, y también aprenden a discriminar entre autoantígenos, que serán tolerados y antígenos extraños que serán atacados. Los órganos linfoides secundarios que incluyen bazo, ganglios linfáticos y MALT (mucosal associated lymphoid tissue) (amígdalas, placas de Peyer del intestino y cúmulos linfoides del tracto urogenital), proporcionan el medio en el que las células implicadas (macrófagos, células presentadoras de antígeno, linfo­citos T y B) pueden interaccionar entre sí y con el antígeno. 3.5.1Órganoslinfoidesprimarios 3.5.1.1Timo Es un órgano linfoepitelial de forma bilobulada situado en posición retroesternal sobre la cara anterior del pericardio. Deriva de un esbozo epitelial formado a partir de la tercera y cuarta bolsas faríngeas, de aparición muy temprana en el embrión. En el hombre su estructura aparece completamente desarrollada en el tercer mes de gestación. El parénquima tímico está constituido por una malla de células epiteliales rellena de células linfoides (denominadas timocitos) y se organiza formando lobulillos tabicados por trabéculas conjuntivas. Dentro de cada lobulillo se puede distinguir una zona externa o corteza, que contiene la gran mayoría de los timocitos, y una zona interna o medular que es pobre en timocitos. El estroma del timo está constituido fundamentalmente por la malla de células epiteliales que adoptan diferentes formas. En la médula se hallan también células dendríticas interdigitadas, derivadas de la médula ósea, que son células presentadoras de antígeno. En la unión corticomedular se hallan también macrófagos. En la médula existen, además, unas estructuras denominadas corpúsculos de Hassal forma­dos por células epiteliales y macrófagos dispuestos de forma concéntrica. Las células epiteliales del timo, tanto de la corte­za como de la médula, expresan una gran riqueza en moléculas del MHC clase II, imprescindibles para el reconocimiento de autoantígenos por los linfocitos T. Los islotes de tejido linfoide en el hígado fetal y en la médula ósea fetal y adulta se ocupan de la producción de linfocitos B. 42 AutoinmunidadHumana 3.5.2Órganoslinfoidessecundarios. 3.5.2.1Bazo Se trata de un órgano situado en el hipocondrio izquierdo, detrás del estómago y cerca del diafragma. Su superficie externa se compone de una cápsula fibrosa con algunas fibras musculares lisas y penetra profundamente en el parénquima del órgano. Básicamente, en el bazo se distingue la pulpa roja que es un reservorio vascular para hematíes y la pulpa blanca que contiene el tejido linfoide, el cual se dispone alrededor de una arteriola central, presentando áreas T y B. Las células T se disponen más próximas y alrededor de la arteriola central, mientras las células B se disponen exteriores a la misma. También son frecuentes las células reticulares dendríticas y macrófagos en el centro germinal, así como macrófagos especializados en la zona marginal (área que rodea a los folículos linfoides) que junto a las células foliculares dendríticas de los folículos primarios (folículos no estimulados sin centro claro germinal) se ocupan de la presentación del antígeno al linfocito B. 43 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 3.5.2.2Ganglioslinfáticos Conforman junto a los vasos linfáticos una compleja red corporal cuya función es filtrar los antígenos procedentes del espacio extracelular y la linfa durante su circulación desde la periferia hasta el ducto torácico. Los ganglios linfáticos, en el humano, son redondeados u ovoides y presentan un hilio donde los vasos sanguíneos entran y salen respectivamente. Básicamente, se distingue un área B denominada córtex, un área T denominada paracórtex y un área medular central. El paracórtex, contiene linfocitos T y abundantes células presentadoras de antígeno (células interdigitantes o histiocitos de la zona T) quienes presentan abundantes antígenos MHC clase II en superficie. La zona medular presenta algunos cordones linfoides separados por espacios vasculares (senos medulares) que contienen la mayor parte de las células plasmáticas y los macró­fagos sinusales de los ganglios linfáticos. El córtex contiene agregados de linfocitos B dispuestos formando folículos primarios y secundarios. Los folículos primarios son primor­diales sin centro claro germinal (anteriores al estímulo antigé­nico) y los folículos secundarios poseen claros centros germinales (tras el estímulo antigénico). Estos últimos contienen además células presenta­doras de antígeno y algunos macrófagos, linfocitos T, y células NK, quienes junto a los macrófagos sinusales parecen jugar un papel en el desarrollo de la respuesta de las células B, como su adquisición de memoria; esta parece ser la función primordial de los centros germinales. 44 AutoinmunidadHumana 3.5.2.3Tejidolinfoideasociadoamucosas(MALT) Acúmulos dispersos de tejido linfoide no encapsulado se observan frecuentemente en diversos órganos, particularmente en áreas submucosas gastrointestinales, respiratorias y urogenitales. Los elementos linfoides se encuentran formando agregados difusos u organizados formando folículos con centro claro germinal. En el tracto intestinal, se observan elementos linfoides difusos en la submucosa del órgano, y formando folículos linfoides con centro germinal en las denominadas placas de Peyer. El epitelio que reviste las placas de Peyer transporta el antígeno y en sentido inverso, la IgA secretora producida por las células plasmáticas muy abundantes en el epitelio. En el hombre, además se encuentra abundante tejido linfoide con centros germinales en las amígdalas faríngeas y también en paredes bronquiales y a lo largo del tracto urogenital. 3.5.2.4Circulaciónlinfocitaria Una vez que los linfocitos B y T abandonan los órganos primarios, pasan al torrente circulatorio, a través del cual circulan por el organismo. A los tejidos llegan a través del torrente sanguíneo, siendo recogidas por los vasos periféricos del sistema linfático que las conduce a los distintos ganglios linfoideos, de donde pueden de nuevo volver a la sangre y a los diferentes tejidos o almacenarse en el bazo. En la Tabla se recoge la proporción de leucocitos en sangre. Leucocitos en sangre Tipo % Neutrófilos 40-75 Eosinófilos 5 Basófilos 0.5 Linfociotos 20-50 Monocitos 1-5 45 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico De esta forma el contacto de los linfocitos con los antígenos se puede establecer en el organismo a nivel de los diferentes tejidos, sistema linfático, bazo y sangre, aunque es fundamentalmente a nivel de los ganglios y el bazo donde se puede desarrollar una respuesta inmune, ejerciendo una acción, bien local en ganglios y bazo, o bien general, dado que los elementos efectores (las Inmunoglobulina y linfocitos activados) pueden ser distribuidos por toda la economía a través del sistema circulatorio y linfático. 46 UNIDADDIDÁCTICAIV INMUNOGLOBULINA AutoinmunidadHumana 4.1introducciónInmunoglobulina A finales del siglo XIX, Von Behring observó que los sueros de animales que habían padecido difteria contenían sustancias que neutralizaban el efecto de la toxina diftérica. A estas sustancias, que se caracterizaban por ser termolábiles y no dializables, se les denominó Anticuerpos, debido a su capacidad de reconocer a las toxinas bacterianas. En 1937 Tiselius descubre la electroforesis y aplica este nuevo método al fraccionamiento de proteínas plasmáticas, identificando así los Anticuerpos como las proteínas del suero que se desplazan más lentamente. Esta fracción recibió el nombre de g-globulina, quedando así asociados temporalmente, los conceptos de Anticuerpo y de gglobulina, como equivalentes.Posteriormente, se comprueba que no todos los Anticuerpos migran electroforéticamente con las g-globulinas, sino que muchos de ellos lo hacen con las a y b globulinas. Esto se observó analizando los niveles de las distintas fracciones de globulinas antes y después de la inmunización de animales con un antígeno. Se concluye entonces, que no todos los Anticuerpos son gammaglobulinas, por lo que Hebermans propone el término de Inmunoglobulina para designar a todas las sustancias con capacidad de Anticuerpo. Hoy se conocen cinco tipos de Inmunoglobulina: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, cada una de ellas con ciertas características distintas. Algunas características bioquímicas de las Inmunoglobulina Clase PM Coeficiente* sedimentación Velocidad síntesis** Vida media (días) (%) Contenido carbohidratos IgG 150.000 6,5 28 30 2,5 IgA 160.000 7,7 10 8 10 IgM 900.000 19 7 10 11 IgD 180.000 7 0,016 0,4 10 IgE 280.000 8 0,0005 --- 10 *(S),Unidad svedberg ** (mg/Kg/día) 49 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 4.2EstructuradelasInmunoglobulina Las Inmunoglobulina son glicoproteínas que, según ya indicó Porter en 1959, están formadas por cadenas polipeptídicas agrupadas, dependiendo del tipo de Inmunoglobulina, en una o varias unidades estructurales básicas. 4.2.1Unidadestructuralbásica Cada unidad está compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas unidas entre sí por puentes disulfuro y otras uniones de tipo no covalente. Para su estudio se han empleado diferentes procedimientos. Por ejemplo, tras la rotura de los puentes disulfuro por sustancias de carácter reductor, como el mercaptoetanol, se individualizan las cuatro cadenas polipep­tídicas y éstos atendiendo a su tamaño, son de dos tipos: de bajo peso molecular (aproximadamente 22 KD) y de alto peso molecular (50-70 KD, dependiendo del tipo de Ig). Los polipéptidos de bajo peso molecular reciben el nombre de cadenas ligeras o cadenas L (Light) y las de alto peso molecular, cadenas pesadas o cadenas H (Heavy). Dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas se agrupan de tal manera que existe una proximidad espacial entre los cuatro extremos amínicos de las cadenas ligeras y pesadas por una parte, y entre los dos extremos carboxílicos de las cadenas pesadas por otra. Esta estructura básica de las Inmunoglobulina puede ser fraccionada mediante la utilización de enzimas (papaína, pepsina, etc.), como fue efectuado por Porter en 1959, obteniéndose diferentes tipos de fragmentos. El tratamiento con papaína produce la ruptura específica de las cadenas H, en el espacio comprendido entre el puente disulfuro que las une entre sí y los que las unen a las cadenas ligeras. Se obtienen tres fragmentos: uno denominado Fc, que determina la actividad biológica, contiene el alotipo y determina la clase y subclase de cadena pesada y dos denominados cada uno de ellos Fab, que contienen el idiotipo y es por donde la molécula se une al antígeno. 50 AutoinmunidadHumana 4.2.2CadenasLigeras Hay dos tipos de cadenas ligeras, estructuralmente diferentes, que se conocen como cadenas ligeras tipo kappa (k) y cadenas ligeras tipo lambda (l). La familia de genes que codifica para la cadena ligera k se localiza en el cromosoma 2 y los loci de los genes homólogos que codifican para la cadena l, en el cromosoma 22. En cada molécula de Inmunoglobulina las dos cadenas ligeras son del mismo tipo, k o bien l, pero nunca existe una de cada tipo en la misma Inmunoglobulina. Las cadenas ligeras están formadas por unos 200 aminoácidos con la particularidad de que existen dos puentes disulfuro que unen grupos de unos cincuenta aminoácidos. Concretamente la IgG1 posee 214 aminoácidos y su estructura secundaria y terciaria están determinadas por dos puentes disulfuro intracatenarios que unen los aminoácidos 23 con el 88 y 134 con el 193. A su vez, estas cadenas ligeras tienen otro puente disulfuro intercatenario, por el cual cada una de ellas se une a una cadena pesada para constituir la unidad básica de las Inmunoglobulina. Este puente se encuentra en el último aminoácido (214) de la parte carboxílica para el tipo k y en el penúltimo para el tipo l. 4.2.3Cadenaspesadas Estas cadenas poseen unos cuatrocientos aminoácidos estableciéndose entre algunos de ellos puentes disulfuro (intracatenarios) que asocian unos 60 aminoácidos y que condicionan la estructura secundaria del polipéptido. Por ejemplo, las cadenas pesadas de la IgG1 poseen 440 aminoácidos y los puentes disulfuro unen el aminoácido 22 con el 96, el 144 con el 200, el 261 con el 321 y el 367 con el 425. Estas dos cadenas pesadas están unidas la una a la otra por puentes disulfuro intercatenarios, ya indicados anteriormente, y que pueden ser de uno a cinco dependiendo del tipo de Inmunoglobulina. En estas cadenas pesadas, y a nivel de los puentes disulfuro intercatenarios, hay una zona de unos 15 aminoácidos, de gran flexibilidad debido a su estructura y constituye lo que se denomina zona bisagra por donde se deforma la molécula de Inmunoglobulina cuando se produce la unión con el antígeno, facilitándose así su acoplamiento con éste. Los loci de los genes que codifican para la cadena pesada se localizan en el brazo largo del cromosoma 14. 4.2.3.1Partevariableyconstantedelascadenasligerasypesadas. Estructuralmente, las cadenas ligeras poseen dos partes: una corresponde al extremo carboxílico que diferencia las cadenas ligeras en dos tipos k y l, y constituye la parte constante de las cadenas ligeras (CL). La otra corresponde al extremo amínico, que 51 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico es muy variable y constituye la parte variable de las cadenas ligeras (VL) y corresponde a la zona de interacción con el antígeno. Las partes constante y variable son prácticamente de igual tamaño en las cadenas ligeras. También las cadenas pesadas poseen una parte variable y otra constante. Aproximadamente el tercio del extremo amínico de estas cadenas se caracteriza por ser estructuralmente muy variable, por lo que se conoce como parte variable de las cadenas pesadas (VH). La estructura de este fragmento, al igual que en las cadenas ligeras, depende del tipo de antígeno que reconoce, dado que este extremo también participa en la unión de la Inmunoglobulina con el antígeno. Por el contrario, aproximadamente los dos tercios del extremo carboxílico de todas las cadenas pesadas de un mismo tipo de Inmunoglobulina poseen una estructura idéntica. De ahí que esta parte de las cadenas pesadas se conozca como parte constante de las cadenas pesadas (CH). Esta parte constante es diferente según la clase de Inmunoglobulina que consideremos, determinando la existencia de cinco tipos de cadenas pesadas: g, a, m, d y e que definen a su vez las cinco clases de Inmunoglobulina: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE respectivamente. 4.3CaracterísticasdelosdistintostiposdeInmunoglobulina Debido a esta distinta estructura, las cadenas pesadas van a presentar distintas propiedades biológicas, tales como la capacidad de unirse entre sí, fijar complemento, fijar la pieza de secreción y unirse a macrófagos, neutrófilos y células NK. En la tabla A se recogen las principales tipos de Inmunoglobulina Hemos de considerar que incluso entre moléculas de una misma clase existen, según a la subclase a la que pertenezcan, ciertas diferencias cómo se observa en la Tabla B. TABLA A. Algunas características bioquímicas de las Inmunoglobulina Clase PM Coeficiente* sedimentación Velocidad síntesis** Vida media (días) (%) Contenido carbohidratos IgG IgA IgM IgD IgE 150.000 160.000 900.000 180.000 280.000 6,5 7,7 19 7 8 28 10 7 0,016 0,0005 30 8 10 0,4 --- 2,5 10 11 10 10 *(S),Unidad svedberg 52 ** (mg/Kg/día) AutoinmunidadHumana TABLA B Propiedades de las Inmunoglobulina Clase Fija C´ Transferencia Presencia Sensibilización placenta LCR cutánea Secreción mucosa Síntesis feto Opsonización IgG + + + + - - + IgA - - + - + - - IgM + - - - - + - IgD - - - - - - - IgE - - - + - - - 4.3.1Isotipos Si inmunizamos un animal de una especie con Inmunoglobulina procedentes de una especie distinta, la mayoría de los Anticuerpos generados (antisuero heterólogo) irán dirigidos contra la región constante de la Inmunoglobulina que hayamos inyectado, permitiendo definir lo que llamamos el isotipo de una Inmunoglobulina determinada. Los genes que codifican para las distintas variantes isotipicas están presentes en todos los individuos sanos, es decir, todos los individuos sanos poseen los genes g1, g2, g3, g4, m, a1, a2, d, e, k y l; que codifican respectivamente para las regiones constantes G1, G2, G3, G4, M, A1, A2, D y E de las cadenas pesadas y para las regiones kappa y lambda de las cadenas ligeras. Existen cinco isotipos de cadena pesada (M, G, A, D y E) y dos de cadena ligera (k y l). Así diremos que el isotipo de una determinada Inmunoglobulina es G1 o que esa Inmunoglobulina es de la clase G y subclase 1, que a su vez puede tener unas cadenas ligeras del isotipo kappa o lambda. 4.3.2Dominiosmolecularesenlascadenasligerasypesadas. Tanto las cadenas pesadas como las ligeras poseen grupos de aminoácidos unidos por puentes disulfuro intracatenarios. Estos segmentos repetidos en las cadenas L y H se conocen como dominios. Los dominios de la parte constante de las cadenas pesadas presentan una gran homología secuencial no sólo entre ellos, sino también con la región constante de la cadena L. De forma similar, los únicos segmentos variables en las cadenas L y H presentan cierta homología entre ellos y en menor grado a los de la región constante. La cadena L tiene dos dominios, uno corresponde a la región variable (VL) y otro a la constante (CL). La cadena H tiene un dominio en la región variable (VH) y tres o cuatro en la constante dependiendo de la clase de Inmunoglobulina que consideremos (tres en la IgG, IgA e IgD y cuatro en las IgM e IgE). Estos dominios de la región C se denominan CH1, CH2, CH3 y CH4 cuando aparece este último. 53 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Los dominios V son los responsables de la unión con el antígeno y los dominios C, con excepción del CH1, constituyen el fragmento Fc que, como ya se ha indicado, determina las propiedades biológicas de las Inmunoglobulina. Concretamente es por el dominio CH2 por donde se produce la unión a las proteínas del complemento y se establece el enlace con la cadena glicosilada que completa la molécula glicoproteica de las Inmunoglobulina. Es entre los dominios CH1 y CH2 donde se establece la zona bisagra. 4.3.3Regioneshipervariables Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su vez unas regiones en donde se concentra fundamentalmente la variabilidad. Son tres pequeños segmentos que constituyen las denominadas regiones o segmentos hipervariables o región determinante de complementariedad CDR (Complementarity Determining Region), pues determinan la forma del centro activo que permite el reconocimiento y unión al antígeno. Cada una de estas regiones hipervariables se componen de 17 a 20 aminoácidos y cambios en muy pocos aminoácidos de estas zonas suponen una enorme diversidad de posibilidades de unión al antígeno sin variar el resto de la molécula. El resto de la parte variable es relativamente constante, de modo que sustituciones en los residuos que la constituyen, no afectan la especificidad de combinación; constituye un “sostén de trabajo” pues su misión es presentar adecuadamente en el espacio las regiones hipervariables al antígeno, por lo que los residuos que componen esta zona se denominan residuos FW (Framework). 4.3.4Moléculasadicionalesalaunidadestructuralbásica. En las Inmunoglobulina aparecen, además de las cuatro cadenas polipeptídicas básicas, un componente glucídico (que representa el 2-14 % del peso total de la molécula) y en algunas clases de Inmunoglobulina, glicoproteínas adicionales conocidas como cadena J y pieza de secreción. La cadena J es una glicoproteína con un 12 % de azúcares y un peso molecular de 15 kD que une, mediante puentes disulfuro, extremos Fc en la IgA e IgM. La pieza de secreción es una glicoproteína de 58 kD de peso molecular que sintetizan las células epiteliales de las mucosas y glándulas exocrinas. 54 AutoinmunidadHumana 4.4EstructuraespacialdelasInmunoglobulina Una vez conocida la secuencia primaria de aminoácidos en las cadenas peptídicas de las Inmunoglobulina, la deducción de su estructura espacial permitió entender la forma en que millones de diferentes sitios de unión al antígeno son construidos sobre una estructura común. Las Inmuno globulinas pueden estar constituidas por unidades básicas simples, como es el caso de la IgG, IgD e IgE; en forma de dímeros (dos unidades básicas unidas), como es el caso de la IgA, o incluso por hasta cinco estructuras básicas unidas por sus extremos Fc como es el caso de la IgM. Esto se debe a la cualidad que tienen las cadenas m y a de unirse entre sí. Esta unión se realiza a través de la cadena J y mediante puentes disulfuro. Las cadenas pesadas y ligeras están plegadas sobre si mismo, tal como se ha visto mediante análisis cristalográfico. Cada uno de los dominios de las cadenas está constituido a modo de “cilindros” en los que se encuentran plegados en forma de sándwich dos grupos de cadenas proteicas, una con tres cadenas polipeptídicas y la otra con cuatro, que presentan estructuras secundarias es de hoja plegada b. Estas dos capas proteicas están alineadas paralelamente rodeando un espacio interior en el que predomina la presencia de aminoácidos hidrófobos. La unión de esas dos capas se efectúa por puentes disulfuro. En las zonas constantes, las capas de cuatro segmentos están en el exterior de la molécula y las de tres en el interior, mientras que en las variables es al contrario; por lo demás, el modelo global de plegado guarda gran semejanza entre los dominios variables y constantes. Sin embargo, las regiones hipervariables constituyen tres bucles adicionales que no se someten al plegamiento del resto del dominio. 55 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 4.5SubclasesdeInmunoglobulina Se sabe que no todas las Inmunoglobulina de una misma clase tienen idéntica estructura, sino que dentro de las clases se pueden establecer subclases considerando la secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas H y el diferente número y situación de los puentes disulfuro intercatenarios establecidos entre las cadenas pesadas. Así, la IgG humana se divide en cuatro subclases (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) y la IgA e IgM en dos (IgA1 e IgA2; IgM1 e IgM2) respectivamente. Las regiones constantes de las cadenas pesadas de estas diferentes clases y subclases de Inmunoglobulina se conocen, como veremos en el apartado siguiente, con el nombre de variantes isotípicas y son las mismas en todos los individuos normales de la misma especie. 4.5.1Alotipos Las Inmunoglobulina, como proteínas que son, pueden actuar como antígenos. Esta propiedad se ha aprovechado para generar Anticuerpos contra ellas, que posteriormente han sido utilizados como instrumentos para analizar su estructura y función. Mediante el uso de los Anticuerpos generados contra las Inmunoglobulina se ha podido detectar la existencia de variaciones en las mismas. Si inmunizamos un animal con Inmunoglobulina de otro animal de la misma especie obtendremos antisueros homólogos. Estos antisueros homólogos pueden ir dirigidos contra las regiones constantes de las Inmunoglobulina, solo contra aquellas zonas que sean distintas entre ambos animales. Estas diferencias reflejan variaciones mínimas, a veces de un solo aminoácido debidas a diferencias en la secuencia de ADN de los genes que codifican para las Inmunoglobulina. Los genes que codifican para las Inmunoglobulina se heredan en forma de alelos mendelianos, por lo que a cada uno de este tipo de variante se le denomina variante alélica y al conjunto de variantes alélicas, se le denomina alotipo. 4.5.2Idiotipos Los antisueros homólogos que referíamos anteriormente que se producen al inmunizar animales con Inmunoglobulina de otro animal de la misma especie, también pueden ir dirigidos contra las regiones hipervariables de las cadenas H y/o L de las Inmunoglobulina. Todas las Inmunoglobulina que poseen los mismos determinantes antigénicos en sus regiones hipervariables se dice que pertenecen al mismo idiotipo, o que poseen los mismos determinantes idiotipicos. Los determinantes idiotípicos son exclusivos para las moléculas producidas por un clon determinado de células productoras de Anticuerpos. Los idiotipos parecen tener importancia fisiológica en la regulación del sistema inmune. Según la teoría de la red de Jerne, frente a los idiotipos se formarían Anticuerpos que al unirse a los mismos formarían un entramado (“red”) de Anticuerpos unidos a otros Anticuerpos que tendrían como acción final la regulación del proceso de síntesis de nuevas Inmunoglobulina. Como decíamos anteriormente, cada uno de los idiotipos se encuentra representado en tan pequeña cantidad que pasa desapercibido para el sistema inmune, sin embargo, cuando un determinado clon de células B reconoce su antígeno especifico, prolifera, se diferencia a célula plasmática y produce una gran cantidad de Inmunoglobulina de una misma especificidad, sus determinantes idiotipicos pasaran a encontrarse en mucha mayor cantidad y ahora sí darán lugar a una respuesta de Anticuerpos contra ellos, Anticuerpos antiidiotipo, que podrán unirse a las Inmunoglobulina que ocasionaron su generación. La unión de los Anticuerpos anti56 AutoinmunidadHumana idiotipo al idiotipo que los origino podrá dar lugar al bloqueo de las Inmunoglobulina solubles que compartan ese idiotipo o unirse a las Inmunoglobulina de membrana presentes en linfocitos B de la misma especificidad, o incluso a las regiones hipervariables del receptor para el antígeno de la célula T que reconocen ese mismo antígeno, con efectos en cada uno de los casos inhibidores o estimuladores. Los idiotipos se encontraron mediante estudios serológicos, al observarse que cuando en un conejo se inyectaban Anticuerpos antisalmonella de otro conejo del mismo alotipo, producían Anticuerpos que reaccionaban con el Anticuerpo inyecta­do, incluso aunque los dos conejos fueran genéticamente idénticos. Estos Anticuerpos anti-idiotipo, en la mayoría de los casos, están dirigidos contra la estructura exclusiva de la porción fijadora de antígeno y por tanto solo reconocen a Inmunoglobulina de la misma especificidad, sin embargo en algunos casos, los Anticuerpos anti-idiotipo pueden estar dirigidos contra zonas de la región hipervariable distintas de la porción fijadora del antígeno y en este caso podrán unirse a Inmunoglobulina de varias especificidades distintas regulando la respuesta inmune frente a varios antígenos. 4.6DistribucióndelasInmunoglobulina Las Inmunoglobulina se encuentran distribuidas en todos los fluidos orgánicos de la economía de los vertebrados y en las membranas de los linfocitos B y células plasmáticas. Las cantidades relativas de cada una de las clases de Inmunoglobulina en los diferentes compartimentos del organismo son muy diferentes. En el torrente sanguíneo predomina la IgG mientras que en las secreciones (saliva, lágrimas, secreción bronquial, así como en el líquido cefalorraquídeo y mucosas) la IgA es la predominante. Los niveles de Inmunoglobulina séricas fluctúan ampliamente en función de diversos aspectos, tales como el estado nutricional, la edad, etc. Cuando las Inmunoglobulina se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos (Inmunoglobulina de membrana), actúan como receptores de las señales de activación antigénicas por su capacidad de reconocimiento del antígeno constituyendo el receptor para el antígeno del linfocito B. 4.7SuperfamiliasdelasInmunoglobulina La estructura de las cadenas pesadas y ligeras de las Inmunoglobulina posee ciertas similitudes entre sí (por ejemplo, la estructura en dominios equivalentes). Esto hizo pensar que ambas cadenas procedían de una molécula ancestral común. Idéntica similitud se ha observado con la b-2-microglobulina y con una gran cantidad de moléculas, todas ellas agrupadas, por tanto, bajo el mismo epígrafe de superfamilia de las Inmunoglobulina. Estas moléculas son: el receptor T para el Antígeno, las moléculas de histocompatibilidad clase I y II, LFA-3, ICAM-1. 4.8FuncióndelasInmunoglobulina La función esencial de las Inmunoglobulina es la de unirse al antígeno. De esta manera las Inmunoglobulina actúan como receptoras de señales antigénicas o bien pueden colaborar en la destrucción antigénica. La primera función se presenta cuando las Inmunoglobulina se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos B (Inmunoglobulina de membrana), y para la segunda requieren la colaboración del 57 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico comple­mento, macrófagos, neutrófilos y células NK, que tienen la propiedad de unir las Inmunoglobulina por su extremo Fc. 4.8.1UniónantígenoAnticuerpo Los epítopos de un antígeno pueden estar formados por aminoácidos consecutivos en la secuencia de la proteína, como las proteínas se encuentran normalmente dobladas sobre si mismas según lo que llamamos estructura terciaria, en la mayoría de los casos los Anticuerpos generados contra este tipo de epítopos solo reconocerán a la proteína desnaturalizada o “linearizada” y por ello se les llama epitopos lineales. En la mayoría de los casos los epítopos suelen estar formados por aminoácidos del Antígeno que solo se encuentran suficientemente cerca unos de otros en la proteína nativa, es decir en la proteína que tiene estructura terciaria conservada, es decir una conformación adecuada, por lo que a estos epítopos se les llama epitopos conformacionales. Cuando inmunizamos un animal con una proteína, generaremos una serie de Anticuerpos dirigidos contra los distintos epítopos de la misma, todos esos Anticuerpos se encontraran circulando en el suero del animal al que, una vez extraido, llamaremos antisuero. El tipo de Anticuerpos que compondrán ese antisuero dependerá en gran medida de la forma en que hayamos preparado la proteína para la inmunización, si la hemos preparado desnaturalizada, solo existirán epítopos lineales, mientras que si hemos inyectado la proteína en su estado nativo, coexistirán en el antisuero Anticuerpos que reconozcan epítopos conformacionales con otros que reconozcan epítopos lineales. En el caso de Anticuerpos monoclonales, todos los Anticuerpos procederán de un clon de células plasmáticas y por tanto estarán dirigidos contra un solo epítopo que será de un tipo u otro. La importancia radica, en que dependiendo del tipo de epitopos que reconozcan los Anticuerpos, las aplicaciones diagnosticas o de investigación serán distintas. En general, los Anticuerpos que reconocen epitopos lineales serán útiles para técnicas de Western Blot (donde se analiza la proteína generalmente desnaturalizada) mientras los que reconocen epítopos conformacionales lo serán para técnicas de inmunofluoresencia, inmunoprecipitación, etc. 4.8.2Paratopo Las Inmunoglobulina se unen a los epitopos de los antígenos por sus sitios activos, constituidos como se ha indicado anteriormente, por los segmentos variables de las cadenas pesadas y ligeras y donde intervienen principalmente las regiones hipervariables. Esta zona de unión al epítopo se conoce con el nombre de paratopo. 4.8.3FuerzasdeuniónAg‐Ac. La unión del antígeno (Ag) con el Anticuerpo (Ac) o Inmunoglobulina es semejante a la que se establece entre la enzima y su substrato o entre proteínas que pertenecen a cualquier vía de señalización intracelular. Estas interacciones se deben a la formación de múltiples enlaces no covalentes (enlaces de hidrogeno, interacciones electrostáticas, de Van der Waals e hidrófobas), cada uno de los cuales por si solos son débiles. Sin embargo, como se establecen múltiples interacciones, la fuerza total de la unión puede ser muy elevada. Para que las interacciones mencionadas lleguen a ser efectivas, los grupos entre los que se establece deben estar situados a distancias muy cortas, y para que esto sea posible y se puedan producir un gran numero de interacciones, el epítopo y el paratopo deben encajar perfectamente, dependiendo de ello la “fuerza” de la interacción que conocemos con el nombre de afinidad. La afinidad esta interacción 58 AutoinmunidadHumana es de vital importancia, por cuanto de ello dependerá tanto la utilidad diagnóstica y de investigación de un Anticuerpo como su importancia fisiopatológica. Para cuantificar la afinidad de una interacción, deberemos entender primero una serie de conceptos de los que nos ocuparemos a continuación. KA Ag + Ac = == Ag-Ac KD Donde ka representa la constante de velocidad y kd la de disociación. Llegara un momento en que la velocidades de asociación y disociación se igualen, es decir, que el numero de complejos Ag/Ac que se formen sea el mismo que el que se disocie, entonces decimos que se ha llegado a una situación de equilibrio dinámico. Una forma indirecta de medir la afinidad de la interacción de una pareja Ag/Ac, será medir la velocidad de asociación y disociación antes de que se llegue al equilibrio, lo cual puede realizarse actualmente mediante biosensores. Cuanto mayor sea la velocidad de asociación y menor la de disociación mayor será la afinidad de la interacción de esa pareja Ag/Ac. Otra forma complementaria y más directa de cuantificar la afinidad de la interacción Ag/Ac, es hacerlo una vez que se ha alcanzado el equilibrio y utilizando concentraciones bajas de Anticuerpo. En estas condiciones la concentración de antígeno que permite que la mitad de los Anticuerpos estén unidos a ellos y la otra mitad libre, medida en molaridad, se denomina constante de disociación (KD) y es una medida directa de la afinidad de la interacción. Cuanto menor sea la KD mayor será la afinidad puesto que indica que es necesaria una menor concentración de antígeno para que la mitad de los Anticuerpos estén ocupados. La inversa de la KD es la constante de asociación (KA) cuyo valor es directamente proporcional a la afinidad de la interacción. Para determinar experimentalmente estas constantes tendremos que conocer las concentraciones de antígeno libre y unido, para lo cual existen varios métodos entre los que destacan análisis mediante diálisis de equilibrio. Esta técnica se basa en la utilización de una membrana semipermeable de un poro tal, que permita el paso de un antígeno suficientemente pequeño (un hapteno) pero no del Anticuerpo. A concentraciones bajas de antígeno, la concentración de Anticuerpo libre ira bajando rápidamente hasta que se alcance el equilibrio, puesto que todo el antígeno que entre a través de la membrana semipermeable 59 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico quedara retenido por el Anticuerpo. Realizando el experimento anterior con varias concentraciones de antígeno, podremos encontrar aquella en la que la mitad del Anticuerpo se encuentra unido al antígeno que como hemos dicho corresponde a la KD. La afinidad que hayamos calculado corresponderá exclusivamente a la de la interacción de esa pareja Ag/Ac. Un determinado Anticuerpo podrá unirse a más de un antígeno con afinidades distintas en cada caso. 4.8.4AvidezdelauniónAg‐Ac Como apuntábamos anteriormente, el fenómeno de la unión Ag/Ac es en realidad mucho más complejo, pues cada uno de los antígenos poseen varios epítopos distintos, por lo que podrán unir mas de un Anticuerpo. Cada molécula de Anticuerpo, por su parte, podrá unir al menos dos moléculas de Antígeno, una por cada Fab y en el caso de la IgM hasta diez moléculas (como se comento anteriormente las Inmunoglobulina IgM se ensamblan en unidades funcionales constituidas por cinco moléculas de Anticuerpo). Finalmente en un antígeno, un determinado epítopo puede estar representado varias veces siendo capaz de unir varias moléculas del mismo Anticuerpo. La fuerza total de la interacción que considera todas las interacciones epítopo/paratopo que tienen lugar entre antígenos y Anticuerpos multivalentes (con varios sitios de unión), se denomina avidez y es mucho mayor que la suma de las afinidades puesto que las distintas interacciones se estabilizan entre ellas. Estas interacciones multivalentes poseen una gran importancia fisiopatológica por cuanto cuando se encuentren Ag y Ac en solución, como es el caso del plasma o los tejidos, se formaran agregados constituidos por muchas moléculas que denominamos Inmunocomplejos. A concentraciones equivalentes de Ag y Ac estos inmunocomplejos serán de gran tamaño y podrán quedar atrapados en los tejidos, iniciando una respuesta inflamatoria y dando lugar a las llamadas enfermedades por depósito de inmunocomplejos. 4.8.5EspecificidaddelauniónAg‐Ac La unión entre el Ag y la Ig tiene una gran específicidad, de tal manera que una Ig se unirá fundamentalmente y con mayor avidez, a un antígeno determinado. En algunos casos la Inmunoglobulina podrá unirse a antígenos con epítopos muy similares, aunque en este caso la afinidad de la unión es mucho menor. También es posible que un mismo epítopo se encuentre con dos antígenos diferentes en cuyo caso el Anticuerpo reaccionara con los dos antígenos, diciéndose entonces que existe una reactividad cruzada. La consecuencia final de la acción de las Inmunoglobulina es la de destruir al antígeno y/o neutralizar los efectos nocivos de los mismos. Para la consecución de estos objetivos todas las Inmunoglobulina poseen, como ya se ha indicado, una característica esencial y común, que es la de unirse específicamente al antígeno, caracteristica que depende como hemos dicho, de sus regiones hipervariables contenidas en el fragmento Fab. Sin embargo, tanto la neutralización como la destrucción del antígeno, lo consiguen 60 AutoinmunidadHumana de muy diversas formas, dependiendo del tipo y manera de encontrarse el antígeno y también del tipo de Inmunoglobulina que interviene en cada caso utilizando para ello, las regiones constantes y concretamente sus extremos Fc. Tras la unión del antígeno y la Inmunoglobulina, ésta puede anular la acción del antígeno por neutralización, precipitación o aglutinación del mismo. Así si la Ig es específica para una toxina bacteriana, cuando se produce la unión Ag-Ac (toxinaantitoxina), quedan neutralizados los efectos tóxicos de la toxina. De ahí que clásicamente, cuando no se conocía la estructura de las Inmunoglobulina, se las denominase antitoxinas, precipitinas o aglutininas, en función de la reacción que se detectaba en cada caso. 4.8.6PropiedadesbiológicasdelasInmunoglobulina Los fenómenos de neutralización, precipitación y aglutinación de los antígenos no son suficientes por sí solos para la destrucción y total eliminación de éstos. Para ello, además de las Inmunoglobulina se requiere de la colaboración de otros muchos elementos, tales como el sistema del complemento, macrófagos, polimorfonucleares o células NK. Podemos decir que las Inmunoglobulina, al detectar los antígenos y producirse la subsiguiente unión a ellos, actúan como trans-ductores de la información de la presencia de los mismos que serían destruidos por el complemento, macrófagos, los polimorfonucleares o células NK a los que dan especificidad. 4.8.7Opsonización Cuando se produce la unión de antígeno e Inmunoglobulina G se producen una serie de cambios alostéricos en el extremo Fc de la IgG que hacen que se una a receptores que se encuentran en la membrana de macrófagos y polimorfonucleares. A este fenómeno se le denomina opsonización. Al producirse esta unión, los macrófagos se activan, iniciándose el fenómeno de fagocitosis y subsiguiente destrucción de los complejos antígeno Anticuerpo por los procesos líticos intracelulares, propios de la acción de los enzimas contenidos en los lisosomas de estas células. Estos receptores pueden ser 61 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico de distinta naturaleza, conociendose en la actualidad tres de estos receptores: FcgRI, FcgRII y FcgRIII, conocidos en la actualidad como CD64, CD32 y CD16 respectivamente. Además de en los macrófagos estos receptores se encuentran en otras células como plaquetas, linfocitos B y NK (Tabla 3.8). Cuando se produce la unión a células NK estas se activan y lisan a las células portadoras del antígeno por un mecanismo conocido como citotoxicidad celular dependiente de Anticuerpos (ADCC). Cuando la Inmunoglobulina que se une a un antígeno es de las clases IgM o IgG, en sus extremos Fc se producen ciertos cambios alostéricos gracias a los cuales éstas adquieren la propiedad de fijar y activar uno de los componentes del complemento. Las fracciones activas del complemento poseen diferentes acciones muy importantes en la defensa del organismo, una de las cuales es la lisis celular. Este fenómeno se conoce con el nombre de citotoxicidad mediada por el complemento. Además de estas funciones, las Inmunoglobulina tienen la capacidad de ser esenciales en el fenómeno de reconocimiento del antígeno por parte de linfocitos B cuando se encuentran ligadas a la membrana celular de estas células como Inmunoglobulina de membrana constituyendo el receptor para el antígeno del linfocito B. Esta propiedad será estudiada extensamente en capítulos posteriores. En la actualidad y utilizando técnicas de Ingeniería Genética, podemos “construir” Anticuerpos monoclonales que contengan una especificidad determinada y que sean del isotipo que deseemos para que predominen unas u otras funciones biológicas. Incluso podemos, con fines terapéuticos generar Anticuerpos monoclonales de una determinada especificidad en ratones y posteriormente aislar el ADN que codifica para las regiones hipervariables que confieren la especificidad y fusionarlo con el ADN que codifica para las regiones constantes humanas, estos Anticuerpos monoclonales “humanizados” tendrán indudables ventajas desde el punto de vista terapéutico al no ser considerados como extraños por el sistema inmune humano. 4.9PropiedadesyfuncióndecadaunadelasInmunoglobulina Aunque en los apartados anteriores se ha hecho mención a las propiedades y función de las Inmunoglobulina, a continuación estudiaremos brevemente y por separado las características funcionales más importantes de cada una de ellas. 4.9.1InmunoglobulinaG Son las Inmunoglobulina más abundantes y representan más del 70 % de las Igs séricas totales; las diferentes subclases se presentan en proporciones muy diferentes. La IgG1 es la subclase más frecuente (más del 60 %), seguida de la IgG2 (aproximadamente un 18 %), mientras que IgG3 e IgG4 se encuentran en mucha menor proporción. Esta Ig posee capacidad neutralizante, precipitante, de fijar complemento, de unirse a células NK y a macrófagos (opsonización) y son capaces de atravesar activamente las membranas biológicas. La propiedad de atravesar activamente las membranas biológicas es de sumo interés por lo que, además de ejercer esta Inmunoglobulina, su efecto en toda la “economía del organismo”, lo hace también en el feto al atravesar la placenta desde la madre, merced a la existencia de receptores para la porción Fc en el sincitiotrofoblasto. Como el feto sólo sintetiza pequeñas cantidades de Inmunoglobulina, adquiere de este modo la posibilidad de defensa, no solamente mientras se encuentra en el seno 62 AutoinmunidadHumana materno, sino incluso durante la lactancia, período en el cual todavía no ha desarrollado la capacidad total de síntesis de Inmunoglobulina. Sin embargo, este paso de IgG desde la madre al feto no siempre es beneficioso para el feto. De todos es sabido que cuando hay incompatibilidad del tipo Rh entre la madre y el feto, se puede desarrollar el síndrome de eritroblastosis fetal como consecuencia de la destrucción de glóbulos rojos fetales, de nefastas consecuencias si no se acude a tiempo. Esto no se presentaría si la IgG no pasase de la madre al feto. La IgG se sintetiza tardíamente tras un primer contacto con el antígeno, sin embargo, tras un segundo contacto la mayoría de las Igs formadas pertenecen a esta clase. 4.9.2InmunoglobulinaM Los Anticuerpos del tipo IgM son los que mas rápidamente se forman en respuesta a un estímulo antigénico (Respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza también por poseer capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar complemento, activar la respuesta inmune, sin embargo no atraviesa activamente las membranas biológicas. Esta última propiedad hace que esta inmuno­globulina ejerza su acción normalmente en los espacios intravasculares. Representa del 5 al 10 % de las Igs séricas totales y junto a la IgD es la más frecuentemente encontrada en la superficie de los linfocitos B como Inmunoglobulina de membrana. 4.9.3InmunoglobulinaA Esta Inmunoglobulina posee capacidad neutralizante y precipitante, mientras que su capacidad de fijar complemento y de opsonización son muy débiles, limitándose su efecto a neutrófilos y no a macrófagos. La propiedad más importante de esta Inmunoglobulina viene determinada por su capacidad de unirse por el extremo Fc a la pieza secretora, gracias a la cual puede ser secretada por las mucosas y glándulas exocrinas, ejerciendo su acción más importante en la superficie de mucosas y líquidos biológicos (sobre todo IgA2), tales como el liquido cefalorraquídeo, secreción bronquial, lágrima, saliva, etc. Esto es importante porque así protegen precisamente los puntos más vulnerables del organismo, esto es, las puertas de entrada al mismo, como son ojos, boca, aparato digestivo, sistema respiratorio, vagina, etc. No olvidemos que, por ejemplo, si desplegamos la mucosa del aparato respiratorio, la superficie que cubriríamos es de unos 300 m2, superficie que se encuentra en contacto directo con el exterior a través del aire que se respira. Se deduce de ello que, sin duda, deben ser importantes los mecanismos de defensa local entre los cuales la IgA tiene un papel esencial. Esta Inmunoglobulina se encuentra también en la leche materna. Los niveles de todas las Inmunoglobulina, a excepción de la IgG en recién nacidos son muy bajos, siendo por tanto de gran significación el hecho de que la IgA se transfiera desde la madre al lactante a través de la secreción láctea. De ahí que tengamos que insistir en que los lactantes se amamanten en el mayor grado posible directamente por las madres y no con leche de otros orígenes, a lo que actualmente existe excesiva tendencia. La IgA recibida de la madre ejerce un importante papel de defensa a nivel de todo el aparato digestivo. En ello parece que influyen las especiales características de pH gástrico del lactante que es menos ácido que en el adulto y una especial resistencia de esta Inmunoglobulina frente al mismo, por lo que no se destruye a su paso por el estómago. 63 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 4.9.4InmunoglobulinaD La concentración de esta Inmunoglobulina en suero es muy baja. Hasta fechas muy recientes no se había demostrado que esta Inmunoglobulina poseía capacidad de unirse a antígenos, por lo que se dudaba de que actuase con función de Anticuerpo. Sin embargo, aunque actualmente se ha demostrado su acción de Anticuerpo, no se conoce con precisión cuáles son sus funciones específicas, aunque se piensa que colabora de forma importante en la activación de linfocitos B al actuar como receptor en la superficie de los mismos. 4.9.5InmunoglobulinaE En muchos individuos alérgicos esta Inmunoglobulina se presenta en grandes cantidades. El estímulo para su síntesis puede proceder de una gran variedad de antígenos, a los que en este caso se conocen como alergenos. Estos alergenos pueden penetrar en el organismo a través de la piel o de las mucosas respiratoria, ocular, del aparato digestivo, etc., así como por inyectables, como es el caso de la penicilina u otros medicamentos. La vida media de la IgE en sangre periférica es de 24-48 horas. No tiene capacidad de atravesar la placenta, por lo tanto, las reacciones de hipersensibilidad inmediata no pueden transferirse de manera pasiva de la madre al feto. Sin embargo, puede existir una predisposición de tipo familiar a padecer enfermedades de naturaleza alérgica. Esta predisposición parece estar relacionada con una tendencia a producir Anticuerpos de tipo IgE en la respuesta secundaria frente a antígenos, en lugar de IgG que seria la respuesta normal en individuos no alérgicos. La IgE se encuentra en forma libre en sangre en donde se observa que los niveles cambian a lo largo de la edad. También la IgE se encuentra en otros líquidos biológicos, así como unida a basófilos y células cebadas, gracias a la propiedad que tiene esta Inmunoglobulina de unirse por su extremo Fc a receptores de superficie presentes en dichas células. Estas células se caracterizan por encontrarse en la piel y mucosas y por contener abundantes gránulos citoplasmáticos, ricos en sustancias vasoactivas que liberan una vez se activan. 64 UNIDADDIDÁCTICAV GENÉTICADELASINMUNOGLOBULINA AutoinmunidadHumana 5.1IntroduccióngenéticadelasInmunoglobulina Los linfocitos B, al reconocer un determinado antígeno mediante las Inmunoglobulina de superficie, se activan, proliferan y diferencian hasta células plasmáticas que poseen la propiedad de sintetizar y secretar Inmunoglobulina en grandes cantidades. La síntesis de Inmunoglobulina, como glicoproteínas que son, se efectúa en los ribosomas de las células plasmáticas, donde tiene lugar la traducción de RNA mensajero correspondiente a las cuatro cadenas peptídicas. Posteriormente se producirá el proceso de la glicosilación de dichas cadenas y la secreción de las mismas. El conocimiento de la heterogeneidad de las Inmunoglobulina debida a su diversidad de clases y a la gran variabilidad estructural derivada de la parte variable de las mismas, ha producido, a su vez, una gran inquietud por conocer a nivel genético el proceso de regulación y síntesis de estas moléculas. Hoy ya conocemos los mecanismos más relevantes por los cuales el organismo es capaz de sintetizar millones de moléculas de Inmunoglobulina diferentes con una cantidad de material genético limitado. 5.1GenesimplicadosenlasíntesisdeInmunoglobulina A partir de los estudios de Tonegawa en 1976, aparece un acúmulo de conocimientos por los que se sabe que la síntesis de las cadenas ligeras y pesadas se regula por genes que se encuentran en cromosomas distintos. Esto fue puesto de manifiesto empleando técnicas de digestión enzimática del DNA de células B y posterior hibridación con sondas de DNA complementario (cDNA), mediante la técnica de Southern Blot. Mediante esta técnica, se pudo observar que usando un cDNA marcado radioactivamente como sonda correspondiente a parte de una cadena pesada, éste se unía a segmentos de DNA de líneas celulares de ratón que contenían el cromosoma 12. Por otra parte, empleando igualmente sondas de cDNA marcadas radioactivamente frente al DNA de cadenas ligeras de tipo k, éstas se unen a células que contienen el cromosoma 6, mientras que las sondas para DNA de cadenas ligeras l lo hacen al cromosoma 16. 5.1.1SegmentosdegenesysíntesisdeInmunoglobulina Otra característica importante de la formación de Inmunoglobulina es que, en la síntesis de cada una de las cadenas de Inmunoglobulina participan varios segmentos de genes de cuyas combinaciones resultan los diversos genes funcionales, responsables directos de la codificación de cada una de las cadenas de Inmunoglobulina. Esto explica 67 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico las múltiples posibilidades de formación del gran número de Inmunoglobulina partiendo de un limitado material genético. 5.1.2Tiposdesegmentosgénicos Estos segmentos codifican por separado la parte variable, la parte constante y las partes por las que ambas regiones se unen, esto es, las regiones bisagra. Los segmentos que codifican la parte variable son de dos tipos, segmentos V y segmentos D, responsables de la variabilidad y diversidad de las Inmunoglobulina respectivamente. Le siguen los segmentos J o de unión, responsables de unir los fragmentos anteriores con los segmentos C que codifican para la parte constante. El número de segmentos responsables de la codificación de la parte constante es muy limitado en relación con el número de segmentos que codifican la parte variable de las Inmunoglobulina. En las células embrionarias los segmentos de una misma clase se encuentran separados del resto de tal forma que, por una parte, se encuentran los segmentos V, por otra los D, los J y los C. Estos segmentos están contenidos en los exones, que son aquellos fragmentos de DNA que serán transcritos para dar lugar a la síntesis de proteínas, y que se encuentran separados entre sí por fragmentos de DNA no codificadores de proteínas denominados intrones. En consecuencia se puede concluir que: La síntesis de las cadenas ligeras y pesadas de las Inmunoglobulina está regulada por cromosomas distintos. En esta síntesis participan varios segmentos de genes que combinados dan lugar a los genes funcionales responsables de la codificación de las cadenas de las Inmunoglobulina. 5.2 Reordenamiento de los segmentos génicos de las Inmunoglobulina Las observaciones anteriores se interpretaron como que a lo largo del proceso madurativo de los linfocitos B, se produce un reagrupamiento de segmentos de genes para la iniciación de la síntesis de las cadenas ligeras y pesadas. A este fenómeno se denomina recombinación intracromosómica. 68 AutoinmunidadHumana A medida que se produce el proceso madurativo de los linfocitos B, los segmentos V, D y J cambian de sitio en el cromosoma de tal manera que se colocan juntos. Posteriormente este conjunto V/D/J se reagrupa con el segmento C correspondiente quedando constituido en consecuencia un gen con toda la información de la cadena. Cuando el linfocito B es maduro posee ya reagrupados los genes correspondientes a sus cadenas ligeras y pesadas y sólo podrá producir un determinado tipo de Anticuerpo. 5.2.1Reordenamientodegenesdecadenasligeras En la síntesis de cadenas ligeras participan los segmentos V, J y C (es decir, no hay genes D para la cadena ligera). Así pues, en el proceso de recombinación de genes de cadenas ligeras se acopla un segmento V con un segmento J y el conjunto V/J se recombina con el segmento correspondiente a la parte constante C. El proceso de transcripción se hace de tal manera que el RNA mensajero contiene información secuenciada V, J y C. Esquema del proceso de recombinación y trascripción ocurridos en la línea celular B conducente a la síntesis de cadenas k: 5.2.2Reordenamientodegenesdecadenaspesadas A su vez, un proceso similar, si bien esta vez en dos etapas, ocurre para la formación de una cadena pesada. En este caso participan los segmentos V, D, J, y C. Primero se produce la recombinación entre un segmento D y un segmento J. En la segunda fase, este conjunto D/J se recombina con un segmento V. El complejo V/D/J se puede por último recombinar con cada uno de los segmentos que codifican las regiones constantes, según la Inmunoglobulina a formar. El proceso de recombinación con los genes C tiene lugar a nivel de RNA. Vamos a encontrar en este momento el siguiente orden: el segmento líder; un fragmento V/D/J reordenado y unido y a continuación cada uno de los genes que codifican para las regiones constantes (Cm; Cd; Ct, etc) separados entre sí por los correspondientes intrones y a su vez precedidos por sus respectivos promotores. Se piensa que el gen Cm es el situado en primer lugar en la secuencia de genes C, seguido de Cd. En células B en reposo, el único y largo tránscrito primario de RNA va a contener la información del complejo V/D/J más la correspondiente a los genes Cm y Cd. Mediante mecanismos de procesamiento del RNA que analizaremos posteriormente, se va a proceder a la escisión en el tránscrito primario de la información correspondiente a Cm o bien a Cd. Se da lugar de esta manera a una Inmunoglobulina de tipo IgM o IgD, y este mecanismo es además el responsable de que en las células B en reposo se encuentre la expresión simultánea de ambas Inmunoglobulina. 5.2.3Segmentoslíderypromotores Asociados a los segmentos V y situados en dirección 5' de los mismos, existen otros segmentos génicos conocidos como segmentos líder (L). Estos segmentos génicos codifican un péptido pequeño que servirá de guía tanto para las cadenas ligeras como pesadas a su paso por el retículo endoplásmico pero que se separa de estas cadenas antes de que las mismas se unan entre sí para formar la molécula completa de Inmunoglobulina. Junto a estos segmentos génicos se sitúan otros conocidos como segmentos promotores y que son responsables de iniciar la señal del proceso de transcripción del mRNA. La secuencia promotora comienza normalmente a una distancia de alrededor de 25 pares de bases antes del lugar de inicio de la transcripción y continúa alejándose del mismo en dirección 5', aunque su localización y longitud no son siempre las mismas. El 69 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico lugar preciso de la iniciación de la transcripción es reconocido por la combinación conservada de cuatro bases en las que se alternan timina y adenina, para formar lo que se conoce como caja "TATA", siendo continuada por el triplete de bases que codifica el aminoácido metionina, que suele ser el primero codificado de manera casi constante en la mayoría de los genes eucarióticos. Dentro de las secuencias promotoras, vamos a encontrar los denominados motivos de secuencias, esto es, secuencias del DNA a las que se van a unir de manera específica ciertas proteínas nucleares que son las que van a regular su función. En definitiva, las proteínas que van a unirse a estos motivos en el DNA van a regular, en última instancia, la transcripción del DNA, por lo que también estos factores o proteínas de unión son conocidos como factores transcripcionales. En el caso de los genes de las Inmunoglobulina, encontramos en la región promotora la presencia conservada de un octámero (secuencia de ocho bases) en la región 5' no traducida de los genes Vk, mientras que la secuencia complementaria pero invertida de este octámero es encontrada en los genes VH. La presencia de este octámero se ha revelado de gran importancia en el control genético de la síntesis de Inmunoglobulina, en tanto que confieren a las regiones promotoras de los genes de las Inmunoglobulina contenidos en las células B no sólo de especificidad tisular (esto es, sólo las células B producen Inmunoglobulina), sino que además es necesaria para la adecuada función del promotor. Esto parece alcanzarse mediante la unión específica de varios factores transcripcionales, entre los que señalamos los conocidos como Oct-1, Oct-2 y Oct-3. De manera general, los promotores eucarióticos pueden contener varias regiones de unión específicas para cada uno de los factores de transcripción que regulan su función. 5.2.4RegulacióndelprocesodereordenacióndelasInmunoglobulina. Este complejo proceso de recombinación que hemos estudiado hasta ahora ha de tener, necesariamente, un mecanismo de regulación muy estricto. Este mecanismo está constituido por, al menos, los genes RAG-1 y RAG-2 (genes actividores de la recombinación 1 y 2). GenesRAG‐1yRAG‐2 Estos genes fueron descubiertos en el laboratorio de David Baltimore en 1990. El descubrimiento previo de que cada uno de los genes V, D y J era precedido de una corta secuencia única de DNA cuya función es la de servir de señal para los procesos de recombinación, y que es conocida como secuencia de señal de recombinación (SSR) permitió la identificación de estos genes. Utilizando un sistema experimental de transfección en diversas células de vectores retrovirales conteniendo genes de resistencia al ácido micofenólico como indicador de actividad, y que contenían los genes germinales de Vk y Jk junto con sus SSR, estos investigadores comprobaron que sólo las líneas pre-B y pre-T tenían capacidad de recombinación, lo que indicaba un mecanismo de regulación común a ambas estirpes. Este sistema experimental permitió la posterior identificación de RAG-1, seguido del descubrimiento de un segundo gen (RAG-2) muy ligado al anterior tanto en su localización como en su estructura, y que actuaba de una manera sinérgica con RAG-1 facilitando los procesos de recombinación. Aún más importante, se ha encontrado recientemente un grupo de pacientes que tienen mutaciones en RAG-1 o RAG-2, dando como resultado la aparición de una inmunodeficiencia combinada severa por bloqueo en los procesos de recombinación tanto de linfocitos B como T. 70 AutoinmunidadHumana 5.2.5Fenómenosdeaproximaciónderegiones El proceso de reordenamiento génico, además de juntar los segmentos de genes que formarán la estructura de las futuras cadenas ligeras y pesadas, aproxima las regiones promotoras a las regiones amplificadoras (regiones enhancer), lo cual facilitará posteriormente la regulación y control del inicio así como la adecuada transcripcion del RNA mensajero correspondiente. Las regiones amplificadoras se localizan normalmente a miles de pares de bases de distancia de las regiones promotoras, en tanto que las regiones amplificadoras pueden encontrarse, según el gen, después de los segmentos J y antes de los segmentos C. Por tanto, este acercamiento implica la formación de un bucle en la estructura espacial del DNA, de manera que la aproximación entre ambas regiones no es lineal, sino espacial. Al igual que en el caso de los segmentos promotores, las regiones enhancer van a contener motivos de unión que van a interactuar con los factores transcripcionales. Uno de los primeros factores en ser descubierto y más relevante funcionalmente es el factor de transcripción NF-kB, que se une a la región amplificadora del gen k. En la Figura se muestra un esquema del proceso por el cual se eliminan los segmentos de genes que no se van transcribir. 5.2.6Unióndesegmentosdegenes Otro mecanismo importante en la regulación del reordenamiento de los genes de las Inmunoglobulina es el que controla las uniones entre los genes V, D y J. Es decir, cuales son las señales que hacen que un gen D identifique, dentro del cromosoma, la secuencia de un gen J con el que puede unirse, y, a su vez, el gen V identifique la secuencia del complejo DJ ya formado. Los reconocimientos y uniones de unos genes con otros están controlados por combinaciones de secuencias de DNA que se encuentran conservadas y son únicas de los genes de las Inmunoglobulina. 71 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 5.2.7CambiodeisotipodelasInmunoglobulina Cuando las células B reconocen al antígeno, una población de las mismas secretarán IgM llevando a cabo la respuesta primaria, mientras que, en menor medida, otras células van a comenzar a producir IgG, IgA e IgE. Esto quiere decir que las células B tienen la propiedad de cambiar la subclase o isotipo de las Inmunoglobulina que producen Por tanto, en respuesta a un mismo antígeno se van a generar Anticuerpos que van a mantener su parte variable, pero van a ser diferentes en los segmentos constantes que van a ensamblar. Se cree que el cambio de isotipo se produce por dos mecanismos. El primer mecanismo implica que las células B cambian su isotipo tiene lugar esta vez a nivel de DNA, así una célula que ha sido comprometida a producir Anticuerpos de un determinado isotipo, va a sufrir una delección de todos los genes C a excepción del correspondiente a la subclase que va a ser producida. El segundo mecanismo es conocido como splicing alternativo. Este proceso molecular genera polimorfismo proteico debido a la transcripción alternativa de los exones Estos fenómenos pueden ser influenciados por ciertas citocinas. Así por ejemplo, la IL-4 induce el cambio de isotipo de IgM a IgG1 o bien a IgE. 5.3CausasdeladiversidaddelasInmunoglobulina La diversidad de las Inmunoglobulina deriva de la variabilidad de las cadenas ligeras y pesadas, por una parte, y por otra de las diversas posibilidades de unirse entre sí estas cadenas. La variabilidad de cadenas, tanto L como H, que un mismo organismo es capaz de producir, se debe al alto número de segmentos V existentes, a las diversas regiones J y D también existentes y a la multiplicidad de formas de combinación de V/J, en las cadenas ligeras, y V/J y J/D, en las cadenas pesadas. Es decir, el primer mecanismo de generación de diversidad procede de las diferentes posibilidades combinatorias de cada uno de los genes entre sí. Un segundo mecanismo generador de diversidad se debe a la imprecisión de las uniones de los segmentos V, D y J debido posiblemente a desequilibrios en la unión entre los intrones y exones correspondientes, y que se traduce en un pequeño cambio en la estructura primaria de la cadena peptídica. Al parecer este mecanismo desempeña un importante papel en la maduración de la afinidad de los Anticuerpos, de tal manera que a medida que progresa la respuesta frente a un antígeno, los Anticuerpos formados presentan cada vez mayor grado de afinidad por los epitopos del antígeno. Este 72 AutoinmunidadHumana mecanismo multiplica por, al menos, nueve las posibilidades combinatorias de los genes de la cadena pesada y por tres las posibilidades de los genes de las cadenas ligeras, en tanto que por término medio se producen tres reordenamientos por cada unión. Además, toda la diversidad generada por los dos mecanismos ya mencionados, puede verse amplificada por la aparición de mutaciones puntuales en el gen responsable de una determinada cadena de Inmunoglobulina. Estas mutaciones somáticas son de gran importancia en los procesos de incremento de la afinidad del Anticuerpo. Sabemos que conforme se produce en el tiempo la respuesta de Inmunoglobulina, esta no sólo incrementa el número de moléculas producidas, sino que igualmente lo hace la afinidad de las mismas. También, hay que indicar que a la diversidad de las cadenas ligeras y pesadas en sí mismo, hay que añadir la diversidad derivada de las diferentes formas de unión de las cadenas ligeras con las pesadas. 5.4ExclusiónalélicaenlasíntesisdeInmunoglobulina Normalmente cada célula productora de Anticuerpos sólo expresa un tipo de cadena pesada y otro de cadena ligera. Este fenómeno se produce a pesar de que los genes que codifican estas cadenas se encuentran presentes en los dos cromosomas, uno de origen paterno y otro de origen materno, en tanto que las células productoras de Inmunoglobulina son diploides. Es decir, a pesar de que existan dos copias para cada uno de los segmentos génicos V, D, J y parte constante de las cadenas pesadas y ligeras, sólo una es expresada. De no ser así se generaría un serio problema en el individuo que generaría Anticuerpos por una misma célula con especificidades diferentes. Se piensa que este fenómeno, conocido como exclusión alélica, se debe a que sólo los genes de un cromosoma sufren los procesos de reagrupamiento antes indicados de manera que sólo la información del cromomosoma no reorganizado es abortada y no se expresa. Esto implica que una vez que se ha producido una unión productiva V/D/J, los procesos de recombinación son bruscamente detenidos en el otro cromosoma, de manera que no se puede dar lugar a un segundo Anticuerpo maduro. El mecanismo exacto por el que se produce la exclusión alélica no está completamente definido. No obstante, se piensa que una vez producido un reordenamiento efectivo de los genes de las Inmunoglobulina, la proteína madura va a enviar una señal negativa de manera que la célula no produzca nuevos reordenamientos. Así, la presencia de un reordenamiento completo de la cadena pesada va suponer el envío de una señal que inhiba nuevos reordenamientos de otras cadenas pesadas, por un lado, y por el otro va a hacer que se inicien los reordenamientos correspondientes a las cadenas ligeras, comenzando por las cadenas k. Si no se produjeran reordenamientos productivos de k, entonces se permitiría el reordenamiento de l. El ensamblaje final de las cadenas pesadas y ligeras impediría nuevos reordenamientos, como ya hemos discutido, mientras que si no se consiguieran reordenamientos productivos en ninguno de los dos alelos de k y l, entonces la célula B entraría en un fenómeno de muerte celular programada, cesando su maduración y siendo posteriormente eliminada. El proceso de exclusión alélica tiene como fin asegurar que cada una de las células B produce un único tipo de Anticuerpo, a fin de evitar el reconocimiento de más de un epítopo mediante la producción de Anticuerpos multireactivos. 73 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 5.4.1FasesFinalesdelasSíntesisdeInmunoglobulina El RNA mensajero correspondiente al péptido a sintetizar se forma mediante la trascripción de los segmentos V, D, J y C ya reagrupados, de manera que la información de estas regiones se transcribe en un solo mRNA al que se añade la cola de poliadenilación (poli-A). Las partes del RNAm correspondientes a los segmentos intrónicos son eliminadas. Esta eliminación implica los procesos de corte del RNAm y posterior unión de los extremos exónicos restantes. Después, el RNAm abandonará el núcleo para alcanzar los ribosomas en donde se producirá la síntesis de los péptidos mediante el proceso de traducción. En el proceso de traducción en el ribosoma se sintetizan los péptidos. Una vez formados los péptidos de una Ig se produce la glicosilación de los mismos en el propio retículo endoplásmico, así como su ensamblaje para la formación de la Ig completa, antes de ser secretada por la célula. El proceso de ensamblaje parece desarrollarse en las siguientes fases: H+H àH2+LàH2L+LàH2L2. En el caso de la IgM, parece que por el contrario se unen primero una cadena pesada con una ligera, uniéndose esta media molécula a su otra media independientemente formada. Una vez que se ha producido el ensamblaje de la Inmunoglobulina, esta molécula tiene dos opciones funcionales. Una primera es la de permanecer en la membrana de las células B, convirtiéndose de esta forma en el receptor de las células B para el antígeno. La segunda opción es la de ser secretada al medio, con la función de interaccionar directamente con el antígeno y conseguir su destrucción. La única diferencia entre ambas es que las formas de Igs de membrana tienen en la región carboxi-terminal de la cadena pesada un fragmento añadido de 19 aminoácidos. La decisión de optar entre una forma u otra es tomada a nivel de trascripción del RNA, una vez más mediante un proceso de splicing. 5.5AnticuerposmonoclonalesproducidosporHibridomas Cuando se realiza una inmunización con el objeto de producir Anticuerpos frente a un antígeno, se produce una gran variabilidad de Inmunoglobulina que poseen función de Anticuerpo frente a los diferentes epitopos del antígeno. Esta producción de Inmunoglobulina es de tipo policlonal debido a que son muchos y muy diversos clonos linfocitarios los que se activan y diferencian para la producción de Anticuerpos. Este fenómeno es de gran utilidad biológica por cuanto ofrecen una amplia barrera de protección del organismo al formarse una gran variabilidad de Anticuerpos. Sin embargo, los antisueros así obtenidos, aunque se han utilizado ampliamente y han sido de gran interés en el conocimiento de la biología y la bioquímica de las Inmunoglobulina (inmunoprecipitaciones e inmunoblotting), ofrecen serias dificultades para su uso, por ejemplo, en la identificación de sustancias u otros fines análogos, debido a la gran heterogeneidad estructural y funcional que poseen. 5.5.1FundamentosdelaproduccióndeAnticuerposmonoclonales El método seguido para la producción de estos Anticuerpos consiste en la unión (fusión) de una célula B productora de Anticuerpos , con una célula de gran capacidad de crecimiento (células de mieloma) con lo cual se forma un híbrido (hibridoma) que posee la información genética necesaria para la síntesis del Anticuerpo deseado, que le es aportada por la célula B, y una activa capacidad de síntesis proteica al tiempo que puede 74 AutoinmunidadHumana multiplicarse tanto in vivo como in vitro indefinidamente, propiedades estas últimas que son aportadas por la célula mielomatosa. De esta manera, se pueden producir innumerables tipos de hibridomas de acuerdo con el tipo de Anticuerpo que interesa. 5.5.2UtilidaddelosAnticuerposMonoclonales Un Anticuerpo monoclonal es un reactivo biológico homogéneo en su actividad, en contraste con los antisueros convencionales que son una mezcla variable de Inmunoglobulina. El uso más generalizado de los AcMo se centra: En la caracterización y cuantificación de sustancias de interés biológico que se encuentran en cantidades muy pequeñas, tales como hormonas, enzimas, interferones, etc. En la identificación de antígenos presentes en las membranas celulares, tales como las moléculas CD3, CD4, CD8 y otras muchas. Esto ha permitido no solamente la cuantificación de subpoblaciones celulares, sino también su fraccionamiento y aislamiento. En este sentido cabe destacar el empleo de equipos conocidos como clasificadores de células activados por fluorescencia" (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter) En trasplantes de órganos y enfermedades Autoinmunes en donde los Anticuerpos Monoclonales dirigidos contra los linfocitos T se utilizan frecuentemente en casos de amenaza de rechazo agudo. En oncología para la localización de células tumorales y/o su destrucción. Para ello los Anticuerpos específicos frente a antígenos tumorales tales como el antígeno carcinoembrionario pueden ser marcados con sustancias radioactivas, como por ejemplo In111 o Tc99, y así localizar su situación en el organismo mediante una gammacamara especial cuando son administrados a individuos afectos de tumores. También los Anticuerpos Monoclonales pueden ser utilizados en la destrucción de células tumorales en oncología, para lo cual los Anticuerpos son marcados con drogas citostáticas y citotóxicas. En esta panorámica general de la utilización de los Anticuerpos monoclonales, asistimos hoy a una impresionante dispersión hacia otros muchos campos, lo cual permite vislumbrar esperanzadores horizontes a partir de una técnica que en principio surgió simplemente de la pretensión de desvelar la organización y expresión genética de las inmunologlobulinas, lo que acabo constituyendo un verdadero hito en la historia de la medicina y las ciencias biológicas. Así pues, paulatinamente, los Anticuerpos monoclonales van sustituyendo a los antisueros convencionales en base a las ventajas que su uso conlleva y en tanto que pueden producirse industrialmente. Se expone un esquema del procedimiento seguido para la producción de AcMo para su posterior utilización tanto en el laboratorio como en la clínica como medio terapéutico y diagnóstico. 75 UNIDADDIDÁCTICAVI SISTEMADEHISTOCOMPATIBILIDAD AutoinmunidadHumana 6.1Introducciónsistemadehistocompatibilidad Las moléculas de histocompatibilidad fueron inicialmente descubiertas por ser las principales responsables de las reacciones de rechazo de tejidos trasplantados entre individuos de la misma especie. Los loci genéticos reguladores de la síntesis de estos antígenos se agrupan en una región denominada Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) y se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel. Una de las principales características de estas moléculas es su extraordinario polimorfismo. Hoy día se considera que las moléculas de histocompatibilidad tienen como función principal recoger péptidos del interior de la célula, transportarlos a la superficie celular y allí presentarlos a las células T. Las moléculas de histocompatibilidad se localizan en la superficie de las células de las distintas especies animales. El primer antígeno de histocompatibilidad (humano) descrito fue Mac (en la actualidad definido como HLA‑A2), descubierto por Jean Dausset en 1958. Pronto se vio que existía una relación entre estos antígenos y la supervivencia de riñones trasplantados. En la actualidad, son ya centenares los antígenos de este tipo que se han definido gracias a las intensas colaboraciones establecidas entre los laboratorios que trabajan en histocompatibilidad, a través de los Workshops Internacionales de Histocompatibilidad que desde 1964 se celebran periódicamente. En este capítulo estudiaremos la estructura de estas moléculas y la organización de los genes que las codifican. Su función en el procesamiento y presentación de péptidos se estudiará en el capítulo siguiente. 6.2Estructuradelasmoléculasdehistocompatibilidad Según su estructura las moléculas de histocompatibilidad se dividen en dos grandes grupos: moléculas de clase I y moléculas de clase II que se encuentran codificadas por regiones genéticas distintas dentro del MHC y desempeñan distintas funciones inmunológicas. 79 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 6.2.1EstructuradelasmoléculasHLAclaseI Las moléculas de los antígenos de histocompatibilidad de clase I, tanto en el sistema HLA como en el H‑2, se hallan constituidas por 2 cadenas polipeptídicas: una cadena pesada, glicosilada, de mayor tamaño, con un peso molecular de 45 kD, que se encuentra asociada, mediante interacciones no covalentes a una cadena ligera, la beta‑2‑microglobulina que tiene un peso molecular aproximado de 12.5 kD. La beta‑2‑microglobulina, polipéptido idéntico al componente sérico normal, es idéntica en todos los individuos de la misma especie y los genes que la codifican no se encuentran en el MHC, situándose en el cromosoma 16, en el hombre. El análisis estructural de la beta‑2‑microglubulina revela que pertenece a la superfamilia de las Inmunoglobulina, con una notoria homología con el tercer dominio constante de la cadena pesada de las Inmunoglobulina. La cadena pesada, por el contrario, es altamente variable entre individuos de la misma especie, siendo la responsable del polimorfismo antigénico de las moléculas de histocompatibilidad clase I. Se distinguen tres zonas bien definidas, una zona extra­celular de mayor tamaño en la que se encuentran los determinan­tes antigénicos de la molécula, una pequeña región transmembrana, hidrófoba, y finalmente una región intracitoplasmática de unos 35 aminoácidos. La zona extracelular se halla organizada en tres dominios de aproximadamente unos 90 residuos cada uno, denominados alfa-1, alfa-2 y alfa-3 mantenidos por la existencia de puentes intracatenarios. Los residuos glucídicos se encuentran unidos a la asparagina en la posición 86 del dominio alfa-1. Los dominios alfa-1 y alfa-2 constituyen regiones de contenido variable en aminoácidos, es decir son las zonas donde radica la variabilidad de la molécula. Por el contrario el dominio alfa-3 es bastante constante, pertenece a la superfamilia de las Igs y por tanto muestra una notable homología con la región constante de las Inmunoglobulina y con la beta‑2‑microglobulina. 80 AutoinmunidadHumana 6.2.2EstructuradelasmoléculasHLAclaseII Las moléculas de clase II son glicoproteínas que se encuentran en la superficie celular. Están formadas por dos cadenas, ambas con un dominio transmembrana, denominadas cadena a o pesada y cadena b o ligera, asociadas entre sí mediante interacciones de naturaleza no covalente. Tanto la cadena a como la cadena b se encuentran codificadas por genes situados en el MHC. La cadena a tiene un peso molecular aproximado de 33kD y la cadena b de 29 kD. Ambas cadenas tienen una organización semejante. Están constituidas por dos dominios extracelulares y se conocen con las denominaciones de a.1 y a‑2 en la cadena pesada y b‑1 y b‑2 en la cadena ligera. Cada uno de estos dominios consta de 90‑96 aminoácidos. El dominio a‑1 es abierto mientras que los dominios alfa-2, beta‑1 y beta‑2 se pliegan mediante un puente disulfuro cada uno de ellos. Cuando se analizan los aminoácidos de las cadenas ligeras, se observa que los dominios a‑2 y b‑2 pertenecen a la superfamilia de las Igs, mientras que los a‑1 y b‑1, que son los que presentan mayor diversidad presentan homología con los dominios alfa-1 y alfa-2 de los antígenos de clase I. Se aprecian tres zonas donde es más frecuente la variabilidad. Un tercer dominio corresponde a la región de cada cadena que atraviesa la membrana celular, contiene unos 30 aminoácidos y es de naturaleza hidrofóbica. Finalmente, el cuarto dominio, corresponde a la parte citoplasmática de la molécula, es de naturaleza hidrofílica y contiene de 10 a 16 aminoácidos. 6.2.3Estructuratridimensional El análisis de la estructura tridimensional de los antígenos de histocompatibilidad de clase I y clase II, determinada mediante cristalografía, demuestra que los dominios están estructurados de forma diferente. Así, dentro de los antígenos de clase I, el dominio alfa-3 y la beta‑2‑microglobulina están organizados en estructura de hoja plegada b. Por el contrario los dominios a1 y a2 constan cada uno de ellos de una sola zona forma­da por cuatro fragmentos en estructura de hoja plegada b seguido de otro segmento organizado en forma de a-hélice. Esta organización delimita una hendidura denominada sitio de unión al péptido (peptide binding groove) en el que los residuos más polimórficos se encuentran en el suelo y las paredes de la hendidura. En esa hendidura se localiza un péptido que no pertenece a la molécula y de aproximadamente 8‑10 aminoácidos. Ese péptido procede de proteínas endógenas, como veremos en el capítulo siguiente e interacciona con las moléculas de histocompatibilidad mediante fuerzas no covalentes entre sitios concretos de ambas estructuras. Un determinado antígeno de histocompatibilidad puede unirse a péptidos diferentes siempre que éstos posean uno o varios motivos que interaccionen con zonas de la molécula cuya estructura suele estar condicionada por residuos polimórficos. 6.2.4DistribucióntisulardelasmoléculasclaseIyII Las moléculas de clase I se encuentran presentes en la mayoría de las células nucleares del organismo pero no en todas, dado que, en algunas localizaciones, su expresión es mínima o incluso nula, como sucede en el endotelio, glándulas de Brunner duodena­les, trofoblasto velloso o neuronas del sistema nervioso central. La expresión de las moléculas de clase II se encuentra fundamentalmente restringida a macrófagos, monocitos, linfocitos B y cuando están activados también en linfocitos T y NK. Igualmente se encuentra expresado en alta densidad en otras células que actúan como presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas del bazo, 81 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico epidérmicas de Langerhans o células endoteliales. También se encuentran en progenitores hematopoyéticos, células leucémicas y células de diferentes tipos de tumores. Esta distribución diferencial de las moléculas de histocompatibilidad de clase I y II se encuentra directamente relacionada con la diferente función de cada tipo de moléculas. Los niveles relativos de las moléculas HLA en diferentes órganos y tejidos son muy variados. 6.2.5Otrasmoléculasdehistocompatibilidad Existen otras moléculas de histocompatibilidad entre las que destacan de manera más significativa: HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan una gran homología con las moléculas clásicas de MHC de clase I (HLA-A, -B y -C). HLA-E: La estructura tridimensional de la molécula de HLA-E, es muy similar a la de las moléculas clásicas HLA-A, B y C presentando sitios de unión conservados para la b-2microglobulina y al CD8. Esta molécula, cuando presenta el péptido adecuado, se une a los receptores CD94/NKG2A que inhiben la actividad citotóxica de las NK y ciertos linfocitos T. En la actualidad se ha descubierto que la proteína UL40 presente en los citomegalovirus, es capaz de unirse ella, y provocar una cascada de inhibición en las células NK. HLA-F: Se sabe que esta molécula se expresa principalmente en amígdalas, bazo y timo. La localización de la proteína es intracelular. Además, está descrito que los tetrámeros de HLA-F se unen a los receptores ILTR2 (LIR1) y ILTR4 (LIR2) que son receptores inhibidores de leucocitos. HLA-G: La molécula HLA-G pertenece a la familia de moléculas de histocompatibilidad no clásicas y se caracterizan por un limitado polimorfismo y una distribución celular y tisular restringida al trofoblasto fetal y células del epitelio tímico. Esta molécula puede presentarse en siete isoformas distintas, codificadas por splicing alternativo, cuatro de ellas son proteínas unidas a membrana (HLA-G1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas que son proteínas solubles (HLA-G5, G6 Y G7). Otras características de esta molécula son: Es reconocida por ciertos receptores inhibidores, tales como KIR2DL4, ILT-2 y ILT-4 y, en consecuencia posee, capacidad de inhibir la lisis mediada por células NK y ciertas células T. 82 AutoinmunidadHumana Está relacionada con la inducción de tolerancia materno-fetal. Se ha demostrado que la molécula HLA-G es capaz de inhibir la actividad de las células NK de los leucocitos de la decídua sobre los trofoblastos durante el primer trimestre de gestación Parece participar en la vigilancia del sistema inmune frente a tumores y se ha descubierto un aumento en el nivel de la expresión de esta molécula en la superficie de las células infectadas por el HIV, que podría ser una forma del virus de escapar de la destrucción por el sistema inmune. Familia de moléculas CD1. Los antígenos CD1 son glicoproteínas no polimórficas constituídos por una cadena pesada de 43-49 kDa que, en muchos casos, se asocia con la beta-2-microglobulina (beta-2-m). Se ha definido como una molécula presentadora de antígeno presente en la mayoría de los mamíferos encontrándose tanto en las células dendríticas como en timocitos. 6.3Genéticadelcomplejomayordehistocompatibilidad Como ya se ha dicho, los genes que codifican las moléculas cuya estructura y función hemos estudiado, se encuentran agrupados en el genoma formando el Complejo Mayor de Histocompatibilidad y en el humano contiene al menos 50 genes distintos. 6.3.1Complejomayordehistocompatibilidadenelhombre El Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el hombre está constituido por un grupo de genes situado en el brazo corto del cromosoma 6. El complejo mayor de histocompatibilidad humano es donde se codifican los loci que de los distintos antígenos HLA clase I y II. Entre los de clase I se encuentran los genes que codifican las cadenas a de los antígenos HLA‑A, HLA‑B y HLA‑C y entre los de clase II se encuentran los pares de genes que codifican las cadenas alfa y beta de los antígenos HLA‑DR, HLA‑DQ y HLA‑DP. Este grupo de genes se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel, como caracteres codominantes simples. La región genética de un cromosoma que contiene todos los genes HLA (a excepción de los que codifican la beta‑2‑microglobulina) se denomina haplotipo HLA. Así pues un haplotipo HLA incluye los genes clase I: HLA‑A, HLA‑B y HLA‑C y los genes clase II: HLA‑DR, HLA‑DQ y HLA‑ DP. y otros loci que codifican moléculas implicadas en el procesamiento de péptidos como son los genes TAP 83 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico cuyos productos están implicados en la transferencia de péptidos del citosol al retículo endoplásmico y los genes LMP que codifican componentes del proteosoma responsable de transformar proteínas en péptidos que posteriormente serán presentados en la superficie celular. Asimismo en esta región se encuentran los genes que codifican algunos factores del complemento, la enzima 21‑hidroxilasa, la citocina TNF-alfa y otros genes y pseudogenes con homología estructural con los genes clase I y clase II con limitado polimorfismo y cuya función aun se encuentra insuficientemente aclarada. Cada célula del organismo, (excepto las células germinales), poseen un haplotipo procedente del padre y otro de la madre. La mayoría de los genes del MHC son altamente polimórficos, es decir pueden ser estructuralmente diferentes entre individuos de la misma especie. No obstante, como se vio al hablar de la estructura, existen zonas muy conservadas, prácticamente idénticas en todos los individuos y zonas altamente variables. 84 AutoinmunidadHumana Probablemente el estudio del polimorfismo de esta región ayudará a comprender por qué unas personas desarrollan unas enfermedades y otras no, en todo caso este avance será una importante herramienta para el estudio filogenético, la biología y la evolución de las familias de multigenes, las poblaciones y la enfermedad. 6.3.2LociHLA‑A,B,C La región que codifica las moléculas de clase I está dividida en tres loci, conocidos como A, B y C, que codifican tres tipos de cadenas pesadas para las distintas moléculas de clase I. Algunos de estos genes han sido estudiados me­diante técnicas de hibridación de DNA y se ha demostrado que se encuentran divididos en exones e intrones, encontrándose una estructuración homóloga a los genes que codifican la b‑2 microglobulina, las Inmunoglobulina y otros tipos de proteínas. El prototipo de gen que codifica moléculas de clase I, se encuentra dividido en 8 exones, cada uno de los cuales, se corresponde a cada dominio estructural de la molécula. Si bien se conoce con precisión la función de estas tres familias de antígenos de histocompatibilidad de clase I expresados en la superficie celular, se ha demostrado la existencia de otros genes que también codifican otros antígenos HLA de clase I con menor polimorfismo y cuya expresión es variable, tanto en su distribución tisular como en la densidad en la membrana celular. Entre estos genes se incluyen: HLA‑E, HLA‑F y HLA‑G. • Gen HLA-E: Este gen presenta una secuencia parecida a la molécula Qa1 murina, que une péptidos hidrofílicos de la secuencia leader de las moléculas MHC clásicas. Se expresa en pequeñas cantidades en la superficie de la célula, y su expresión está regulada por la presencia de las otras moléculas de histocompatibilidad presentadas en la superficie celular y es TAP dependiente. • Gen HLA- F: Este gen es muy similar en estructura y secuencia a los genes de las moléculas clásicas. Se trancribe en una gran variedad de células y tejidos presentando un polimorfismo limitado. • Gen HLA-G: Este gen presenta la estructura típica de la HLA clase I y su expresión parece estar restringida a la placenta y se asocia con funciones de caracter tolerogénico. 6.3.3RegiónHLA‑D En la región D se localizan los genes que codifican las moléculas HLA‑DR, HLA‑DQ y HLA‑DP. Su análisis bioquímico demuestra que se trata de moléculas de clase II compuestas, como ya hemos indicado, por una cadena a y otra b. Las moléculas HLA‑DR y HLA‑DQ se estudiaron por serología y los antígenos HLA‑DP fueron inicialmente definidos por estudios funcionales, mediante estimulación secundaria de linfo­citos previamente sensibilizados (PLT). El empleo de técnicas de biología molecular ha permitido el aislamiento y secuenciación de los genes de esta región, de manera que hoy se conoce con precisión que la región D posee un elevado número de genes. 85 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 6.3.4TipajeHLA Se denomina tipaje HLA, al análisis llevado a cabo en el laboratorio para conocer los alelos HLA de un determinado individuo mediante métodos serológicos, análisis de genes por biología molecular y métodos celulares. El tipaje HLA tiene especial interés en las siguientes situaciones: - Estudio de la asociación con distintas formas clínicas de una enfermedad. Por ejemplo la diabetes insulino-dependiente está asociada a DR3 y DR4. - En trasplantes de órganos y medula ósea. - Estudios de filiación familiar. 6.4Métodoserológico El método serológico más comúnmente utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad, que se realiza enfrentando una población de linfocitos a una batería de sueros o Anticuerpos monoclonales que son específicos para cada uno de los antígenos posibles. Posteriormente se añade complemento de tal manera que en los pocillos en los que se encuentre el antisuero específico para los antígenos de un individuo determinado, se producirá la lisis celular que podrá ser visualizada al microscopio. Para visualizar la lisis, actualmente se usan una técnica fluorescente con una mezcla de anaranjado de acridina y bromuro de etidio. El bromuro de etidio se fija al ADN de las células muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al anaranjado de acridina que tiñe a las células vivas de color verde brillante. Los cultivos se incuban y se hacen las lecturas de viabilidad celular. Para llevar a cabo la tipificación de los antígenos de clase II se utilizan poblaciones purificadas de linfocitos B, ya que en estas células los antígenos de clase II se expresan más abundantemente que en los linfocitos T (de hecho, las células T expresan cantidades significativas de moléculas MHC de clase II sólo cuando están activadas). Los linfocitos B se separan haciendo pasar suspensiones de lin­focitos totales a través de una columna empaquetada con fibra de nylon. Por sus propiedades adherentes, las células B se retienen en el nylon y posteriormente se despegan por manipulación mecánica de la columna de la que previamente se han eliminado, por lavado, las células no adherentes. Existe a su vez, otro método más utilizado y menos perjudicial para la separación de las células B que 86 AutoinmunidadHumana consiste en el uso de microesferas magnéticas acopladas a Anticuerpos contra antígenos específicos de estas células (el antígeno CD19, por ejemplo). La sangre se mezcla con las esferas y luego éstas se separan en un campo magnético (con un imán) y se lavan para proceder a su tipificación por serología. 6.5Métodosdebilogíamolecular Las técnicas de biología molecular más usadas (no las únicas) para detectar polimorfismos en el ADN utilizan los métodos de: a) Secuenciación directa del ADN b) Análisis del tamaño de los fragmentos de restricción del ADN (RFLP restriction fragment lenght polymorphism) c) Reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) La secuenciación directa del ADN no es práctica para su uso rutinario. Actualmente son utilizadas técnicas de PCR-SBT en la que se secuencian los fragmentos amplificados mediante PCR. La técnica de RFLP incluye la fragmentación del ADN con enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos, la transferencia de los fragmentos separados a membranas de nylon, la hibrida­ción con sondas, de secuencias conocidas, marcadas con isótopos radiactivos o con enzimas y la detección del producto por autorradiografía, quimioluminescencia o colorimetría. La técnica de PCR permite amplificar segmentos particulares de ADN en pocas horas (ver capitulo sobre métodos inmunológicos). Las técnicas que actualmente más se utilizan para realizar tipaje HLA son PCR-SSO y PCR-SSP. La PCR-SSO que se basa en: amplificación de la zona polimórfica del ADN por PCR, hibridación con oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO) fijados a membranas de nylon. Con la técnica de PCR-SSP (Primers específicos de secuencia) sólo se consigue amplificación en aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para los que son específicos por lo tanto lo único que se hace es probar la existencia o no de los productos amplificados. 6.6Métodoscelulares También existe la posibilidad de detectar los antígenos de histocompatibilidad por métodos celulares mediante el cultivo de mezclas de linfocitos, del donante y del receptor. Esta reacción que se conoce como CML (cultivo mixto de linfocitos), se basa en la propiedad que tienen los linfocitos de proliferar cuando se incuban en presencia de linfocitos portadores de antígenos HLA diferentes. Los linfocitos con antígenos idénticos no estimulan las respuestas proliferativas entre ellos. La proliferación celular se puede cuantificar utilizando diferentes técnicas, aunque la más común mide la incorporación de timidina tritiada (3HT) por las células proliferantes. En una variante de la reacción, denominada CML unidireccional, las células estimuladoras se tratan previamente con mitomicina C para inhibir su capacidad de división celular, sin modificar su viabilidad (la mitomicina se combina con los husos cromáticos evitando la segregación cromosómica y la mitosis) y así las células sólo funcionan como antígeno. Los cultivos de células mezcladas se mantienen de 72 a 96 horas antes de adicionar la timidina radiactiva. De 4 a 18 horas después las células se colectan, se lavan y se procesan para determinar la cantidad de radiactividad incorporada. La incorporación de 3HT se establece midiendo la emisión de radiación beta en un contador de centelleo y los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm). 87 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 6.6.1OtrosgenesdelsistemaHLA Situados en el complejo HLA se encuentran un grupo de genes que codifican tanto el componente Bf de la cascada alternativa del complemento, como los componentes de la vía clásica C2 y C4 que se estudian en el capítulo dedicado al complemtno. Otros genes de esta región y de interés en la respuesta inmune son los genes que codifican: 1. Las formas alfa y beta del factor de necrosis tumoral (TNF-alfa). 2. HSP (Heat Shock Protein). 3. lmp que codifican los componentes del proteosoma y 4. TAP1 y 2 que son proteínas transportadoras. 6.7Mecanismosdegeneracióndelpolimorfismo El polimorfismo del MHC es el resultado de un largo proceso de evolución a lo largo de miles de millones de años como consecuencia de la presión evolutiva ejercida por los agentes infecciosos. Para la generación de este elevado polimorfismo el MHC ha utilizado diferentes mecanismos que han contribuido de diferente forma a la creación de nuevos alelos. Así, algunos son el resultado de mutaciones puntuales mientras que otros proceden de la combinación de secuencias completas entre diferentes alelos, bien mediante un proceso de recombinación génica o bien mediante el proceso denominado conversión génica, según el cual una secuencia es reemplazada por otra semejante de un gen homólogo. La recombinación entre alelos del mismo locus parece ser el mecanismo más frecuentemente utilizado para la creación del polimorfismo y así muchos alelos diferentes pueden proceder de procesos de recombinación repetidos a partir de un pequeño número de genes ancestrales. La existencia de este proceso evolutivo apoya que el polimorfismo es esencial para la función de los antígenos de histocompatibilidad. 88 AutoinmunidadHumana 6.8Funcióndelasmoléculasdehistocompatibilidad Las moléculas de histocompatibilidad presentes en las células del organismo son marcadores para las células del sistema inmunitario de "lo propio" (el yo inmunológico) e intervienen de manera fundamental en la educación tímica de los linfocitos T. La función biológica de las moléculas de histocompatibilidad es la de presentar péptidos antigénicos para la activación de los linfocitos T. Los linfocitos T que reconocen moléculas HLA clase I y su péptido pertenecen a la subpoblación citotóxica. Las células T que reconocen moléculas HLA clase II en su la mayoría tienen función reguladora produciendo citocinas. Las moléculas de histocompatibilidad de un individuo son antigénicas para otro y por lo tanto activan el sistema inmune (rechazo de trasplantes). 6.8.1HLAyEnfermedad Desde hace varias décadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociación cuando tiene un valor estadísticamente significativo, se viene considerando como un factor de susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer la enfermedad, que puede cifrarse estadísticamente como “riesgo relativo” (RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad que tiene un sujeto a padecer una determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo HLA con respecto a aquellos individuos que no lo tienen. Las causas de esta asociación HLA y enfermedad no son conocidas completamente. En el caso de la diabetes mellitus insulin dependiente (DMID), enfermedad que cursa con una destrucción selectiva de los islotes de Langerhans del páncreas, con infiltración linfocitaria, se considera que es el resultado de una respuesta autoagresiva frente a antígenos presentes en la membrana celular mediada por linfocitos T. 89 UNIDADDIDÁCTICAVII PROCESAMIENTODEANTÍGENOS AutoinmunidadHumana 7.1Introducciónprocesamientodeantígenos Los linfocitos, las únicas células con receptores específicos de antígeno, son responsables de iniciar y llevar a cabo la respuesta inmune adaptativa. Los linfocitos B interaccionan con el antígeno mediante su receptor (BCR), una Inmunoglobulina de membrana (mIg) que reconoce determinantes antigénicos tridimensionales en proteínas y otras moléculas antigénicas, solubles o particuladas, en estado nativo. En cambio, el receptor clonotípico de los linfocitos T (TCR) reconoce complejos moleculares en la membrana de las células presentadoras de antígeno (APC), formados por moléculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) de clase I (MHC-I) o de clase II (MHC-II) (ver más adelante) y péptidos antigénicos resultantes de la degradación intracelular del antígeno. Las células T, por tanto, a diferencia de los linfocitos B, necesitan de células presentadoras de antígeno (APC) accesorias que captan el antígeno, lo procesan y lo presentan en la membrana. El TCR interacciona molecularmente con el péptido contenido en la cavidad de las moléculas del MHC y con las propias moléculas presentadoras, de forma que el reconocimiento del antígeno por el linfocito T, tal como se ha visto en capítulos anteriores, queda restringido por el MHC (Figura 6.1). El fenómeno de la restricción por el MHC del reconocimiento de antígeno fue originalmente descrito por Zinkernagel y Doherty (1974) en la respuesta de los linfocitos T al virus de la linfocoriomeningitis (LCV). Estos investigadores demostraron que las células T citotóxicas específicas de virus sólo reconocen las células infectadas si éstas expresan determinadas moléculas de histocompatibilidad en su superficie. Este trabajo mereció el Premio Nobel de Medicina en 1996. 7.2CÉLULASPRESENTADORASDEANTÍGENO Los requerimientos para la presentación de antígeno son: capacidad de captación de antígenos del medio externo, maquinaria proteolítica eficiente que permita la degradación del antígeno en péptidos capaz de ser presentado, expresión de moléculas de MHC-II y expresión de moléculas coestimuladoras y de adhesión. Los tres tipos celulares que cumplen en diferentes grados estos requisitos, llamadas APC profesionales, son las células dendríticas, los macrófagos y los linfocitos B. Existen otras estirpes celulares que, aún no siendo APCs profesionales, son capaces de expresar moléculas de MHC-II bajo determinadas condiciones. 7.2.1Célulasdendríticas Las células dendríticas derivan de la médula ósea, son de linaje mieloide y tienen una morfología irregular con prolongaciones membranosas. Las células dendríticas se generan en la médula ósea desde donde migran en estado inmaduro a los tejidos periféricos, por ejemplo las células de Langerhans de la piel. Mientras están en estado inmaduro, las células dendríticas tienen gran capacidad de captación de antígeno del medio y una maquinaria proteolítica eficiente, expresan bajos niveles de MHC y de moléculas coestimulatorias; expresan receptores Fc (CD32), de manosa y de complemento, implicados en captación de antígeno por endocitosis, fagocitosis y, sobre todo, macropinocitosis. Al activarse su maduración en presencia de citocinas inflamatorias, aumenta considerablemente su capacidad de macropinocitosis y la expresión de receptores que permiten la captación de antígeno; también se activa la 93 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico síntesis de moléculas de MHC-I y II que unirán con gran eficiencia tanto péptidos originados en la propia célula dendrítica como péptidos externos que se hallan en el lugar de inflamación. Desde el sitio de la herida, las células dendríticas maduras expresan un alto número de complejos MHC/péptido de alta estabilidad en su membrana, paran la síntesis de novo de MHC, pierden la capacidad de captación de antígeno y la expresión de algunos receptores iniciando su migración los órganos linfoides secundarios (ganglios linfáticos, bazo o mucosas). Durante el transporte de los tejidos periféricos a los órganos linfoides por los vasos linfáticos, las células cambian de morfología y reciben el nombre de células veladas (veiled cells). A su llegada a los órganos linfoides secundarios, las células dendríticas maduras se emplazan en las zonas ricas en células T (recibiendo el nombre de células dendríticas interdigitantes) donde realizan su función de presentar péptidos a células T específicas que allí se encuentren, iniciándose así la respuesta inmune contra el agente agresor. Las células dendríticas son especialmente eficientes en la activación y estimulación de células T pre-inmunes, tanto CD8 como CD4. Mediante la unión de péptidos exógenos o endógenos a sus moléculas de MHC-I, altamente expresadas, pueden iniciar una respuesta de células T CD8+, incluso simultánea a la activación de células T CD4+. Por otra parte, se las ha propuesto como responsables en gran parte del mantenimiento de la memoria T ya que los complejos MHC-II/péptido formados permanecen expuestos en su membrana durante un período de tiempo largo proporcionando a las células T de memoria un contacto continuado con el antígeno que las ha estimulado en la respuesta primaria. 7.2.2Macrófagos Los macrófagos son células fagocíticas mononucleares de linaje mieloide y con gran capacidad de procesamiento de antígenos tanto solubles como particulados. Los macrófagos inmaduros de sangre periférica se denominan monocitos. Los macrófagos diferenciados localizados en tejidos se encargan de eliminar restos celulares in situ. Estos macrófagos diferenciados son residentes esenciales de los tejidos linfoides, pero también se encuentran en otras localizaciones, en suspensión o integrados en tejidos sólidos; allí reciben distintos nombres y, aunque mantienen sus propiedades principales, adquieren características específicas al diferenciarse en los diferentes tejidos. Los macrófagos en suspensión son células muy activas en la eliminación de partículas extrañas y restos celulares, entre ellos se encuentran principalmente los peritoneales y los alveolares. Los macrófagos de tejido sólido son más especializados, por ejemplo las células de Kupffer del hígado son responsables de la eliminación de productos particulados y bacterias de la circulación sanguínea. Entre este grupo se agrupan las células de la microglía del sistema nervioso central, los osteoclastos del tejido óseo o las células mesangiales del glomérulo renal, entre otros. Los macrófagos activados en el lugar de infección inician un proceso de fagocitosis muy activo mediante receptores específicos, receptores tipo toll (TLR) y receptores scavenger, capaces de reconocer patrones moleculares (PAMPS) expresados en los patógenos. Los macrófagos también pueden endocitar antígenos opsonizados con moléculas del complemento o Anticuerpos, vía receptores del complemento o receptores Fc (CD64, CD32, CD23). Los monocitos y macrófagos no activados expresan niveles bajos de MHC-II, en cambio en los macrófagos activados se induce la expresión de moléculas de clase II y las moléculas accesorias en su superfície que aumentan su capacidad de presentación de antígeno. Consecuencia de la activación, los macrófagos secretan quimiocinas que reclutan células inflamatorias y citocinas implicadas en la activación de las células T como IL-12 dirigiendo la respuesta adaptativa en las fases iniciales. 94 AutoinmunidadHumana 7.2.3LinfocitosB Los linfocitos B pueden actuar como células presentadoras de antígeno ya que expresan MHC-II constitutivamente, expresión que aumenta cuando se activan, aunque su capacidad de captación de antígeno es muy baja. Sin embargo, los linfocitos B son células presentadoras muy eficientes si expresan una Inmunoglobulina de superficie (BCR) específica del antígeno. La eficiencia de la presentación de un antígeno por células B aumenta 100-1000 veces cuando el antígeno se internaliza tras su unión con el BCR, permitiendo que un antígeno se presente con gran eficiencia incluso en bajas concentraciones. La presentación de antígeno a linfocitos T específicos es parte esencial de la completa activación y diferenciación de la célula B en célula plasmática productora de Anticuerpos, ya que para este proceso, los linfocitos B requieren de la colaboración de los linfocitos T. La presentación de antígeno es su forma de obtener esta colaboración. La interacción entre células T y B específicas del mismo antígeno requiere segundas señales producidas a partir de la interacción entre CD40 en la célula B y CD40L en la célula T y por la interacción entre la IL-4 producida por los linfocitos T y su receptor en la célula B. El papel de las células B como APC se refuerza en la respuesta secundaria contra el antígeno, ya que existen un mayor número de células B específicas expandidas durante la respuesta primaria. 7.2.4APCSnoprofesionales En humanos, las células endoteliales expresan moléculas del MHC-II y moléculas accesorias que aumentan en condiciones de inflamación y se las ha implicado en la presentación de antígeno en reacciones de hipersensibilidad retardada en tejidos periféricos. Además existen otras células, como las epiteliales o los fibroblastos que en presencia de citocinas, especialmente IFN-gamma, expresan MHC-II y como consecuencia podrían presentar antígeno en determinadas situaciones. Por otra parte, todas las células nucleadas que expresan MHC-I pueden presentar antígeno a células T CD8+ aunque no son capaces de iniciar una respuesta inmune. 7.3Captaciónyprocesamientodeantígeno El procesamiento de antígeno es el conjunto de mecanismos de degradación de antígenos tanto exógenos como endógenos para su presentación a células T una vez unidos a las moléculas de MHC de clase II. 7.3.1CaptacióndeAntígenoExógeno Las células captan antígeno exógeno por endocitosis, mediada o no por receptor, proceso por el que la célula incorpora en su citoplasma materiales del medio externo. Se distinguen dos tipos de endocitosis: pinocitosis y fagocitosis. Pinocitosis es la captación de líquido extracelular en el que se hallan los antígenos en forma soluble, llamada macropinocitosis cuando la célula es capaz de captar grandes volúmenes de fluido que después concentra, mecanismo clásico de las células dendríticas. La fagocitosis es un proceso utilizado por fagocitos mononucleares, neutrófilos y otras células para ingerir y eliminar partículas de gran tamaño, incluídos agentes infecciosos, células seniles y restos celulares. La internalización de la partícula se inicia por la interacción de receptores en la superficie de la célula con ligandos de la superficie de la partícula o por simple invaginación mecánica de la membrana. 95 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Después de la internalización, la vesícula formada (endosoma o fagosoma) madura por fusión con compartimentos de la vía endocítica en varios pasos, que culminan en la formación de lisosomas. La vía endocítica está constituída por distintos tipos de vesículas cuyo contenido se va modificando a medida que van madurando en el interior de la célula. El pH del interior de estas vesículas es bajo y va acidificándose a medida que éstas van evolucionando hacía lisosomas. Las primeras vesículas de la vía endocítica son los endosomas tempranos que evolucionan a endosomas tardíos, pasan a prelisosomas y finalmente se transforman en lisosomas. Los diferentes compartimentos contienen distintas proteasas que los caracterizan. El procesamiento de antígeno consiste en la desnaturalización y proteolisis de las proteínas captadas en las vesículas acídicas. Las proteasas son activas a pH bajo de forma que si tratamos las APCs con agentes lisosomotrópicos que alcalinizan las vesículas endocíticas, como la cloroquina o el cloruro amónico, se bloquea el procesamiento, la generación de péptidos y, por tanto, la presentación del antígeno. 7.4BiosíntesisdelasmoléculasdelMHC Las moléculas del MHC son glicoproteínas de membrana cuya función es presentar el antígeno en forma de péptidos a los linfocitos T en la respuesta immune. Las moléculas del MHC se dividen en dos clases: de clase I y de clase II y, aunque ambas son proteínas de membrana, la vía biosintética y de exocitosis que utilizan es distinta e influye en el tipo y origen de los péptidos que presentan. 7.4.1VíabiosintéticadeMHC‐I Las moléculas de clase I están formadas por una cadena pesada (cadena alfa) y la beta2-microglobulina (beta2-m) cuya asociación se lleva a cabo en el retículo endoplasmático (RE) con la ayuda de diversas chaperonas, desde donde siguen la ruta constitutiva de exocitosis hacia la membrana celular. Esto es, las moléculas del MHC-I generadas en el RE pasan al aparato de Golgi, después pasan a través del tras-Golgi y por vía vesicular, llegan a la membrana celular. Sin embargo, el heterodímero alfa-beta2m formado en el RE es inestable en condiciones fisológicas y requiere de la unión de un péptido para alcanzar una 96 AutoinmunidadHumana conformación estable que le permita la salida del retículo endoplásmico. La cadena pesada a se une a una molécula de 88 kDa llamada calnexina, chaperona de MHC-I por excelencia, que funciona uniéndose a proteínas de nueva síntesis que aún no se han plegado o ensamblado correctamente, reteniéndolas en el RE. Cuando la beta2m se une a la cadena a, la calnexina se desplaza para que MHC-I se una a otras chaperonas, entre ellas la calreticulina, cuya función es parecida a la calnexina. El complejo calreticulina-alfabeta2m se une a una tercera chaperona llamada tapasina que a su vez se une a la subunidad TAP1 del transportador de péptidos asociado a la membrana TAP (ver más adelante). Esta asociación estabiliza a los heterodímeros alfa-beta2m parcialmente plegados hasta que se asocian a un péptido. Los dímeros TAP, formados por las subunidades TAP-1 y TAP-2 se encargan de transportar péptidos de degradación citosólica al interior del RE. Cuando TAP proporciona un péptido con afinidad adecuada para poderse unir a la molécula de clase I, se forma el complejo estable MHC-I/péptido, que se separa de las chaperonas e inicia la vía de exocitosis hacia la superficie celular, donde queda expuesto el péptido para su posterior reconocimiento por un linfocito T CD8+ específico. 7.4.1.1TAP La mayoría de péptidos presentados por MHC-I derivan de proteínas citosólicas. Para transportar péptidos al interior del RE, las células han adaptado una molécula transportadora de una familia de moléculas conocida con el nombre de transportadoresABC (ATP-binding cassette (ABC)-transporters) encargados del transporte de iones, azúcares, aminoácidos e incluso proteínas. El transportador de péptidos, conocido con el nombre de TAP (Transporter Associated with antigen Processing) está compuesto por dos proteínas homólogas, TAP1 y TAP2. El heterodímero TAP1/TAP2 conserva las características esenciales de los transportadores-ABC: cada cadena contiene 6 dominios transmembrana, es decir, atraviesa 6 veces la membrana del RE, y dos dominios hidrofílicos de unión a ATP. Estas dos cadenas se disponen en la membrana con la posibilidad de generar un poro por el que accede el sustrato al interior del RE. El mecanismo de transporte propuesto de los péptidos generados en el citoplasma, es el siguiente: el péptido interacciona con la parte citoplasmática de TAP provocando la hidrólisis del ATP que induce un cambio conformacional del transportador permitiendo el paso del sustrato al lumen del RE. Las moléculas TAP se han descrito en humanos, ratones y ratas. Se ha demostradouna preferencia en el tamaño, de 8-12 aa, y de secuencia del péptido transportado, por lo que se ha involucrado a TAP en la selección de péptidos que se van a unir al MHC-I. La mayoría de los péptidos no se unen a MHC-I y son rápidamente transportados de nuevo al citosol donde son degradados por mecanismos aún desconocidos. Los genes que codifican las sub unidades TAP-1 y TAP-2 están dentro del MHC. 7.4.1.2Proteosoma Los péptidos transportados por TAP se generan por degradación de proteínas en el citosol celular. Existen varios sistemas de degradación de proteínas en el citosol de los cuales el complejo multicatalítico llamado proteasoma es el más directamente involucrado en la generación de péptidos para clase I. El proteasoma es un complejo proteico multienzimático de alto peso molecular resultado de la asociación de distintas subunidades con capacidad catalítica, muy abundante y ubicua, que se encuentra en arqueobacterias, eubacterias y eucariotas, y en estos últimos se localiza en el citosol y en el núcleo. 97 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 7.4.1.3VíabiosintéticadeMHC‐II Las moléculas del MHC de clase II están formadas por dos cadenas alfa y beta que se sintetizan en el RE, a las que posteriormente se une una cadena llamada invariable (Ii), no polimórfica. Los heterodímeros aparecen como agregados transitorios de elevado peso molecular, puesto que una vez se han ensamblado las dos cadenas se forman trímeros de dímeros alfa/beta. Por su parte la Ii una vez sintetizada también se dispone en forma de trímero generándose finalmente un nonámero formado por tres moléculas alfa/beta/Ii, (alfa/beta/Ii)3. 7.4.1.4Cadenainvariante La cadena invariable es una proteína de membrana que se une a los dímeros alfa/beta, ocupando el lugar de unión a péptido, impidiendo así la formación de complejos MHC-II/péptido en el RE. Además, la cadena invariante es la responsable de la desviación a la vía endocítica del complejo nonamérico (alfa/beta/Ii)3 y de la retención en la vía endocítica de los agregados inestables que se forman. En humanos se han descrito 4 isoformas de Ii, resultantes del procesamiento alternativo del RNA, aunque la forma predominante es la denominada p33. La cadena invariante tiene estructura lineal, lo que permite que el fragmento de Ii que se une a la cavidad bloquee perfectamente el acceso del péptido. 7.4.1.5HLA‐DMyHLA‐DO La molécula de DM es un heterodímero integrado en la membrana, formado por una molécula DMalfa y una DMbeta. DM se sintetiza en el RE, viaja por el aparato de Golgi y transGolgi desde donde se desvía a la vía endocítica, donde permanece por un tiempo. A diferencia de las moléculas de clase II, HLA-DM no se expresa en la superficie celular, lo que sugiere que dicha molécula actúa preferentemente en la vía endocítica. En 1994, dos estudios independientes demostraron que, en ausencia de HLA-DM, las moléculas de clase II no podían generar el complejo MHC-II/péptido, sugiriendo un papel esencial en el intercambio entre CLIP y los péptidos ubicados en la vía endocítica. HLA-DM se ha definido como catalizador del intercambio de péptidos en la cavidad del MHC-II, aunque parece ser que su principal función es de chaperona, mediando la retención en el MIIC de complejos alfa/beta vacíos o asociados a CLIP, hasta que se asocien con un péptido capaz de conferirles alta estabilidad. HLA-DO es otra molécula codificada en la región de clase II que interviene en la formación del complejo MHC-II/péptido. HLA-DO es un heterodímero formado por la unión de las cadenas DOalfa y DObeta al que se le ha atribuído un papel regulador de la función de DM en algunas células, incluyendo el epitelio tímico y las células B. 7.4.2Integracióndelasdosvías La presentación de antígeno exógeno se lleva a cabo mayoritariamente por las moléculas del MHC de clase II. Los antígenos exógenos entran en la APC por procesos de fagocitosis o de endocitosis, formándose vesículas que se fusionan con endosomas tempranos donde se inicia su degradación. La generación de péptidos es más intensa en los compartimentos más maduros debido a su contenido en enzimas y por tanto en ellos es más importante la formación de complejos MHC-II/péptido. Si después de este tránsito por todos los compartimentos de la vía endocítica, ni el péptido ni la molécula de clase II se han asociado, terminarán degradándose en los lisosomas. Las moléculas de membrana una vez expresadas están sometidas a procesos de internalización, formándose unas 98 AutoinmunidadHumana vesículas denominadas "coated-pits" que se fusionan con endosomas tempranos de reciente formación. Así pues, estas moléculas acceden a la vía endocítica donde, al igual que cualquier proteína extraña exógena incorporada a la célula por endocitosis, se degradan y, por tanto, pueden ser presentadas por moléculas MHC-II. Los antígenos endógenos citoplasmáticos tanto propios como sintetizados tras infección de la APC por un microorganismo, están sometidos a la maquinaria degradativa del citoplasma y se presentan preferentemente en el contexto de MHC-I. Los péptidos antigénicos generados en el citosol son transportados al RE por TAP y aquellos péptidos con afinidad por el alelo de clase I expresado en la célula formarán el complejo MHCI/péptido que finalmente se expresará en la membrana celular. 7.4.3Víasalternativas Existen excepciones a esta asociación. Por una parte, proteínas citosólicas parcialmente degradadas en el citoplasma pueden acceder a la vía endocítica por microfagocitosis o mediante chaperonas citoplásmicas (moléculas encargadas de conducir a otras moléculas a determinados compartimentos o localizaciones celulares) donde se degradan a péptidos capaces de formar complejos MHC-II/péptido, según su afinidad por el alelo de clase II expresado. A su vez, los péptidos generados en el citoplasma por degradación de proteínas endógenas, también pueden ser presentados por MHC-II aunque el mecanismo de acceso a la vía endocítica utilizado por estos péptidos es todavía desconocido. Por otra parte, los antígenos exógenos pueden acceder a la vía de clase I mediante dos mecanismos distintos: por rotura de la integridad de la membrana de un fagosoma, consecuencia de ello proteínas parcialmente fraccionadas escapan al citosol donde se degradan (presentación cruzada) o por proteolisis extracelular de proteínas de superfície por lo que los péptidos generados pueden unirse a un grupo minoritario de moléculas de clase I vacías, expresadas en la membrana de APCs profesionales como las células dendríticas. Las vías de procesamiento y presentación de antígeno endógeno y exógeno no son excluyentes. En la célula presentadora de antígeno profesional que expresa tanto moléculas de clase I como de clase II, en un estado de infección donde existe alta expresión de moléculas de MHC y una gran producción de antígeno extraño, todas las vías de presentación de antígeno coexistirán en la misma célula para cubrir todas las posibilidades de presentación de antígeno y combatir más efectivamente al patógeno. 99 UNIDADDIDÁCTICAVIII RECEPTORDECÉLULAST AutoinmunidadHumana 8.1IntroducciónreceptordecélulasT Los linfocitos T, presentan un mecanismo de reconocimiento antigénico distinto de los linfocitos B. En el caso de los linfocitos T, el antígeno endógeno o exógeno es primero degradado y procesado en el interior de las células presentadoras de antígeno (APC). Posteriormente, sus determinantes antigénicos procesados son expuestos en la superficie de la APC, en el seno de una molécula del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC de clase I o de clase II). El linfocito T, a través de su receptor clonotípico, únicamente reconoce al antígeno cuando éste se encuentra presente en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Asociados a las dos cadenas polipeptídicas polimórficas (alfa y beta o gamma y delta) que constituyen las dos variantes del TCR, se encuentra un grupo de moléculas monomórficas de membrana llamado colectivamente CD3, formando así el complejo TCR/CD3. Cuando tiene lugar el reconocimiento antigénico entre el TCR y la molécula MHC que porta el antígeno, se desencadena una cascada de reacciones bioquímicas en el citoplasma de la célula T, dando así lugar al proceso de activación. Las funciones del receptor clonotípico de la célula T son, durante el desarrollo en el timo del linaje T, participar en la selección positiva y negativa, y en la periferia el reconocimiento de antígenos exógenos. Estos fenómenos desembocan en la activación celular, durante la cual se inducen diversos programas funcionales en los linfocitos T: síntesis de factores de crecimiento y de maduración llamados linfocinas, síntesis de perforinas, selección clonal, proliferación celular, etc. En el reconocimiento antigénico, además del receptor clonotípico juegan un papel fundamental otras moléculas de superficie (entre ellas se encuentran CD4, CD8, CD2, CD45). 8.1.1SelecciónintratímicadeloslinfocitosT El desarrollo de las células T en el timo, está controlado por el TCR de los timocitos en dos estadios distintos. Primero, un homodímero TCR-beta asociado al complejo CD3 controla la expansión de los timocitos inmaduros, media la exclusión alélica del locus TCRalfa, inicia la expresión génica simultánea de CD4 y CD8, e induce la transcripción del locus TCR alfa. 103 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico En un segundo estadio, una vez que las células tienen el receptor formado por el heterodímero alfa/beta, la especificidad del TCR intervine controlando el proceso de maduración de los timoncitos de dos formas: - Seleccionando estas células para la maduración cuando reconocen las moléculas MHC de clase I y II de las células del epitelio cortical del timo (selección positiva). - Entre las seleccionadas positivamente, entran en una muerte celular programada (apoptosis) cuando sus receptores se unen con alta afinidad a un complejo MHC-péptido endógeno (selección negativa). 8.1.2SelecciónpositivadeloslinfocitosT En la selección positiva los timocitos se unen mediante su TCR con baja afinidad a las moléculas HLA clase I y II de las células epiteliales del timo en cuyo caso sobreviven mientras que aquellos timocitos que no participan en este tipo de unión mueren por apoptosis. En definitiva estos linfocitos que se seleccionan positivamente son rescatados de su muerte por apoptosis. En este proceso participan también los péptidos propios presentados por las moléculas de histocompatibilidad también propias de cada individuo. En este proceso también participan los receptores CD4 y CD8 de estos timocitos que como sabemos son doblemente positivos (CD4+ y CD8+). Incluso experimentos bloqueando con Anticuerpos monoclonales tanto los receptores CD4 como CD8 han demostrado que la participación de uno u otro de estos receptores hace que los timocitos deriven hacia linfocitos T citotóxicos o linfocitos T colaboradores, según que participe el receptor CD8 o CD4 respectivamente. Este tipo de selección se efectúa principalmente en el cortex del timo. 8.1.3SelecciónnegativadeloslinfocitosT Este tipo de selección conduce a la muerte por apoptosis de aquellos timocitos que reconocen con gran avidez mediante su TCR a las moléculas de histocompatibilidad I o II presentes en células dendríticas del timo. En este caso esta demostrado que los péptidos propios presentados por las moléculas HLA son de gran importancia. Este tipo de selección es especialmente importante eliminando aquellos clonos celulares que al reconocer lo propio (HLA más péptidos propios) pueden tener capacidad autoreactiva una vez han madurado. Precisamente al eliminar estas células se evita esto y la posibilidad de desarrollo de enfermedades Autoinmunes en el futuro. Es de destacar, que cuando este tipo de unión de alta afinidad se produce en células maduras, en lugar de muerte por apoptois, se produce una activación linfocitaria. Este tipo de selección se efectúa principalmente en la médula del timo.En conclusión con estos dos procesos se garantiza: - La supervivencia selectiva de los linfocitos T capaces de reconocer péptidos sobre las moléculas MHC del individuo en el que tendrán que trabajar (selección positiva) - La eliminación de los linfocitos T autorreactivos (selección negativa). 8.1.4ReconocimientodelantígenoporelreceptordelacélulaT Una vez en la periferia, el linfocito T tiene la capacidad de migrar a través del cuerpo, adhiriéndose tanto funcional como no funcionalmente a distintos tipos celulares, sobre los que reconoce antígenos exógenos. Por otro lado, una célula presentadora de 104 AutoinmunidadHumana antígeno que ha procesado una proteína antigénica determinada expresará en su superficie celular un largo número de diferentes complejos MHC/antígeno. Los péptidos que son reconocidos por las células T deben tener una estructura secundaria en a-hélice. Se ha visto que todos los péptidos antigénicos son anfipáticos, con una cara hidrofílica y otra hidrofóbica, pudiendo interaccionar una de las caras con el complejo TCR/CD3 y la otra con la molécula de MHC, respectivamente. Por esta razón, el reconocimiento de la asociación MHC/péptido antigénico es un proceso dinámico que incluye un primer paso de complejas interacciones célula-célula, antes de que se produzca un contacto productivo que dé lugar a la activación celular. 8.1.5Reconocimientodesuperantígenos Se denominan superantígenos a aquellos antígenos capaces de reaccionar con distintas moléculas MHC de clase II y TCR de un mismo individuo. Pueden ser exógenos (como las toxinas de ciertos estafilococos), si provienen del exterior, o endógenos (como el retrovirus MMTV), si se reproducen en la línea germinal. El reconocimiento del superantígeno se distingue del reconocimiento del péptido antigénico convencional por tres características fundamentales: - La especificidad de la célula T a los superantígenos está determinada por la región variable de la cadena beta, siendo independiente de otros componentes del receptor de la célula T. - El superantígeno tiene dos sitios de unión, uno para la molécula MHC de clase II, fuera de la hendidura de reconocimiento peptídico, y otro para el TCR, situado en la región Vb fuera del sitio clásico de unión al complejo MHC-antígeno (esta característica hace posible que un mismo superantígeno pueda interaccionar con distintas células del repertorio T). - Como consecuencia del reconocimiento de superantígenos exógenos en periferia, se produce la activación celular y fuerte expansión de las células T implicadas en el reconocimiento. 8.2EnfermedadesasociadasalcomplejoTCR/CD3 Alteraciones de diferente índole del TCR/CD3 pueden dar lugar a enfermedades a veces de difícil diagnóstico. 8.2.1Receptorclonotípico:oligoclonalidadyenfermedad Los linfocitos T constituyen, en condiciones normales, una población policlonal en la que están representados, en proporciones equivalentes, todas las regiones V de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta. Sin embargo, diferencias en la configuración de los genes del receptor clonotípico o en la selección intratímica pueden afectar al repertorio de linfocitos T, existiendo una reducción de determinados clones y un aumento de los niveles de otros. Estas alteraciones pueden detectarse analizando la expresión de las regiones V de las cadenas alfa y beta de estas células, y se ha demostrado que se asocian a ciertas enfermedades Autoinmunes como la artritis experimental inducida por colágeno. 105 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 8.2.2ComplejoCD3ytransduccióndelaseñal Se ha descrito diversas enfermedades causadas por deficiencias que afectan de forma selectiva a una o varias moléculas del complejo TCR/CD3 (defectos estructurales), o bien por un defecto en la transmisión de la señal de activación al interior celular (deficiencias funcionales, ya sean primarios o secundarios). Estas deficiencias producen alteraciones en el sistema inmune: disminución del número de linfocitos, inhibición de la proliferación celular, reducción de la síntesis de citocinas, etc. Las consecuencias clínicas que se derivan de estos defectos son variadas y más o menos graves; sobre todo existen infecciones recurrentes y, a veces, enfermedades Autoinmunes. 8.2.3Defectosestructurales Hasta el momento se han descrito, en humanos, tres deficiencias que afectan al complejo CD3 o proteínas asociadas a él: CD3-gamma, CD3-epsilon y la PTK Zap-70. En los enfermos con déficit de las cadenas CD3-gamma, CD3epsilon hay una disminución del número de moléculas de membrana del complejo TCR/CD3, el 50% para la deficiencia de CD3-gamma y un 90% para el CD3-epsilon; este dato sugiere que la cadena e es más importante para la conformación del complejo, y que, como comentamos anteriormente, existirían isoformas del complejo donde las cadenas CD3-gamma y epsilon, que pueden ser alternativas, y suficientes para que CD3 se transporte a la membrana. 8.2.4DefectosecundariodelreconocimientoatravésdelTCR/CD3. Algunos virus pueden producir efectos patogénicos directos en el sistema inmune por interferir en la transducción de señales por el TCR/CD3. Se ha demostrado que algunos virus infectan células T humanas: virus de inmunodeficiencia humana (HIV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano tipo 6 (HHV-6), Virus de measles y otros. También se sabe que algunos tumores inducen inmunodeficiencias secundarias de los linfocitos T, probablemente, entre otros factores alteraciones estructurales en el complejo CD3. 106 UNIDADDIDÁCTICAIX MOLÉCULASDEADHERENCIA AutoinmunidadHumana 9.1Introducciónmoléculasdeadherencia La adhesión intercelular y la de células con componentes de la matriz extracelular son fenómenos que tienen un papel clave en la organización general de los seres vivos multicelulares. La embriogénesis, la remodelación de tejidos, la cicatrización y la migración de células dependen de moléculas que se expresan en la membrana celular y que permiten la adhesión reversible y selectiva de los diversos elementos celulares entre sí y de éstos con los componentes de la matriz extracelular. Así, la integridad y organización general de los diversos tejidos y órganos de un individuo dependen de la adecuada interacción entre los elementos que los componen. A las moléculas que participan en estas funciones de interacción se les conoce como moléculas de adhesión celular. Las moléculas de adhesión celular tienen un papel muy importante en la fisiología de las células inmunes: linfocitos, monocitos/macrófagos y granulocitos. Asimismo, estas moléculas son las responsables de la interacción que se establece entre las células del torrente sanguíneo y las células endoteliales y por lo tanto ejercen un papel clave tanto en fenómenos normales (por ejemplo el tráfico de células linfoides y la hemostasia), como patológicos (por ejemplo inflamación, trombosis, metástasis de células tumorales). Una función de las moléculas de adhesión celular que es de gran importancia en el sistema inmune es la de permitir la interacción entre leucocitos, fenómeno indispensable en la generación de la respuesta inmune; asimismo, los fenómenos de citotoxicidad y de migración de leucocitos hacia sitios de inflamación dependen de interacciones celulares mediadas por moléculas de adhesión celular. Las moléculas de adhesión celular son múltiples y se han clasificado en diversos grupos de acuerdo a semejanzas estructurales y funcionales. Estos grupos son denominados familias o superfamilias, dependiendo de cuán estrecha sea la similitud entre los diversos miembros de un grupo en particular. La mayor parte de las moléculas de adhesión celular se han incluido en las siguientes familias y superfamilias: - Familia de las selectinas - Familia de las integrinas - Superfamilia de las Inmunoglobulina 109 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico - Mucinas - Cadherinas - Otros receptores de adhesión En el presente capítulo se expondrán las principales características de los receptores de adhesión que están involucrados en el fenómeno de migración leucocitaria. 9.2Moléculasdeadhesióncelular 9.2.1Selectinas Las selectinas son receptores de adhesión que se caracterizan por poseer una estructura muy conservada, la cual incluye a un dominio tipo lectina, un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico, dos o más dominios tipo proteína reguladora del complemento, una región transmembranal y una región intracitoplásmica corta en el extremo carboxilo terminal. Se han identificado a tres miembros de esta familia, los cuales corresponden a los antígenos de diferenciación leucocitaria: - CD62L (L-selectina) - CD62P (P-selectina) - CD62E (E-selectina) Estas tres moléculas reconocen y se unen, a través de su dominio tipo lectina, a diversos oligosacáridos, los cuales están usualmente conjugados con proteínas transmembranales. La selectina L (CD62L) forma parte de la membrana de granulocitos, monocitos y de la mayoría de los linfocitos de sangre venosa periférica; al activarse estas células, la mayor parte de la selectina L es eliminada de la membrana mediante un mecanismo enzimático, el cual genera una forma soluble de la molécula, que es liberada al medio extracelular. La selectina P (CD62P) es almacenada en gránulos intracitoplásmicos de plaquetas y células endoteliales; al activarse estas células la selectina P es translocada a la membrana plasmática, permitiendo la interacción con sus ligandos. Por último, la selectina E (CD62E) no se expresa de novo en células endoteliales, como consecuencia de la inducción de la expresión del gen correspondiente durante la activación celular. 9.2.2Mucinascomoligandosdelasselectinas Hasta el momento se han identificado con precisión a cuatro moléculas que interaccionan de forma específica con las diferentes selectinas, GlyCAM‑1 (Glycosylated­‑depen­dent Cell Adhesion Molecule‑1), CD34, MadCAM‑1 (Mucosal addressin Cell Adhesion molecule‑1) y PSGL‑1 (P Selectin Glycoprotein Ligand-1). Estas moléculas pueden ser incluidas dentro de la familia de las mucinas ya que poseen una estructura extendida y están ricamente glicosiladas en residuos de serina y treonina (sitios de O‑glicosilación). 110 AutoinmunidadHumana 9.2.3Integrinas La familia de las integrinas comprende a un grupo amplio de moléculas heterodiméricas constituídas por dos subunidades polipéptidicas transmembranales denominadas cadenas alfa y beta. Las diferentes subfamilias de integrinas se forman de acuerdo a la cadena beta que poseen, la cual puede asociarse en una forma restringida con diferentes cadenas alfa. Hasta el momento se han identificado a 16 cadenas alfa y 8 cadenas beta, las cuales dan lugar a 21 integrinas diferentes 9.2.3.1Ligandosdelasintegrinas Las integrinas beta1 interaccionan principalmente con componentes de la matriz extracelular (colágeno, laminina, fibronectina) estas diferentes integrinas pueden interaccionar con el mismo ligando (por ejemplo. colágeno ó fibronectina). Las integrinas participan activamente no solo en fenómenos de adhesión celular sino que también están involucradas en otra serie de fenómenos clave en la fisiología celular. De lo anterior, se puede concluir que las integrinas efectivamente sirven como una vía de integración (de ahí su nombre) entre el medio intra y extracelular. 9.2.4Inmunoglobulina Algunos miembros de la superfamilia de las Ig (ICAM‑1, ICAM‑2, VCAM‑1 y PECAM) están implicados en fenómenos de adhesión de leucocitos a células endoteliales y su subsiguiente migración. El receptor de adhesión ICAM‑1 interviene además en fenómenos de co‑estimulación de células inmunes y de adhesión entre leucocitos y entre éstos y células diana (fenómenos de citotoxicidad). Otros miembros de la superfamilia de las Ig tienen también un papel importante en la adhesión inter‑leucocitaria, generación de señales de co‑estimulación (por ej. ICAM‑3, CD2, etc.), en la interrelación de las células presentadoras de antígenos y los linfocitos, pero no participan de forma importante en la migración leucocitaria. 9.3Interacciónleucocito‐endotelioenlainflamación El fenómeno inflamatorio es un mecanismo importante de defensa que es desencadenado por diversos factores endógenos y exógenos tales como productos bacterianos (antígenos, lipopolisacáridos, exotoxinas, peptidos formilados, etc.), venenos, traumatismos, etc. A pesar de su papel primario como un fenómeno de protección, en algunas circunstancias la magnitud del fenómeno inflamatorio es desproporcionado en relación con el agente inductor y resulta en daño significativo e irreversible al tejido afectado. El proceso inflamatorio consiste esencialmente en la extravasación de líquido y células (polimorfonucleares, linfocitos y monocitos) hacia un sitio definido, en donde ocurre, en mayor o menor grado, lisis de células y destrucción de componentes de la matriz extracelular. De acuerdo a su comportamiento temporal, la inflamación puede ser aguda o crónica; en la primera, el infiltrado inflamatorio es a base principalmente de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos, en tanto que en la segunda las células del infiltrado son principalmente linfocitos y monocitos/macrófagos; cuando este tipo de inflamación es de muy larga duración, el tejido afectado puede adquirir algunas características del tejido linfoide, principalmente la presencia de nódulos linfáticos y vasos sanguíneos con endotelio cuboidal ("órganos linfoides terciarios"). 111 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico La extravasación de leucocitos hacia sitios de inflamación es un proceso en el que participan en forma concertada y secuencial diversas moléculas de adhesión. De hecho, se menciona que este proceso es un fenómeno en cascada, en donde es necesario que los eventos iniciales ocurran para que los que les siguen puedan suceder. En la actualidad se ha determinado que el proceso de extravasación de leucocitos incluye a las siguientes etapas: 1) Interacción inicial leucocito‑endotelio. 2) Rodamiento de leucocitos sobre el endotelio. 3) Activación leucocitaria. 4) Adhesión firme al endotelio. 5) Migración transendotelial. 9.3.1Adhesióncelularinicial En condiciones fisiológicas los leucocitos del torrente sanguíneo pueden tener contacto con las células endoteliales, pero estos contactos son aleatorios, fugaces y no son consecuencia de la interacción entre moléculas de adhesión. En una condición no fisiológica, cuando se genera un foco inflamatorio en el intersticio, se producen diversas substancias, en ese sitio que inducen activación de las células endoteliales de los vasos sanguíneos regionales. Esta activación endotelial resulta en la producción de substancias quimiotácticas), así como en la inducción de la expresión de moléculas de adhesión, tales como las selectinas P y E. 9.3.2Rodamientodeleucocitos El rodamiento de leucocitos sobre el endotelio activado es consecuencia de interacciones entre moléculas de adhesión celular que son fácilmente reversibles y de una avidez tal que permiten que los leucocitos se desplacen sobre la superficie endotelial permaneciendo adheridos a la misma. Las moléculas que permiten este tipo de interacciones son las mismas que intervienen en la interacción inicial leucocito‑endotelio, principalmente las selectinas y sus ligandos. También se ha encontrado que las integrinas. El fenómeno de rodamiento ocurre principalmente en sitios donde normalmente la presión hidrostática es baja (vénulas postcapilares) y se ve favorecido por la vasodilatación. Aquí vale la pena mencionar que diversas substancias que se generan o liberan en focos inflamatorios (por ej. C5a, factor activador de plaquetas, prostaglandinas, histamina, etc.) Poseen actividad vasodilatadora. 9.3.3Activaciónleucocitaria En el foco inflamatorio se generan diversas substancias que poseen la capacidad de activar a leucocitos; estas substancias pueden ser exógenas (por ej. péptidos bacterianos formilados) o endógenos (por ejemplo. C5a, factor activador de plaquetas o leucotrieno B4). En los últimos años, se ha puesto de manifiesto la importancia de ciertas citocinas como substancias quimiotácticas e inductoras de activación leucocitaria. 9.3.4Adhesiónfirme El fenómeno de activación leucocitaria es aparentemente muy rápido y resulta en la generación de señales que inducen la activación de las integrinas de la membrana (integrinas beta-2 en el caso de los neutrófilos e integrinas beta-1, beta-2 y beta-7 en el caso de los linfocitos); 112 AutoinmunidadHumana 9.3.5Extravasaciónymigraciónentejidos La extravasación de leucocitos y posterior migración a través del tejido implican que ocurran fenómenos de adhesión dinámicos que permitan simultáneamente el movimiento de la célula y su adherencia. La migración de los leucocitos en el intersticio de los tejidos está dirigida por la presencia de substancias quimiotácticas y la densidad de los ligandos de receptores de adhesión en el mismo; la dirección de migración de los leucocitos está así determinada tanto por el gradiente de concentración de la sustancia que induce atracción de las células (quimiotaxis) como por la región del tejido que sea más adhesiva para el leucocito (haptotaxis). Lo anterior resulta en la eficiente y rápida migración de los leucocitos hacia el foco inflamatorio. De lo anteriormente expuesto, se hace evidente que la migración de células del torrente sanguíneo hacia focos de inflamación es un fenómeno en el que participan múltiples moléculas, de adhesión, de atracción y de activación celular, las cuales participan en forma secuencial y concertada. En apariencia el sistema es redundante ya que, por ejemplo, existen varias selectinas o múltiples quimiocinas involucradas, pero es posible que sea necesaria la participación de muchas moléculas para que un organismo pueda regular tanto la calidad como la magnitud de un fenómeno inflamatorio, de tal modo que éste sea lo más ventajoso posible desde el punto vista biológico. 9.3.5.1Tráficodecélulaslinfoides En condiciones fisiológicas, los linfocitos que se encuentran en el torrente sanguíneo, el tejido linfoide secundario y otros tejidos no permanecen en esos sitios indefinidamente sino que en forma constante migran hacia otros tejidos y órganos. El patrón de migración de las células linfoides no es aleatorio y diversas evidencias indican que puede ser diferente para algunas subpoblaciones de linfocitos. En forma característica, los linfocitos abandonan el torrente sanguíneo y retornan a él en forma repetida y a través del mismo tejido (por ej. ganglios linfáticos, piel o placas de Peyer); este fenómeno se conoce como la autodirección, o recirculación (homing) de linfocitos y es consecuencia, principalmente, de la expresión diferencial de moléculas de adhesión en los linfocitos y el endotelio de los vasos sanguíneos de los diferentes órganos en donde ocurre este fenómeno. En la recirculación de células linfoides parecen también participar en forma importante algunos factores quimiotácticos aún no bien caracterizados. Es conveniente mencionar aquí que los leucocitos polimorfonucleares no presentan el fenómeno de recirculación, sino que una vez que son liberados de la médula ósea emigran hacia focos inflamatorios en donde finalmente mueren; en condiciones de no inflamación, es muy probable que los leucocitos polimorfonucleares tengan como destino final el bazo, órgano en que la circulación sanguínea es abierta y donde los macrófagos pueden eliminar sin consecuencias los restos celulares. No es claro hasta el momento si los monocitos recirculan, pero en condiciones de inflamación, éstas células siguen un patrón de migración similar al de los linfocitos. Los linfocitos de memoria y los que no han sido estimulados previamente por el correspondiente antígeno (linfocitos vírgenes o naive) presentan un patrón de recirculación diferente, así como una distinta expresión de moléculas de adhesión; muestran una autodirección hacia la lámina propia y el epitelio intestinal. Como se expone a continuación, los linfocitos vírgenes recirculan principalmente a los órganos linfoides secundarios, en tanto que los de memoria lo hacen tanto a estos órganos como a tejidos específicos no linfoides (por ejemplo piel). 113 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Por todo lo anteriormente expuesto, se puede decir que la migración de leucocitos del torrente sanguíneo hacia diversos tejidos es un fenómeno que está finamente regulado por tres factores fundamentales: - Las moléculas de adhesión expresadas por el leucocito, - Las expresadas por las células endoteliales - El tipo de factor activador/quimiotáctico que se está produciendo en ese tejido. La conjunción de estos tres factores determina el tipo de leucocito que hace la interacción inicial y posteriormente el rodamiento, la activación, la adhesión firme y la migración transendotelial. La ausencia de uno de estos factores, por ej. la substancia quimiotáctica, conduciría a que fuese posible la interacción inicial y el rodamiento, pero no la adhesión firme, con la consecuente desunión del leucocito del endotelio. Asimismo, la ausencia de moléculas que median la migración transendotelial conduciría a que fuesen posibles las cuatro primeras fases de la interacción leucocito‑endotelio, pero el resultado final de lo anterior sería también el desprendimiento del leucocito, aún cuando hubiese ocurrido su firme adhesión al endotelio. Por último, la ausencia de las moléculas que median la interacción inicial tendría como consecuencia que no ocurriera ninguna de las fases de la interacción leucocito‑endotelio. De esta forma, se ha propuesto que la migración de cada una de las subpoblaciones de leucocitos del torrente sanguíneo sigue un código definido cuyos elementos son determinados factores quimiotácticos y moléculas de adhesión. En algunos casos se conoce con precisión el código completo de migración (por ejemplo. en la migración de neutrófilos hacia un foco inflamatorio agudo), en tanto que en otros no se ha dilucidado aún alguno de los elementos clave del código (por ejemplo. el caso del factor quimiotáctico en la recirculación de linfocitos vírgenes hacia ganglios linfáticos). 9.3.5.2Papeldereceptoresdeadhesiónencondicionespatológicas. Como se ha expuesto anteriormente, las moléculas de adhesión celular tienen un papel clave en la génesis del fenómeno inflamatorio. De esta forma, los receptores de adhesión están involucrados en el daño que ocurre en los tejidos en las muy diversas enfermedades que se caracterizan por presentar inflamación en algún tejido u órgano. Asimismo, las moléculas de adhesión participan en forma importante en aquellas condiciones patológicas en las que ocurre una respuesta inmune aberrante (Autoinmunidad) o fenómenos de citotoxicidad mediada por células; lo anterior es debido al hecho de que tanto la generación de la respuesta inmune como los procesos de citotoxicidad celular implican a fenómenos de adhesión intercelular. Se puede mencionar entonces que en el daño a tejidos que es mediado inmunológicamente (reacciones de hipersensibilidad inmediata, enfermedades por depósito de complejos inmunes circulantes, fenómenos de hipersensibilidad retardada, etc.) están involucradas en forma importante las diversas moléculas de adhesión leucocitaria. La ausencia de determinadas moléculas de adhesión puede tener también consecuencias patológicas importantes. Las moléculas de adhesión intercelular también están involucradas en la patogenia de condiciones patológicas diferentes de la inflamación. La metástasis a distancia de células tumorales implican el paso de células neoplásicas a la circulación y su posterior extravasación en un sitio diferente. Diversas observaciones indican que la migración y extravasación de células malignas está también determinada por moléculas de adhesión intercelular. En este sentido, la migración 114 AutoinmunidadHumana preferencial de células neoplásicas (distintos tumores muestran preferentemente metástasis a ciertos órganos y tejidos) pudiese seguir una mecánica similar al de la migración selectiva de leucocitos; Así, las células tumorales podrían seguir determinados códigos de migración que las indujeran a extravasarse a ciertos tejidos. Es muy probable que en un futuro cercano se dilucide el papel real de las moléculas de adhesión en los fenómenos de metástasis y que se determinen los posibles códigos de migración selectiva de células tumorales. 115 UNIDADDIDÁCTICAX CITOCINASYQUIMIOCINAS AutoinmunidadHumana 10.1Introducción En este capitulo se tratará sobre las citocinas y quimiocinas. Las citocinas comprenden un amplio grupo de proteínas o glicoproteínas que poseen la capacidad de modular la actividad funcional de células individuales y de tejidos, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Las quimiocinas son un grupo de pequeñas moléculas proteicas con características bioquímicas comunes y que están producidas por muchos tipos celulares en respuesta a estímulos exógenos o endógenos 10.2Citocinas Son moléculas de bajo peso molecular, normalmente entre 15-30 KDa, constituidas por 120-180 aminoácidos. Aunque en general están producidas por leucocitos, determinadas citocinas pueden también ser secretadas por otros muchos tipos celulares. Originariamente se estableció el término linfocina para denominar productos biológicos producidos por linfocitos en respuesta al antígeno. Posteriormente su uso se amplió a moléculas de características similares secretadas por otros tipos celulares, por lo que se utilizó el término más amplio de citocina. El término interleucina (IL) se aplicó a aquellas moléculas que servían como señales de comunicación entre distintos tipos de leucocitos, numerándose correlativamente a medida que se descubrían (IL-1, IL-2, etc.). No obstante, algunas de ellas se detectaron inicialmente en ensayos funcionales in vitro y aún conservan su denominación original de acuerdo con la función biológica que permitió su identificación, como es el caso del TNF (factor de necrosis tumoral) y el TGF (factor transformador de tejidos). La expresión de la mayoría de las citocinas está estrictamente regulada. En general, no se detecta una producción constitutiva significativa de estas moléculas, siendo necesaria la activación celular para que se produzcan citocinas en cantidades suficientes para ejercer sus efectos biológicos. La mayoría de las citocinas son secretadas al espacio extracelular, muchas de ellas en forma glicosilada que incrementa su estabilidad y solubilidad. No obstante, algunas citocinas se pueden acumular en el interior de la célula, o, bien, permanecer ancladas a la membrana o en la matriz extracelular. En general, son moléculas que poseen una vida media muy corta y actúan a muy bajas concentraciones, del orden de picogramos, mediante la unión a receptores de alta afinidad presentes en la superficie de la propia célula productora o en otros muy variados tipos celulares. Las citocinas ejercen un efecto autocrino cuando se unen a receptores presentes en la propia célula productora. También pueden tener un efecto paracrino, actuando sobre diferentes tipos celulares que se encuentran en su vecindad. En algunos casos pueden liberarse a la circulación sanguínea o linfática, ejerciendo su efecto en otros órganos y tejidos, actuando así como las hormonas, de forma endocrina. 119 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Dos importantes características funcionales de las citocinas son su pleiotropismo, de tal manera que una misma citocina es capaz de ejercer efectos biológicos diferentes al actuar sobre distintos tipos celulares, y su redundancia, es decir, que varias citocinas pueden contribuir al desarrollo de la misma función en un determinado tipo celular. Una consecuencia de estas propiedades es que, en ausencia de una determinada citocina, sus funciones pueden ser reemplazadas total o parcialmente por otras. Muchas de estas características biológicas de las citocinas se pueden explicar por la estructura y amplia distribución celular de sus receptores, como se verá más adelante. Las acciones de las citocinas se engloban dentro de un sistema o red funcional, donde el efecto de una molécula está estrechamente regulado, positiva o negativamente, por otras moléculas del sistema. Así, la secreción de una citocina puede estar inducida, potenciada o inhibida por otra citocina que, a su vez, puede incrementar o inhibir la expresión de sus receptores. Los efectos biológicos de las citocinas pueden ser muy variados, ya que, no solamente desempeñan un papel esencial en las respuestas inmunes, sino que algunas de ellas están también implicadas en la embriogénesis y en el desarrollo de órganos (por ejemplo, en la angiogénesis), otras juegan un papel clave en procesos neuroinmunes y neuroendocrinos, y muchas son importantes reguladores, tanto positivos como negativos, de acontecimientos celulares como la mitosis, la diferenciación, la migración, la supervivencia, la muerte celular, e, incluso, de su transformación maligna. La actividad biológica de las citocinas se puede medir con distintas modalidades de bioensayos, utilizando, por ejemplo, líneas celulares cuya función depende de la presencia del factor que se quiere estudiar. En la actualidad, se utilizan como técnica más habitual inmunoensayos en fase sólida, como el ELISA para cuantificar la concentración de citocinas en fluidos biológicos, y el ELISPOT para conocer el número de células productoras. También es posible cuantificar y caracterizar las células productoras identificando las citocinas intracelulares mediante citometría de flujo. Otra posibilidad es la utilización de técnicas de RT-PCR cuantitativa que permiten detectar y medir los niveles de RNAm que codifican una determinada citocina. Aunque la mayoría de las citocinas no poseen ninguna homología secuencial entre sí, algunas de ellas se han agrupado en familias en base a su estructura tridimensional. De acuerdo con la estructura secundaria de la molécula se han agrupado las citocinas según posean una conformación en alfa-hélice (IFN-alfa, IFN-gamma, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, G-CSF, M-CSF y GM-CSF), una estructura de láminas beta (IL-1-alfa, IL-1-beta, TNF-alfa y TNF-beta) o una estructura compuesta alfa/beta IL-8 e IFN-gamma). Por otra parte, el análisis de su disposición génica ha dado lugar a la definición de grupos de citocinas que se encuentran asociadas genéticamente. Uno de estos grupos se ha descrito en el brazo largo del cromosoma 5 (5q31), donde se encuentran los genes que codifican para IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, subunidad p40 de la IL-12, IL-13 y GM-CSF, mientras que en el cromosoma 2 (2q12-14) se localizan los genes que codifican para las citocinas IL-1 e IL-1RA, ésta el antagonista natural del receptor de la IL-1. Es difícil establecer una clasificación funcional de las citocinas debido a su alto grado de pleiotropismo. No obstante, para facilitar su estudio las describimos englobadas, de acuerdo con su función más relevante, dentro de las siguientes secciones: 1) Citocinas implicadas en el desarrollo hematopoyético, 2) Citocinas implicadas en las respuestas inmunes innatas. 3) Citocinas generadas durante las respuestas inmunes adaptativas. 120 AutoinmunidadHumana 10.2.1 Citocinas implicadas en el crecimiento y la diferenciación hematopoyético Comprenden un grupo amplio de citocinas que promueven el crecimiento y diferenciación de las células sanguíneas maduras a partir de células madre hematopoyéticas. Son producidas por células del estroma de la médula ósea o por linfocitos maduros activados. Algunas de estas citocinas reciben el nombre genérico de factores estimuladores de la formación de colonias (CSF) por su capacidad para estimular la formación de colonias celulares en los cultivos de médula ósea. A continuación describimos las más relevantes: IL-3. Es producida mayoritariamente por los linfocitos T activados y también por mastocitos. Induce la proliferación y diferenciación de progenitores hematopoyéticos tempranos de todas las series sanguíneas, por lo que también es conocida como multi-CSF. Induce fundamentalmente la hematopoyesis en situaciones de stress que requieren una respuesta rápida, siendo menos claro su papel en la hematopoyesis constitutiva. - - IL-5. Es secretada en forma glicosilada por LT CD4+ activados del tipo Th2. Es esencial en la proliferación y diferenciación de las células precursoras de los eosinófilos, así como en el mantenimiento de la actividad de los eosinófilos maduros siendo la responsable de la eosinofilia en infecciones parasitarias. Sobre los linfocitos B actúa incrementando su proliferación y estimulando la producción de IgA. - IL-7. Es producida por células estromales de la médula ósea. Promueve la maduración de progenitores pro- y pre-B hacia linfocitos B maduros en la médula ósea y de linfocitos T inmaduros en el timo fetal y adulto. También actúa como factor de crecimiento para linfocitos T y B. - IL-9. Es producida por linfocitos T activados. Tiene un amplio espectro de actividades no muy bien definidas entre las que se incluye la proliferación de precursores eritroides. Al igual que la IL-7, también induce la proliferación de LT y estimula la producción de Inmunoglobulina en células B. - IL-11. Es producida por fibroblastos del estroma de la médula ósea y otros tipos celulares. Estimula la megacariocitopoyesis y sinergiza con otras citocinas para estimular el crecimiento de otros precursores hemáticos. Comparte algunas funciones con la IL-6, como la inducción de proteínas de fase aguda en el hígado. También se ha descrito su capacidad como estimuladora de la secreción de Inmunoglobulina por células B en respuestas T-independientes. - GM-CSF. Es producido por linfocitos T activados y por otras células como fibroblastos, células endoteliales y monocitos. Es un polipéptido con varios posibles lugares de glicosilación. Induce la proliferación de los progenitores de granulocitos y macrófagos, produciéndose en respuesta a estímulos específicos en situaciones que requieren una elevada producción de éstas células. También puede actuar sobre granulocitos y macrófagos maduros. - G-CSF. Es producido por fibroblastos, células endoteliales y monocitos en respuesta a estímulos específicos. Actúa sobre los precursores hematopoyéticos de los granulocitos y sobre los granulocitos maduros. La granulocitosis asociada a ciertas infecciones se debe a que el LPS de las paredes bacterianas es un potente inductor de la producción de esta citocina. Se han descrito otras funciones de este factor, como la estimulación de la fagocitosis y de la citotoxicidad mediada por Ac. 121 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico - M-CSF. Es producido por monocitos y macrófagos maduros activados y está implicado en el desarrollo de las células progenitoras de los macrófagos. También se ha visto que facilita el desarrollo de la placenta, siendo producido por células del epitelio uterino en respuesta a los estrógenos. 10.2.2Citocinasproducidasenlasrespuestasinmunesinnatas Estas citocinas se producen de forma inmediata tras el contacto de las células implicadas en las respuestas inmunes innatas con un agente extraño. Los monocitos y macrófagos activados son la principal fuente de estas moléculas aunque también pueden ser producidas por linfocitos activados y otras células no pertenecientes al sistema inmune, como células endoteliales y fibroblastos: - IL-1. Es producida fundamentalmente por monocitos y macrófagos, pero también por células dendríticas, endoteliales, NK y otros tipos celulares. Existen dos formas, IL-1alfa e IL-1beta que, aunque solamente tienen un 25 % de homología en su secuencia aminoacídica, comparten el mismo receptor y ejercen efectos biológicos similares. Parte de sus efectos proinflamatorios se debe a que induce la liberación de histamina en los mastocitos, generando vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular en el lugar de la inflamación. Es el principal pirógeno endógeno, induciendo fiebre a través de la producción de prostaglandinas. También promueve la síntesis de proteínas de fase aguda por los hepatocitos y actúa sobre el SNC induciendo sueño y anorexia, típicamente asociados con los procesos infecciosos. - IL-6. Es producida fundamentalmente por monocitos/macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, linfocitos T y células del estroma de la médula ósea. Junto con la IL-1 es la principal inductora de la síntesis de proteínas de fase aguda, sobre todo de fibrinógeno. Además de su efecto en la inflamación, se ha observado que promueve la diferenciación de linfocitos B hacia células plasmáticas, induciendo la producción de Inmunoglobulina. También puede aumentar la producción de IL-2 y el desarrollo de los precursores hematopoyéticos dependientes de la IL-3. - TNF. Los factores de necrosis tumoral fueron descritos inicialmente por su capacidad de causar necrosis en algunos tumores. Con posterioridad, sin embargo, ganaron protagonismo por las numerosas funciones que ejercen sobre las respuestas inmunes. Se han descrito dos moléculas estrechamente relacionadas, el TNF-alfa y el TNF-beta, con elevada homología en su secuencia aminoacídica. El TNF-alfa es producido fundamentalmente por monocitos y macrófagos en respuesta a antígenos bacterianos, tales como el LPS, siendo esta citocina el principal responsable del shock séptico asociado a bacteriemias. También puede ser producido por linfocitos T y B, NK, fibroblastos y mastocitos. Junto con la IL-1 está implicado en los procesos inflamatorios derivados de los procesos infecciosos, elevando la temperatura corporal y produciendo caquexia y sueño al actuar sobre el SNC. Por otra parte, induce la expresión de moléculas de adhesión y estimula la producción de IL-8 por células del endotelio vascular, lo que contribuye a la extravasación de linfocitos, neutrófilos y monocitos. El TNF-beta o linfotoxina, es producido exclusivamente por linfocitos T activados, aunque se une a los mismos receptores que el TNF-alfa e induce funciones similares. 122 AutoinmunidadHumana - IL-10. Es producida por linfocitos del tipo Th2, así como también por monocitos/macrófagos, linfocitos B, queratinocitos y otros varios tipos celulares. Es la citocina inmunosupresora por excelencia, inhibiendo la síntesis de muchas otras citocinas, entre las que podemos citar IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2, IL-12, y la expresión de MHC-II y moléculas de adhesión en monocitos. También tiene efectos antiproliferativos sobre muchos tipos celulares. La IL-10 ejerce además múltiples actividades inmunomoduladoras. Se ha visto que es un cofactor para el crecimiento de líneas y colonias de células mastocíticas in vitro. Regula las funciones mediadas por linfocitos B induciendo la síntesis de IgG, y por linfocitos T, influyendo en el desarrollo de timocitos y células T. También ejerce efectos reguladores sobre la angiogénesis. El virus de Epstein Barr secreta una proteína que posee una gran homología estructural con la IL-10 humana (vIL-10), y que tras unirse con baja afinidad al propio receptor de la IL-10, ejecuta actividades biológicas similares. Relacionadas estructural y funcionalmente con la IL-10 se han descrito recientemente nuevas moléculas tales como la IL-19, IL-20 e IL-22, cuyas funciones son todavía poco conocidas. - IL-12. Es producida mayoritariamente por monocitos/macrófagos, aunque su producción puede ser también inducida en células dendríticas y linfocitos B. Inicialmente se describió como el factor estimulador de las células asesinas naturales (NK), pero la actual importancia de esta citocina deriva de su capacidad de dirigir la diferenciación de los linfocitos Th hacia células efectoras tipo Th1 de la hipersensibilidad retardada. La forma madura de esta molécula (p75) está compuesta de dos subunidades, p35 y p40. La síntesis de ambas subunidades está regulada diferencialmente, siendo ambas necesarias para la actividad funcional del heterodímero. Esta citocina incrementa la actividad citotóxica de las células NK e induce células LAK (linfocitos asesinos activados por linfocinas). Incrementa la producción de IFN por linfocitos T y células NK y activa linfocitos T citotóxicos. Recientemente se ha descrito un factor proteico denominado p19, sin actividad biológica por sí mismo, que se combina con la subunidad p40 de la IL-12 para dar lugar a una nueva citocina biológicamente activa denominada IL-23. Esta citocina es producida por células dendríticas activadas, se une al receptor de la IL-12 y comparte algunas de las funciones biológicas con ella. - IL-18. Esta citocina está estrechamente relacionada en sus funciones biológicas con la IL-12, ya que posee la misma capacidad de inducción de IFNgamma en linfocitos T y células NK. Sin embargo, es producida por diferentes tipos celulares que la IL-12, siendo las células adrenales y de Kupffer las principales fuentes de producción de la IL-18. - Interferones tipo I. Los interferones fueron inicialmente descritos como agentes producidos por células infectadas por virus. Posteriormente se descubrió que además de su capacidad antiviral ejercían efectos reguladores sobre la proliferación y la diferenciación de varios tipos celulares y tenían capacidad de modular el sistema inmune. Se clasificaron en dos grupos. Los interferones tipo I, que incluyen el IFN-alfa y el IFN-beta, con capacidad principalmente antiviral y antiproliferativa, y el IFN-gamma (tipo II), al que nos referiremos posteriormente, con un mayor efecto inmunomodulador. El IFN-gamma es producido fundamentalmente por monocitos y macrófagos, mientras que el IFN-alfa es secretado por fibroblastos y algunas células epiteliales. Ambos incrementan la 123 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico expresión de moléculas de MHC de clase I. En algunos casos se ha observado que poseen actividad antitumoral, posiblemente debido a su efecto antiproliferativo sobre las células tumorales, y modulador sobre el sistema inmune. 10.2.3Citocinasproducidasenlasrespuestasinmunesadaptativas En respuesta a una estimulación antigénica, los linfocitos T se activan, proliferan y se diferencian hacia células efectoras específicas. Estas células ejercen sus funciones produciendo una serie de moléculas solubles, verdaderas artífices de los mecanismos efectores de la respuesta inmune adaptativa. - Los linfocitos T CD4+, como consecuencia de una estimulación antigénica, pueden diferenciarse hacia linfocitos T cooperadores de tipo Th1 o Th2, estando esta diferenciación en parte condicionada por las citocinas que se encuentran en el medio. Así, la presencia de IL-12 promueve la diferenciación hacia Th1, mientras que la IL-4 condiciona el desarrollo Th2. Los linfocitos Th1, en colaboración con los macrófagos, están implicados en la respuesta inmune celular, mientras que los Th2 promueven la respuesta inmune humoral. Para llevar a cabo su función los linfocitos Th1 secretan IL-2, IFN-gamma y TNF, mientras que los Th2 producen IL4, IL-5, IL-10 e IL-13. Se han descrito otras subpoblaciones de linfocitos T CD4+ efectores que secretan un perfil de citocinas diferente y llevan a cabo funciones específicas. Este es el caso de los linfocitos T reguladores de los que se han descrito varios tipos. - Los linfocitos T CD8+ se diferencian hacia linfocitos T citotóxicos como respuesta a la estimulación antigénica y a la presencia de citocinas secretadas por otras células. Ejercen su función efectora mediante la secreción fundamentalmente de IL-2, IL-16, IFN-gamma y TNF. Finalmente hay una serie de citocinas que pueden ser producidas por ambos tipos de linfocitos T, CD4+ y CD8+, tales como IL-2, GM-CSF y TGF-beta. - IL-2. Es secretada por linfocitos T CD4+ y CD8+ activados en respuesta a un estímulo antigénico. Inicialmente se describió como factor de crecimiento de células T, ya que es el principal agente que controla su proliferación. Ejerce otros muchos efectos sobre el sistema inmune, teniendo un papel esencial en el desarrollo de las respuestas inflamatorias crónicas, tanto humorales como celulares. Es un factor estimulador del crecimiento de linfocitos T, B y NK. Promueve la actividad citotóxica mediada por linfocitos T y células NK, así como el desarrollo de células LAK (células asesinas activadas por citocinas). Tras unirse a su receptor en linfocitos T, activa la secreción de IFN-alfa, linfotoxina, IL-4, IL-3, IL-5 y GM-CSF. Sobre los linfocitos B estimula su crecimiento y diferenciación e incrementa la expresión de moléculas de MHC de clase II. - IL-15. Es secretada por una amplia variedad de células, entre las que se incluyen células epiteliales, monocitos, músculo esquelético, hígado, pulmón y placenta. Aunque no es una citocina producida por linfocitos Th1 se incluye en este apartado por su similitud funcional con la IL-2, con la que comparte la mayoría de sus actividades biológicas, como la estimulación de células NK, y la proliferación y diferenciación linfocitaria. - IFN. Es producido por linfocitos Th1, LTC y por células NK. Además de su efecto antiviral posee una importante actividad inmunomoduladora. Incrementa la 124 AutoinmunidadHumana expresión de antígenos de HLA de clase I y II en varios tipos celulares, lo que facilita su función presentadora de Ag y activa a los macrófagos, incrementando su capacidad tumoricida y de defensa contra las infecciones. Actúa de forma autocrina sobre las propias células NK que lo producen, aumentando su actividad citolítica y, como consecuencia, incrementando su efecto antitumoral. Sobre los linfocitos Th2 inhibe la proliferación, de manera que su presencia durante la estimulación antigénica induce la diferenciación de linfocitos T hacia células efectoras tipo Th1 favoreciendo, por lo tanto, el desarrollo de las respuestas inflamatorias. - IL-4. Es producida por linfocitos Th2, mastocitos, basófilos, células del estroma de la médula ósea y, posiblemente, por determinadas subpoblaciones de células NK. Es una citocina muy pleiotrópica, ya que ejerce numerosos efectos en diferentes tipos celulares. Promueve la diferenciación de linfocitos T vírgenes hacia células de tipo Th2, inhibiendo la generación de células Th1. Posee efectos inmunosupresores, ya que inhibe la producción de deteminados mediadores inflamatorios de los macrófagos e induce la producción de IL-1Ra, que bloquea la acción de la IL-1. Por otra parte, promueve el desarrollo de las respuestas inmunes humorales a través de la inducción del crecimiento y diferenciación de linfocitos B, produciendo el cambio isotípico hacia IgG4 e IgE e incrementando la expresión de moléculas CD23 en linfocitos B, basófilos y eosinófilos. Por todo ello, los efectos de esta citocina se han relacionado con el desarrollo de los procesos alérgicos y con el incremento de IgE en las infecciones parasitarias - IL-13. Es producida por linfocitos T activados del tipo Th2, compartiendo muchas de sus funciones con la IL-4 con la que se encuentra genéticamente relacionada. Es una citocina con actividad inmunosupresora ya que inhibe, junto con la IL-4 y la IL-10, la producción de citocinas inflamatorias por los monocitos (IL-1beta, TNF-alfa, IL-8, IL-6). Por otra parte, esta citocina incrementa la proliferación y diferenciación de monocitos y células B, incrementa la expresión de CD23 y promueve el cambio de clase de Inmunoglobulina hacia la producción de IgE - IL-16. Está producida por los linfocitos T CD8+ donde se acumula y se secreta en respuesta a la estimulación con serotonina o histamina. Originariamente se identificó como factor quimiotáctico de linfocitos, recibiendo el nombre de linfotactina, debido a su efecto atrayente sobre los linfocitos T CD4+. - TGF. Hay dos tipos de factores transformadores del crecimiento, el TGFalfa y el TGF-beta, que no poseen ninguna similitud estructural ni comparten los mismos efectos. Solamente el TGF-beta tiene efectos inmunomoduladores. Es producido por linfocitos T, plaquetas y otros muchos tipos celulares. Su nombre responde a la observación inicial de que inducía cambios fenotípicos en los fibroblastos de rata. Incrementa la proliferación de fibroblastos, osteoblastos y células musculares lisas e incrementa la síntesis de proteínas de la matriz extracelular, lo que favorece la curación de las heridas. Esta citocina tiene también efectos inmunosupresores ya que se observó que inhibía el crecimiento y la función de muchos tipos celulares. En el sistema inmune inhibe la síntesis y/o el efecto del IFN-gamma, TNF-alfa, TNF–beta, IL-1, IL-2 e IL-3, así como la citotoxicidad natural y específica. 125 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 10.2.4Citocinasproinflamatoriaseinmunosupresoras En relación con la respuesta inflamatoria algunas citocinas favorecen el desarrollo de la misma (citocinas proinflamatorias) mientras que otras ejercen un efecto supresor de la inflamación (citocinas inmunosupresoras). Las citocinas con actividad antiinflamatoria e inmunosupresora inhiben el crecimiento celular o suprimen la secreción de otras citocinas. Entre ellas se encuentran la IL-4, IL-13 e IL-10, que activan las acciones de los linfocitos B a la vez que inhiben las respuestas inflamatorias. Como ya comentamos, la IL-10 es la citocina inmunosupresora por excelencia. También se incluye en este apartado el TGF-beta que, como se ha dicho anteriormente, inhibe el crecimiento y la función de muchos tipos celulares, la síntesis de determinadas citocinas y la actividad citotóxica natural y específica. Finalmente, los interferones tipo I (alfa y beta), también se pueden considerar citocinas supresoras debido a su capacidad antiproliferativa y a su efecto regulador de la producción de citocinas proinflamatorias. En el grupo de las citocinas con actividad proinflamatoria se incluyen las producidas por los monocitos y macrófagos activados durante las respuestas inmunes innatas, aunque también pueden ser producidas por linfocitos activados (Th1 o citotóxicos), y otras células no pertenecientes al sistema inmune. Las principales citocinas que participan en los acontecimientos celulares y moleculares asociados con los fenómenos inflamatorios son la IL-1, IL-6, TNF-alfa y algunos miembros de la familia de las quimiocinas, que describimos ea continuación. Otra importante citocina proinflamatoria es el IFN-gamma, producido por linfocitos Th1 en las respuestas inmunes específicas y por células NK activadas. 10.3Quimiocinas Su nombre proviene de “citocinas quimiotácticas” a que muchas de ellas poseen propiedades quimioatrayentes, regulando el trasvase de leucocitos hacia órganos y tejidos. Las quimiocinas secretadas se unen a proteoglicanos y a proteínas de la matriz extracelular donde se cree permanecen inmovilizadas sin pasar a la circulación. Esta capacidad de unión a la matriz extracelular favorece la permanencia de las quimiocinas en su lugar de producción y apoya el concepto de que la migración de los leucocitos se realiza a través de un gradiente sólido. La característica bioquímica común de estas moléculas es la conservación de 4 residuos de cisteína que se unen formando dos puentes disulfuro, esenciales para la actividad de la molécula. Dependiendo de si las dos primeras cisteínas están o no separadas por otro aminoácido se han clasificado en quimiocinas CXC (cis-X-cis), y quimiocinas CC (cis-cis). Hay otras 2 quimiocinas, la linfotactina y la fractalkina, que pertenecen a otras subfamilias por tener características bioquímicas diferentes. La molécula más representativa de la familia CXC es la IL-8 (CXCL8). Es sintetizada por todos los tipos de leucocitos, así como por otros muchos tipos celulares (fibroblastos, células endoteliales, hepatocitos, astrocitos. etc.) y células tumorales (melanoma, carcinoma de ovario, pulmonar, etc.) en respuesta a una amplia variedad de estímulos. La primera actividad biológica descrita fue la activación de neutrófilos, en los que inducía degranulación, cambios morfológicos y quimiotaxis. Luego se observó que también era quimiotáctico para eosinófilos y basófilos. Es también un potente factor angiogénico. Dentro de la familia CC se encuentran la eotaxina, importante en los procesos alérgicos 126 AutoinmunidadHumana por ser quimiotáctica para eosinófilos, el RANTES que es quimiotáctico para linfocitos T de memoria, y la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP-1). En general, las quimiocinas CXC son potentes quimioatrayentes para neutrófilos mientras que las CC atraen más eficientemente a los monocitos. Dado que las respuestas inflamatorias se inician con la migración de estas células hacia el foco inflamatorio, dirigidas por la acción de las quimiocinas, estas moléculas son altamente inducibles en una amplia variedad de células por estímulos proinflamatorios, como el LPS bacteriano, IL1, TNF e IFN-gamma. Algunas quimiocinas CC son también potentes atrayentes de eosinófilos y basófilos e, incluso, de células T de memoria, de tal forma que puede iniciar una respuesta inflamatoria como consecuencia de una respuesta inmune específica. Hasta el momento actual se han descrito más de 40 moléculas de quimiocinas, que agrupadas en las dos grandes familias, CXC y CC, en las que se muestra la última nomenclatura sistemática propuesta y la original. Hasta hace poco se pensaba que las quimiocinas actuaban sobre neutrófilos, monocitos y eosinófilos, y que, por lo tanto, estaban implicadas principalmente en las respuestas inflamatorias agudas y crónicas. Recientemente se han identificado nuevas quimiocinas con características funcionales diferentes. Algunas de ellas son altamente específicas para linfocitos y células dendríticas y se expresan constitutivamente en órganos linfoides primarios y secundarios. El hallazgo de estas nuevas quimiocinas que tienen como diana células pertenecientes al sistema inmune ha atraído el interés sobre estas moléculas y ha propiciado una nueva clasificación, principalmente en base a criterios funcionales. De acuerdo con esta nueva clasificación se denominan quimiocinas inflamatorias a las clásicas con capacidad atrayente sobre monocitos y neutrófilos, mientras que las que actuan sobre linfocitos reciben el nombre de inmunoquimiocinas. 10.4Receptoresdelascitocinas La comunicación entre los diferentes tipos celulares del sistema inmune y de otros sistemas del organismo está mediada por factores solubles denominados citocinas. Estas moléculas ejercen su efecto biológico a través de su unión con receptores específicos expresados en la superficie celular. Los receptores de citocinas son proteínas de membrana glicosiladas que constan de una región extracitoplasmática de unión con la citocina, una región transmembranal y una región citoplasmática que interviene en la transmisión de señales al interior de la célula. La clonación de muchos de estos receptores y el análisis de su estructura ha permitido clasificarlos en 4 familias según regiones comunes de homología dentro de los miembros de una misma familia. Los receptores funcionales son de alta afinidad (10-9-10-11M), es decir, únicamente son necesarias bajas concentraciones de citocinas para una unión efectiva con su receptor y para desencadenar su correspondiente efecto biológico. Además, estos receptores se expresan en un número bajo en la superficie celular generalmente de unos pocos cientos a unos pocos miles de receptores por célula. La distribución de algunos de ellos, como por ejemplo los de la IL-2 y de la IL-5, está restringida a unos pocos tipos celulares mientras que otros, entre los que se pueden citar los de la IL-1, IL-4 e IL-6, se encuentran distribuidos en una amplia variedad de tipos celulares. La expresión de los receptores de citocinas en la superficie celular puede ser constitutiva, es decir, tiene lugar sin necesidad de ningún estímulo fisiológico o, por el contrario, puede requerir que la célula sea activada previamente. En general, la activación celular incrementa el número de receptores por célula. 127 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Muchos de los receptores de citocinas son complejos multicatenarios compuestos de una cadena que se une específicamente a la citocina (cadena específica) y de una cadena que transduce las señales al interior de la célula y que es compartida por otros receptores de citocinas (cadena común). Para la transducción de señales se requiere, en general, de la unión de varias cadenas específicas (homodímeros) o de la cadena específica con la común (heterodímeros). En algunos casos, es necesaria la interacción de tres cadenas para la formación de receptores de alta afinidad. La transducción de señales puede tener lugar por mecanismos comunes a todas las familias de receptores o por mecanismos específicos de cada una de ellas. Como comentaremos en este capítulo, muchas de las características funcionales de las citocinas, como la redundancia y el pleiotropismo, pueden ser explicadas ahora por los conocimientos actuales sobre la composición y mecanismos de señalización de sus receptores. Según su estructura, los receptores de citocinas se pueden agrupar en 4 familias diferentes: 1. La superfamilia de las Inmunoglobulina, 2. La familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), 3. La familia del receptor del factor de crecimiento hematopoyético (HGFR) que incluye la mayoría de los receptores de citocinas por lo que también se denomina superfamilia de los receptores de citocinas. 4. La familia de los receptores de quimiocinas. Dentro de cada familia la homología entre sus diferentes miembros es aproximadamente del 15 al 25%. Existen receptores que no pueden ser agrupados en ninguna de estas familias como, por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), la cadena a del receptor de la IL-2 y el receptor del factor b de crecimiento transformante (TGFbeta). 10.4.1SuperfamiliadelasInmunoglobulina Se incluyen dentro de esta familia un grupo de receptores que presentan en la región extracitoplasmática un número variable de dominios que son similares a los de las Inmunoglobulina y que intervienen en la unión con el ligando. La región citoplasmática contiene secuencias tirosina cinasa mediante las cuales tiene lugar la transducción de señales al interior de la célula como consecuencia de la unión del ligando con su receptor. A esta familia pertenecen los receptores de la IL-1 y de otras citocinas implicadas en el crecimiento celular como son el factor estimulante de colonias de mácrofagos (M-CSFR), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) y el factor de células pluripotentes (SCFR). Existen dos tipos de receptores para la IL-1 (IL-1RI e IL-1RII) a los que se unen tanto la IL-1a como la IL-1b aunque lo hacen con diferente afinidad. Recientemente se ha clonado un componente adicional del complejo del IL-1RI, denominado proteína accesoria del receptor de interleucina 1 (IL-1RAcP), que también pertenece a esta familia y que presenta una homología limitada con los IL-1RI y II. 10.4.2FamiliadelTNFR La característica principal de los receptores que se incluyen dentro de esta familia es la presencia en el dominio extracelular de 3 a 4 secuencias conservadas, de aproximadamente 40 aminoádos, ricas en cisteína e implicadas en la unión con el ligando. La región intracelular no presenta secuencias homólogas de aminoácidos y tampoco se han identificado secuencias con motivos de señalización al interior de la célula. Dentro de 128 AutoinmunidadHumana esta familia se incluyen el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) y los 3 tipos de receptores para el TNFa y las linfotoxinas (LT) (TNFRI, TNFRII y TNFRIII) (Tabla 9.1). El TNFa y la LTa (TNFb) se unen, con afinidades similares, tanto al TNFRI como al TNFRII mientras que la LTb se une al TNFRIII. Además, a esta familia de receptores pertenecen otras proteínas de membrana como el CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX-40, Fas-APO1 y APO2L. 10.4.3Superfamiliadelosreceptoresdecitocinas Los receptores que pertenecen a esta familia se pueden subdividir a su vez en dos clases relacionadas evolutivamente. La clase 1 está compuesta por la mayoría de los receptores de citocinas mientras que en la clase 2 se incluyen los receptores para los IFNs. Receptores de clase 1. Las cadenas polipeptídicas que forman parte de esta clase de receptores se caracterizan por poseer en su región extracitoplasmática dos pares de residuos de cisteína conservados en el extremo distal y un motivo Tryp-Ser-X-Tryp-Ser (WSXWS, donde X es un aminoácido no conservado) en su extremo carboxiterminal. La presencia de este dominio permite la unión eficiente del ligando al receptor. En la región citoplasmática no se han encontrado secuencias con actividad catalítica pero existen ácidos hidrofóbicos denomi­nados respec­tivamente box1 y box2 que son necesarios para la transducción de señales al interior de la célula. Los receptores que forman parte de esta clase son complejos multicatenarios y la mayoría de ellos además de poseer una o más cadenas específicas de unión al ligando comparten una misma cadena que interviene en la transducción de señales al interior de la célula. Dentro de esta clase se incluyen las cadenas de transducción comunes bc y gc, la cadena b del IL-2R, así como la cadena específica de los receptores de la IL-3, IL-4, IL-5, IL7, IL-9, GM-CSF, EPO (eritropoyetina) y TPO (trombopoyetina) (Tabla 9. 1). La cadena de transducción común gp130 y los receptores específicos de la IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, factor inhibidor de la leucemia (LIF) y oncostatina M (OSM) pertenecen a esta familia aunque su región extracitoplasmática distal presenta también dominios similares a los de las Inmunoglobulina, por lo que tienen una estructura de tipo mixto entre la de la superfamilia de las Inmunoglobulina y la de la superfamilia de receptores de citocinas. Además, dentro de esta familia se incluyen receptores para otras moléculas que no tienen funciones específicas inmunitarias, como el receptor de la hormona del crecimiento (GHR), de la prolactina (PRLR) y el del factor neurotrófico ciliar (CNTFR). Receptores de clase 2. Estos receptores tienen conservado en su región extracelular un par de residuos de cisteína aunque, a diferencia de los receptores de clase 1, no contienen el motivo WSXWS. Dentro de esta clase se incluyen los receptores de los IFNs y el receptor de la IL-10. Los IFNs se unen a dos tipos de receptores: el IFN-alfa y el b al receptor de tipo I (IFNRI) y el IFN-gamma al receptor de tipo II (IFNRII). Recientemente se ha comprobado que los receptores funcionales de los IFNs, tanto de tipo I como de tipo II, constan de dos cadenas. Las nuevas cadenas clonadas (IFNRI2 e IFNRII2) pertenecen también a esta familia de receptores y son necesarias para la transducción de señales. 129 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico En la figura se esquematiza la intensidad de la señal atendiendo a la afinidad de la citocina a su receptor. 10.4.5Receptoresdequimiocinas Las quimiocinas son un tipo de citocinas estructuralmente semejantes que se caracterizan por ejercer una actividad quimiotáctica y estimuladora sobre células de tipo inflamatorio. Esta familia de moléculas puede ser dividida en dos clases, CC y CXC, según variaciones en un motivo de cisteínas que se encuentra conservado en todos los receptores de esta familia. En las de tipo CXC, los dos residuos de cisteína están separados por un aminoácido no conservado mientras que en las de tipo CC las dos cisteínas están adyacentes. Los receptores a los que se unen las quimiocinas presentan caraterísticas muy diferentes a los receptores de las otras familias de receptores de citocinas. Actualmente se han clonado muchos de ellos y se ha comprobado que presentan una estructura similar a los receptores de la familia de la rodopsina ya que consisten en una región extracelular corta, contienen 7 dominios trans­membranales muy conservados y están asociados a proteínas de unión con nucleótidos de guanina (proteína G) que intervienen en la transducción de señales. Dentro de esta familia de receptores, se pueden distinguir los receptores específicos y los compartidos según su especificidad de unión con el ligando. Los específicos unen un ligando en concreto siendo el ejemplo más representativo el IL8RA o CXCR1 que única­mente une a IL-8. Por el contrario, los receptores compartidos pueden unir a más de una quimiocina del tipo CXC o a más de una quimiocina del tipo CC. Receptores de este tipo son, por ejemplo, el IL-8RB o CXCR2 que une a IL-8 y a otras quimiocinas CXC y el CCR1 cuyos ligandos son quimiocinas del tipo CC. 10.4.5.1Mecanismosdetransduccióndeseñales La unión de una citocina a su receptor en la superficie de la célula diana produce su efecto biológico mediante la fosforilación de proteínas celulares, incluido el propio receptor. Estas proteínas fosforiladas activan factores de transcripción produciéndose, en último término, la transcripción de determinados genes cuyos productos proteícos son los que, en último término, van a ejercer el efecto biológico correspondiente. En la mayoría de los receptores, el primer paso en la señalización consiste en la oligomerización de varias cadenas de receptores inducida por la unión con el ligando. Esta asociación permite el 130 AutoinmunidadHumana contacto de las regiones citoplasmáticas de los receptores a partir del cual se van a activar mecanismos de señalización específicos de cada familia de receptores de citocinas. Además, las citocinas también transducen señales mediante mecanismos comunes a otros ligandos: 10.4.5.2SuperfamiliadeInmunoglobulina:señalizaciónporreceptorescon actividadtirosinacinasa. En los receptores de la familia de las Inmunoglobulina, la señalización está mediada por secuencias con actividad tirosina cinasa presentes en su región citoplasmática que fosforilan residuos de tirosinas en proteínas citoplasmáticas. Este dominio está altamente conservado y funciona como un sitio de unión para el ATP implicado en la reacción de fosforilación. La oligomerización de varias cadenas del receptor parece ser necesaria para la inducción de la actividad tirosina cinasa. En el caso del PDGFR y M-CSFR, sus ligandos son complejos diméricos que, al unirse a dos cadenas próximas en la superficie celular, producen la dimerización del receptor y la transducción de señales al interior de la célula. El IL-1RI es un sistema más complejo ya que recientemente se ha comprobado que para una señalización efectiva por IL-1, además de la cadena específica, es esencial la presencia de la proteína accesoria (IL-1RAcP) también perteneciente a esta familia. 10.4.5.3SeñalizaciónenlafamiliadelTNFR La región citoplasmática de los receptores de la familia del TNFR no presenta secuencias con actividad catalítica pero se ha comprobado que para la transducción de señales por varios de ellos son necesarias unas proteínas citoplasmáticas, pertenecientes a una nueva familia, denominadas factores asociados al receptor del TNF (TRAF). Estas proteínas forman complejos multimoleculares e interaccionan con las regiones citoplasmáticas de los receptores produciéndose, en último término, la activación del 131 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico factor de transcripción NFkB. En esta familia también parece ser necesaria la oligomerización de varias cadenas del receptor para que tenga lugar la señalización al interior de la célula. Por ejemplo, en el caso del TNFR se produce la transducción de señales porque su ligando es una proteína trimérica que provoca la oligomerización de 3 cadenas del receptor y su posterior contacto citoplasmático. 10.4.5.4Superfamiliadelosreceptoresdecitocinas:señalizaciónporJaksy Stats En la superfamilia de receptores de citocinas tampoco existen dominios con actividad catalítica en su región citoplasmática. A pesar de ello, la unión de una citocina con su receptor produce una rápida fosforilación de tirosinas en proteínas celulares incluido el propio receptor. Esta señalización está mediada principalmente por una nueva familia de tirosina cinasas denominadas Janus cinasas (Jaks) y por factores de transcripción de una nueva familia denominada Stat (transductores de señal y activadores de la transcripción). No se conoce todavía el mecanismo exacto mediante el cual se produce la señalización por las cinasas Jak y los factores de transcripción Stat. Diversos estudios sugieren que las Jaks se encuentran asociadas con una de las subunidades del receptor y que la oligomerización del receptor inducida por la unión con su citocina produce la activación por autofosforilación de estas cinasas. Esta activación requiere los motivos citoplasmáticos box1 y box2 ya que mutaciones o deleciones en estas regiones suprimen la señalización. A continuación, las Jaks activadas fosforilan residuos de tirosina en el propio receptor y en los factores de transcripción Stat. El siguiente paso en la señalización consiste en la dimerización de los Stat fosforilados y en su translocación al núcleo donde se unen a secuencias palindrómicas en el ADN en las que se puede reconocer una estructura general TT(N) 5A. La familia de cinasas Jak consta actualmente de 4 miembros (Jak1, Jak2, Jak3 y Tyk2). Parece existir un patrón de asociación entre un determinado receptor y una determinada Jak según la cadena común que interviene en la transducción de señales. Uno de los ejemplos más claros es el de los receptores que utilizan la cadena gc en los que la cadena específica se asocia con Jak1 mientras que la cadena común se asocia con Jak3. La identificación de los Stats y su relación con las cinasas Jak ha sido posible gracias a los estudios realizados sobre la inducción de transcripción en respuesta a los IFNs. Hasta el momento se han identificado 6 componentes de esta familia. No parece existir un patrón específico de activación receptor-Stat ya que un Stat puede ser activado por múltiples receptores y la unión de una citocina con su receptor puede activar varios Stats. Por otra parte, existe una cierta relación entre grupos de receptores que comparten una misma cadena de transducción de señales y determinados Stats. Así, los receptores que comparten la cadena bc activan el Stat5 mientras que los que utilizan la cadena gp130 activan preferentemente el Stat3. 10.4.5.5Familiadelosreceptoresdequimiocinas:señalizaciónpor proteínaG La señalización por los receptores de quimiocinas está mediada por proteínas G asociadas a su extremo carboxiterminal. Estas proteinas se encuentran localizadas en la cara interna de la membrana citoplasmática y catalizan el intercambio de GDP por GTP produciéndose la activación de muchas enzimas citoplasmáticas y, en último término, la 132 AutoinmunidadHumana activación de factores de transcripción. En esta familia, no es necesaria la oligomerización del receptor para la transducción de señales al interior de la célula ya que los receptores funcionales constan únicamente de una cadena. 10.4.5.6Víascomunesdetransduccióndeseñales Además de los mecanismos de señalización específicos de cada familia de receptores, las citocinas pueden activar mecanimos comunes a las distintas familias e incluso a otros sistemas de receptores. Los primeros candidatos para la fosforilación en tirosinas producida inmediatamente después de la unión de una citocina con su receptor fueron cinasas de la familia src. Estas tirosina ciinasas han sido implicadas en la respuesta a muchos ligandos y además se requieren en la activación celular a través del TCR. Actualmente, se ha comprobado que varias src ciinasas son activadas por receptores de citocinas de la superfamilia de las Inmunoglobulina, como el PDGFR, y por varios componentes de la superfamilia de receptores de citocinas. Otra vía de señalización utilizada también por los receptores de citocinas es la RasGTP que, además, forma parte del crecimiento normal en respuesta a muchos factores de crecimiento y de la proliferación maligna inducida por oncogenes. La estimulación de esta vía, en último término, produce la activación de la cascada de cinasas de proteína activadas por mitógenos (MAPK). Las MAPK activadas se translocan al núcleo donde fosforilan varios factores de transcripción como c-Myc y c-Jun. La transducción de señales por la vía Ras-GTP parece ser común a muchas citocinas ya que su activación ha sido observada en la señalización por componentes de todas las familias de receptores de citocinas. 10.4.5.7Implicacionesfuncionalesdelosreceptoresdecitocinas. Determinadas características funcionales de las citocinas pueden ser explicadas ahora por los recientes conocimientos adquiridos sobre la composición y los mecanismos de activación de sus receptores. Las citocinas son redundantes, es decir, varias citocinas ejercen efectos biológicos similares sobre un mismo tipo celular. El que algunos receptores de citocinas sean complejos oligoméricos que comparten una misma cadena de transducción de señales puede explicar este hecho. En estos receptores, la señalización tendría lugar por vías comunes produciéndose la transcripción de los mismos genes. Este fenómeno ha sido mejor observado en las citocinas que utilizan receptores que son miembros de la superfamilia de los receptores de citocinas. Por ejemplo, la IL-3 y el GMCSF que utilizan receptores que comparten la cadena beta como transductora de señales tienen funciones muy parecidas en el sistema hematopoyético. En el caso de las citocinas que utilizan la cadena gp130 (IL-6, LIF, CNTF, OSM, e IL-11), todas ellas son capaces de inducir la producción de proteínas de fase aguda en el hígado. Respecto a las citocinas cuyos receptores comparten la cadena gamma como transductora de señales (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15), todas son factores de crecimiento de células T. Este hecho es de gran importancia en la inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (XSCID) en la que no se produce un desarrollo normal de células T debido a la falta de una cadena transductora funcional por mutaciones en la cadena gamma. Otro mecanismo que explicaría la redundancia de las citocinas es el hecho de que no exista una elevada especificidad de unión entre una citocina y su receptor como es el caso de las quimiocinas y sus receptores. Muchas de ellas tienen efecto quimiotáctico sobre un mismo tipo celular lo que puede ser explicado porque comparten un mismo receptor. 133 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico La pleiotropía es otra característica funcional de las citocinas ya que algunas realizan múltiples funciones diferentes en distintos tipos celulares. El empleo de varias rutas de señalización así como la activación de múltiples cinasas y factores de transcripción que tiene lugar como consecuencia de la unión de las citocinas a sus receptores puede explicar la diversidad funcional de las mismas. 10.4.5.8ReceptoresSolubles Además de existir como proteínas de membrana, muchos receptores de citocinas son sintetizados como proteínas solubles. La existencia de estos receptores ha modificado en gran manera el conocimiento sobre la interacción citocina-receptor y la regulación de las distintas funciones de las citocinas. A nivel molecular, los mecanismos más comunes de generación de las formas solubles de los receptores son la rotura proteolítica del receptor expresado en la membrana y el procesamiento alternativo del ARNm. El receptor soluble del CNTF (sCNTFR) se forma por un mecanismo de rotura lípidica y en el caso de la forma soluble del receptor de la IL-6 (sIL-6R), no se conoce su mecanismo de generación. Los receptores solubles pueden ejercer varios efectos biológicos si bien el más común es el de antagonistas de su receptor equivalente en la membrana mediante compe­tición por la unión con el ligando para prevenir la señalización al interior de la célula. Receptores solubles de este tipo son, por ejemplo, los de la IL-1, IL-4 y TNF-alfa ya que producen una inhibición dosis dependiente de la función del receptor de membrana. Cuando los receptores solubles se generan por proteolisis de los receptores de membrana, disminuye el número de receptores funcionales a los que se puede unir la citocina en la superficie celular y por tanto, también se produce una inhibición en la señalización al interior de la célula. Además de las funciones inhibidoras de los receptores solubles, se ha comprobado que, en algunos casos, estos receptores pueden facilitar la señalización inducida por la unión con su citocina en células que no expresen el receptor funcional completo de membrana. Este mecanismo se ha observado en las formas solubles de receptores. 134 UNIDADDIDÁCTICAXI ACTIVACIÓNLINFOCITOST AutoinmunidadHumana 11.1IntroducciónactivaciónlinfocitosT La activación de los linfocitos T se produce tras el reconocimiento por parte del TCR/CD3 de la molécula HLA y el péptido presentado por la misma junto con otros procesos, como son la activación de ciertas moléculas accesorias presentes en su membrana. También en este proceso de activación se hace mas eficiente si los linfocitos reciben el estimulo de ciertas citocinas mediante su unión a los receptores específicos presentes también en la membrana de estos linfocitos. Una vez activados los linfocitos T, estos prioritariamente producirán citocinas o factores citotóxicos, según se trate de linfocitos T CD4+ o CD8+. De esta manera se desarrollará la respuesta inmune. Los linfocitos T CD4+ colaborarán en la posterior activación de otras células, tales como NK, T CD8+, linfocitos B o macrófagos. A su vez los linfocitos T CD8+ tras su activación ejercerán su función citotóxica destruyendo células blanco. 11.2Fenómenosdeinteraccióncelular El proceso de reconocimiento varía si el receptor de la célula T está formado por el heterodímero alfa/beta (células T alfa/beta CD4+ o CD8+) o si es del tipo gamma/delta (células T gamma/delta CD4-/CD8-), ya que en estas últimas no existe función coestimuladora por parte de las moléculas accesorias CD4 y CD8 (no se puede producir la unión MHC-CD4 o MHC-CD8). Como se dijo anteriormente, las moléculas de histocompatibilidad "no clásicas" pueden presentar péptidos antigénicos a los receptores gamma/delta. En muchos casos la unión del antígeno con el TCR no es suficiente para dar lugar a una respuesta inmune eficaz. Para que esta respuesta se lleve a cabo se requiere la participación de una serie de moléculas conocidas globalmente como accesorias, y cuya función es precisamente la de contribuir al desarrollo de una respuesta inmune efectiva facilitando la interacción entre las distintas células. Se forma así lo que se viene en denominar sinapsis entre linfocitos T y célula presentadora de antígeno. Las principales moléculas que están implicadas en este fenómeno de reconocimiento son el CD4, CD8, CD2, CD45 y CD28 y sus ligandos respectivos. Todas estas moléculas de adhesión también juegan un importante papel en la transducción de señales y activación de la célula T. 137 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 11.2.1MoléculasCD4yCD8 Las moléculas CD4 y CD8 son glicoproteínas cuyos ligandos naturales son las moléculas del MHC de clase II y de clase I respectivamente. La molécula CD4 pertenece a la superfamilia de las Inmunoglobulina y esta formada por una sola cadena. La molécula CD8 pertenece también a la superfamilia de las Igs. Las interacciones de estas moléculas con el HLA, juegan un papel esencial en la maduración tímica de los linfocitos. 11.2.2MoléculasCD2 Las moléculas CD2 junto con el CD11a/CD18 (LFA-1) son las moléculas de adhesión primaria que contribuyen a potenciar la afinidad de unión del linfocito T a la célula presentadora. Sus ligandos naturales que son el CD58 (LFA-3) y CD54 (ICAM-1) respectivamente, se expresan en la superficie de todas las células que realizan la función de APC. El CD2 es una glicoproteína presente en la superficie de timocitos y linfocitos T, organizada en dos dominios globulares extracitoplasmáticos, una región transmembrana y una larga región intracitoplasmática. Esta molécula es la primera molécula que se expresa en el linaje T durante su diferenciación y se encuentra en todos los timocitos y células T maduras. Además de su papel en la interacción entre células, está implicado en una vía alternativa de activación T antígeno-independiente. Otras moléculas de membrana que intervienen en el proceso de adhesión son CD5 y CD40, cuyos ligandos en la APC son, respectivamente, CD72 y CD40L. 11.2.3MoléculasCD28 Las moléculas CD28 son también de especial importancia en los mecanismos de adhesión celular. El CD28 se expresa en todos los linfocitos CD4 y aproximadamente en el 50% de los linfocitos CD8, sus ligandos naturales pertenecen a la familia B7 (B7-1, CD80; B7-2, CD86). CD28, además de su papel en el proceso de adhesión, también participa en el mecanismo de transducción de señal y activación de la célula T ya que el CD28 induce la denominada segunda señal de activación celular (la primera está generada por el TCR/CD3). En ausencia de esta segunda señal, los linfocitos T pueden anergizarse por la primera señal de activación dependiente TCR/CD3. Esta segunda señal parece ser regulada negativamente por la molécula CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4). 11.3Transmisióndeseñales Todas las células eucariotas incluidos los linfocitos T, B y NK poseen mecanismos a través de los cuales los estímulos externos son procesados y enviados al núcleo a través de una serie de cambios bioquímicos que conocemos genéricamente como señales de activación intracelulares o de transducción de señales. Estos mecanismos implican la formación de los denominados segundos mensajeros que son capaces de regular la transcripción específica de un amplio número de genes, los cuales participan en los procesos de crecimiento, división y diferenciación celular. En la activación de esta cadena de segundos mensajeros intervienen señales procedentes tanto del TCR/CD3 como de las moléculas accesorias y receptores de citocinas presentes en la membrana de los linfocitos. Un mecanismo fundamental en la regulación de la actividad y la función de numerosas proteínas en las células eucarióticas son los ciclos de fosforilación y defosforilación mediados por cinasas y fosfatasas. Básicamente existen dos tipos de cinasas, dependiendo de su actividad fosfotransferasa la cual se manifiesta fosforilando proteínas en aminoácidos serina y treonina (serina/treonina cinasas) o bien en 138 AutoinmunidadHumana aminoácidos tirosina (tirosina cinasas). Igualmente hay fosfatasas que defosforilan específicamente proteínas fosforiladas bien en serina/treonina o en tirosina. Una propiedad general de los linfocitos es la necesidad de generar dos señales distintas para inducir la proliferación hacia células efectoras. Como se ha comentado anteriormente la primera señal la proporciona la unión del complejo péptido-MHC al TCR (y a los co-receptores CD4 y CD8), esta señal está potenciada por moléculas de adhesión (CD2, el LFA-1, el CD26, etc.). La segunda señal es suministrada por moléculas coestimuladoras del tipo CD28, que de alguna manera complementan las señales de activación inducidas por el TCR permitiendo una activación celular completa. Estas señales coestimuladoras son necesarias para la activación del linfocito, ya que en su ausencia la señal mediada por el TCR puede conducir al linfocito a la muerte celular o a un estado de anergia (en la que el linfocito no responde a nuevas estimulaciones). Después de la ocupación de los receptores T por el antígeno, se produce la activación de los linfocitos y la iniciación de eventos tempranos de traducción de señales que finalmente conducen a la reprogramación génica y a la adquisición de funciones efectoras. Para que el linfocito T pueda llevar a cabo estas funciones se requiere un complejo sistema responsable de la transmisión de señales de activación desde la superficie al interior de la célula. En esta última década se está realizando un gran esfuerzo para identificar los componentes celulares y moleculares que están involucrados en dicha activación celular y determinar la secuencia de eventos bioquímicos que ocurren después del reconocimiento del antígeno. 11.3.1EstímulosiniciadosporelTCR Uno de los primeros eventos bioquímicos que ocurren en linfocitos T después de la interacción Ag-TCR, es el incremento de fosforilación en tirosina de las cadenas no polimórficas del CD3. Estas cadenas poseen en sus dominios intracitoplasmáticos unas regiones denominadas ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs) que se fosforilan por la acción de las tirosina cinasas c-lck o c-fyn. La tirosina cinasa c-lck se encuentra localizada en la parte intracelular de la membrana plasmática unida a la bicapa lipídica por un proceso de miristilación de su región aminoterminal (Figura 10.6). La asociación física y funcional del CD4 y del CD8 con el TCR/CD3, hace que la c-lck asociada a estas moléculas se aproxime a la porción citoplásmica de las proteínas del complejo CD3, donde puede fosforilar en tirosina a sus regiones ITAM. Además del CD3 esta cinasa puede también fosforilar otros substratos como es el caso de PLC-gamma-1 (fosfolipasa C-gamma-1) que participa en la regulación del sistema inositol fosfato que se describirá más adelante. C-fyn, al igual que c-lck es otra tirosina cinasa que pertenece a la familia de cinasas Src. También está anclada a la cara interna de la membrana celular por miristilación de su porción aminoterminal. Esta cinasa está físicamente asociada al TCR y su actividad está regulada por la ocupación y activación del mismo. Una vez que los ITAM son fosforilados en residuos tirosinas, se convierten en sitios específicos de acoplamiento que se unen a proteínas citoplásmicas con dominios SH2. La función de los dominios SH2 es interactuar con algunas proteínas que se encuentran fosforiladas en residuos tirosina, así su función esta regulada por procesos fosforilacióndesfosforilación de estos aminoácidos. Por este motivo, un dominio SH2 puede interactuar con una fosfotirosina adyacente en la misma o en otra molécula. Cuando es sobre la misma molécula contribuye al control de su propia actividad enzimática. En otras 139 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico ocasiones, la enzima con el dominio SH2 interacciona a través de dicho motivo con otras proteínas previamente fosforiladas en tirosina por otra cinasa. Esta interacción es responsable de su activación y de la de otros substratos. Este es el caso de la enzima ZAP70 que se activa cuando a través de sus dominios SH2 se une a las cadenas que han sido previamente fosforiladas por c-fyn o c-lck. ZAP-70 desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la cascada de señales que se pone en marcha tras el reconocimiento del antígeno por el TCR. En este sentido, esta enzima es un acoplador de señales desde la superficie celular al núcleo por fosforilación de los adaptadores Lat y SLP-76. Lat es una proteína transmembrana cuya función, una vez fosforilada, es organizar complejos multimoleculares en determinados subdominios lipídicos de la membrana plasmática. Estos complejos contienen proteínas claves en la señalización al interior de la célula como son la PLC-gamma1 (fosfolipasa C), el Grb-2 (growth factor binding protein), SLP-76, la PI3K y Vav-1 11.3.2FosfatasaCD45 El CD45, LCA (Antígeno común leucocitario) o T200 es una de las glicoproteínas más abundantemente expresadas en la superficie de células hematopoyéticas, pudiéndose detectar hasta un millón de moléculas por célula El CD45 presenta una larga región citoplasmática que contiene dos dominios catalíticos con actividad fosfatasa, una región intra-membrana y una región aminoterminal extracelular que se encuentra glicosilada y que varía en su estructura. Esta variedad ha sido explicada después del clonaje e identificación del gen que, codificada dicha proteína, el cual gracias a que puede transcribir de forma alternativa los tres exones (A, B y C) que codifican la porción aminoterminal de la proteína. Esta transcripción alternativa puede generar hasta ocho diferentes ARN mensajeros que traducen al menos seis diferentes isoformas del CD45 en la membrana celular. El ligando del CD45 no se conoce y la existencia de estas diferentes isoformas pueden indicar que los ligandos del CD45 sean múltiples y medien diferentes funciones en diferentes subpoblaciones de linfocitos T. 11.3.3PLC‐gamma‐1 Después del reconocimiento antigénico por parte del TCR esta PLC-gamma-1, se fosforila en tirosina y se activa dentro de los complejos multi moleculares lipídicos de la membrana plasmática donde induce la hidrólisis de su substrato específico, el fosfatidilinositol bifosfato (PIP2), generándose los metabolitos inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). El IP3 se une a un receptor específico (IP3R) localizado en unas estructuras específicas del retículo endoplásmico facilitando la liberación del calcio intracelular de sus compartimentos y aumentando la concentración de estos iones en el espacio libre intracelular. El IP3, posiblemente en conjunción con su metabolito, el IP4, puede regular los canales de calcio de la membrana plasmática permitiendo la entrada de calcio del exterior al interior celular. El calcio intracelular puede estimular la enzima calmodulina, que es una serina/treonina cinasa que puede activar a su vez a la fosfatasa calcineurina. Además de la activación del sistema calmodulina/calcineurina, los niveles altos de calcio intracelular también ayudan a la activación de otras cinasas como son algunas isoenzimas de las proteína cinasas C (PKC) y posiblemente algunas cinasas activadas por mitógenos (MAPKs). El otro metabolito de la hidrólisis del PIP2, el diacilglicerol es el principal responsable de la activación de las enzimas proteína cinasas C. 140 AutoinmunidadHumana 11.3.4ProteínaCinasasC Las proteína cinasas C (PKCs) son una familia de isoenzimas que están ampliamente distribuida en tejidos y órganos. Esta familia de serina/treonina proteína cinasas está constituida por varias subfamilias que engloban distintas isoformas. Hasta el momento, se conocen 11 isoenzimas de PKC diferentes, clasificadas según su estructura y necesidad de cofactores para su activación. Aunque todas las isoformas de PKC se activan mediante fosfolípidos, estas isoenzimas en particular se diferencian marcadamente en su sensibilidad hacia el calcio. Teniendo en cuenta este factor, podemos clasificar estos 11 genes de PKC de mamíferos conocidos hasta ahora en las siguientes subfamilias: - PKC convencionales (cPKC): su activación es dependiente de Ca++ y diacilglicerol (DAG). Esta subfamilia engloba las siguientes isoformas: alfa, beta (1 y 2) y gamma. - PKC novel (nPKC): su activación es dependiente de diacilglicerol e independiente de Ca++. Esta subfamilia engloba distintas isoformas: delta, epsilon, etc. - PKC atípica (aPKC): pertenecen estructuralmente a esta familia de enzimas, pero no se activan mediante ésteres de forbol o diacilglicerol. Esta subfamilia engloba varias isoformas. Las PKCs en condiciones de reposo celular se encuentra localizada en el citosol donde es inactiva, una vez que recibe el estímulo del DAG conjuntamente con iones Ca++ (dependiendo del isotipo enzimático) se transloca a la membrana celular donde en presencia de fosfolípidos (fundamentalmente fosfatidilserina) ejerce su función de cinasa de proteínas en aminoácidos serina y treonina. La implicación de las PKCs en el transcurso de activación de células T ha sido bien establecida desde finales de los años 70. Así, las células T expresan múltiples isotipos de PKC, incluyendo PKC-alfa,-beta1 y otros; sin embargo, el papel de los diferentes isotipos de PKC en la regulación de la señalización celular y la transcripción génica no está aún establecido definitivamente. La activación de linfocitos T implica una compleja cascada de respuestas celulares, que incluye la entrada en el ciclo celular y la liberación de citocinas. La estimulación de células T resulta en la transcripción de varios genes y en la expresión de una determinada variedad de moléculas, incluyendo las citocinas y sus receptores específicos (como es el caso de IL-2 y su receptor). Las PKCs regulan la activación de genes de células T mediante el control de varios factores de transcripción. 11.3.5GAP‐RAS La familia de los protooncogenes Ras comprende al menos tres genes que codifican otras tantas proteínas denominadas Ha-, Ki- y N-Ras, que juegan un papel crítico en el control de la proliferación celular. 11.3.6Fosfatidilinositol‐3'Cinasa(PI3K) Además de la PLCgamma1, otras enzimas presentes en las células T que participa en el metabolismo de fosfolípidos son las denominadas fosfatidilinositol-3' cinasas (PI3Ks), que fosforilan el PIP2 generando cuatro especies de inositoles específicos que son; i) el fosfatidilinositol 3-fosfato; ii) el fosfatidilinositol 3,4-bifosfato; iii) el fosfatidilinositol 3,5bifosfato y iv) el fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato.. Una de las dianas mejor caracterizadas de la acción de estos lípidos fosforilados es la proteína cinasa B. En respuesta a estímulos 141 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico externos, la Akt citosólica (inactiva) se transloca a la mebrana plasmática por los estos inositoles fosfatos y se fosforila y activa. Una vez que Akt está activa es capaz de fosforilar y activar a su vez una gran variedad de substratos (BAD, CREB, factores de transcripción de la familia forhead, la cinasa IkB, la procaspasa-9, etc.), explicando el por qué de la importancia de esta cinasa como elemento clave en los procesos de proliferación y diferenciación celular. 11.3.7ProteínaCinasaActivadaporMitógenos(MAP‐CINASAS) En los últimos años se ha identificado y caracterizado parcialmente un sistema de transmisión de señales crucial no solo para la activación de células T sino también para todas las células eucariotas. Este sistema de traducción de señales está regulado por las MAPKs (mitogen activated protein kinases) que de alguna manera actúan como puente entre tirosinas cinasas próximas a la membrana con otras cinasas que fosforilan en aminoácidos serina/treonina una serie de factores de transcripción regulando así su actividad transactivadora. Estas MAPKs engloban a una familia de serina/treonina cinasas, que son activadas cuando a su vez se fosforilan en serina/treonina o tirosina. Al menos tres subfamilias de MAPKs han sido bien identificadas, i) las ERK1 y 2 (Extracellular Regulated Kinases), 2) la subfamilia de c-Jun cinasas, JNK1, JNK2 y JNK3 (también llamadas SAPK), y 3) la subfamilia p38 (p38, p38b, p38g, y p38d). Las ERKs activadas migran al núcleo donde regulan la transcripción de c-fos, que forma dímeros con c-jun para formar el complejo AP-1, que es fosforilado por las JNK en la subunidad c-jun, regulando su actividad transcripcional. La p38 también participa en la activación de AP-1 y recientemente se ha descrito que en linfocitos T actúa como limitador de la regulación transcripcional mediada por el factor de transcripción NF-AT. Las MAPKs son reguladas a su vez por otras cinasas denominadas MAPKK, y estas a s vez por otro grupo de cinasas que por inercia han sido llamadas MAPKKK (ej, Raf). Estas últimas actuarían como integradores de las señales inducidas por la ocupación de receptores de activación (ej. el TCR), fosforilando a las MAPKK, y estas a su vez fosforilando a las MAPKs en residuos treonina y tirosina. 11.3.8FactoresdeTrascripción Tras la activación de las células T se transcriben alrededor de 100 genes (conocidos). La activación de esta plétora de genes ocurre de una manera secuencial, de manera que alguno de ellos se transcribe inmediatamente después del reconocimiento antigénico y otros incluso días después. Por este motivo se pueden clasificar de manera didáctica en genes inmediatos (su trascripción ocurre entre diez y treinta minutos después de la activación), tempranos (transcritos entre treinta minutos y dos días) y tardíos (transcripción entre dos días e incluso hasta dos semanas). Una de las funciones más importantes de los linfocitos T es la producción de linfocinas, las cuales, en última instancia, junto a los procesos de interacción e celulares, van a modular el tipo de respuesta inmune producida. 11.3.9FactornucleardelacadenaKdecélulasB(NF‐κB/rel) NF-κB (factor nuclear de la cadena Kappa en células B) fue caracterizado por primera vez, en 1986, como un factor específico de células B y que se unía a una secuencia localizada en el promotor de la cadena ligera de las Inmunoglobulina. NF-kB se encuentra fundamentalmente en todos los tipos celulares y está implicado en la activación de 142 AutoinmunidadHumana multitud de genes en respuesta a inflamación, infección y otras situaciones de stress que requieren una rápida reprogramación de la expresión génica. Este factor de trascripción está formado por una familia de proteínas que presentan una alta homología entre ellas y que está compuesta principalmente por las proteínas p50, p52, p65, RelB, y c-rel. Estas proteínas pueden estar formando distintos complejos entre ellas siendo los más comunes p50/p50 y p50/p65. Los distintos complejos tienen distintas afinidades por los sitios de unión al DNA y posiblemente tengan diferentes actividades transactivadoras. 11.3.10Activadordeproteína1(AP‐1) A diferencia de NF-KB, AP-1 (Activador protein 1) es un factor de transcripción exclusivamente nuclear que se activa por fosforilación mediada por determinadas cinasas que se translocan al núcleo e inducen en este factor una modificación postranslacional que le hace activo. 11.3.11FactornucleardecélulasTactivadas(NF‐AT) La familia de proteínas NF-AT (Nuclear Factor of Activated T cells) está constituida al menos por cuatro miembros NF-AT1/p, NF-AT2/c, NF-AT3, y NF-AT4/x, presentando cada uno de ellos, excepto NF-AT3, varias isoformas probablemente derivadas de splicing (corte y empalme) alternativo del mismo gen. Todas las isoformas presentan dos regiones de secuencia homólogas entre ellas, el dominio de unión al ADN (DBD) y la región homóloga para NF-AT (NHR). El DBD, comprendido aproximadamente entre los aminoácidos 400 y 700, es la zona más conservada entre los miembros de la familia NFAT. 11.3.12Inmunopatologia Se han descrito alteraciones de muchas de la cinasas que intervienen en la activación de los linfocitos T. Así, se ha descrito el déficit de Zap-70 en individuos que tenían en común valores muy bajos o ausentes de linfocitos T CD8+ en sangre periférica. Los linfocitos de los pacientes no proliferan en respuesta a lectinas, a Anticuerpos monoclonales anti-CD3, a antígenos o a células alogénicas. Los análisis de laboratorio revelan la ausencia de Zap 70 en los linfocitos T de los pacientes. 143 UNIDADDIDÁCTICAXII ACTIVACIÓNCÉLULASNK AutoinmunidadHumana 12.1Introducción Las células NK participan activamente en la defensa del organismo frente a infecciones, principalmente de tipo viral y frente al crecimiento de células tumorales. Estas células participan tanto en la defensa innata y como en los mecanismos de defensa adquirida o adaptativa. La función esencial de estas células es identificar y destruir células blanco. También es importante su función reguladora del sistema inmune debido a su capacidad secretora tanto de citocinas como de quimiocinas. Las células NK constituyen la tercera estirpe de células de tipo linfoide. Carecen de TCR y de Igm, que junto con otros marcadores definen a este grupo celular. La detección de algunos de estos marcadores puede ser variable, definiéndose varias subpoblaciones NK, tales como células muy positivas para CD56 (CD56 bright), muy poco positivas para este marcador (CD56dim), o células CD16+ CD56+ o CD16-CD56+, etc. Las células NK se encuentran en sangre, bazo y médula ósea y en muy baja proporción en ganglios linfáticos. 12.2FuncióncitotóxicadelascélulasNK La función citotóxica de las células NK fué la primera acción asignada a estas células y el motivo de su descubrimiento. Para que las células NK ejerzan su función citotóxica se requiere la identificación, a través de los receptores implicados, de las células blanco. Entre estos receptores destacan receptores de activación y otro grupo recientemente descrito de receptores que tienen como ligando moléculas de histocompatibilidad clase I y que pueden ser de tipo inhibidor o activador. En este fenómeno además intervienen ciertas citocinas y moléculas de adherencia facilitadoras de la interacción celular. Mediante la acción citolítica, las células NK pueden destruir un amplio espectro de células, tanto anormales (infectadas por virus o tumorales) como incluso normales (alogénicas). Esta lisis se realiza de manera directa, lisis natural, o bien mediante la participación de Anticuerpo, citotoxicidad celular dependiente de Anticuerpos o ADCC. La citotoxicidad natural consiste en lisis de una gran variedad de células de manera espontánea y sin necesidad de un periodo de sensibilización previa. De ahí la 147 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico denominación dada de NK (de natural killer) debido a que la capacidad citolítica que presentan lo hacen, a diferencia de las células T citotóxicas, de una manera natural, esto es sin necesidad de un aprendizaje preliminar. Esto implica que estas células no requieren un proceso de preparatorio de activación para destruir células en los términos que lo hacen los linfocitos T citotóxicos, pero sin duda la activación por células blanco o por citocinas hace que esta función sea mas eficiente. Kärre y Cols observaron que variantes de una misma línea celular tumoral manifestaban distinto grado de sensibilidad a la lisis NK, que se correlacionaba inversamente con la expresión de moléculas de clase I del MHC. Por otra parte, la transfección de células diana con moléculas del MHC-I les confería resistencia. Los autores propusieron la teoría de missing self para explicar los fenómenos de citotoxicidad natural. Así hoy se considera que pese a que las células NK son responsables de mecanismos de citolisis inespecífica no restringida por el MHC, se sabe que la función de las células NK está regulada en parte por el reconocimiento de moléculas MHC de clase I (MHC-I) en la célula diana. La citotoxicidad dependiente de Anticuerpos (ADCC), implica la presencia de Anticuerpos que son reconocidos por su extremo Fc por los receptores CD16 presentes en las células NK y también en otras células, como son los macrófagos. Cuando el CD16 reconoce su ligando activa la maquinaria lítica de la célula NK. 12.3FunciónsecretoradelascélulasNK Además de la acción citotóxica, las células NK tienen la propiedad de sintetizar y liberar diversos tipos de citocinas de gran importancia en la regulación del sistema inmunitario, en la acción de las propias células NK y en otras funciones como es la hematopoyesis. Las principales citocinas producidas por las células NK son TNF-alfa, IFN-gamma, IL-3, GM-CFS y M-GSF. Estos inmunomoduladores se producen como consecuencia de la activación de células NK como consecuencia de su interacción con la célula blanco, por la acción de diferentes citocinas como son IL-2 y Il-12 o por activación directa, por ejemplo por Anticuerpos frente a las moléculas CD16, CD69, CD80 y otras. También las células NK producen cuando son estimuladas ciertas quimiocinas, tales como MIP-1alfa, MIP-1beta y RANTES de gran importancia en los fenómenos inflamatorios. Hoy se sabe que las células NK mas positivas para el CD56 (CD56bright) poseen mayor capacidad para producir citocinas que las células mas débiles para esta molécula (CD56dim). A su vez las células NK CD56dim poseen mayor capacidad citotóxica que las CD56 bright. 12.4ReceptoresactivadoresdecélulasNK Para que las células NK desarrollen su función tienen que identificar a la célula blanco. Para ello las células NK poseen diferentes tipos de receptores con función de reconocimiento de moléculas en las células blanco y en consecuencia de activar la maquinaria citolítica y/o secretora de estas células. Después veremos como junto a estos receptores de tipo activador existen otros cuya función es inhibidora. En consecuencia hoy se conoce que la acción final de las células NK depende del equilibrio entre las señales inhibidoras y activadoras procedentes de sus receptores de superficie. 148 AutoinmunidadHumana Entre los receptores de activación de las células NK destacan el CD16, CD80, CD43 y los recién descritos receptores de citotoxicidad natural (NCKs) y entre los inhibidores destacan ciertos receptores presentes en las células NK con capacidad de reconocer molécula de histocompatibilidad (Receptores NK de HLA). 12.4.1ReceptorCD16 La vía de activación a través de CD16 es, al menos parcialmente, comparable a la del CD3/TCR. Ambos receptores se asocian a ciertas cadenas del complejo CD3, implicadas en la transducción de señales. Por otra parte, la estimulación vía CD16, determina también la activación de ciertas cinasas y PLC-gamma, y se ha demostrado su asociación molecular con p56lck. 12.4.2Receptoresdecitotoxicidadnatural Los receptores de citotoxicidad natural (NCKs), han sido descritos recientemente y de manera mayoritaria por el grupo de Moretta, mediante el empleo de Anticuerpos monoclonales en ensayos en donde lo que se ha analizado es la capacidad de inhibir la lisis de determinadas líneas celulares tras el uso de los mencionados Anticuerpos. Entre estos receptores destacan tres conocidos como: - NKp46. - NKp44. - NKp30. También recientemente se han descrito receptores de tipo activante que se caracterizan por reconocer específicamente moléculas de histocompatibilidad y que trataremos a continuación. 12.4.3ReceptoresNKEspecíficosdeantígenosHLA El reciente descubrimiento de receptores presentes en células NK que reconocen moléculas de histocompatibilidad y que tienen funciones reguladoras de la función de estas células ha abierto una importante puerta para entender la biología de estas células. Los receptores NK específicos de antígenos HLA clase I son un grupo heterogéneo de glicoproteínas que pertenecen a distintas familias de moléculas y se expresan en células NK pero también en ciertos linfocitos T. La primera familia incluye receptores de antígenos HLA-I pertenecientes a la superfamilia de las Inmunoglobulina. Originariamente estos receptores se conocieron por su acción inhibidora de la citotoxicidad y se denominaron como KIRs (killer cell Ig-like receptors). Otro grupo de estos receptores pertenece también a la superfamilia de las inmunogbubulinas y son conocidos como ILTs (immunogloobulin like transcripts). Además existe otro grupo de receptores que son heterodímeros formados por la asociación de dos moléculas diferentes con dominio lectina tipo C como es el CD94 que se puede unir a miembros de las superfamilia de moléculas NKG2. Estos receptores pueden tener acción inhibidora, que es como originariamente se descubrieron, pero pueden poseer también acción activante de acuerdo con la estructura de la parte citoplasmatica de sus moléculas. 149 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 12.4.4ReceptoresNKtipoKIR Se trata de receptores que pertenecen a la familia de las Inmunoglobulina. Originariamente estos receptores fueron descubiertos porque estaban implicados en la inhibición de la lisis al interaccionar específicamente con determinadas moléculas HLA de clase I de la célula blanco. En primer lugar, se observó cierta correlación entre la expresión de estos receptores por distintos clones NK y el reconocimiento de diferentes grupos de alelos de HLA-C. Por otra parte, se observó que Anticuerpos monoclonales frente a estos receptores restablecían la citotoxicidad de los clones NK frente a dianas protegidas específicamente por la expresión de moléculas HLA. La distribución de estos receptores en las células NK no es homogénea y cada clon NK puede expresar uno o varios tipos de estos receptores. Se aprecian claras diferencias en la expresión de cada receptor cuando se estudian distintos individuos, y hay indicios en los que el repertorio de receptores está regulado durante el desarrollo por factores genéticos, incluyendo presumiblemente la influencia del propio MHC. A estos receptores recientemente se les ha dado la denominación de CD158 seguido de una letra (ente a y k) según el tipo de receptor. Los genes que codifican estos receptores se encuentran localizados en el cromosoma 19 en humanos en una en donde se codifican también los receptores ILTs, Fca y NKp46. 12.4.5ReceptoresNKtipoILT Otro grupo de receptores, que también pertenece a la superfamilia de las Inmunoglobulina, se conocen como ILTs (immunogloobulin like transcripts) o como LIR (leukocyte Ig-like receptor). Alguno de estos receptores, reconocen moléculas HLA-G y la proteína UL18 (LIR1 y LIR2) del citomegalovirus humano y tiene una distribución muy extensa en diferentes tipos de células incluyendo no solo células NK sino también monocitos y ciertas células de tipo polimorfonuclear. A estos receptores recientemente se le ha dado la denominación de CD85 seguido de una letra (a-m) para definir el tipo de receptor. 150 AutoinmunidadHumana 12.4.6ReceptoresNKtipolectina Consideramos a este receptor de especial importancia en los procesos de regulación de la acción de células NK in vivo, debido a la extensa distribución de las moléculas de histocompatibilidad HLA-E que reconoce y sobre todo por el hecho de encontrarse presente en un amplio numero de células NK (60-80 %) y ciertos linfocitos T, mientras que por ejemplo los recetores KIRs lo están en una proporción de células mucho más baja. 12.4.7ReceptoresNKdemoléculasHLAenotrascélulas Los receptores NK específicos de moléculas HLA se encuentran también en otras estirpes celulares no NK, aunque en una menor proporción y densidad. Este es el caso de una población especial de células NK se encuentran en la decidua y que son conocidas como células NK deciduales y cuya función no esta completamente esclarecida. Algunos de estos receptores se encuentran también en linfocitos T, principalmente del tipo citotóxico (Tc) pero también en linfocitos Th, lo que hace pensar que además de su intervención en la regulación de los procesos citotóxicos de las células intervengan también en su regulación funcional, principalmente en la secreción de citocinas. 12.4.8TransducciondeSeñales Tal como se ha indicado con anterioridad, tanto los receptores KIR, ILT como el homodímero de CD94 con distintos miembros de la familia de NKG2, pueden ejercer acciones inhibidoras como activantes. El que ejerza una u otra acción depende de la cola citoplasmatica de dichas moléculas y de las cinasas con las cuales se asocien. 12.4.9Mecanismosdeinhibición Los receptores inhibidores se caracterizan por poseer en sus dominios intracitoplasmáticos los motivos YxxL-26-YxxL, denominados ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs). Estos motivos tienen la propiedad de unirse al dominio SH2 que contiene las tirosin fosfatasas, SHP-1 y SHP-2, y así producir inhibición de la citotoxicidad. En la figura se representan un ejemplo de cada uno de los dos tipos de receptores, inhibidores y activadores. 151 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Es de destacar que esta acción inhibidora ejercida por los receptores inhibidores después de reconocer a su ligando (HLA clase I) en la células tiene una gran importancia fisiológica, pues esto previene la destrucción de las célula normales del huésped. Esto se debe a que, como se sabe, la mayoría de las células del organismo expresan moléculas de histocompatibilidad clase, incluidas las moléculas HLA-E. Precisamente cuando una célula deja de expresar moléculas de histocompatibilidad, entones pude ser destruida por las células NK al no ser frenada su actividad por no actuar los receptores de tipo inhibidosr. Estos mismos fenómenos han sido descritos para linfocitos T, en los que el efecto activador mediado por el TCR-CD3, puede ser bloqueado por acción de un receptor de tipo inhibidor. Los receptores de este grupo son KIR2DL, KIR3DL, ILT-2, NKG2A y NKG2B. 12.5ActivaciónNKyrespuestainmuneinnata Las células NK forman parte de la primera barrera defensiva del individuo junto con macrófagos y polimorfonucleares. Constituyen así parte de la respuesta inmune innata. Ciertas citocinas que potencian el efecto de estas células son producidas precisamente por macrófagos en las primeras fases de la infección. Las células NK actúan destruyendo células (por ejemplo infectadas por virus) y produciendo citocinas y quimiocinas, que intervienen regulando el sistema inmune y el proceso inflamatorio. 152 AutoinmunidadHumana 12.5.1InmunopatologiadelasCélulasNK Las células NK son de especial importancia en las primeras fases de la infección, especialmente frente a virus, de ahí que cuando estas células no actúan correctamente, el individuo se hace más vulnerable a las infecciones virales. Por ejemplo en individuos infectados por HIV-1, se ha podido comprobar que las células NK han disminuido su capacidad citolítica, lo que puede explicar que el virus HIV-1 se desarrolle con más facilidad. De igual manera ha podido ser comprobado que las células NK infiltrantes de tumores poseen menor capacidad citolítica que las células NK normales, probablemente por un aumento de expresión de receptores de tipo inhibidor. Por otra parte una excesiva capacidad citotóxica de las células NK, pueden inducir estados de pérdida de la tolerancia normal y contribuir al desarrollo de enfermedades de tipo Autoinmune. Recientemente se ha visto que las células NK, pueden ser utilizadas en terapia anti-tumoral. Para ello después de su extracción del individuo y cultivo con Il-2, IL-12 o IL15, son posteriormente reinyectadas en el enfermo en forma de células LAK (citokyne activated lymphocytes). En enfermos con SIDA, también se esta tratando de potenciar la respuesta inmune innata y en especial estas células NK, mediante la administración de IL2. 153 UNIDADDIDÁCTICAXIII SISTEMADELCOMPLEMENTO AutoinmunidadHumana 13.1Introducciónsistemadelcomplemento El sistema de complemento esta constituido por moléculas implicadas principalmente en la defensa frente a infecciones y células tumorales. Parte de los factores del complemento potencian la inflamación y la fagocitosis y actúan produciendo la lisis de células y microorganismos. El complemento es especialmente importante frente a gérmenes gram negativos que pueden ser directamente lisados por Anticuerpos y complemento. La mayor parte de los factores del complemento son proteínas plasmáticas y una pequeña proporción de ellos son proteínas de membrana (Tabla 13.1). Muchos de los componentes del complemento (C2, C3, C4, C6, C7, C8, Factor B y Factor I) son polimórficos, es decir que existen diferentes formas alélicas que se expresan con distintas frecuencias en poblaciones o razas. El hepatocito es el principal productor de factores del complemento. No obstante, por ejemplo los componentes de C1 son sintetizados por las células epiteliales del intestino y del sistema genito-urinario y los adipocitos sintetizan factor D. Se ha observado que los macrófagos activados producen algunos factores del complemento; sin embargo, esto solo tiene importancia, en el foco inflamatorio. Las citocinas inflamatorias (IL1, IL6 y TNF) e IFN-gamma incrementan la síntesis de algunos factores del complemento en el hígado. 13.2Activacióndelcomplemento En la activación del complemento se pone en marcha una serie de reacciones consecutivas en cascada, de tal forma que a partir de cada una de ellas se genera un producto activo que además de determinar que la reacción consecutiva prosiga, puede tener diferentes acciones biológicas importantes en la defensa del organismo. Algunos de los factores del complemento son enzimas con carácter proteolítico, de tal forma que durante el proceso de activación, algunas moléculas son rotas en fragmentos a los que para identificarlos se les añade letras minúsculas (Ej. C3a, C3b). Estos fragmentos poseen importanes funciones biológicas y son mediadores de la inflamación. 157 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico La activación del complemento puede iniciarse por dos vías: la vía clásica y la vía alternativa. La vía clásica se activa por la unión antígeno-Anticuerpo, mientras que la vía alternativa se activa por productos bacterianos. En ambas vías el factor C5 se transforma en C5b lo que permite, en uno y otro caso, poder entrar en la vía terminal o lítica que conduce a la lisis celular o bacteriana. Una vez producida la activación del complemento, toda la serie de reacciones subsiguientes se llevan a cabo por un proceso multiplicador, de tal forma que, aunque la activación comienza por un número limitado de moléculas, son muchos los factores con actividad biológica que aparecen en el curso de las reacciones. La acción de las moléculas puede ser local, en el sitio de su producción, pero también puede ejercerse a distancia por dispersión a otras zonas. 13.2.1Viaalternativa Esta vía es más antigua desde el punto de vista evolutivo que la clásica, diferenciándose además de ésta en que la vía alternativa no necesita Anticuerpos para activarse, por lo que es un mecanismo de defensa importante en los estadios iniciales de la infección cuando todavía no se han sintetizado cantidades importantes de Anticuerpos. Funciona de forma continua a un bajo nivel y solo en presencia de determinados factores se amplifica. Por ello, podemos distinguir dos situaciones para la vía alternativa: en estado de reposo y en estado de activación. 13.2.1.1Víaalternativaenestadodereposo En condiciones normales, en el plasma, el factor C3 se escinde continuamente y de forma lenta, en un proceso que se denomina marcapasos de C3, dando lugar a C3b y quedanso así su enlace tioester interno expuesto. El factor D circula en la sangre de forma activada aunque no es perjudicial para el organismo, debido a su baja concentración. Este factor tiene actividad esterasa de tipo serina y uniéndose al complejo C3bB rompe a B en una pequeña fracción, Ba, que se libera y en una de mayor peso molecular, Bb, que se mantiene unida al complejo (C3bBb). Este complejo, que permanece en la fase fluida, tiene actividad convertasa de C3 de la vía alternativa, es decir que puede degradar a C3 en dos fracciones: C3a y C3b, radicando la actividad proteolítica del complejo en la molécula Bb. 13.2.1.2Amplificacióndelavíaalternativa Cuando C3b se une a las membranas de bacterias, hongos y parásitos, los mecanismos de regulación que bloquean la amplificación en el estado de reposo no funcionan. El factor C3b sobre estas membranas capta factor B formando el complejo C3bB sobre el que actúa el factor D liberando Ba y quedando el complejo C3bBb que tiene actividad convertasa de C3, siendo Bb la molécula responsable de la actividad proteolítica. Esa convertasa libera más factor C3b que al formar C3bBb3b retroalimenta el circuito y consigue su amplificación. 13.2.2Viaclásica Se inicia tras la unión Ag‑Ac y siempre que el Anticuerpo que participe en ello sea del tipo IgM o IgG de las clases IgG1, IgG2 o IgG3. Los Anticuerpos solubles o libres no activan el complemento, solo se activa este sistema cuando se forman complejos antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac). En el caso de la IgG, que es una Ig monomérica, se necesitan al menos dos complejos Ag-Ac cercanos para que las fracciones Fc de la IgG 158 AutoinmunidadHumana unan y activen el factor C1. En el caso de la IgM, al ser una molécula pentamérica, solo es necesario un complejo Ag-Ac. La unión de la Ig al antígeno, induce un cambio conformacional en los dominios de la región Fc que permite la unión del factor C1. 13.2.2.1FactorC1 El factor C1 está compuesto por tres subunidades proteicas (q, r y s), que en el momento de la activación del complemento se unen entre sí por enlaces dependientes del Ca++ formando un complejo constituido con una unidad de C1q, 2 de C1r y 2 de C1s (C1qr2s2). La molécula C1q es una proteína con dos partes bien diferenciadas, globular y fibrilar. Parece ser que en las porciones globulares se encuentran los sitios de combinación con el Anticuerpo con los que se une solo cuando éste está unido al Ag. Las porciones fibrilares poseen una estructura química que guarda similitud con el colágeno, con gran cantidad de aminoácidos hidroxilados que unen disacáridos de glucosa y galactosa. 13.2.2.2ActivacióndeC1 La subunidad C1q se fija al Anticuerpo en los sitios de unión que son el dominio CH2 de la IgG y el CH3 y/o CH4 de la IgM). Este fenómeno es el primero que ocurre en la activación mediada por Anticuerpos de la vía clásica del complemento y es el que pone en marcha la cascada de reacciones subsiguientes. El fragmento C1q va a activar a las dos subunidades C1r, que actuará sobre las dos C1s que, entonces, adquieren actividad de esterasa de tipo serina, responsable de iniciar las fases siguientes. Para que se produzca la activación de C1q, éste debe estar unido por su región globular al menos a dos dominios de distinta fracción Fc. Esto implica que los Anticuerpos, para activar al complemento, han de encontrarse con la disposición espacial apropiada que permita a C1q acoplarse a varios de ellos al mismo tiempo (complejos Ag-Ac dispersos sobre una superficie celular pueden no llegar a activar el complemento). C1q, por otra parte, solo se une a Inmunoglobulina cuando éstas, a su vez, se encuentran unidas a sus antígenos y éstos están integrados en una misma superficie (membrana celular). Este concepto es importante para comprender por qué complejos antígenoAnticuerpo solubles no conectados con membranas, pueden convivir en el suero con los factores del complemento sin llegar a activarlos y que, por el contrario, si se activan cuando tales complejos quedan atrapados sobre algún tejido, originando, en este caso, un proceso inflamatorio localizado. La activación de C1q provoca que una molécula de C1r del complejo C1qr2s2 pierda por autocatálisis un trozo de bajo peso molecular, quedando activada. Esta molécula, a su vez, activa a la otra molécula de C1r. Las dos moléculas de C1r atacan a las dos moléculas de C1s liberando sendos trozos de bajo peso molecular y dejando expuestos sus dominios catalíticos. La MBP (mannose-binding protein) es una molécula del grupo de las colectinas (proteínas con colas de colágeno y dominios globulares de tipo lectina). Esta proteína reconoce carbohidratos en distintos gérmenes, lo que le permite unirse a ellos y tiene la capacidad de sustituir a C1q en la activación de C1r y C1s, pudiendo iniciar de esta forma la vía clásica. 159 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 13.2.2.3ActivacióndeC4yC2 C1s del complejo C1q2r2s va a actuar sobre la cadena a de C4 produciendo su escisión en dos moléculas, una pequeña, C4a, que difunde a la fase fluida y otra mayor, C4b, que se une por enlace covalente de tipo éster o amida (equivalente al del C3b) a la superficie celular. Esta fracción C4b unida a la membrana, en presencia de iones Mg++, forma un complejo con la fracción C2. C1s también actúa sobre C2, provocando la escisión de esta molécula en dos fragmentos, uno menor C2b y otro mayor C2a. Este último se une al C4b para formar el complejo C4b2a (convertasa C3 de la vía clásica), que tiene actividad esterásica. 13.2.2.4ConvertasadeC5delavíaclásica El complejo C4b2a, cuyo centro activo se encuentra en el componente C2a, actúa sobre la cadena a del factor C3 que se transforma por proteolisis en dos fragmentos activos: la anafilotoxina C3a, que pasa al medio líquido, y el fragmento C3b que se une a la membrana celular mediante un enlace de tipo éster o amida. Al complejo formado por C4b2a3b se le denomina convertasa de C5 de la vía clásica ya que tiene capacidad de actuar sobre este factor, siendo éste el primer paso de la denominada vía lítica. El factor C3b unido a la membrana celular también puede ser captado por los fagocitos, que al presentar receptores de membrana para C3b, se facilita de esta forma el proceso de la fagocitosis (opsonización) La anafilotoxina C3a, por otra parte, potencia la inflamación al inducir la desgranulación de los basófilos y mastocitos y liberar, por tanto, mediadores de la inflamación. El incremento de la permeabilidad capilar facilita el acceso al foco de nuevos factores del complemento y de Inmunoglobulina desde la sangre, así como la llegada de fagocitos que son movilizados por la actividad quimiotáxica del propio C3a y otros factores quimiotáxicos del foco inflamatorio. Receptores del complemento, sus ligandos y funciones Receptor Nombre CR1 Ligandos CD CD35 C3b eritrocitos iC3b linfocitos T y B Aclaramiento de inmunocomplejos C4b SFM Fagocitosis C5b67 neutrófilos Quimiotaxix linfocitos B Citolisis iC3b C3d C3dg C5b-9 CR3 160 CD11b/ CD18 Funciones Lo expresan C3b CD21 Células iC3b c. dentríticas c. epiteliales Atrapamiento de complejos en centros germinales SFM Fagocitosis neutrófilos Anclaje al endotelio y diapedesis foliculares NK AutoinmunidadHumana SFM CR4 CD11c/ CD18 iC3b neutrófilos plaquetas Como CR3 c. dendríticas C3aR -- C3a mastocitos Degranulación basófilos Aumento de la permeabilidad vascular c. endoteliales c. músculo liso Contracción músculo liso mastocitos C5aR -- C5a basófilos Quimiotáxis cél.endoteliales Opsonización neutrófilos C1qR -- C1q leucocitos plaquetas Aclaramiento de inmunocomplejos SFM, células del sistema fagocítico mononuclear 13.3Receptoresparafactoresdelcomplemento Muchas de las funciones del complemento se llevan a cabo tras la unión de fragmentos de algunos factores del complemento a receptores específicos presentes en la superficie de varios tipos de células. Los mejor conocidos son los que tienen como ligando a fragmentos de C3. 13.3.1CR1(Receptordecomplementotipo1,CD35) Sus ligandos son los fragmentos C3beta, iC3beta y C4beta. Se encuentra sobre todo en las células del sistema fagocítico mononuclear, en los neutrófilos, en los linfocitos T y B y en los eritrocitos. En las células fagocitarias facilita la fagocitosis de partículas opsonizadas por sus ligandos. En los eritrocitos facilita su unión a inmunocomplejos opsonizados por C3beta y C4beta. Estos inmunocomplejos son retirados de la superficie de los hematíes en el hígado y bazo por los fagocitos. De esta forma los hematíes quedan con sus receptores libres para continuar el aclaramiento de inmunocomplejos de la circulación. 13.3.2CR2(Receptordecomplementotipo2,CD21) Sus ligandos son C3b, la forma inactiva de éste, iC3b y sus fragmentos de degradación C3delta y C3deltagamma. Este receptor se encuentra en los linfocitos B, en las células dendríticas foliculares y en algunas células epiteliales. El CR2 se encuentra en las células B formando un complejo trimolecular junto con otras dos proteínas, CD19 y CD81. Este complejo es el llamado correceptor del linfocito B y envía señales al interior de la célula B que facilitan su respuesta una vez unida al antígeno por su receptor (Inmunoglobulina + moléculas Ig-alfa e Ig-beta). En las células dendríticas foliculares CR2 sirve para atrapar en los centros germinales complejos Ag-Ac opsonizados por iC3beta o C3deltagamma. El CR2 es el receptor usado por el virus de 161 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Epstein-Barr para invadir a las células B. Este virus es el causante de la enfermedad mononucleosis infecciosa y está relacionado con tumores como el linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo. 13.3.3CR3(Receptordecomplementotipo3,MAC‐1,CD11bCD18) Se encuentra en fagocitos mononucleares, neutrófilos, células cebadas y NK. La cadena beta de CR3 (CD18) se encuentra en otras dos moléculas (LFA-1 y p150, 95). CR3, LFA-1 y p150, 95 pertenecen a la familia de las integrinas. El ligando de CR3 es iC3b por lo que participa en la fagocitosis de partículas opsonizadas por este factor. Pero en los fagocitos y neutrófilos se une también a ICAM-1. Esta molécula se encuentra en los endotelios por lo que facilita el anclaje de fagocitos a las células endoteliales para posteriormente abandonar los vasos por diapédesis. 13.3.4CR4(CD11cCD18,p150,95) Su ligando es también iC3b y probablemente la función de CR4 es similar a la de CR3. CR4 es abundantemente expresado por las células dendríticas por lo que se usa como marcador para identificarlas. 13.4Funcionesdelcomplemento Las funciones del complemento son muy diversas, de ahí la gran potencialidad defensiva del mismo. Las acciones anafilotóxicas, quimiotáxicas y opsonizantes del complemento lo convierten en un factor fundamental en la potenciación de la inflamación, fenómeno básico en la defensa frente a la infección 162 - Acción citolítica - Acción anafilotóxica - Acción quimiotáxica - Acción facilitadora de la fagocitosis (opsonización) - Aclaramiento de inmunocomplejos - Acción reguladora de la respuesta inmune - Mecanismos de Regulacion del Complemento - Inhibición de C1 - Inhibición de C4 - Inhibición de C3 - Inhibición del MAC - Protección de lo propio, lisis de lo extraño UNIDADTEMÁTICAXIV CITOTOXICIDAD AutoinmunidadHumana 14.1INTRODUCCIÓNCITOTOXICIDAD La citotoxicidad celular constituye uno de los mecanismos efectores de determinadas poblaciones celulares especializadas del sistema inmunitario, consistente en la capacidad para interaccionar con otras células y destruirlas. Cualquier tipo celular, normal o patológico, puede ser potencialmente susceptible a las células citotóxicas, y se emplea gráficamente el término "células diana" (target cells) para su designación. Este mecanismo de respuesta interviene en la defensa frente a infecciones víricas y células neoplásicas, así como en la destrucción de células alogénicas en transplante de órganos. Se consideran como prototipos de las células especializadas en dicha función a una subpoblación de linfocitos T (Tc, CTL o cytotoxic T lymphocyte) y a las células natural killer (NK). Otras células como los macrófagos ejercen también una importante función citolítica y serán tratados al final del capitulo. Las diferentes fases del proceso lítico están reguladas por diversos tipos de receptores con acciones a veces contrapuestas, y el efecto final es la consecuencia del equilibrio que en cada momento se alcance. El proceso lítico es una acción que se desarrolla en fases sucesivas que se inicia con el reconocimiento de las células implicadas en el proceso y termina con la lisis de la célula diana. Las principales etapas en las que se desarrolla el proceso de citolisis son las siguientes: Fase de reconocimiento y adhesión intercelular. Las células efectoras interaccionan a través de diferentes receptores de superficie con estructuras en la membrana de la diana. Esta fase es dependiente de Mg2+, no requiere Ca2+ y puede producirse por debajo de la temperatura fisiológica. 165 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Fase de activación de la célula efectora. La interacción de los receptores de superficie con sus ligandos determina la transducción de señales a la célula que conllevan la generación de segundos mensajeros, la aparición de cambios estructurales y la exocitosis del contenido de los gránulos de secreción al espacio intercelular, tras la fusión de los mismos con la membrana plasmática. Fase lítica. Esta etapa viene determinada por la acción de diferentes componentes de la célula efectora sobre la diana, la cual experimenta una serie de complejas alteraciones que inician su desestructuración. Tanto esta fase como la anterior son dependientes de Ca2+. Fase de disociación del contacto intercelular. Permitiendo que la célula efectora inicie potencialmente un nuevo ciclo lítico, a la par que prosigue la destrucción de la célula diana. Existen muchas formas de citotoxicidad mediada por células según la célula que intervine, principalmente participan célula NK o CTL. 14.2Fasedeadhesiónintercelular De forma esquemática, se admite que la fase de contacto y adhesión intercelular implica la participación coordinada de dos tipos de receptores, el primero determina la especificidad/selectividad de la interacción, mientras que el segundo grupo desempeña un papel complementario, no menos específico. 14.2.1ReconocimientoporlinfocitosTc La estructura implicada en el reconocimiento específico por las células Tc es el receptor para antígeno (TCR). La mayoría de los linfocitos Tc se encuentran in vivo quiescentes, por lo que algunos autores los denominan en la literatura pre-CTL, y únicamente despliegan su capacidad funcional tras la activación, en la que tiene un papel central la interleucina 2 (IL2), citocina que también estimula la división mitótica de los CTL. Así pues, el pleno desarrollo de la respuesta citotóxica específica requiere la participación de linfocitos Th. 166 AutoinmunidadHumana 14.2.2ReconocimientoporcélulasNK Las células NK utilizan diversos receptores para reconocer a las células blanco, tal y como hemos visto en el capítulo dedicado a las células NK. Entre estos receptores destacan el CD16, ciertos receptores de activación y otro grupo recientemente descrito de receptores que tienen como ligando moléculas de histocompatibilidad clase I. 14.3Fasedeactivacióndecélulasefectoras Los estudios ultra estructurales de las células citotóxicas, tras la interacción con la célula diana, demuestran una serie de cambios que se relacionan directamente con la actividad lítica, muchos de ellos ya han sido estudiados en capítulos anteriores. Sin embargo hemos de considerar de manera específica que la preparación de las células efectoras para la lisis de una célula diana, implica al menos tres aspectos de especial importancia. Estos son: - Reorganización del citoesqueleto con localización del centro organizador de microtúbulos (MTOC) y de los centriolos próximos a la zona de contacto intercelular - Polarización del aparato de Golgi y de los gránulos de secreción en la misma zona. - Fusión de los gránulos con la membrana plasmática y la subsiguiente exocitosis de su contenido al espacio intercelular. 14.4Faselítica Los linfocitos T citotóxicos y las células NK destruyen las células dianas a través de la liberación de los factores citotóxicos tales como perforina y granzymes mediante el proceso de exocitosis de los gránulos donde se encuentran almacenados. La consecuencia es la muerte celular de la célula blanca por necrosis. 14.4.1Citoxicidadpornecrosis Como consecuencia de la interacción con las células citotóxicas, se aprecian una serie de cambios en la célula diana que conducen a su destrucción. Por una parte, se objetiva una permeabilización de la membrana plasmática, que altera el intercambio iónico y permite la salida de macromoléculas al exterior, perturbando el equilibrio osmótico/oncótico. El fenómeno puede apreciarse in vitro por la liberación del isótopo 51Cr, con el que previamente se marcan las células diana en el laboratorio, constituyendo el fundamento técnico del ensayo convencional para estudiar estos procesos. Múltiples observaciones señalan que el proceso citolítico resulta de la acción lesiva sobre la membrana de la célula diana, ejercida por elementos moleculares presentes en los gránulos de secreción, cuando son liberados al espacio intercelular. De hecho, los gránulos aislados presentan cierta capacidad lítica frente a eritrocitos, indicando que al menos algunos de sus componentes están implicados como mediadores moleculares en el proceso. Estos gránulos azurófilos, característicos de las células citotóxicas, son estructuras con un núcleo electrodenso rodeado de cuerpos vesiculares y poseen pH ácido. Dado que comparten propiedades con los lisosomas y los gránulos de secreción, se ha propuesto el término descriptivo granulosoma para designarlos. El contenido de estos 167 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico gránulos ha sido parcialmente definido, y entre ellos destacan ciertos enzimas y las moléculas de perforinas. 14.4.2Enzimasgranulares Se ha demostrado que dentro de los gránulos se encuentran ciertos componentes como son varias serina esterasas, denominadas descriptivamente granzymes o fragmentinas, que se expresan específicamente en linfocitos. Otras enzimas detectadas en los gránulos son: carboxipeptidasas, catepsina D, aril-sulfatasa y beta-glucuronidasa. También se han identificado proteoglicanos, y dos proteinas denominadas TIA-1 o nucleolisina y TIAR (TIA-related), que unen poliadenilato. 14.4.3Perforinas Además en estos gránulos se encuentran la proteína, denominada perforina o proteína formadora de poros (PFP). El resultado es la exocitosis del contenido de los gránulos en la membrana plasmática de la célula diana. Al ponerse en contacto la perforina con el calcio intercelular polimeriza. Además de estos componentes en este tipo de muerte celular tiene especial importancia el factor TNF que puede ser reconocido por ciertos receptores y actuar desencadenando la citolisis de las células blanco. 14.4.4Citoxicidadporapoptosis Se considera que la apoptosis es un proceso básico de regulación fisiológica del desarrollo en diferentes sistemas celulares y puede desencadenarse por la acción de mediadores fisiológicos o farmacológicos, así como por la carencia de factores de crecimiento. La interacción del ligando fisiológico (Fas-L) con la molécula Fas pone en marcha la cascada de acontecimientos de lisis celular. El proceso de apoptosis consta de tres fases: Fase de iniciación, que se inicia con una inducción dependiente del estímulo de muerte y seguida por la fase de transducción de señales correspondiente. El estímulo inductor es muy variado incluyendo agentes químicos y físicos, activadores fisiológicos, asociados a terapias, y toxinas, también puede iniciarse por unión de Fas a su ligando. Fase efectora, en la que la célula está programada para morir, activándose las enzimas proteolíticas encargadas del proceso, denominadas caspasas. Fase degradativa, en la que las células muertas son reconocidas y fagocitadas por los macrófagos. La muerte celular se produce después de grandes alteraciones nucleares, de la membrana plasmática y de las mitocondrias. En el núcleo se degrada el ADN y se hace visible condensaciones de cromatina nuclear formándose aglomeraciones que se desplazan hacia la superficie de la membrana nuclear. 14.5Lisismediadapormacrófagos Del mismo modo que las células NK y linfocitos T CD8+, los macrófagos poseen capacidad citolítica de otras células o incluso detritos celulares o células en proceso de muerte. Especialmente los macrófagos poseen capacidad de destruir microorganismos una vez fagocitados o bien de manera extracelular. 168 AutoinmunidadHumana Para desarrollar este efecto los macrófagos poseen receptores especializados en el reconocimiento del material a fagocitar y una maquinaria especialmente desarrollada para la lisis ya sea intracelular como extracelular 14.5.1Receptoresdemacrófagos Los macrófagos poseen receptores de diferente tipo que hacen posible el fenómeno de reconocimiento, entre ellos destacan: - Receptores Fc (FcRI y FcRIII de alta afinidad) y así pueden ser dirigidos contra células recubiertas de Anticuerpos, participando en las reacciones líticas por ADCC. - Receptores depuradores o “scavenger”. - Receptores tipo TOLL - Receptores inhibidores (ILT y otros) 14.5.2Opsonización La fagocitosis es el proceso de ingestión e internalización mediado por células especializadas de material que incluye microrganismos vivos, células alteradas y trozos de tejidos. La fagocitosis se incrementa si el material está recubierto por ciertas proteínas plasmáticas llamadas opsoninas, llamándose en este caso a este proceso de opsonización. Las opsoninas más importantes son: Anticuerpos específicos de clase IgG y Fragmento activado del sistema del complemento C3 (C3b) y su forma inactiva (iC3b) y la fibronectina plasmática que actúa como co-opsonina potenciando el efecto del complemento Las opsoninas son ligandos para receptores específicos de la membrana leucocitaria: la IgG se une a los receptores Fc, y el C3b, el iC3b y la fibronectina a sus respectivos receptores. Una vez unidas a la membrana, las partículas son ingeridas mediante pseudópodos e incluidas en una vesícula ligada a la membrana llamada vacuola fagocitaria o fagosoma. Posteriormente los fagosomas y lisosomas se unen dando lugar a los fagolisosomas y así la partícula ingerida se expone al efecto degradativo de los enzimas lisosomales, cuya actividad es óptima a un pH de alrededor de 5.0 14.5.3Mediadorescitolíticosenmacrófagos Los principales mecanismos por los que los macrófagos desarrollan finalmente su capacidad citolítica son: 1. Liberación de enzimas lisosómicas 2. Metabolitos reactivos de oxígeno 3. La formación de óxido nítrico (NO) 4. Producción de TNF–alfa 5. Producción de péptidos anti-microbianos 6. Producción de lactoferrina 169 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Visión general donde se observa que los macrófagos forman parte de la respuesta inmune innata y la respuesta adaptativa en sus dos vías, humoral y celular. 170 UNIDADTEMÁTICAXV TOLERANCIAINMUNOLÓGICA AutoinmunidadHumana 15.1Introducción Se define la tolerancia como la ausencia específica de respuesta inmune frente a un antígeno, ya sea propio o extraño, inducida por el contacto previo con dicho antígeno. Se trata de un estado activo (no es una simple ausencia de respuesta), dotado de especificidad y de memoria. Los antígenos que inducen este estado de tolerancia se denominan tolerógenos, para distinguirlos de los que provocan respuesta inmune (inmunógenos). La tolerancia se puede desarrollar de un modo natural, como cuando un animal en desarrollo se vuelve incapaz de responder a sus propias moléculas (autototolerancia). Cuando este sistema falla, se producen patologías por Autoinmunidad. La tolerancia inducida experimentalmente es un estado de ausencia de respuesta a un antígeno que normalmente sería inmunogénico. Para ello, como veremos, el antígeno ha de ser administrado bajo ciertas condiciones. Propiedades de la inducción de la tolerancia - La tolerancia es un estado adquirido ("aprendido"), no innato - Que se induce más fácilmente en linfocitos inmaduros - Que se induce cuando no hay señal coestimulatoria - y que requiere que el antígeno persista para que dicho estado permanezca A continuación desarrollaremos cada uno de estas propiedades de la inducción de la tolerancia, aludiendo a experimentos históricos que fueron revelando estos aspectos. - La tolerancia es un estado aprendido o adquirido - La tolerancia se induce mejor en linfocitos inmaduros - La distinción entre inmunidad y tolerancia depende de que el linfocito reciba o no una señal coestimulatoria - El mantenimiento de la tolerancia depende de la persistencia del antígeno La persistencia del antígeno juega un papel esencial en el mantenimiento de la tolerancia: cuando la concentración del antígeno cae por debajo de cierto umbral, se recupera la capacidad de respuesta. Ello se debe a que se originan nuevos linfocitos a partir de sus precursores de los órganos linfoides primarios. Los principales factores que afectan a la tolerancia experimentalmente inducida son el estado del antígeno, su dosis y vía de entrada, y el estado de los linfocitos. 1. Vía de entrada - Las rutas de entrada que mejor inducen tolerancia son las de administración oral y la intravenosa. - La tolerancia oral puede que haya evolucionado para evitar reacciones contra proteínas ingeridas necesarias para la nutrición. La administración intravenosa tiene más probabilidades de inducir tolerancia que la subcutánea. 173 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 2. Estado del antígeno Los antígenos solubles inducen mejor la tolerancia que los particulados. Parece que ello se debe a que cuando son engullidos por las células presentadoras, éstas no se activan, por lo que no expresan moléculas coestimulatorias como la B7. Cuando estas APC presentan el antígeno a los linfocitos T, éstos no reciben esa segunda señal, lo que induce el estado de anergia clonal. Este hecho se está intentado aprovechar a la hora de diseñar vacunas contra alergias o enfermedades Autoinmunes, administrando formas solubles del alergeno o autoantígeno. 3. Dosis del antígeno Dosis muy altas o muy bajas del antígeno pueden inducir estado de tolerancia, existiendo lo que se denomina como zona de tolerancia a dosis bajas y zona de tolerancia a dosis altas. Por lo tanto, a la hora de la vacunación es esencial ajustar correctamente las dosis para lograr el efecto deseado. La existencia de la zona de tolerancia a dosis bajas se puede aprovechar clínicamente para la desensibilización alérgica: se inyecta al individuo dosis repetidas a baja concentración del alergeno para el que está sensibilizado; con ello se puede inducir tolerancia a las dosis normales de dicho alergeno, evitando los síntomas de esa hipersensibilidad inmediata. 4. Susceptibilidad de las células T y B Parece ser que existe una susceptibilidad intrínseca diferente para la tolerancia en los linfocitos T y B. Las células T se vuelven tolerantes pronto y se mantienen así durante más tiempo que las células B. Sin embargo, como la mayoría de las células B requieren in vivo la ayuda de las células T, en última instancia la respuesta humoral y su correspondiente tolerancia tendrían una cinética determinada por el estado de capacidad de respuesta de los linfocitos T. Con las técnicas de Ingeniería Genética es posible "diseñar" ratones de laboratorio que portan genes previamente clonados bajo el control de promotores adecuados (ratones transgénicos). Esto permite estudiar de modo directo la autotolerancia, ya que el gen introducido se expresa en fases tempranas del desarrollo, y por lo tanto podemos comprobar el efecto de que el sistema inmune entre en contacto temprano con determinadas moléculas. La proteína codificada por el gen introducido es tratada por el sistema inmune como un autoantígeno, y sus efectos se pueden estudiar sin los métodos traumáticos y llenos de artefactos que existían antes de la llegada de estas técnicas transgénicas. Desde el punto de vista de cómo se logra el estado funcional de tolerancia, se pueden distinguir varios tipos de mecanismos: 174 - Delección clonal: eliminación física de las células (auto)-reactivas en algún momento de su proceso de maduración. - Aborto clonal: bloqueo de la maduración/diferenciación de la célula inmadura. AutoinmunidadHumana - Anergia clonal: inactivación funcional del linfocito maduro. - Ignorancia clonal: clones de linfocito T o B autorreactivos potencialmente funcionales, pero que no llegan a activarse porque el auto-antígeno está en muy pequeña cantidad (ejemplo: idiotipos de Ig o de TCR) o está secuestrado en órganos inmunológicamente privilegiados. Desde el punto de vista de dónde se produce la inducción de tolerancia, se puede distinguir entre tolerancia central y tolerancia periférica. Tolerancia central: la que ocurre en los órganos linfoides primarios con los linfocitos inmaduros. Este proceso debe de estar ocurriendo continuamente, ya que también lo está la producción de linfocitos T y B. Pero esta tolerancia central no debe de ser la única, ya que es difícil imaginar que todos los posibles auto-antígenos lleguen al timo y a la médula ósea durante la maduración de los linfocitos T y B. Dada la gigantesca variedad de receptores que puede lograrse por los mecanismos aleatorios genéticos, cabe pensar que algunos linfocitos T y B inmunocompetentes contengan receptores para antígenos propios que no fueron presentados durante su educación (maduración). Se habla entonces de que deben de existir también mecanismos de inducción de tolerancia periférica. 15.2ToleranciacentralenlinfocitosT Parece ser que los autoantígenos secretados por diversos órganos y tejidos llegan al timo, donde son internalizados y presentados por macrófagos y células dendríticas a los timocitos dobles positivos (CD4+ CD8+); es aquí cuando se produce la selección negativa, en la que los clones autorreactivos son eliminados (delección clonal). El estado de diferenciación del timocito (linfocito inmaduro) es determinante para esta delección. Esto puede deberse a que en este estado inmaduro los auto-antígenos desencadenan vías de transducción de señal diferentes a las de los linfocitos T maduros. 175 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 15.3Toleranciaperiférica(postímica)delinfocitosT Algunas células T potencialmente autoagresivas logran escapar de la selección negativa del timo, por lo que el sistema inmune posee mecanismos para evitar su acción. En experimentos con ratones transgénicos se ha visto que existe tolerancia periférica por varios mecanismos: Delección periférica de linfocitos Tc autorreactivos en órganos inmunoprivilegiados (globo ocular, ovario, testículos). Las células de estos tejidos expresan CD95L, que al unirse al CD95 del Tc le provocan la apoptosis. Anergia clonal, por ausencia de la señal coestimulatoria (cuando la APC carece de moléculas B7). 15.4ToleranciacentraldelinfocitosB Existe evidencia de que existe tolerancia central por delección clonal de linfocitos B inmaduros (mIgM+) durante su maduración en la médula ósea. Las células B inmaduras, una vez que contactan con el autoantígeno en la superficie de células propias, detienen su desarrollo y mueren por apoptosis al cabo de 1-3 días, normalmente antes de salir de la médula Por otro lado, los linfocitos B inmaduros que unen antígeno propio soluble quedan anérgicos, al bajar el nivel de mIgM y aumentar el de mIgD. 15.5ToleranciaperiféricadelinfocitosB Son varios los mecanismos que se han estudiado: Delección clonal de linfocitos B maduros en periferia (por apoptosis) al reconocer moléculas de membrana propias. Anergia clonal cuando los receptores del linfocito B tienen un alto grado de ocupación: cuando hay altas concentraciones de un antígeno soluble monomérico, se inducen en las células B un cambio importante: baja notablemente el número de IgM de membrana, lo que condiciona que sean incapaces de interaccionar adecuadamente con los linfocitos TH, induciéndose un estado de anergia. Además, su vida media desciende a sólo 3-4 días, en comparación con las 4-5 semanas que dura una célula B periférica normal. 176 UNIDADDIDÁCTICAXVI FILOGENIASISTEMAINMUNE AutoinmunidadHumana 16.1Introducción Todos los organismos, ya sean uni o pluricelulares, y más o menos complejos, tienen mecanismos para defenderse de posibles ataques de patógenos y de invasiones externas. Estos mecanismos de defensa presentan diferencias significativas a lo largo de la escala filogenética, tendiendo hacia una mayor complejidad y potencia de las respuestas de defensa y hacia un reconocimiento específico de los patógenos, pero manteniendo los sistemas de defensa presentes en especies menos evolucionadas. El primer mecanismo de defensa, y el más efectivo, es el impedir la entrada de los patógenos gracias al desarrollo de barreras físicas y/o químicas. Este tipo de barreras se encuentran en todos los seres vivos, con características peculiares dependiendo de qué organismo se trate. Así encontramos las cubiertas de las plantas, la pared en las bacterias, el exoesqueleto en los insectos, la piel en los mamíferos, etc. Junto a estas barreras, los animales, tanto invertebrados como vertebrados, presentan un segundo nivel de complejidad, presentando ya un sistema inmunitario encargado de la defensa. En el caso de los invertebrados, éstos poseen únicamente un Sistema Inmune Innato, donde participan componentes celulares (células con capacidad fagocítica), y componentes solubles o humorales. Únicamente los animales vertebrados tienen un tercer nivel de complejidad, el denominado Sistema Inmune Adaptativo o Adquirido, gracias a que poseen linfocitos T y B y Anticuerpos. Entre sus características fundamentales, que les diferencian de los animales invertebrados, están la capacidad para reconocer de forma específica un antígeno (debido a la gran diversidad de receptores distintos en la superficie de los linfocitos T y B); la posibilidad de recordar exposiciones previas a un antígeno (memoria); y la de responder de forma más eficaz después de ponerse de nuevo en contacto con ese mismo antígeno (maduración de la respuesta inmune). 179 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 16.2Mecanismosdedefensa 16.2.1Barreras Los animales vertebrados presentan barreras físico-químicas, que al igual que el resto de seres vivos, intentan impedir la entrada de patógenos. La variedad de vertebrados que existe condiciona el tipo de barrera que se desarrolla, dependiendo de si es un pez, un anfibio, un ave, o un mamífero. Entre las barreras, la más importante es la piel que recubre la mayor parte del cuerpo del animal, revestida con escamas, con plumas, con pelos, etc... Alrededor de los orificios naturales, también se van a constituir elementos de defensa, como son la formación de moco, el reflejo de la tos y estornudo, cilios del epitelio respiratorio, compuestos enzimáticos como la lisozima (presente en saliva y en lágrimas). Otros elementos que participan en la defensa son sustancias antimicrobianas como la espermina del semen, el establecimiento de flora microbiana intestinal, el pH ácido del estómago, etc... 16.2.2Sistemainmuneinnato Celular inespecífico. Los animales vertebrados mantienen el sistema inmune presente en invertebrados, con células fagocíticas inespecíficas, pero incrementan la diversidad de este tipo celular, y están mejor caracterizadas. De esta manera se encuentran no sólo macrófagos, sino también neutrófilos, que van a jugar un papel fundamental también como células fagocíticas, junto a eosinófilos, basófilos y mastocitos, Junto a los macrófagos, como células fagocíticas y células presentadoras de antígeno, los vertebrados poseen otras células accesorias como son las células dendríticas interdigitantes y las células dendríticas foliculares. Dentro de la citotoxicidad natural, los animales vertebrados poseen células “natural killer” (NK). 16.2.3Humoralinespecífico Con respecto al complemento, a partir de los ciclóstomos (que sólo poseen C3 y sólo pueden activar la cascada por la vía alternativa), se han caracterizado otros factores que participan en la activación de la cascada clásica en tiburones, peces, anfibios, aves y mamíferos. Los vertebrados también poseen otras sustancias con capacidad opsonizante como las proteínas de fase aguda (proteína C reactiva), similares a las descritas en invertebrados, lectinas solubles, y gran cantidad de factores con actividad antimicrobiana. Dentro del Sistema Inmune Innato de los vertebrados, se han caracterizado distintas familias proteicas que intervienen en el reconocimiento de patógenos, interactuando con sustancias presentes en una gran variedad de patógenos, lo que se ha denominado como “Reconocimiento de patrones”. También se encuentran gran cantidad de citocinas como las interleucinas y las quimiocinas, producidas en su mayoría por linfocitos y macrófagos, que participan en las respuestas inmunitarias (induciendo diferenciación celular, proliferación, inhibición, actividad quimiotáctica, etc.), y también sobre otros sistemas (hematológicos, nervioso, endocrino) 16.2.4Sistemainmuneespecíficooadquirido Los vertebrados son los únicos animales que poseen el sistema inmune adquirido o específico. 180 AutoinmunidadHumana 16.2.5Componentecelularespecífico Los animales vertebrados presentan elementos celulares más evolucionados (linfocitos T y B), con receptores específicos en su membrana, que van a permitir el reconocimiento de una gran diversidad de estructuras antigénicas, con capacidad para recordar exposiciones previas (memoria) y de responder de forma más efectiva en segundas o posteriores exposiciones al mismo antígeno (maduración de la respuesta). Evolución de órganos linfoides. La existencia de linfocitos T y B en los animales vertebrados, está asociado con la presencia de órganos linfoides dedicados a la producción o diferenciación de estas células. Sin embargo, aunque se encuentran tejidos y órganos linfoides en todos los vertebrados, éstos sufren una gran evolución desde los peces hasta los mamíferos, tendiendo hacia un mayor grado de complejidad. Mientras que se han encontrado agregados linfoides asociados al intestino en todos los animales vertebrados, el timo se encuentra únicamente a partir de los tiburones, y se mantiene ya a lo largo de toda la escala filogenética como órgano linfoide primario de linfocitos T. Lo mismo ocurre con el bazo, que se encuentra en todos los animales vertebrados, excepto en los agnados. Con respecto a las células progenitoras, se ha visto que se necesita una correcta estructura ósea para el desarrollo de la médula ósea y ésta no apareció hasta que los vertebrados se adaptaron al medio terrestre. Así los peces no tienen médula ósea, mientras que los anfibios tienen ya restos de tejido linfoide en sus huesos, siendo la médula ya totalmente funcional en anfibios (anuros), reptiles, aves y mamíferos. El riñón, en la porción del pronefros o riñón anterior, se comporta como órgano linfoide primario en peces y algunos anfibios, supliendo la carencia de médula ósea y nódulos linfoides en estos animales. La médula ósea también ejerce de órgano linfoide primario de linfocitos B en gran parte de los animales vertebrados. Como excepciones se encuentran las aves, cuyo órgano linfoide primario para células B es la Bolsa de Fabricio (área especializada de tejido linfoide intestinal), y en ovejas y cerdos, donde además de la médula ósea, se han implicado a las placas de Peyer del intestino. Como estructuras linfoides más organizadas aparecen más tarde en la escala filogenética los ganglios linfáticos, constituidos por folículos primarios de células B, rodeadas de linfocitos T. Aparecen ya bien definidos a partir de los anfibios anuros, y se encuentran en el resto de animales vertebrados, aunque con ciertas diferencias entre ellos. Mientras que los anfibios presentan linfocitos alrededor de capilares sinusoides, los reptiles tienen primitivos nódulos linfoides alrededor de grandes vasos como aorta y cava, y las aves presentan unas formaciones linfoides equivalentes a los nódulos pero que carecen de cápsula. Únicamente en aves y mamíferos, animales homeotermos de sangre caliente, surgen los centros germinales o folículos linfoides secundarios en los órganos linfoides. Como bacterias y virus se multiplican bien a esas temperaturas, es probable que haya sido necesario el desarrollo de una estructura que permita la eliminación más efectiva y rápida de estos patógenos en estos animales. En estos centros germinales se produce una correcta cooperación entre linfocitos T y B, la generación de linfocitos de memoria, y la incorporación de mutaciones en los genes de las Inmunoglobulina por un mecanismo denominado Hipermutación Somática, que incrementa la afinidad del Anticuerpo por el antígeno. 181 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 16.2.6Componentehumoralespecífico:Anticuerpos Los animales vertebrados son los únicos animales capaces de generar Anticuerpos específicos frente a una gran diversidad de patógenos. Con respecto al número y tipo de Inmunoglobulina que se encuentran en ellos, se observa una evolución hacia una mayor variedad y complejidad de los Anticuerpos en la escala filogenética, siendo los mamíferos los que mayor variedad de clases de Inmunoglobulina poseen. 16.2.7GenesdeIGS,delTCRydelCMH La manera en que las moléculas de Inmunoglobulina y el receptor de la célula T están codificadas por segmentos génicos, así como el tipo y estructura de estos segmentos, se encuentran conservados en los vertebrados en toda la escala filogenética. Los vertebrados (excepto los agnatos) presentan segmentos génicos V, (D), J y C, que deben de reagruparse para dar lugar finalmente al gen de la cadena pesada (Figura 16.8) o ligera de las Inmunoglobulina, o a cada una de las cadenas del receptor del linfocito T. Los mamíferos son los animales vertebrados que presentan una mayor variedad de clases de Anticuerpos distintos y los que pueden realizar mejor una adecuada maduración de las respuestas inmunitarias. Moléculas de Histocompatibilidad. Los genes que codifican las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) se han encontrado en todos los vertebrados. Gen ancestral común. El grado de conservación de la estructura en segmentos génicos V, D, J, C, en los animales vertebrados a lo largo de la escala filogenética, así como la existencia de diversas proteínas que comparten homología estructural con el dominio plegado de las inmunogloblinas (forman parte de la “superfamilia de las Inmunoglobulina”), sugieren la existencia de un gen ancestral que pudiera dar orígen a los diversos miembros de la superfamilia. En cuanto al origen de los genes de los Anticuerpos y del receptor del linfocito T, podrían haberse originado a partir de la segmentación de un exón que codificaba un único dominio V, en elementos separados V y J para dar lugar a una proteína tipo cadena ligera. Esto pudo ser seguido por una segunda segmentación que originase las regiones D, y posteriores diversificaciones y participación de trasposones o mecanismos de recombinación intragénica, permitiría originar la variedad de segmentos génicos de las Igs y de los receptores de los linfocitos T. 182 UNIDADDIDÁCTICAXVII MÉTODOSBASADOSENUNIÓNANTÍGENO‐ANTICUERPO AutoinmunidadHumana 17.1Introducción Gran parte de los progresos alcanzados por la biología moderna se deben al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones inmunológicas ha representado un importante avance en el análisis de sustancias de interés en biología animal y vegetal difíciles de medir empleando los métodos bioquímicos habituales. Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas) hace que estos métodos se empleen ampliamente. Existen diversos métodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unión Ag-Ac. Así tenemos: 1. Técnicas de aglutinación. Cuando el antígenos e encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. 2. Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo. Para la realización de estas técnicas el Anticuerpo se marca con un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. 3. Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al Anticuerpo se une un isótopo radiactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida. 4. Cromatografía de afinidad. La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros. 5. Inmunoprecipitación e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y Anticuerpos específicos. 17.2Técnicasdeprecipitación Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitación del complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales: 1. Técnica de precipitación propiamente dicha. 2. Técnica de difusión radial de Ouchterlony. 3. Técnica de inmunoelectroforesis. 4. técnica de difusión radial simple de mancini. 17.2.1Técnicadeprecipitación El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. El esquema de los distintos tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antígenos a los que se añaden igual cantidad de un anti­suero. La precipitación es 185 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente) Este tipo de reacción no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antígeno y de Anticuerpo para poder medir el precipitado formado. 17.2.2TécnicadedifusiónradialdobledeOuchterlony Esta técnica se realiza en placas de agar. En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el Anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarán y se formará en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente que se hace visible en forma de una línea de precipitación. En una preparación que contenga varios antígenos, se obtendrán múltiples líneas de precipitado. La técnica de Ouchterlony permite identificar sustancias según la forma de unirse las líneas de precipitación de dos o varios sistemas. 17.2.3Técnicadeinmunoelectroforésis La inmunoelectroforesis es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antígeno que se desea detectar se hace reaccionar con un Anticuerpo específico colocado en un pocillo lateral. Por difusión llegan a encontrarse los antígenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por comparación con un sistema estándar. En Inmunología clínica, esta técnica puede utilizarse en la identificación de las proteínas de mieloma. 17.2.4TécnicadedifusiónradialsimpledeManzini Esta técnica se basa en la difusión de un antígeno colocado en un pocillo en un gel de agarosa que lleva incorporado un Anticuerpo específico. Este anillo de precipitación es fácilmente visible y las concentraciones antigénicas están en relación directa con el área del círculo de precipitación. Al difundir el antígeno se genera un gradiente de concentración desde el pocillo donde se ha colocado. Cuando la concentración del antígeno es la adecuada (zona de equivalencia) el inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitación. 186 AutoinmunidadHumana 17.3Técnicasdeaglutinación En estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los Anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex. 17.3.1Hemaglutinacióndirecta La presencia de antígenos en la superficie de los glóbulos rojos se puede detectar por la hemaglutinación producida cuando se añade un antisuero con Anticuerpos frente a dichos antígenos. Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habrá aglutinación cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero añadido. De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinación de los distintos grupos Rh. 17.3.2Hemaglutinaciónindirecta Se basa en el principio de la inhibición de la hemaglutinación. Para su realización se precisan glóbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar. Si estos glóbulos rojos son puestos en presencia de Anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se producirá su aglutinación. Por el contrario, cuando se añade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los Anticuerpos se unirán a dicha sustancia y no a los glóbulos rojos. En este caso no se producirá la hemaglutinación. Por tanto, aglutinación (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinación (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotrofina coriónica (HCG) para el diagnóstico de embarazo puede realizarse por esta técnica. 17.4Técnicasdeinmunofluorescencia La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que, al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación. Las moléculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en luz de menor energía (longitud de onda más larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característico; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores). La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de autoAnticuerpos y Anticuerpos contra antígenos de superficie de células y tejidos. Para ello se emplean Anticuerpos preparados frente a la proteína que se desea detectar marcados con moléculas fluorescentes (Figura 17.6). Se aprecia si hubo unión del Anticuerpo con el antígeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitación del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los Anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o células con 187 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico antisueros anti-antígeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente antiInmunoglobulina marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta) 17.4.1 Citometriadeflujo La técnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de células de sangre periférica. Actualmente el análisis de una suspensión de células vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citómetro de flujo. La suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas. Las células pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser que produce la dispersión de la luz y la activación de la fluorescencia. Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio en función de sus propiedades fisicoquímicas y del marcaje efectuado. Para la separación celular este aparato lleva acoplado un sistema que carga eléctricamente las células y con placas deflectoras se realiza su separación. Además de basarse en la detección de la fluorescencia emitida por las células marcadas, tambien lo hace en otras propiedades diferenciales de las células en estudio como tamaño (FSC), complejidad (SSC), etc. La señal producida como consecuencia de la excitación del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de células reconocido por el Anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imagenes en dos dimensiones (Dot-Plot) o en una dimensión (Histograma) en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas. La puesta a punto de las técnicas de citofluorometría, en las que se conjuga los avances de informática, rayos láser y Anticuerpos monoclonales permite el análisis fenotípico y funcional de las células T, B y de todas aquellas células de las que se disponga de un antisuero que las identifique. Marcadores de linfocitos B. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresión de las moléculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresión de moléculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en reposo. Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8 presentes de forma específica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones de células T de colaboración y citotóxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activación celular T se expresan nuevas moléculas de superficie, son principalmente receptores para factores de crecimiento y proliferación celular. Entre estos nuevos antígenos de activación expresados en la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la molécula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de la insulina y de la transferrina (CD71); c) antígenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II, que no están presentes en linfocitos T en reposo; y d) una gran variedad de moléculas de superficie, cuya función no es totalmente conocida (por ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69). n(Ac)+c(Ag) + m(Ag*) <---> h(Ag-Ac)+j(Ag*-Ac)+K(Ag*)+I(Ag) En donde: Ac: Anticuerpo; Ag: Antígeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antígeno marcado con un isótopo; Ag-Ac: Complejos de Anticuerpos y antígenos no marcados y Ag*-Ac: Complejos de Anticuerpos y antígenos marcados 188 AutoinmunidadHumana 17.5Técnicaderadioinmunoensayo El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a Anticuerpos específicos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un isótopo. Al establecerse esta competición resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor será la cantidad de sustancia radiactiva que se une al Anticuerpo y viceversa. Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al Anticuerpo y la de la hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solución y la hormona unida al Anticuerpo forma agregados fácilmente precipitables. Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentración de la hormona no marcada a investigar. En el RIA directo, a la fase sólida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes concentraciones conocidas de antígeno marcado se incuban con una concentración constante de la muestra de la que se desea conocer la concentración del antígeno en cuestión. El fundamento y la detección no sufrirían cambios respecto lo anteriormente comentado. El RIA de inhibición también sería una técnica competitiva de análisis pero lo que se une a la fase sólida es una cantidad fija de antígeno. Para el proceso de inhibición se incuba una concentración fija de Anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antígeno. Existe una técnica no competitiva que es el denominado sandwich: Se une un Ac en cantidades constantes a la fase sólida. Una vez realizado el bloqueo, se añade el antígeno en concentraciones variables. Posteriormente se añade un segundo Anticuerpo contra el antígeno, pero esta vez marcado. Además del radioinmunoensayo antes descrito hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez más frecuente el empleo de Inmunoglobulina marcadas con isótopos radiactivos para su posterior aplicación en diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antígenos específicos, en técnicas inmunorradiohistológicas y técnicas de análisis no competitivo que pueden ser una alternativa al RIA en la determinación de algunas moléculas que no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la detección de tumores primarios o metastásicos (inmunoescintografía) e incluso la posibilidad de irradiación local de células neoplásicas (inmunorradioterapia). Todas las posibilidades anteriormente indicadas se basan en la posibilidad de marcar el Anticuerpo con radioyodo sin mermar su inmunorreactividad. El marcaje de proteínas o péptidos con yodo radiactivo I125 ó I132 puede realizarse por diferentes métodos. La incorporación del yodo a la molécula se realiza en los aminoácidos aromáticos que forman parte de la estructura de la cadena peptídica: tiroxina, fenilalanina, triptófano o histidina. La técnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de utilizar isótopos. Además de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de instalaciones adecuadas para su utilización, existen isótopos que tienen el inconveniente de su pronta caducidad. 189 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 17.6Técnicadeenzimoinmunoensayo Esta técnica, también se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificación de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antígeno, o bien unidas al Anticuerpo. El test de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el Anticuerpo específico frente al antígeno a determinar. b) Se añade la muestra con el antígeno. c) Se adiciona el Anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA e indirecto o competitivo, se diferencia del caso anterior en que se añaden los Anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los Anticuerpos que no se han unido a los antígenos de la muestra lo harán a los antígenos de los pocillos Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta técnica se utiliza para la medida de hormonas, antígenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones. Una variante de esta técnica de gran utilidad se conoce como test en fase sólida y está orientada a la determinación de Anticuerpos frente a un determinado antígeno. Para ello el antígeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plástico). Al añadir la muestra con el posible Anticuerpo se unirá y podrá ser detectado añadiendo antiInmunoglobulina marcadas con el enzima. Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimáticas es cuando el antígeno se encuentra fijo en células o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de inmunofluorescencia indirecta, en este caso también se emplean dos Anticuerpos. El primero, con actividad frente a los antígenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y que actúa de puente con el complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa-antiperoxidasa (PAP). La diferencia principal entre las técnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como marcador un isótopo y la segunda la actividad de un enzima, así el RIA directo y el ELISA competitivo serían equivalentes, y también existiría ELISA de inhibición y ELISA en Sandwich. Existen inmunoensayos que se denominan homogéneos en los cuales no es necesario la separación de los inmunocomplejos de los reactivos libres. Son técnicas muchas de ellas patentadas por diferentes firmas comerciales. 17.7Técnicasnefelométricas Estas técnicas se basan en la detección de los complejos Ag-Ac, por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el Anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados. Este procedimiento es rápido y sensible y se está utilizando en la actualidad, sobre todo, para la cuantificación de proteínas en suero y en otros líquidos biológicos. 190 AutoinmunidadHumana 17.8Seleccióndecélulasunidasaunanticuerpo En la actualidad disponemos de varios métodos para seleccionar células a las que previamente se ha unido un Anticuerpo. La adición de complemento elimina dicha población celular (selección negativa), es la denominada técnica de inmunotoxicidad. La separación inmunomagnética se basa en la interacción entre antígenos celulares superficiales y Anticuerpos unidos a bolas magnéticas. La aplicación de un campo magnético permite separar las células unidas a las bolas (selección positiva) de las células no unidas (selección negativa). Es un método fácil, rápido y no muy costoso. Este método presenta muchas aplicaciones no sólo en Inmunología sino también en Microbiología, utilizando bolas unidas a Anticuerpos frente a un determinado microorganismo; en Biología Molecular para aislamiento de DNA y mRNA utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia de oligonucleótidos respectivamente. También se pueden usar para la purificación de proteínas si se unen las bolas a Anticuerpos específicos. La separación de células puede realizarse mediante el FACS (Fluorescence activated cell sorting) en la que además de los dispositivos de citometría ya mencionados se dispone de mecanismos de separación celular en función de la fluorescencia emitida por las células marcadas con Anticuerpos. Esta es la técnica que actualmente ofrece mejores resultados. 17.9 Técnicas usadas en el aislamiento de anticuerpos o antígenospuros Esta técnica es ampliamente utilizada en Bioquímica e Inmunología. Puede aplicarse en el aislamiento de una población pura de Anticuerpos. Para ello se prepara un inmunoabsorbente en fase sólida, que es un antígeno unido covalentemente a un soporte inerte, como por ejemplo bolitas de dextrano entrecruzadas. El inmunoabsorbente, se coloca en una columna y la mezcla de Anticuerpos se hace pasar a través de él bajo condiciones fisiológicas. Los Anticuerpos específicos para el antígeno permanecen unidos a la columna, y aquellos que no se unen son eliminados mediante lavado. En el segundo paso, se eluye la columna, usando un tampón de elución que disocia la unión antígenoAnticuerpo (por ej., acetato a pH 3.0) para obtener el Anticuerpo que se unió al inmunoabsorbente. A la inversa, colocando Anticuerpos en la columna se tendrá antígeno puro. Esta técnica permite obtener otros tipos de moléculas. Así una columna de lectina absorberá todas las moléculas con determinados residuos azúcar, que pueden eluirse en un tampón con el azúcar libre, ya que éste compite con la proteína ligada por los sitios de unión a la lectina. 17.10Inmunoprecipitacióneinmunoblotting La inmunoprecipitación es una de las técnicas inmunológicas más útiles cuando se asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se pueden determinar la presencia y cantidad de un antígeno, el peso molecular relativo de una cadena polipeptídica, su síntesis y degradación, la interacción con proteínas, ácidos nucleicos u otros ligandos. La técnica de inmunoprecipitación se divide en cuatro pasos: 1. Marcaje del antígeno (opcional) 2. Lisis de las células para liberar el Ag 191 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 3. Formación del complejo Ag-Ac 4. Purificación de los inmunocomplejos En la mayoría de los casos el antígeno se marca incubándolo con un precursor radiactivo aunque muchos antígenos se pueden detectar por medios que no requieren marcaje directo. El antígeno se extrae de las células mediante lisis. Después, los Anticuerpos se añaden al lisado y se forman los inmunocomplejos Ag-Ac. Estos se unen por adsorción a una fase sólida que contiene proteína A. Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel pero también pueden ser usados en diferentes técnicas incluyendo estudios enzimáticos, unión a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc. Una de estas técnicas es el Western blot que combina la resolución de la electroforesis en gel con la especificidad de la detección inmunoquímica. Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antígenos y de Anticuerpos específicos. En la actualidad es el test confirmatorio más empleado para el diagnóstico del SIDA. Se emplean antígenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes proteínas víricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se incuban con el suero problema. Los Anticuerpos se detectan añadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda coloreada al añadir un sustrato. Esta técnica identifica Anticuerpos específicos frente a las distintas proteínas del VIH. 17.11Otrastécnicasbasadasenlauniónantígeno‐anticuerpo Hay otros modos para detectar el complejo antígeno-Anticuerpo una vez que éste se ha formado, además de los descritos en los apartados anteriores. Son, por ejemplo, las técnicas basadas en el marcaje de Anticuerpos con ferritina u oro coloidad, de gran utilidad en microscopía electrónica. La técnica de Anticuerpos marcados con ferritina se basa en el hecho de que casi el 25% de esta molécula está formada por hierro que, al ser opaco a los electrones, puede ser detectado en microscopía electrónica. Los Anticuerpos pueden ser combinados a la ferritina (u otras proteínas) mediante ligandos bivalentes como el 1,3-difluoro-4,6dinitrobenceno o la bencidina bidiazoica entre otros. La técnica basada en el marcaje de Anticuerpos con oro coloidal y su uso en microscopía electrónica se basa, al igual que en el caso anterior, en la opacidad de estas moléculas a los electrones. Estas técnicas son de gran utilidad en inmunohistología e inmunocitología humana, animal y vegetal. También están tomando cada vez mayor auge las técnicas quimioluminiscentes. La quimioluminiscencia consiste en términos generales en la producción química de la luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la energía de una reacción química oxidativa, son colocadas en un estado de excitación electrónica. La emisión de luz se produce al volver a su estado inicial y la energía química absorbida se cede en forma de fotones fácilmente cuantificables con un fotodetector. Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de isótopos radiactivos en el inmunoanálisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisión de luz sólo se produce cuando se provoca la reacción oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes. 192 AutoinmunidadHumana Las técnicas anteriores así como las de inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis e enzimoinmunoensayo pueden realizarse utilizando un sistema de ampliación de las señales empleando el complejo avidina-biotina. La biotina es una vitamina de bajo peso molecular, y la avidina es una glicoproteína, contenida en la clara del huevo. La biotina se une covalentemente al Anticuerpo a través de un grupo amina, carboxilo sulfhidrilo o tiosil. Varias moléculas de biotina, pueden unirse a una de Anticuerpo y dada la afinidad biotina-avidina resulta que, cada molécula proteica, se vería unida, a través de la biotina, con varias moléculas de avidina a su vez unidas al marcador correspondiente. 17.12Técnicasdebiologíamolecularútileseninmunología Otro grupo de técnicas ampliamente utilizadas en inmunología son de biología molecular. Una de las más utilizadas es la Southern Blot. Esta técnica consiste en la separación de fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestión con enzimas de restricción. La separación se hace mediante electroforesis y después este DNA es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa (blot). Después, para la identificación de la banda que interesa se realiza un proceso llamado hibrización, en el que la membrana es "incubada" con un fragmento de DNA complementario al gen de interés (sonda) previamente marcada, generalmente con un isótopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante autoradiografía la banda en la cual se ha producido unión. 193 UNIDADDIDÁCTICAXVIII AUTOINMUNIDAD AutoinmunidadHumana 18.1Introducción La Autoinmunidad patológica viene definida por reacciones de base inmunológica, habitualmente persistentes y de larga duración, en las que intervienen antígenos propios (autoantígenos). Su expresión clínica es la consecuencia de la alteración orgánica o funcional de las células, u órgano donde reside el antígeno que interviene en la reacción (enfermedades Autoinmunes órgano-específicas). Cuando complejos de autoantígenoautoAnticuerpos, circulan por la sangre y se depositan en diversos lugares del organismo, dan lugar a patología a nivel de diversos órganos, y constituyen la base de las denominadas enfermedades Autoinmunes sistémicas o no órgano especificas. La idea de Autoinmunidad patológica lleva implícita, la de Autoinmunidad fisiológica o natural. En efecto todos los individuos, tenemos linfocitos T y linfocitos B con potencialidad autorreactiva. Sin embargo como ha quedado dicho en el capitulo anterior, existen una serie de mecanismos que permiten que aquellos linfocitos autorreactivos potencialmente peligrosos sean eliminados física o funcionalmente. 18.2Criteriosquedefinenlasenfermedadesautoinmunes No existen unos criterios definidos y aceptados internacionalmente que permitan incluir como Autoinmune una determinada enfermedad. Sin embargo muchas de las que actualmente se aceptan como Autoinmunes lo son por combinar algunos o todos de los criterios que apuntamos a continuación: - Presencia en el suero del enfermo de autoAnticuerpos reactivos con autoantígenos, presentes especificamente en el órgano o en algunas células del órgano diana de la enfermedad; o autoAnticuerpos contra autoantígenos distribuidos de forma más general en el organismo. - Presencia de autoAnticuerpos fijados en las células o estructuras que sufren el proceso patológico. - Demostración de que dichos autoAnticuerpos juegan un papel patógenico en la enfermedad correspondiente. - Presencia de infiltrados linfocitarios de forma crónica en los tejidos afectados. - Demostración de que los linfocitos T aislados del órgano que sufre el proceso Autoinmune, pueden ser activados in vitro por el autoantígeno putativo presentado adecuadamente. - Existencia de modelos experimentales espontaneos o inducidos que remeden la enfermedad correspondiente en el hombre, y en los que se demuestre que el sistema inmunólogico juega el papel fundamental en su instauración. - Asociación en un mismo paciente de alguna otra enfermedad considerada de base Autoinmune - Mejoría del cuadro clínico con tratamientos inmunosupresores. - La observación de que un órgano o tejido transplantado de un individuo idéntico, es rechazado de forma acelerada por el receptor, confirma el origen Autoinmune del proceso que llevó a la necesidad de dicho transplante. 197 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 18.2.1 Factoresgenéticosyenfermedadesautoinmunes Hoy sabemos que existen factores genéticos que imprimen susceptibilidad para el desarrollo de enfermedades Autoinmunes y en muchos casos el genotipo del complejo principal de histocompatibilidad influye en la susceptibilidad a desarrollar determinadas enfermedades Autoinmunes como se trata en el capitulo HLA y enfermedad. Sin embargo, el mecanismo que relaciona la asociación de determinados alelos del complejo principal de histocompatibilidad con susceptibilidad a enfermedades Autoinmunes no esta aclarado y hay que dejar constancia del carácter incompleto de dichas asociaciones. Solamente una pequeña fracción de los individuos que presentan un determinado alelo HLA desarrollará la enfermedad con que dicho alelo se asocia. 18.2.2Factoresambientalesyenfermedadesautoinmunes La concordancia de gemelos monocigotos para una enfermedad Autoinmune no supera en ningún caso el 60%. En consecuencia debe haber factores no controlados genéticamente que intervienen en la expresión de las enfermedades Autoinmunes. A dichos factores en general les denominamos factores ambientales. Entre ellos destacan los: 18.2.2.1Agentesinfecciosos Es frecuente que una enfermedad Autoinmune venga precedida de forma más o menos próxima de una enfermedad infecciosa. Los agentes infecciosos pueden poner en marcha una enfermedad Autoinmune actuando de diversas maneras, por ejemplo: Actuando como superantígenos, pueden mediar la activación policlonal de linfocitos T y/o B y macrófagos y liberar gran cantidad de citocinas que rescatarian células anergizadas autorreactivas. Pueden causar la modificación de un autoantígeno, creándose un neoantígeno capaz de desencadenar una respuesta que actuaría sobre el autoantígeno. Virus infectando las propias células linfocitarias podrían destruir o alterar la función de determinadas poblaciones con capacidad reguladora de la respuesta. Los Anticuerpos y/o linfocitos T generados en una respuesta inmune contra componentes de un agente infeccioso, pueden reaccionar en forma cruzada con ciertos componentes del propio huesped, al presentar estos últimos ciertos epítopos compartidos con el componente microbiano. Este fenómeno de reactividad cruzada entre componentes de un huesped y componenetes de un agente infeccioso suele designarse como mimetismo molecular. El mimetismo molecular como mecanismo de enfermedad Autoinmune, fue descrito por primera vez, al demostrarse que pacientes con fiebre reumatica presentaban Anticuerpos que reaccionaban con antígenos del estreptococo y con el tejido cardiaco. El mecanismo de mimetismo molecular, es uno de los que en la actualidad tiene más predicamento para explicar la iniciación del fenómeno Autoinmune. En esta dirección se han buscado moléculas en agentes infecciosos con epítopos reconocidos por linfocitos B y que se encuentren también en moléculas propias, y aun más importante moléculas conteniendo secuencias con los motivos requeridos para poder ser presentados por determinados alelos de antígenos de histocompatibilidad y que mimeticen peptidos propios. Epítopos con estas características se han encontrado en moléculas altamente conservadas en la filogénia, de todas ellas las más analizadas han sido las proteinas de estrés o de choque térmico (HSP heat shock proteins). 198 AutoinmunidadHumana Las proteínas de estrés, son producidas por todas las células procariotas y eucariotas. Existen varias familias de estas proteínas cuya producción se incrementa rápidamente, en situaciones de estrés o estímulos adversos para la célula (incremento de la temperatura, desecación, falta de glucosa en el medio, falta de otros nutrientes, irradiación ultravioleta, radiaciones ionizantes, estímulos inductores de apoptosis en general). Entre las proteínas de estrés equivalentes de distintos orígenes existe una alta similitud. La denominada HSP 70 de la E. coli y del hombre tienen un 50% de homologias. Por otra parte dichas proteínas juegan un papel fundamental en el correcto plegamiento de determinadas proteínas a las que a veces acompañan temporalmente para translocarlas de un compartimento de la célula a otro. En cualquier caso una respuesta inmunológica montada en principio contra epitopos o peptidos de la proteína de estrés del microorganismo podría reaccionar cruzadamente con proteínas de estrés propias y colaborar a que se establezca por un mecanismo de spreading (diseminación) respuesta contra antígenos propios, preferentemente contra la proteínas que acompañadas por las proteínas de estrés forman con ellas complejos moleculares. Anticuerpos contra varias proteínas de estrés se encuentran en diversas enfermedades Autoinmunes como diabetes tipo I, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, lupus eritematoso. Intervienen en el desarrollo de enfermedades Autoinmunes experimentales, como en la artritis por adyuvante, y posiblemente en aquellas que se consiguen por la inmunización de animales con extractos proteicos emulsionados con adyuvante completos. 18.2.2.2Sustanciasquímicas Ciertas drogas como hidralazina y procainamida, pueden inducir la aparición de LES y de determinados Anticuerpos antinucleares. Otras como la alfa metil dopa pueden inducir anemia hemolitica por Anticuerpos de la clase IgG. El halotane y ácido tienílico Anticuerpos contra el citocromo P450 y hepatopatia. Por otra parte la administración de cloruro de mercurio a animales de experimentación les induce cuadro de LES con neuropatía y Anticuerpos antinucleares. En este momento no se conoce con certeza el mecanismo de actuación de dichas sustancias en el desarrollo del fenomeno, pero una posibilidad es que modifiquen determinadas proteínas creando neoantígenos y que estos intervengan en la rotura de la tolerancia para los antígenos propios. 18.2.2.3Factoreshormonales Las hormonas sexuales femeninas intervienen de forma aun no aclarada en favorecer la aparición de enfermedades Autoinmunes. De hecho las enfermedades Autoinmunes son en general mucho más frecuentes en mujeres que en varones. La relación mujer varón va desde 4:1 para la diabetes tipo I y para la artritis reumatoide, hasta 50:1 para la tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar primaria y hepatitis Autoinmune clásica. 18.3Clasificacióndeenfermedadesautoinmunes A. Sintémicas o no específicas de órgano B. Específicas de órgano Entre las primeras se incluyen las que afectan a gran número de órganos y se asocian a menudo a hiperactividad de linfocitos B y a un número amplio y variado de autoAnticuerpos. En este grupo destacan: Lupus eritematoso sistémico, Artrtitis 199 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico reumatoide, Esclerodermia, Dermatomiositis y Polimiositis. De todas ellas la verdaderamente sistémica y que sin duda presenta más alteraciones inmunologicas es el LES. Ademas la existencia de diversas cepas de ratones (NZBxNZW, MRL lpr/lpr ó n/n, BXSB, SWRxSJL), que de forma espontanea presentan un cuadro clínico y hallazgos inmunológicos muy similares a los del lupus del hombre, ha permitido conocer más a fondo diversos aspectos inmunológicos y genéticos de dicha enfermedad. En las enfermedades Autoinmunes específicas de órgano, como la miastenia gravis, el pénfigo o la tiroiditis de Hashimoto, los autoAnticuerpos se dirigen específicamente contra un órgano o un tipo celular concreto de un órgano determinado. Existe un grupo de enfermedades Autoinmunes dificilmente incluibles en las dos anteriores clasificaciones, por compartir características de ambos grupos, esto es, afectar un órgano solo o preferentemente, pero tener autoAnticuerpos contra estructuras antigénicas diversas sobre todo nucleares. Entre ellas destacan: la cirrosis biliar primaria, la hepatitis Autoinmune, y el síndrome de Sjögren. 18.2.2 Autoanticuerposyenfermedadesautoinmunessistémicas Una característica de las enfermedades Autoinmunes sistémicas, es la presencia de autoAnticuerpos frente a antígenos de localización intracelular y no órgano ni especie específicos. En generico suelen denominarse Anticuerpos antinucleares. El nucleoplasma, la matriz nuclear y el nucleolo, son los compartimentos en que dichos antígenos suelen estar localizados, aunque con la misma denominación de antinucleares se definen con frecuencia a algunos que reconocen antígenos de localización citoplásmica. Los antígenos diana suelen ser moléculas muy conservadas a lo largo de la evolución, como el DNA, las histonas y ciertas enzimas intranucleares. Algunos de los Anticuerpos antinucleares (ANA), se han asociado específicamente a una determinada enfermedad, (e incluso a la prevalencia de determinados signos o sintomas), y se utilizan como marcadores para su diagnóstico. Esto ocurre con los Anticuerpos anti DNA nativo y anti Sm en el LES, los anti Scl-70 en la esclerodermia difusa, el anti-centrómero en el sindrome de CREST (calcinosis, Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasias), anti sintetasas de RNA de transferencia en la dermatomiositis-polimiositis. Otros autoAnticuerpos se encuentran en diversas entidades como los anti-histonas en el LES y en el lupus inducido por drogas, el anti U1 RNP en el lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, y algunos casos de esclerodermia, anti La y anti Ro en LES y en el sindrome de Sjögren y otros muchos de menor significación. 18.2.3 Enfermedadesautoinmunesespecíficasdeórgano Aunque algunos autores como McDevitt, preconizan que todas las enfermedades Autoinmunes son específicas de órgano y que la única diferencia con las enfermedades Autoinmunes sistémicas (como el LES), radicaría en que en estas últimas el órgano diana de la Autoinmunidad es el núcleo de las células, lo cierto es que existen claras diferencias entre ambos tipos de enfermedades. En primer lugar la diversidad de autoAnticuerpos que se encuentra en el suero de los pacientes con enfermedades Autoinmunes sistémicas es mucho más amplia y variada que en las enfermedades de órgano, en las cuales los autoAnticuerpos, y en conjunto la célula diana de la enfermedad, se limitan con frecuencia a un solo órgano, e incluso a antígenos concretos de algún tipo celular de dicho órgano. 200 AutoinmunidadHumana Por otra parte en las enfermedades específicas de órgano, los autoAnticuerpos o son especie específicos o reaccionan con más alta afinidad con antígenos de la propia especie. Además, en las enfermedades Autoinmunes específicas de órgano solo se afecta el órgano diana, mientras que en las sistémicas, la repercusión del fenómeno Autoinmune, alcanza diversas estructuras del organismo. Desde el punto de vista de la instauración de la respuesta Autoinmune (y sin descartar alteraciones de la regulación inmunológica comunes a ambos tipos de enfermedades Autoinmunes), todo hace pensar que en las enfermedades específicas de órgano existirían alteraciones cuantitativas o cualitativas relacionadas con alguno o algunos antígenos del órgano diana, mientras que en las sistémicas el factor más importante sería el fracaso de la regulación inmunológica con una hiperactivación policlonal aunque restringida de linfocitos B. El número de enfermedades a las que se adjudica un mecanismo Autoinmune específico de órgano, se ha incrementado con el tiempo, lo que se debe por una parte, al desarrollo de técnicas más sensibles para la detección de autoAnticuerpos y, por otra al empleo de técnicas de estudio funcional, que permiten demostrar el efecto que producen dichos Anticuerpos. 18.4 Mecanismos autoinmunes patogénicos en las enfermedades Los mecanismos inmunológicos de daño tisular en las enfermedades Autoinmunes son de los mismos tipos que los que operan en las reacciones inmunológicas denominadas de hipersensibilidad. En algunos casos el resultado final es la consecuencia de la reacción secuencial o simultanea de varias de ellas. Cuando la respuesta Autoinmune va dirigida contra antígenos presentes en las membranas basales como en el caso del sindrome de Goodpasture, la activación del complemento in situ conduce a la liberación de mediadores que concentran granulocitos en la zona, los cuales liberan localmente enzimas lisosomales que conducen al daño de la membrana. En algunos casos los autoAnticuerpos van dirigidos contra receptores hormonales, y pueden actuar como activadores como en el hipertiroidismo de Graves. En otros los autoAnticuerpos no activan sino que bloquean los receptores y conducen a una situación de hipofunción sin destruir tejidos, esta es la situación en un tipo de diabetes denominada insulino resistente, en la que Anticuerpos contra el receptor de la insulina, interfieren con la acción de dicha hormona. En la miastenia gravis, los autoAnticuerpos contra el receptor de acetil colina, no solo bloquean los receptores de acetilcolina en la placa neuromuscular sino que facilitan la internalización y degradación de dichos receptores. En todos los casos descritos y por los mecanismos expuestos, los autoAnticuerpos son patogénicos. La adjudicación de responsabilidad patogénica en los casos de enfermedades Autoinmunes no órgano específico es más incierto. En el lupus eritematoso sistémico, los Anticuerpos anti DNAds (de doble hebra) o nativo, mediante la formación de complejos DNA-anti DNA circulantes, se depositan preferentemente en riñones y piel en donde activan complemento. Los productos liberados durante la activación del complemento atraen y activan células fagociticas a la zona. Dichas células vertiendo localmente sus enzimas lisosomales, y determinadas quimocinas, son las verdaderas efectoras del daño local. 201 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Para otros muchos autoAnticuerpos muy frecuentes y variados en el lupus eritematoso sistémico no se ha podido demostrar un papel claro en la patogenia. Solamente los Anticuerpos anti Ro y anti La en los casos de lupus neonatal, se han demostrado patogénicos, produciendo en algunos casos bloqueo auriculo ventricular y lesiones dermatológicas denominadas eritema anular. El mecanismo de acción no queda claro, pero su patogenicidad si, ya que las lesiones guardan correlación con la presencia de tales autoAnticuerpos en la madre, que los transfiere al hijo a través de la placenta. Las lesiones del niño remiten cuando el catabolismo de la IgG (y por tanto los autoAnticuerpos transferidos de la madre) lleva a su desaparición. Mientras que la patogenicidad de los autoAnticuerpos es en general fácilmente demostrable, la de los linfocitos T no lo es. La complejidad del sistema que reconoce el linfocito T (peptidos en el contexto de antígenos de histocompatibilidad), constituye un sistema mucho más complejo que el de antígenos y Anticuerpos, para analizar in vitro. Por otra parte el análisis in vivo por transferencia pasiva solo es posible en modelos animales, de modo que es a través de dichos modelos, que conocemos algunos datos a este respecto. En este sentido se ha podido demostrar que linfocitos T obtenidos de animales con enfermedades Autoinmunes, bien desarrollada de una forma espontanea como en el caso de la Diabetes tipo I en los ratones NOD, o bien inducida mediante la administración de antígenos o péptidos de dichos antígenos, como en la encefalomielitis Autoinmune experimental, son capaces de transferir pasivamente a animales de la misma cepa, la enfermedad correspondiente. Los linfocitos T pueden producir lesiones por dos mecanismos fundamentalmente. Uno es dependiente de linfocitos T citotóxicos, que están mediados por poroperforinas, granzimes y apoptosis y el otro por linfocitos T colaboradores mediante la liberación de citocinas inflamatorias. En este último caso, es difícil entender como un mecanismo de este tipo podría actuar con tal finura como para destruir unas células y respetar otras intimamente relacionadas en el espacio (como ocurre por ejemplo con las células beta de los islotes pancreaticos en la dibates tipo I). No obstante en modelos de transferencia pasiva en ratones se ha podido demostrar que células CD4+ con especificidad para antígenos presentes en células beta de los islotes, pueden mediar la destrucción de dichas células. Recientemente se ha puesto en evidencia un nuevo mecanismo en la producción de lesiones tisulares en varias enfermedades Autoinmunes: tiroiditis de Hashimoto, diabetes de ratones NOD, y sindrome de Sjögren. En estas entidades la concomitante expresión de Fas y Fas-L, en los tirocitos, células beta de los islotes pancreáticos y epitelio de las glándulas salivares, correspondientes a los órganos diana de las enfermedades antes enunciadas, lleva a la denominada muerte fratricida por mecanismo de apoptosis (la destrucción se produce entre las propias células al interacionar el Fas-L de unas con el Fas de las otras). Este mecanismo no requeriría en principio una respuesta Autoinmune. Desde esta perspectiva las reacciones Autoinmunes formarían parte de una fenomenología más amplia que conduciría a la destrucción de las células o tejidos involucrados. La Autoinmunidad es consecuencia de la activación de clones autorreactivos por parte de antígenos propios con las subsecuentes respuestas humorales y celulares dirigidas contra ellos. El significado biológico de estas respuestas es diverso. Así, las respuestas autoinmunitarias son de gran importancia en la regulación de la respuesta 202 AutoinmunidadHumana inmune adaptativa (red idiotipo-antiidiotipo) y en la eliminación de células y antígenos propios derivados del recambio tisular Por otro lado, existen diversas patologías en las que se produce muerte y daño tisular, tales como infarto e inflamación, durante las cuales se liberan antígenos tisulares que originan autoAnticuerpos los que participan en su eliminación. En todos estos casos, los fenómenos autoinmunitarios son necesarios y beneficiosos. En las enfermedades autoinmunitarias, en cambio, la presencia de autoAnticuerpos o linfocitos efectores autorreactivos se traduce en daño serio y progresivo a estructuras propias. 1. La red idiotipo -antiidiotipo es un mecanismo regulador de la respuesta inmune. Los idiotipos son los determinantes antigénicos de la región hipervariable de Inmunoglobulina y receptores para Antígeno. El sistema inmune tiene la capacidad de reconocer estos determinantes antigénicos y montar respuestas humorales frente a ellos denominadas respuestas anti-idiotipo. Estos Anticuerpos anti-idiotipo, además de neutralizar la zona hipervariable de los Anticuerpos o receptores que les dieron origen, estimulan a su vez al sistema originando Anticuerpos anti-antiidiotipo. De esta manera, se conforma una red idiotipo-antiidiotipo que tiende a regular negativamente la respuesta inmune. 2. Las células propias alteradas por envejecimiento u otros mecanismos cambian su estructura molecular originando antígenos que normalmente eran reconocidos como propios y por lo tanto tolerados. Las respuestas inmunes que surgen colaboran en la eliminación de estas estrucuras a través de una opsonización que aumenta la eficiencia de la fagocitosis o bien mediante la lisis por complemento. 3. El daño tisular producto de un infarto, proceso inflamatorio u otro mecanismo, se traduce en la liberación a la circulación de proteínas que no están normalmente en contacto con el sistema inmune. Estos auto-antígenos, al aumentar en concentración, rompen el estado de tolerancia que existía para ellos, y generan respuestas Autoinmunes transitorias que, en general no producen daño al organismo. 4. Las enfermedades Autoinmunes surgen como consecuencia de una pérdida de la tolerancia a antígenos propios y están mediadas por los mecanismos de daño inmunológico tipos II, III y IV principalmente. Son de etiologia desconocida, de carácter progresivo o recurrente y pueden afectar una gran diversidad de órganos o sistemas. De acuerdo a la distribución de él, o los antígenos que provocan estas patologías, se distinguen las enfermedades Autoinmunes órgano-específicas y sistémicas. Entre estos dos extremos, se encuentran una serie de enfermedades conformando lo que se denomina espectro de enfermedades autoinmunitarias, el cual, ordenado secuencialmente incluyeprincipalmente a Tiroiditis de Hashimoto, Mixedema Primario, Tirotoxicosis, Anemia Perniciosa, Gastritis Atrófica Autoinmune, Enfermedad de Addison, Diabetes tipo I, Sindrome de Goodpasture, Miastenia Gravis, Infertilidad Masculina Autoinmune, Pénfigo Vulgar, Penfigoide, Oftalmía Simpática, Esclerosis Múltiple, Anemia Hemolítica Autoinmune, Púrpura Tromobocitopénica Idiopática, Leucopenia Idiopática, Cirrosis Biliar Primaria, Colitis Ulcerativa, Sindrome de Sjögren, Artritis Reumatoidea, Dermatomiositis Escleroderma, Lupus Eritematosos Discoide y Lupus Eritematoso Sistémico. Los antígenos que originan la respuesta inmune responsable del daño en las EAI son muy diversos en cuanto a su naturaleza y ubicación anatómica. Por ejemplo, en la Esclerosis Múltiple, el sistema inmune reacciona con la proteína básica de la mielina, en la 203 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Miastenia Gravis, el antígeno es el receptor para acetilcolina en la placa neuromotora. En la Artritis Reumatoidea,la reacción es contra una Inmunoglobulina, en la Diabetes tipo I, el antígeno está presente en las células ß de los islotes de Langerhans del páncreas. En el Lupus Eritematoso Sistémico, los antígenos son DNA de una o dos hebras, histonas, ribonucleoproteínas, proteínas de membrana de eritrocitos, granulocitos y plaquetas y factores de la coagulación entre otros. En la Enfermedad de Basedow-Graves, el antígeno es el receptor para TSH en tiroides. A pesar de que el número de antígenos propios que podrían hipotéticamente originar una enfermedad Autoinmune es enorme, sólo algunos de ellos participan en su etiopatogenia. La razón de esta selectividad no se conoce, más aún, en muchas enfermedades Autoinmunes, se desconoce la naturaleza del antígeno que las inicia. Las enfermedades Autoinmunes presentan distintos mecanismos efectores responsables del daño a estructuras propias. Algunas enfermedades órgano-específicas se deben a la acción de células T CD4+ a través de un mecanismo de daño tipo IV (Diabetes tipo I y Esclerosis Múltiple). Otras, como la Enfermedad de Graves y la Miastenia Gravis son resultado de respuestas humorales por un mecanismo de daño tipo II. En las enfermedades Autoinmunes sistémicas suelen coactuar diversos mecanismos de daño inmunológico. Así, en la Artritis Reumatoídea se observan los tipos III y IV y en el Lupus Eritematoso Sistémico predominan los tipos II y III. Los sindromes de inmunodeficiencia pueden corresponder a fenómenos congénitos (inmunodeficiencias primarias) o bien a alteraciones adquiridas o iatrogénicas (inmunodeficiencias secundarias). Las inmunodeficencias primarias pueden afectar a uno a más de los distintos componentes inespecíficos y específicos del Sistema Inmune. La mayoría son defectos genéticos que alteran el desarrollo, activación o función de las diversas poblaciones celulares responsables de la respuesta específica (linfocitos T y/o B) o de las células o moléculas que participan en mecanismos de amplificación de la respuesta de la inmunidad adaptativa. La gravedad de las inmunodeficiencias primarias se relaciona directamente con la etapa del desarrollo de las células del sistema inmune en que se produjo la alteración. En general, se considera que en el desarrollo de los distintos tejidos participan fenómenos de determinación y diferenciación a partir de células multi o pluripotentes. En este proceso participan por una parte la dotación genética celular y por otra, factores ambientales que inducen cambios en la expresión génica determinando un fenotipo particular. En el desarrollo de los diversos órganos y sistemas están involucradas básicamente la proliferación y la diferenciación celulares. Los factores etiólogicos que llevan a alteraciones en estos procesos son de diversa naturaleza y de gran complejidad. Pueden tener su origen en defectos genéticos prexistentes o heredados o bien ser consecuencia de la interacción de las células en desarrollo con distintos factores externos denominados genéricamente agentes teratógenos. Entre ellos se encuentran las radiaciones, algunos virus, medicamentos u otros a los que el individuo en desarrollo puede haber sido expuesto. En este caso la alteración es de carácter poligénico. En las inmunodeficiencias en particular, se ha identificado sólo en algunos casos la etiología de las diversas alteraciones que afectan al ser humano. 204 AutoinmunidadHumana Para entender las características y consecuencias de las distintas inmunodeficiencias es necesario conocer el origen de los diversos componentes del sistema inmune. Las células que participan en los componentes específico e inespecífico de la Respuesta Inmune provienen de células multipotentes que dan origen a células madre pluripotentes que son las precursoras de las series linfoide y mieloide, entre otras. La serie linfoide madura y se diferencia en el Timo (linfocitos T) y en la médula ósea (linfocitos B). La serie mieloide madura en médula ósea y origina monocitos y granulocitos. En el microambiente de estos tejidos, las células mencionadas adquieren su fenotipo diferenciado para salir posteriormente a poblar los órganos linfoides periféricos y el resto de los tejidos a través de la circulación sanguínea y linfática. Cada uno de los pasos de las células a lo largo del camino hacia la diferenciación puede ser alterado por las condiciones genéticas o ambientales. Las manifestaciones morfofuncionales y clínicas que presentan los pacientes inmunodeficientes dependen de la etapa del desarrollo celular afectada. Mientras más precoz sea la alteración, mayor gravedad presentará el cuadro clínico resultante. Las inmunodeficiencias primarias son poco frecuentes, se manifiestan clínicamente entre los seis meses y dos años de edad y se caracterizan por presentar un aumento en la susceptibilidad a infecciones. Además, se ha observado que algunas inmunodeficiencias se asocian con un aumento en la incidencia de cáncer. Se señalan a continuación algunas inmunodeficiencias ilustrativas de estas patologías: A. Cuando el defecto involucra la ausencia o disminución importante de células madre, se produce la disgenesia reticular o Inmunodeficiencia Combinada Severa con Leucopenia. En ella se observa ausencia total de linfocitos y granulocitos tanto circulantes ycomo en médula ósea. Los niños mueren a los pocos días después del nacimiento por infecciones masivas. El defecto parece ser de transmisión autosómica y su causa es desconocida. B. Cuando el defecto está en la maduración de la linea linfoide afectando a las células precursoras de linfocitos, se produce la Inmunodeficiencia Combinada Severa que puede ser ligada al cromosoma X o bien ser autosómica recesiva. Estos pacientes carecen de linfocitos T y B y la enfermedad suele estar asociada a deficiencias enzimáticas (adenosina-deaminasa). En otros casos hay fallas enla expresión de moléculas codificadas por el sistema mayor de histocompatibilidad. Se observa una depleción importante de linfocitos en el tejido linfoide y en sangre periférica (menos de 1000/mm3). La función fagocítica está normal. Al fallar las respuestas adaptativas celular y humoral, los niños afectados presentan infecciones recurrentes por hongos y otros microorganismos y mueren generalmente antes de los dos años de edad. El defecto puede ser subsanado actualmente mediante trasplante de médula ósea. C. Las deficiencias de la linea linfática T pueden estar asociadas a aplasia tímica (Sindrome de diGeorge) o hipoplasia tímica (Sindrome de Nezelof). En el Sindrome de di George existe un desarrollo embriológico anormal de la tercera y cuarta bolsa faríngea lo que se traduce en aplasia tímica y de las glándulas paratiroides entre otras alteraciones. Los pacientes, al carecer de respuesta celular, sufren de infecciones recurrentes por microorganismos oportunistas tales como hongos, virus y P.carinii. Los niveles de Inmunoglobulina séricas pueden estar normales o presentar aumento de IgE y 205 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico disminución de IgA. Además de estas manifestaciones, los niños presentan las alteraciones propias de la ausencia de paratiroides (crisis hipocalcémicas) o de otros sistemas afectados. Su etiología no está clara, afecta a los dos sexos por igual y suelen encontrarse anomalías cromosómicas. En el sindrome de Nezelof se observa hipoplasia tímica y de órganos linfáticos periféricos, con linfopenia y respuesta adaptativa celular muy pobre. Los niveles séricos de las cinco clases de Inmunoglobulina suelen estar normales. Los niños padecen infecciones crónicas pulmonares recurrentes, candidiasis, diarreas crónicas, infecciones cutáneas, sepsis por gramnegativos entre otras infecciones. Se supone que corresponde a una alteración autosómica recesiva o bien ligada al cromosoma X. D. En la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X o enfermedad de Bruton existe una alteración de linfocitos pre-B en la médula ósea. En este caso se detecta una severa linfopenia B con disminución importante de IgG y una ausencia casi completa de IgA e IgM lo que se traduce en una respuesta adaptativa humoral casi ausente. Los síntomas se inician generalmente a partir de los seis a nueve meses de edad ya que antes cuentan con Inmunoglobulina aportadas por la madre. Los pacientes sufren de infecciones recurrentes por microorganismos extracelulares piógenos. Su respuesta celular está normal. Otras inmunodeficiencias que afectan la maduración de linfocitos B son la agammaglobulinemia variable común y la deficiencia selectiva de IgA. La respuesta humoral se ve además afectada por otras deficiencias que no involucran a la maduración de linfocitos B. Entre ellas se cuentan la deficiencia en el componente secretor de la IgA (alteración de epitelio mucoso) y la deficiencia selectiva de IgM por alteración en linfocitos T cooperadores. E. Las alteraciones que afectan a las células fagocíticas pueden tener su origen en el precursor mieloide (se detecta deficiencia en monocitos y polimorfonucleares) o en una de las líneas en particular. El primer caso no es común, sin embargo si se ha descrito fallas en el número de leucocitos (neutropenias hereditarias) y alteraciones funcionales de ellos. Así, en la Enfermedad Granulomatosa Crónica de la Infancia existe una incapacidad de los polimorfonucleares de generar peróxido de hidrógeno y otros radicales derivados del oxígeno pertenecientes a los mecanismos bactericidas oxígeno dependiente de estas células. Los pacientes sufren graves infecciones bacterianas especialmente por aquellas catalasa-positivas. En el Sindrome de Chediack-Higashi se observa, entre otras alteraciones, la existencia de lisosomas gigantes en el citoplasma de polimorfonucleares neutrófilos y eosinófilos, los que presentan alteraciones funcionales que afectan la quimiotaxis y la capacidad microbicida. Finalmente, existen deficiencias genéticas que afectan a prácticamente cada uno de los componentes del sistema del complemento, uno de los principales mecanismos amplificadores de la respuesta humoral. Las inmunodeficiencias secundarias o adquiridas tienen diverso origen y repercusiones clínicas. Los de menor gravedad son los de anergia inmunológica que suelen ocurrir después de las enfermedades infecciosas intensas, especialmente de origen viral. Son transitorias y revierten espontáneamente debido a la gran capacidad del sistema inmune. Otro caso, de mayor gravedad, es la inmunodeficiencia que acompaña al cáncer, su intensidad aumenta aun como consecuencia de los tratamientos a los que son sometidos estos pacientes. 206 AutoinmunidadHumana Una tercera categoría de inmunodeficiencias secundarias Corresponden a una serie de condiciones iatrogénicas derivadas del tratamiento con agentes inmunosupresores. Los individuos afectados son principalmente pacientes receptores de transplantes de órganos y aquellos que padecen alergias o enfermedades autoinmunitarias. Los agentes inmunosupresores mas utilizados son la azatioprina, los glucocorticoides, la globulina antilinfocítica y como se ha dicho, las drogas y la irradiación utilizadas en el tratamiento del cáncer. Estos agentes producen distintos efectos sobre el sistema inmune los que se manifiestan finalmente como una deficiencia en la respuesta humoral y/o celular, aumentando la susceptibilidad del paciente a padecer enfermedades infecciosas. Sin embargo, la inmunodeficiencia adquirida que causa mayor preocupación en la actualidad es el SIDA o síndrome de inmunodeficiencia adquirida, de carácter epidémico y curso clínico fatal. Esta enfermedad surgió alrededor de 1980, aumentando en forma alarmante en morbimortalidad hasta constituir un serio problema que afecta a toda la población mundial. El SIDA es provocado por el virus de inmunodeficiencia humana VIH, también denominado virus linfotropo de células t humanas tipo III HTLV-III, identificado en la molécula CD4 presente en la membrana de linfocitos TCD4+ cooperadores y en células presentadoras de antígeno. El modo de transmisión horizontal del virus, inicialmente mas frecuente, fue la relación homosexual. Sin embargo, en la actualidad, se ha visto un dramático aumento en la transmisión a través de relaciones heterosexuales. Tal es así, que la organización mundial de la salud ha efectuado proyecciones que señalan que el año 2000 el 90% de los contagios se producirán por esta vía. Otra alternativa de transmisión es la inoculación del virus al efectuar transfusiones sanguíneas o de plasma contaminadas, siendo los hemofílicos los individuos mas frecuentemente afectados. Finalmente, el uso de jeringas contaminadas con el virus por drogadictos constituye una vía frecuente de contagio. La transmisión vertical, de madre a hijo, durante el embarazo o el parto, es también posible. El virus VIH que contiene dos hebras de RNA genómico, ingresa a los linfocitos y células presentadoras de antígeno uniéndose al marcador CD4 a través de su proteína de superficie gp 120. Luego, en el citoplasma, se produce la trascripción de su genoma a DNA mediante la enzima viral trancriptasa reversa. Estas hebras complementarias se incorporan al genoma celular en calidad de provirus DNA. La replicación de este material genético se traduce en la generación de nuevos virus que abandonaran la célula para continuar su actividad infectiva. La presencia del virus en el plasma, en células circulantes y en los tejidos presenta variaciones de acuerdo a la etapa de la enfermedad en que se encuentra el paciente. La historia natural del SIDA comprende básicamente tres periodos sucesivos: Etapa primaria. Es asintomática en más del 50% de los pacientes. Cuando se manifiesta, lo hace con síntomas similares a aquellos de la mononucleosis aguda (fiebre e hiperplasia de ganglios linfáticos). En ellos se observa una disminución transitoria del recuento de linfocitos TCD4+ concomitante con un aumento de la cantidad de células circulantes infectadas por el virus y en la viremia. Durante este periodo, que suele ser de tres meses, se produce además un aumento progresivo en el recuento de linfocitos TCD8+. 207 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Etapa de latencia clínica. Es de 1 a 15 años de duración en la cual los pacientes no presentan sintomatología relacionada con VIH. Sin embargo, durante este periodo, existe una activa producción de partículas virales, especialmente en linfocitos TCD4+ ubicados en ganglios linfáticos. Se observa una disminución leve pero progresiva en el recuento de linfocitos TCD4+ circulantes, especialmente a expensas de la población con fenotipo Th1. la población TCD8+ mantiene el nivel alcanzado en la etapa anterior, o sea es 1.5 a 2 veces mayor que en individuos normales. Etapa clínica. Se inicia con los típicos síntomas de la enfermedad, esto es, diarreas prolongadas, fiebre, perdida de peso, infecciones oportunistas y desarrollo de neoplacias malignas. Este periodo tiene una duración de 1 a 4 años y termina con la muerte del paciente. Los principales cambios que afectan a células del sistema inmune incluyen un aumento progresivo en la viremia y en la cantidad de células infectadas con el virus tanto en la circulación como en el tejido linfoide. el recuento de linfocitos TCD4+ y TCD8+ muestra una fuerte disminución, presentando estos últimos una incapacidad citolítica. En pacientes terminales todas las sub-poblaciones linfocitarias están reducidas, aun cuando la producción de Anticuerpos puede estar aumentada. Los mecanismos patogénicos que subyacen a los cambios descritos son en parte desconocidos y objeto de intensa investigación en la actualidad. En resumen, las alteraciones de los diversos componentes de la respuesta inmune incluyen principalmente: 1. En monolitos y macrófagos se produce una disminución en la respuesta a factores quimiotacticos, una menor capacidad paraciticida y una disminución en la expresión de moléculas codificadas por el MHC. 2. Los linfocitos TCD4 efectores presentan disminución en su respuesta a antígenos solubles, una menor producción de linfoquinas, una incapacidad de respuesta en cultivo mixto de linfocitos y de expansión clonal. 3. Los linfocitos TCD8 citotóxicos presentan una disminución en su función y en su capacidad proliferativa. 4. Las células NK tienen una menor actividad antitumoral y antiviral. 5. Los linfocitos B presentan una menor capacidad de respuesta a nuevos antígenos. Además, sufren activación y diferenciación policlonal espontánea y generación de Anticuerpos. Finalmente la función reguladora de los linfocitos TCD4+ esta francamente dañada. La Autoinmunidad patológica viene definida por reacciones de base inmunológica, habitualmente persistentes y de larga duración, en las que intervienen antígenos propios (autoantígenos). Su expresión clínica es la consecuencia de la alteración orgánica o funcional de las células, u órgano donde reside el antígeno que interviene en la reacción (enfermedades Autoinmunes órgano-específicas). Cuando complejos de autoantígenoautoAnticuerpos, circulan por la sangre y se depositan en diversos lugares del organismo, dan lugar a patología a nivel de diversos órganos, y constituyen la base de las denominadas enfermedades Autoinmunes sistémicas o no órgano especificas. La idea de Autoinmunidad patológica lleva implícita, la de Autoinmunidad fisiológica o natural. En efecto todos los individuos, tenemos linfocitos T y linfocitos B con potencialidad autorreactiva. Sin embargo como ha quedado dicho en el capitulo anterior, existen una serie de mecanismos que permiten que aquellos linfocitos autorreactivos potencialmente peligrosos sean eliminados física o funcionalmente. 208 UNIDADDIDÁCTICAXIX ENFERMEDADESAUTOINMUNES AutoinmunidadHumana 19.1TiroiditisdeHashimoto También conocida como Enfermedad Tiroidea Autoinmune. La tiroiditis linfocitaria crónica o tiroiditis linfomatosa, es una inflamación crónica del tiroides, de mecanismo Autoinmune; cursa con bocio y puede desarrollar hipotiroidismo permanente. Es la causa más frecuente de enfermedad tiroidea en la edad pediátrica, causante del 55-65% de los bocios y estos pueden estar presentes en un 4-6% de la población escolar. Más frecuente en niñas, con una incidencia respecto al varón de 3/1 ó 2/1 según las series. La incidencia es también más elevada en el Síndrome de Down y en el Síndrome de Turner. Existe fuerte predisposición familiar. Se asocia a otros procesos autoinmunitarios como: - Insuficiencia suprarrenal. - Diabetes mellitus tipo l. - Ooforitis autoinmunitaria. Se ha encontrado asociación a dicha entidad con: - La presencia de antígenos leucocitarios HLA DR3, DR4, DR5. - Asociación con el haplotipo B8. Es una enfermedad Autoinmune con amplia relación etiopatogénica con la enfermedad de Graves, pero en la actualidad todavía no se ha podido determinar la manera de como actúan los diversos factores inmunológicos para producir el daño tiroideo. La determinación de TSH es el parámetro más sensible para el diagnóstico del hipotiroidismo. Su elevación es indicativa de que la función del tiroides es insuficiente. Este fenómeno se produce antes de que comiencen a descender en la sangre las concentraciones de hormonas tiroideas. Generalmente, en el hipotiroidismo establecido, además de la elevación de TSH, se produce un descenso de T4. El nivel de T3 con frecuencia se encuentra dentro de la normalidad. Así pues, cuando aparecen síntomas sugestivos, el médico solicitará una determinación de TSH que es el mejor método para descartar que exista hipotiroidismo. Puede acompañarse de una determinación de T4 y de Anticuerpos antitiroideos si se desea conocer si la causa se debe a fenómenos de Autoinmunidad. En los casos de hipotiroidismo secundario debido a disminución de la secreción de TSH por parte de la hipófisis, el diagnóstico se basa en confirmar concentraciones disminuidas de T4 y TSH en la sangre. Cuando la elevación de TSH se acompaña de niveles normales de T4 la condición es conocida con el nombre de hipotiroidismo subclínico. Si existe bocio puede ser conveniente realizar una ecografía tiroidea. Cuando existe sospecha de alteraciones en el desarrollo de la glándula o de deficiencia enzimática, puede ser útil obtener una gammagrafía tiroidea. Si se confirma un diagnóstico de hipotiroidismo de causa Autoinmune, es habitual evaluar la asociación de alteraciones en otras glándulas como las suprarrenales, paratiroides o gónadas. Es muy frecuente el hallazgo en un análisis de sangre de Anticuerpos antitiroideos (Ac. Antitiroperoxidasa, Antitiroglobulina, Antifracción Microsomal) y esta frecuencia aumenta con la edad. Pero su presencia no indica que la glándula tiroides está funcionando de menos, sólo advierten que hay una enfermedad subyacente que sí puede generar la alteración en la función de la glándula. 211 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico La presencia de Ac en sangre periférico es uno de los primeros datos que orientan hacia una supuesta patogenia Autoinmune de esta entidad: A. Los autoAc como marcadores de Autoinmunidad. AutoAg hacia los que va dirigida la reacción inmune. Se han identificado 3 tipos de autoAc: - Ac antiperoxidasa tiroides (anti-TPO) o antimicrosomiales. - Ac antitiroglobulina (anti-TG). - Ac relacionados con el receptor de TSH (anti-TSHR). Los Ac antitiroglobulina reaccionan frente a dicha molécula, que es el componente fundamental del coloide folicular. Los Ac antimicrosomiales reaccionan frente a un Ag microsomial que se identifica como la molécula de peroxidasa que es una enzima celular. Los Anticuerpos relacionados con el receptor de TSH (anti-TSHR), pueden ser estimuladores o TSA ("Thyroid Stimulating antibodies"), que coinciden con los clásicamente denominados LATS (Long Acting Thiroid Stimulator) o TSI ("Thyroid Stimulating Immnunoglobulins") características de la enfermedad de Graves-Basedow y ocasionales en la tiroiditis de Hashimoto, e inhibidores que ligan el receptor TBII ("Thyroid Binding Inhibitory Immunoglobulins"), más frecuentes en la tiroiditis Autoinmune. B. Morfología e infiltración linfocitaria tiroidea. Los linfocitos, células responsables de la respuesta inmunitaria, que responden con especificidad y memoria frente al estímulo antigénico, están integrados por dos grandes poblaciones, los LT responsables de la respuesta inmunitaria mediada por células, y los LB, que en respuesta al estímulo antigénico producen Ac. Los LB para poder producir Ac requieren la cooperación de los LT. Para la actuación linfocitaria en un foco determinado, los linfocitos deben inicialmente marginarse uniéndose a vénulas de endotelio alto y penetrar en el foco. En los centros germinales, estos acúmulos linfoides están formados por células B rodeadas de una corona de LT. Las células que protruyen entre las células epiteliales tiroideas, al contrario que los linfocitos que forman los folículos, son predominantemente CD8+ citotóxicos con menos porcentajes de CD4+, ambas activadas en un porcentaje elevado. La mayoría de los linfocitos infiltrantes son citolíticos. C. Las alteraciones del sistema inmune detectadas en sangre periférica son discordantes. Pruebas de función tiroidea: Se presentan como eutiroideo, hipotiroidismo subclínico, hipotiroidismo clínico transitorio o definitivo. Muy raramente la enfermedad puede manifestarse transitoriamente en forma de hipertiroidismo, situación denominada Hashitoxicosis. 212 - Presencia de Ac. - Antitiroglobulina. - Antimicrosomales. - TBI (antiTSH). AutoinmunidadHumana 19.2Anemiaperniciosa(AnemiapordéficitdevitaminaB12) La disminución de la absorción de vitamina B12 es el principal mecanismo fisiopatológico y puede deberse a varios factores. La anemia causada por deficiencia de vitamina B12 también suele denominarse anemia perniciosa. Clásicamente, el término anemia perniciosa expresa la deficiencia de B12 producida por pérdida de la secreción de factor intrínseco. La competencia por la vitamina B12 disponible y la escisión del factor intrínseco pueden ocurrir en el síndrome del asa ciega (debido al empleo bacteriano de B12) o en las infestaciones por cestodos. Las áreas de absorción ileal pueden faltar de forma congénita o destruirse por enteritis regional inflamatoria o resección quirúrgica. Causas menos frecuentes de disminución de la absorción de B12 incluyen la pancreatitis crónica, los síndromes de malabsorción, la administración de ciertos fármacos (p. ej., quelantes orales del calcio, ácido aminosalicílico, biguanidas), la ingestión inadecuada de B12 (generalmente en vegetarianos) y, en muy raras ocasiones, el aumento del metabolismo de la B12 en el hipertiroidismo de larga duración. Una causa muy habitual de deficiencia de B12 en la población anciana es la absorción inadecuada de B12 unida a alimentos en ausencia de cualquiera de los mecanismos anteriores; la vitamina B12 pura se absorbe, pero la liberación y la absorción de la B12 unida a alimentos son defectuosas. La enfermedad sistémica combinada hace referencia a los cambios degenerativos que se producen en el sistema nervioso. Los cambios degenerativos en la sustancia blanca cerebral y en los nervios periféricos afectan tanto a los axones como a las vainas de mielina y suelen preceder a las alteraciones de las columnas posteriores y los tractos corticoespinales. Las neuronas corticales también pueden degenerar, aunque las alteraciones neuronales son menores en comparación con las que se observan en los tractos mielinizados. En ocasiones se afectan los nervios ópticos. 19.2.1 Síntomasysignos La anemia generalmente se desarrolla de manera insidiosa y progresiva a medida que se agotan los depósitos hepáticos de B12. A menudo, es más intensa de lo que cabría esperar por los síntomas, porque su lenta evolución permite una adaptación fisiológica. En ocasiones se palpan esplenomegalia y hepatomegalia. Pueden estar presentes diversas manifestaciones GI, como anorexia, estreñimiento y diarrea intermitentes y dolor abdominal mal localizado. La glositis, descrita generalmente como una quemazón sobre la lengua, puede ser un síntoma temprano. Es frecuente una pérdida de peso considerable. Un signo raro es la FOD que responde con rapidez al tratamiento con B12. Puede haber afectación neurológica incluso en ausencia de anemia. Este hecho se comprueba sobre todo en pacientes mayores de 60 años. Los nervios periféricos son los que se afectan con mayor frecuencia, seguidos de la médula espinal. Los síntomas neurológicos preceden algunas veces a las alteraciones hematológicas (e incluso ocurren en su ausencia, en especial si se ha administrado ácido fólico). En las fases iniciales se detecta una pérdida periférica de la sensibilidad posicional y vibratoria en las extremidades, junto con debilidad leve o moderada y pérdida de reflejos. En fases posteriores aparecen espasticidad, signo de Babinski, mayor pérdida de la sensibilidad propioceptiva y vibratoria en las extremidades inferiores y ataxia. La sensibilidad táctil, algésica y térmica se alteran con menos frecuencia. Las extremidades superiores se afectan más tarde y con menos regularidad que las inferiores. Algunos pacientes también muestran irritabilidad y depresión moderada. Puede desarrollarse ceguera para los colores azul y amarillo. En los casos avanzados puede surgir paranoia 213 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico (demencia megaloblástica), delirio, confusión, ataxia espástica y, en ocasiones, hipotensión postural. 19.2.2Diagnósticoydatosdelaboratorio La enfermedad sistémica combinada debe diferenciarse de las lesiones medulares compresivas y de la esclerosis múltiple. El diagnóstico precoz es fundamental, ya que los defectos neurológicos se vuelven irreversibles cuando persisten durante meses o años. La anemia es macrocítica, con un VCM >100 fl. En la extensión se aprecia macroovalocitosis, anisocitosis y poiquilocitosis. Como es de esperar, la ADE es elevada. Es frecuente la aparición de cuerpos de Howell-Jolly (fragmentos residuales del núcleo). A menos que el paciente haya sido tratado, existe reticulocitopenia. La hipersegmentación de los granulocitos es uno de los primeros hallazgos; la neutropenia se desarrolla con posterioridad. Se observa trombocitopenia en aproximadamente la mitad de los casos graves, y las plaquetas a menudo tienen formas extrañas y tamaños desiguales. En la médula ósea se aprecian hiperplasia eritroide y cambios megaloblásticos. La bilirrubina indirecta sérica puede estar elevada como consecuencia de la eritropoyesis ineficaz y la supervivencia reducida de los hematíes defectuosos. La LDH sérica suele estar muy aumentada, lo que refleja la hematopoyesis ineficaz y el incremento de la hemólisis. La ferritina sérica está generalmente elevada (>300 ng/ml), lo cual concuerda con la existencia de hemólisis. El método empleado con mayor frecuencia para establecer el déficit de B12 como causa de la megaloblastosis es la determinación de la vitamina B12 sérica. Si bien pueden surgir valores falsos negativos, en general, niveles inferiores a 150 pg/ml (<110 pmol/l) indican, con fiabilidad, la existencia de déficit de B12. Habitualmente, la anemia o las alteraciones neurológicas son evidentes con niveles de B12 menores de 120 pg/ml (<90 pmol/l). En circunstancias limítrofes (150-250 pg/ml [110-180 pmol/l) y cuando la sospecha clínica sugiere la existencia de una deficiencia de B12, el análisis de B12 debe complementarse con otras pruebas. La deficiencia tisular de B12 ocasiona aciduria metilmalónica (y propiónica); en consecuencia, la medición del ácido metilmalónico en suero es una prueba muy sensible para detectar el déficit de B12. Este análisis se ha convertido en la prueba de elección para el diagnóstico en caso de sospechar posibles valores falsos negativos, sobre todo en los ancianos, de los que el 5-10% tienen valores séricos de B12 normales a pesar de los indicios de deficiencia tisular. Un análisis menos habitual consiste en la determinación del contenido de transcobalamina II-B12, que identifica un equilibrio negativo de B12 cuando la transcobalamina II-B12 es menor de 40 pg/ml (<30 pmol/l). Una vez confirmada la deficiencia de B12, debe identificarse el mecanismo fisiopatológico responsable. Pueden detectarse autoAnticuerpos contra las células parietales gástricas en el 80-90% de los pacientes con anemia perniciosa. Más importantes para el diagnóstico son los Anticuerpos contra el factor intrínseco, que pueden hallarse en el suero de la mayoría de los pacientes. La determinación de Anticuerpos antifactor intrínseco puede realizarse si el paciente no ha tomado B12 en los cinco días precedentes. La mayoría de los pacientes con anemia perniciosa presentan aclorhidria. Los análisis gástricos demuestran un pequeño volumen de secreciones gástricas (aquilia gástrica) con un pH >6,5; la aclorhidria se confirma si el pH se eleva a 6,8-7,2 tras la administración de histamina. El origen de la anemia perniciosa típica es la ausencia de secreción de factor 214 AutoinmunidadHumana intrínseco; éste debe determinarse en la secreción gástrica independientemente del pH, dado que puede existir una secreción discordante de ácido y de factor intrínseco. La prueba de Schilling mide la absorción de vitamina B12 radiactiva con factor intrínseco y sin él. Es muy útil para establecer el diagnóstico en pacientes que han sido tratados y están en remisión clínica, pero en los que existen dudas respecto a la validez del diagnóstico. La prueba se realiza mediante la administración v.o. de vitamina B12 marcada radiactivamente, seguida al cabo de 1-6 h de una dosis "de refuerzo" parenteral (1.000 mg) de B12 para evitar el depósito hepático de la B12 radiactiva; a continuación se determina el porcentaje de material radiactivo en la orina de 24 h (valor normal >9% de la dosis administrada). Una excreción urinaria reducida (<5% si la función renal es normal) indica una disminución de la absorción de vitamina B12. Esta prueba (Schilling I) puede repetirse (Schilling II) empleando cobalto radiactivo unido a factor intrínseco de origen porcino. La corrección de una excreción previamente reducida sugiere que la ausencia de factor intrínseco es el mecanismo fisiopatológico responsable de los valores bajos de vitamina B12. Finalmente, la incapacidad para corregir la excreción indica un mecanismo de malabsorción GI (p. ej., esprue). Puede practicarse una prueba de Schilling III tras la administración de un antibiótico oral durante 2 sem. Como la prueba produce repleción de vitamina B12, debe practicarse tras finalizar todos los estudios y ensayos terapéuticos. La prueba de Schilling no mide la absorción de B12 unida a los alimentos, por lo que no detecta los defectos de liberación de esta fracción de la vitamina en los pacientes ancianos. Debido al aumento de la incidencia de cáncer gástrico en los pacientes con anemia perniciosa, es aconsejable practicar radiografías GI en el momento del diagnóstico. Éstas también pueden descartar otras causas de anemia megaloblástica (p. ej., divertículos o asas ciegas intestinales o los patrones característicos del intestino delgado que aparecen en el esprue). Debe realizarse una vigilancia posterior cuando los hallazgos clínicos (p. ej., síntomas, prueba de sangre oculta en heces positiva) sugieren un cambio en el estado del estómago; el papel de la endoscopia o las radiografías periódicas no está completamente definido. 19.3Anemiapordéficitdeácidofólico Numerosos tejidos vegetales y animales contienen ácido fólico (ácido pteroilglutámico, folacina) como metil o formil poliglutamatos reducidos. En la forma tetrahidrato, los folatos actúan como coenzimas en procesos en los que existe transferencia de una unidad de carbono (p. ej., en la biosíntesis de nucleótidos purínicos y pirimidínicos), en conversiones de aminoácidos (p. ej., de histidina a ácido glutámico a través del ácido formiminoglutámico) y en la síntesis y utilización de formatos. La absorción se lleva a cabo en el duodeno y el yeyuno proximal. En las células epiteliales, los poliglutamatos de los alimentos se reducen hasta dihidrofolatos y tetrahidrofolatos. Se unen a proteínas y se transportan como metiltetrahidrofolato. Los valores séricos oscilan entre 4 y 21 ng/ml (9-48 nmol/l) y son un fiel reflejo de la ingestión dietética. El folato eritrocitario (valores normales, 225-640 ng/ml de sangre total [5101.450 nmol/l], corregido a un Hto del 45%) constituye un indicador más adecuado del estado tisular de folato. El folato total del organismo se aproxima a 70 mg, localizándose la tercera parte en el hígado. Alrededor del 20% del folato ingerido se excreta sin haberse absorbido, junto con 60-90 mg/d no reabsorbidos por la bilis. 215 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 19.4EnfermedaddeAddison La enfermedad de Addison (insuficiencia corticosuprarrenal) se produce cuando las glándulas surarrenales secretan cantidades insuficientes de corticosteroides. Presenta una destrucción anatómica de la glándula suprarrenal: Para que aparezca la Enfermedad de Addison debe destruirse más del 90% de las glándulas suprarrenales de forma bilateral. Mecanismo autoinmunitario: La mitad de los pacientes tienen Anticuerpos circulantes contra las glándulas suprarrenales, concretamente contra la P450. Entre las causas autoinmunitarias encontramos al Síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo II caracterizado por presentar dos o más manifestaciones endocrinas autoinmunitarias en una misma persona como: tiroiditis linfocitaria crónica, insuficiencia ovárica prematura, diabetes mellitus tipo I, hipotiroidismo o hipertiroidismo, anemia perniciosa, vitíligo, alopecia, y miastemia gravis por producción de autoAnticuerpos. Dentro de las familias se observan muchas generaciones que están afectadas por una o más de las enfermedades citadas. Se debe a un gen mutante situado en el cromosoma 6, y se asocia a los alelos B8 y DR3 del HLA. Suele manifestarse en la edad adulta. El Síndrome autoinmunitario poliglandular de tipo I se caracteriza por la combinación de insuficiencia paratiroidea y suprarrenal y moniliasis mucocutánea crónica. También puede aparecer anemia perniciosa, hepatitis crónica activa, alopecia, hipotiroidismo primario e insuficiecia gonadal prematura. Este síndrome se hereda de forma autosómica recesiva, y no está asociado al HLA. Al contrario que el síndrome tipo II, este síndrome aparece en la niñez. Se desconoce los mecanismos por los que interactúa la predisposición genética y la Autoinmunidad en estos procesos. Aunque la mayoría de los autoAnticuerpos suprarrenales producen destrucción de las glándulas, algunos ocasionan insuficiencia suprarrenal al provocar bloqueo de la unión de la ACTH a sus receptores por autoAnticuerpos. Otro proceso es la insuficiencia suprarrenal familiar autosómico recesivo que produce una falta de reactividad a la ACTH secundaria a mutaciones del receptor de la ACTH. 19.4.1Datosdelaboratorio Hiponatremia: Los niveles séricos bajos de sodio se debe a su pérdida por la orina por déficit de aldosterona y al desplazamiento del sodio hacia el compartimento intracelular. Esta pérdida de sodio extravascular reduce el volumen plasmático y acentúa la hipotensión. Hiperpotasemia: Aumento de los niveles séricod de potasio. Se debe a los efectos combinados del déficit de aldosterona, la reducción del filtrado glomerular y la acidosis. Hipocortisolemia: Los niveles de cortisol y aldosterona son bajos y no aumentan con la administración de ACTH. Hipercalcemia: Aumento de los niveles séricos de calcio. Ocurre en un 10-20% de los pacientes de causa desconocida. Hemograma: Puede haber anemia normocítica, linfocitosis relativa y eosinofilia moderada. Prueba de estimulación de ACTH: Es la prueba principal que nos confirma el diagnóstico de insuficiencia suprarrenal, al evaluar la capacidad de las suprarrenales para producir esteroides, que suelen estar ausentes o disminuídos tanto en sangre como en orina tras la estimulación de ACTH. 216 AutoinmunidadHumana Determinación de la ACTH: En la insuficiencia suprarrenal primaria o Enfermedad de Addison, la ACTH y sus péptidos afines, están elevados en plasma ante la pérdida del mecanismo de retroalimentación del eje hipotálamo-hipófisario-suprarrenal. 19.5DiabetestipoI La Diabetes Mellitus tipo I involucra la evolución de un fenómeno Autoinmune en cuya causa destacan factores genéticos y ambientales. La presentación clínica de la enfermedad se produce al final de un proceso de destrucción paulatino de las células beta del islote pancreático. Este episodio afecta la producción de insulina, lo que se traduce en la alteración del metabolismo de los hidratos de carbono caracterizado por la elevación de la glucosa sanguínea. Factores aún no identificados actúan como desencadenantes del daño a las células beta. En este sentido se ha postulado el papel de ciertos virus y toxinas, además de factores ambientales, los que en una persona genéticamente predispuesta inician la producción de mediadores de la respuesta inmune que inducen la expresión del Sistema Mayor de Histocompatibilidad D/DR, seguido de la presentación de autoantígenos de membrana que interaccionan con los macrófagos y linfocitos T autorreactivos. Se produce entonces, al interior del islote pancreático, una reacción de respuesta frente a agentes reconocidos como extraños, conocida como insulitis. Esta respuesta de Autoinmunidad se evidencia a través del hallazgo de una serie de autoAnticuerpos que se han utilizado como marcadores inmunológicos para identificación de sujetos en riesgo de desarrollar Diabetes Mellitus, para la clasificación de presentaciones atípicas de la enfermedad, así como en el seguimiento de estudios de inmunointervención. Los Anticuerpos más frecuentes presentes en diabéticos de diagnóstico reciente y sus parientes son: los Anticuerpos anticélulas de islote (ICA), los Anticuerpos anti descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), los Anticuerpos anti insulina (IAA), y los Anticuerpos anti proteína similar a tirosina fosfatasa (IA-2). Sin embargo, existe un grupo de pacientes que no presentan estos Anticuerpos y según la clasificacion de la Asociación Americana de Diabetes y la OMS caen dentro de la categoría de diabetes 1B o idiopática. De los Anticuerpos mencionados, los ICA han sido uno de los más estudiados y difundidos, estandarizándose su determinación y su unidad de medida. Estos marcadores corresponden a autoAnticuerpos del tipo Ig G dirigidos contra el citoplasma de la célula beta, su determinación se realiza mediante técnicas inmunohistoquímicas donde se utilizan cortes de tejido pancreático y Anticuerpos marcados con peroxidasa o fluorescencia. Su unidad de medida es la JDF, y corresponde al valor inverso de la última dilución positiva, los títulos de ICA sobre 20 JDF se correlacionan con un alto riesgo de desarrollo de diabetes mellitus tipo I. 19.6ArtritisReumatoide La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crónica que origina dolor, rigidez, hinchazón y pérdida de función en las articulaciones y puede tambien acompañarse de inflamación en otros órganos. Aunque la causa de la AR sigue siendo desconocida, se están produciendo importantes progresos en la investigación de los mecanismos inmunológicos inflamatorios, que conducen a la artritis y al daño articular. 217 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Positividad analítica de un Anticuerpo que se conoce como factor reumatoide, si bien el 25% de los pacientes con AR nunca desarrollarán este factor y, dicho Anticuerpo, puede aparecer en sujetos que no tienen AR. Se realizará una analítica de rutina con hemograma, bioquímica hepática y función renal y un sedimento de orina. Para valorar la actividad se determinará la VSG y la PCR y como pruebas inmunológicas el FR, los Anticuerpos anti-peptidos citrulinados y los ANA. Se solicitará serología de Hepatitis y la determinación de HLA DR1 y DR4. Estas determinaciones son útiles en el seguimiento de la enfermedad, la detección precoz de complicaciones y los efectos secundarios del tratamiento. La determinación de otras pruebas de laboratorio queda a criterio del médico que debe valorar en cada caso según antecedentes o comorbilidad asociada. En nuestro medio se recomienda la realización de la prueba de la tuberculina (Mantoux), con dos unidades de PPD, en caso de negatividad se repetirá en dos semanas (Booster), con dos unidades de PPD. En caso de tuberculosis latente (Mantoux positivo) se realizará tratamiento con isoniacida durante 9 meses (tratamientos biológicos) ó 6 meses (otros FAME o corticoides). Valores normales o Negativos: - Menor de 60 U/ ml (por nefelometría). - Título menor de 1:80 (método de aglutinación). En estos valores puede haber muy pequeñas diferencias por la técnica o por criterios de normalidad propios de laboratorios concretos, a veces en el rango de valores y otras veces por las unidades a las que se hace referencia. Valoración de los Resultados Anormales: - Mayor de 60 U/ ml - Título mayor de 1:80 (latex) Puede aparecer Positivo el Factor Reumatoide (FR) en: 218 - Artritis Reumatoide - Dermatomiositis - Escleroderma - Hepatitis crónica - Infección viral crónica - Mononucleosis infecciosa - Leucemia - Lupus Eritematoso Sistémico - Síndrome de Sjogren - Síndrome Nefrótico - Tuberculosis AutoinmunidadHumana 19.7LupusEritematosoSistémico El término "Lupus" proviene de la palabra latina que significa "Lobo"; "Eritematoso" quiere decir "Rojo". Se le aplicó este nombre porque se pensaba que la lesión de la piel semejaba la mordedura de un lobo. El Lupus Eritematoso Sistémico es una enfermedad de etiología desconocida que afecta a muchos órganos y sistemas y que se caracteriza por la presencia de múltiples autoAnticuerpos que participan en la lesión tisular mediada inmunológicamente. No hay órgano, aparato o sistema que se pueda considerar indemne a esta enfermedad y, cuando se realizan pruebas o estudios especiales, siempre se encuentra que sus manifestaciones subclínicas son mucho más frecuentes de lo esperado. La afectación del Sistema Nervioso en el LES puede traducirse por una amplia gama de manifestaciones, sin que los estudios anatomopatológicos hayan puesto de manifiesto una lesión cerebral capaz de explicar las anomalías neurológicas o una lesión patognomónica por LES. Por otra parte, el evento cerebrovascular (ECV) constituye una alteración neurológica frecuente, y es sin duda una de las complicaciones más graves del LES. Dentro de las manifestaciones neurológicas, la cefalea es la más frecuente. La patogenia de la cefalea en el LES se desconoce, aunque se han postulados varios mecanismos, principalmente la presencia de vasculitis y de Anticuerpos antifosfolípidos (AFL). El Lupus Sistémico Eritematoso es una enfermedad de etiología desconocida en la que autoAnticuerpos e inmunocomplejos patogénicos ocasionan la destrucción de células y tejidos. La etiología del lupus sistémico eritematoso es desconocida. Aunque esta enfermedad puede ocurrir a todas las edades, es más frecuente entre las mujeres jóvenes. Se estima la prevalencia de esta enfermedad en 20 a 80 casos por cada 100.000 habitantes/año. Los autoAnticuerpos producidos ocasionan la formación de inmunocomplejos que, al acumularse en tejidos y órganos conducen a las lesiones sintomáticas más o menos extensas. Los órganos más afectados por estos depósitos son los glomérulos, la piel, los pulmones, el líquido sinovial y otros muchos otros sitios. La respuesta inmunológica anormal incluye una hiperactividad de los linfocitos T y B y una regulación inadecuada de dicha hiperactividad. 19.7.1ModelodepatogénesisdelLupusSistémicoEritematoso El modelo de patogénesis del Lupus Sistémico Eritematoso se produce en en cuatro fases: 1. La primera fase sería la fase de susceptibilidad en la que se encontrarían implicados algunos genes que producirían una predisposición a la enfermedad: en efecto, la predisposición al lupus es 10 veces mayor entre gemelos homocigóticos que entre gemelos heterocigóticos, lo que indicaría la intervención de al menos 4 genes, entre ellos el que regula la producción de los complejos mayores de histocompatibilidad. 2. La segunda fase o fase de inducción implica la aparición de células T autoreactivas que muestran una pérdida de autotolerancia. Durante esta fase, en la que intervienen diferentes mecanismos (fallo del timo, expresión aberrante del antígeno HLA-DR, aparición de péptidos crípticos durante la apoptosis), juegan una gran importancia la radiación UV y otros factores ambientales. 219 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 3. En la tercera fase o fase de expansión, se observa un aumento progresivo de la respuesta autoimnune, siendo detectables serológicamente una serie de Anticuerpos producidos por los linfocitos B hiperreactivos, Anticuerpos que se dirigen preferencialmente contra el nucleosoma (Anticuerpos antiDNA y anti-histona), el espliceosoma (Anticuerpos anti-Sm y anti-RMP) y las moléculas Ro y La (Anticuerpos anti-Ro y anti-La). 4. La última fase, la más importante desde el punto de vista clínico, es la debida los efectos patogénicos de los complejos de los autoAnticuerpos con sus antígenos, que se acumulan en los tejidos ocasionando lesiones debidas a la muerte de algunas células, la activación de otras, la opsonización y el bloqueo de funciones de las células diana. No se conoce la etiología del lupus sistémico eritematoso, habiéndose considerado factores genéticos, la exposición a la luz UV, el tabaco y algunos fármacos. También se ha especulado sobre la influencia de algunos virus, en particular los virus de la rubeóla y citomegalovirus. El lupus eritematoso sistémico (LES) es un padecimiento Autoinmune crónico con componente inflamatorio muy importante, que cursa con periodos de remisiones y exacerbaciones, que causa daño tisular mediado por mecanismos inmunológicos en diferentes órganos, aparatos y sistemas. La expresión clínica de este padecimiento es muy variable y proteiforme como resultado del compromiso sistémico y posiblemente de una serie de factores relacionados entre sí: genéticos, inmunológicos y ambientales. LES es más frecuente de lo que se cree. Reconocerlo, diagnosticarlo e iniciar la terapéutica a la medida del paciente son avances de gran valor que ofrecen seguridad profesional al médico y beneficios indudables al paciente. Aunque la mortalidad en el pasado era significativa en pacientes con complicaciones vitales, hoy en día el pronóstico se ha modificado sustancialmente debido a las mejoras en las técnicas de laboratorio, avances en modalidades terapéuticas, control adecuado de los pacientes y mejor conocimiento del Lupus. En general, aún en aquellos pacientes con complicaciones serias, el pronóstico es favorable. En la mayoría de los casos el Lupus tiene un curso benigno caracterizado por exacerbaciones con fatiga, fiebre baja crónica ondulante, y a veces dolor e hinchazón en las articulaciones o erupciones cutáneas. La mayoría de los pacientes lleva una vida normal, pero en ocasiones raras, algunos desarrollan serias complicaciones. El Lupus no es igual en todos los pacientes y los síntomas suelen ser diferentes; en general existen tres clases de Lupus: discoide (LD), sistémico (LES) y el ocasionado o inducido por medicamentos (LIM). El Lupus Discoide es limitado a la piel, principalmente de la cara, oídos, cuello y cuero cabelludo. Casi nunca compromete órganos internos y los exámenes de laboratorio, como los Anticuerpos antinucleares, por lo general son negativos. Luego de varios años, aproximadamente en 10% de los pacientes se desencadenan síntomas sistémicos (diseminación). Infortunadamente no existe manera de evitar esta complicación. Generalmente el Lupus Eritematoso Sistémico (LES) es más severo que el Discoide y puede afectar cualquier órgano del cuerpo aun en forma diferente en los distintos 220 AutoinmunidadHumana pacientes. No es frecuente encontrar dos individuos lúpicos con los mismos síntomas. El Lupus Eritematoso Sistémico cursa con períodos de pocos o ningún síntoma (remisión) y con épocas de gran actividad (exacerbación). En algunos casos, y de manera impredecible, la enfermedad puede desaparecer en forma espontánea. El Lupus inducido u ocasionado por medicamentos ocurre luego del uso, por lo general prolongado, de algunos fármacos. Por lo general los síntomas son menos severos y casi siempre desaparecen al suspender el medicamento responsable. En consecuencia, en todo paciente con diagnóstico de Lupus Eritematoso, se deben investigar los medicamentos que por alguna razón esté recibiendo. 19.7.2Anormalidadesinmunológicas El LEG es primariamente una enfermedad con anormalidades en la regulación inmune. Estas anormalidades son secundarias a una pérdida de la tolerancia a lo propio, de modo que los pacientes afectados desarrollan una respuesta Autoinmune (contra antígenos propios). Las siguientes son algunas de las anormalidades inmunes descritas en el LEG, aunque no se conoce exactamente si están relacionadas a la patogenia del LEG y en que forma: - Disminución de las células T citotóxicas y células T supresoras (que normalmente inhiben la respuesta inmune). - Aumento de las células T helper o CD4+. - Activación policlonal de células B en etapas precoces de la enfermedad. - Defecto en la tolerancia de las células B relacionado a defectos en la apoptosis y/o deficiencia de complemento lo que conduce a una vida prolongada de células B. - Defecto en las señales celulares de las células inmunes, expresado por una respuesta aumentada frente al calcio, hiperfosforilación de proteínas citosólicas y factor nuclear kb (NFkb) disminuido. - Aumento en la producción de citokinas Th2. En más del 98% de los pacientes con LES existe una prueba de ANA positiva (por lo general con títulos altos) y esto obliga a realizar otras determinaciones más específicas para detectar Anticuerpos anti-ADN de cadena doble (mediante ELISA o con el método del portaobjetos con crithidia, una prueba menos sensible pero más específica). Cuando existen titulos elevados de Anticuerpos anti-ADN de cadena doble, son muy específicos de LES. * LEG (lupus eritomatoso generalizado) Anticuerpo Manifestación Clínica Anticuerpo Antinuclear: Muy sensible para LEG, en 95% o más de los casos. Poco específico, (+) en otras enfermedades: otras ETC, procesos inflamatorios crónicos, tumores y envejecimiento. AntiDNA de doble hebra: Específico para LEG. (+) en 50% a 75% de los casos. Títulos altos correlacionan con actividad del LEG y sugieren riesgo de nefritis. AntiDNA de una hebra: No es sensible ni específico y ocurre en muchas enfermedades 221 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Anticuerpo Manifestación Clínica Anti-Ro: (+) En LEG y en Sjögren. Frecuente en LEG con AAN (-). Puede causar lupus neonatal, y tiene riesgo de bloqueo cardíaco congénito. Frecuente en el lupus cutáneo subagudo. Anti-Sm: Específico para LEG. Los títulos no varían con la actividad del LEG. Antiribonucleoproteína (RNP) En muchas ETC, en síndromes de sobreposición y en la Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo. Los enfermos con LEG con solo este Anticuerpo no desarrollan nefritis grave ni alteración del SNC. Anticardiolipina (+) En alrededor de 30 % a 50% de los casos con LEG y en otras ETC y en algunos sanos. Se asocia con trombosis y pérdida fetal recurrente. Anticoagulante lúpico Dirigido contra fosfolípidos de la cascada de coagulación. Se asocia con trombosis y pérdida fetal recurrente. Antihistona: Se asocia con Lupus inducido por drogas, también común en el lupus espontáneo. Anti proteína P ribosomal: Se ha asociado con Psicosis lúpica Otros ANA y Anticuerpos anticitoplásmicos (p. ej., Ro [SSA], La [SSB], Sm, RNP, Jo1) son de ayuda en el diagnóstico del LES y de otras enfermedades del tejido conjuntivo. Debido a que el Ro es fundamentalmente citoplásmico, en ocasiones se pueden detectar Anticuerpos anti-Ro en pacientes con LES ANA negativos que presentan un lupus cutáneo crónico. El anti-Ro es el Anticuerpo causal del lupus neonatal y del bloqueo cardíaco congénito. El anti-Sm es muy específico del lupus, pero, al igual que ocurre con el antiADN de cadena doble, no es muy sensible. En el 5-10% de los pacientes con LES se producen resultados positivos falsos en las pruebas serológicas de la sífilis. Pueden asociarse con una prueba positiva para el anticoagulante del lupus o con una prolongación del tiempo de tromboplastina parcial. Los valores anormales en una o más de estas determinaciones indican la presencia de Anticuerpos antifosfolípidos (p. ej., Anticuerpos anticardiolipina), que se asocian con trombosis arterial o venosa, aborto espontáneo, pérdida fetal tardía y trombocitopenia. Los Anticuerpos anticardiolipina se pueden detectar mediante ELISA. Los niveles de complemento sérico suelen estar disminuidos en la fase activa y son muy bajos en los pacientes con nefritis activa. La VSG está elevada de manera casi uniforme durante la fase activa del trastorno. Los niveles de proteína C reactiva son sorprendentemente bajos en el LES, incluso con una VSG >100 mm/h. La leucopenia es la norma, sobre todo con linfopenia en el LES activo. Puede existir una anemia hemolítica. La trombocitopenia Autoinmune puede ser grave y producir compromiso vital. La presencia de LES es indistinguible en ocasiones de la púrpura trombocitopénica idiopática. La afectación renal puede ser evidente en cualquier fase, incluso aunque no existan otras manifestaciones del LES. Un título elevado de Anticuerpos anti-ADN o una elevación del mismo puede predecir el riesgo de nefritis en el lupus. No suele ser necesaria la biopsia renal para el diagnóstico, pero puede ayudar a evaluar el estado de la afectación renal (p. ej., inflamación activa frente a fibrosis postinflamatoria) y puede determinar la conducta terapéutica. Los análisis de orina pueden permanecer sin alteraciones a pesar de 222 AutoinmunidadHumana la comprobación de afectación renal temprana por la biopsia. Por esta razón, se deben realizar a intervalos regulares durante el seguimiento del paciente en remisión aparente. La presencia de hematíes y de cilindros granulares sugiere una nefritis más activa. En reumatología distinguimos dos grupos de pruebas de laboratorio: Iniciales o generales, que son útiles para descubrir y seguir la evolución de padecimientos sistémicos inflamatorios. Especiales, cuya positividad puede tener valor para reconocer una enfermedad determinada. Los estudios generales incluyen la biometría hemática completa, química sanguínea, examen general de orina, velocidad de sedimentación globular, proteína C reactiva y factor reumatoide. 19.7.3BiometríaHemática 19.7.3.1Fórmularoja: El dato más común es la presencia de anemia, la cual en términos generales es normocítica normocrómica. Esta en general nos traduce actividad inflamatoria y es frecuente su presencia en enfermedades crónicas sistémicas como la artritis reumatoide (AR), el lupus eritematoso sistémico (LES), las vasculitis, las espondiloartropatías, etc. También puede ser consecuencia del efecto secundario de medicamentos (p.ej. uso de antiinflamatorios no esteroideos y hemorragia del tubo digestivo) o bien como consecuencia de factores solubles o Anticuerpos (p.ej. anemia hemolítica Autoinmune en LES). La poliglobulia es poco frecuente en el paciente reumático y puede estar presente como consecuencia de afección pulmonar en pacientes con padecimientos inflamatorios sistémicos, pudiendo resultar muy orientadora en el caso de la osteoartropatía hipertrófica. 19.7.3.2Fórmulablanca: La presencia de leucocitosis puede ser de ayuda en el reconocimiento de padecimientos inflamatorios agudos como en el caso del ataque agudo de gota, la artritis séptica, la fiebre reumática y algunas vasculitis por citar algunos ejemplos; además puede orientarnos en la posibilidad de infección en padecimientos inflamatorios sistémicos con o sin tratamiento con esteroides y/o inmunosupresores. La leucopenia puede ser el resultado de actividad de algunos padecimientos Autoinmunes condicionada por factores solubles o Anticuerpos como ocurre en el LES o el síndrome de Felty. También puede ser secundaria al efecto de algunos medicamentos. Podemos encontrar en la diferencial alteraciones como la presencia de neutropenia (LES, S. Felty), linfopenia (LES), linfocitosis (actividad inflamatoria), neutrofilia (actividad inflamatoria, procesos infecciosos), eosinofilia (algunas vasculitis, fascitis eosinofílica). Plaquetas: En general la presencia de trombocitosis es un dato que nos orienta a actividad inflamatoria y esta la podemos encontrar en padecimientos como la AR, la artritis reumatoide juvenil (ARJ), las espondiloartropatías, etc. La trombocitopenia es el resultado de la presencia de factores solubles o Anticuerpos como ocurre en el LES, síndrome antifosfolípido (SAF), etc., o bien como resultado de efecto tóxico de medicamentos como inductores de remisión para AR o inmunosupresores. 223 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 19.7.3.3QuímicaSanguínea Esta nos proporciona información para la detección y seguimiento de enfermedades metabólicas, compromiso hepático y renal condicionado por enfermedades reumáticas sistémicas como pueden ser AR, LES, vasculitis, etc. Asimismo, es importante para detectar efectos secundarios por la terapéutica empleada. El ácido úrico debe ser solicitado ante la sospecha clínica de gota. Es conveniente recordar que la hiperuricemia no es diagnóstica de la enfermedad, que puede ser producida por otras patologías y que incluso puede ser asintomática. Las enzimas musculares que incluyen transaminasas, creatincinasa, aldolasa y deshidrogenasa láctica deberán solicitarse en caso de sospecharse miopatía inflamatoria. 19.7.3.4ExamenGeneraldeOrina Es de utilidad en la valoración de problemas urinarios y renales, los cuales pueden estar relacionados con enfermedades reumáticas sistémicas como las ya mencionadas o también con efectos secundarios de la terapéutica empleada. 19.7.3.5VelocidaddeSedimentaciónGlobular(VSG) Es la medición de la proporción de eritrocitos sedimentados en sangre anticoagulada bajo condiciones estándares. Es una prueba de laboratorio no específica indicadora de proceso inflamatorio o infección. Puede tener variaciones de acuerdo al volumen del paquete globular, por lo que debe ser solicitada con una fórmula roja para su debida interpretación. Es de utilidad para el seguimiento de procesos inflamatorios crónicos como la AR y algunas vasculitis como la polimialgia reumática/arteritis de células gigantes y enfermedad de Takayasu. Se encuentra elevada durante el embarazo y en ocasiones hasta el tercer mes del puerperio. Por su simplicidad técnica y su valor interpretativo no superado por técnicas más costosas y sofisticadas es el reactante de fase aguda de elección para la valoración de actividad de enfermedades reumáticas. 19.7.3.6ProteínaCReactiva(PCR) Es como la VSG un reactante de fase aguda, inespecífico (no sólo ocurre en fiebre reumática), que es utilizado en el seguimiento de procesos infecciosos y enfermedades inflamatorias. Sus concentraciones son mínimas en sujetos normales; pero en respuesta a infecciones bacterianas, trauma, necrosis tisular e inflamación, sus concentraciones pueden elevarse de 100 a 1000 veces en menos de 24 horas; pasado este lapso la VSG es complementaria de este estudio. Puede permanecer elevada indefinidamente en procesos inflamatorios crónicos. Sin embargo, en enfermedades como el LES sus concentraciones son normales, cuando se elevan tienen 39% de sensibilidad y 93% de especificidad para diagnosticar infección agregada en ausencia de serositis. 19.7.3.7FactorReumatoide(FR) Son autoAnticuerpos de los isotipos IgM, IgA e IgG que reaccionan con el fragmento Fc de una IgG. Pueden ser determinados por fijación de látex, Waaler Rose (eritrocitos de carnero) y nefelometría. El 5% de la población normal puede tener positividad para la prueba. Se encuentra en el 50-90% de pacientes con AR; sus concentraciones son más altas en enfermedad activa y correlaciona inversamente con la capacidad funcional. Puede encontrase también en el síndrome de Sjögren (SS), enfermedad mixta del tejido conjuntivo (EMTC), nefropatía por IgA, crioglobulinemias, LES, esclerosis sistémica 224 AutoinmunidadHumana progresiva (ESP), polidermatomiositis, así como en otros padecimientos inflamatorios no reumáticos (hepatitis, endocarditis, etc.) Su positividad no establece el diagnóstico y su negatividad no lo descarta; la interpretación por consiguiente depende de la información clínica. 19.7.3.8EstudiosEspeciales Anticuerpos antinucleares (AAN) Son encontrados en una gran variedad de enfermedades Autoinmunes; su frecuencia incrementa con la edad en personas aparentemente sanas. Pueden ser determinados por diferentes métodos aunque de preferencia debe utilizarse la técnica de inmunofluorescencia para su detección. Se han considerado la piedra angular para la evaluación y diagnóstico del LES, con una sensibilidad del 99% y especificidad del 49%. Pueden estar presentes en otras enfermedades reumáticas como ESP, SS, AR, EMTC, polidermatomiositis, en padecimientos infecciosos como la endocarditis bacteriana y la lepra, en enfermedades hepáticas como la hepatitis crónica Autoinmune y la cirrosis biliar primaria y pueden ser inducidos también por medicamentos. Anti DNA/ Anti Sm Son de utilidad en el diagnóstico de LES. Los Anticuerpos contra DNA de doble cadena básicamente se encuentran en pacientes con LES y sus concentraciones elevadas además de ser útiles en el diagnóstico tienen valor predictivo en recaídas de la enfermedad. El Anticuerpo contra Sm tiene una baja sensibilidad pero alta especificidad para establecer el diagnóstico de LES. Sus títulos no varían con la actividad del padecimiento. Antiribonucleoproteína (RNP) Forman parte de los antígenos extractables del núcleo (ENA). Son dirigidos contra ribonucleoproteínas. Son de utilidad en el diagnóstico de la EMTC en la cual pueden estar presentes a concentraciones elevadas. Pueden estar presentes en LES, SS, ESP y polidermatomiositis. Anti p-anca/anti c-anca Los Anticuerpos anticitoplasmaticos del neutrófilo son determinados por inmunofluorescencia y muestran 3 patrones: citoplasmático (C-ANCA), perinuclear (PANCA), y atípico (X-ANCA). Pueden ser de utilidad en el diagnóstico y evolución del la granulomatosis de Wegener y la poliarteritis microscópica, sindrome de Churg- Strauss, vasculitis sistémica y glomerulonefritis ideopática. El patrón atípico se ha encontrado en enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, colangitis esclerosante, LES, hepatitis Autoinmune y lepra. Anticuerpos anti-cardiolipina. Son autoAnticuerpos de los subtipos IgG, IgM e IgA. Es el procedimiento estándar para la detección de Anticuerpos antifosfolípido en pacientes con sospecha de síndrome de antifosfolípido primario o secundario. Cuantificación de C3, C4 y CH50. Una disminución en los valores de estas pruebas puede ser predictivo de recaída en LES; son útiles en el seguimiento de actividad, con mejor correlación a nivel renal. 225 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Anti Ro (ss-a)/ anti La (SS-B) El primero se asocia a la presencia de SS, lupus cutáneo subagudo, lupus neonatal; el segundo con SS tanto primario como secundario, LES y lupus cutáneo, se encuentra presente en niños con bloqueo cardiaco. Los estudios inmunológicos y genéticos, deben ser muy bien pensados. Con frecuencia se cae en la situación conflictiva de tener mucha información pero su interpretación resulta difícil o incierta, dependiendo sobre todo de la experiencia en el manejo de este tipo de información. Resulta común incurrir en gastos mayores e innecesarios. Depuración de creatinina y albúmina en orina de 24 horas Exámenes de utilidad para valorar la función renal y dar seguimiento a la respuesta terapéutica en pacientes con enfermedad reumática sistémica con afección renal. Existe correlación negativa entre las dos pruebas (depuración baja-albuminuria elevada, depuración incrementada-albuminuria negativa). Complejo principal de histocompatibilidad (hla) Su determinación no es diagnóstica de ningún padecimiento reumático. Es de utilidad para establecer asociaciones desde el punto de vista genético como factor predisponente para el desarrollo de enfermedades (v. gr. HLA B 27 y espondilitis anquilosante). Crioglobulinas y viscosidad sérica Las crioglobulinas son de 3 tipos, actúan como complejos inmunes circulantes y producen vasculitis sistémica; precipitan con el frío. La crioglobulinemia puede ser esencial o asociada a LES, poliarteritis nodosa, el SS y otros trastornos Autoinmunes, infecciosos y linfoproliferativos. La viscosidad sérica es útil para el seguimiento de inflamación crónica, particularmente para detectar y dar seguimiento a síndromes de hiperviscosidad en mieloma múltiple, macroglobulinemia y enfermedades Autoinmunes. Existen otra gran variedad de exámenes como la determinación de otros tipos de autoAnticuerpos, electroforesis de proteínas. Cuantificación de Inmunoglobulina, etc. que pueden ser de utilidad pero cuya realización es limitada a pocos laboratorios a costos elevados y su indicación debe ser precisa y justificada. Punción articular Su indicación más frecuente es para diferenciar artropatías inflamatorias de las que no lo son. Es una urgencia en el caso de sospechar artritis infecciosa. Puede ser diagnóstica y terapéutica. En términos generales si el examinador piensa que está indicada, probablemente es cierto. Debe ser realizada por un médico familiarizado con el procedimiento. La realización del procedimiento incluirá siempre registro del volumen y aspecto macroscópico, estudio citológico y químico, tinción de Gram y cultivo, búsqueda de cristales. Tradicionalmente el líquido sinovial se ha clasificado en 3 o más grupos dependiendo de su aspecto macroscópico, cuenta total y diferencial de leucocitos, contenido de proteínas y glucosa, coágulo de mucina, viscosidad, etc. Estos grupos se han denominado "normal", "no inflamatorio", "inflamatorio", "séptico" y "hemorrágico". Estas clasificaciones son de poca utilidad ya que su valor diagnóstico es limitado debido a que los líquidos de una enfermedad pueden caer en cualquier grupo. El mensaje correcto de estas clasificaciones es diferenciar a la artritis inflamatoria de la artropatía no inflamatoria, 226 AutoinmunidadHumana intentar la identificación de la causa de la inflamación y vigilar más en atención a una artritis infecciosa cuando la cuenta de leucocitos es alta o el líquido tiene aspecto purulento. La punción articular y el estudio detallado del líquido puede proporcionar información con valor diagnóstico definitivo. 19.8Dermatomiositis La dermatomiosítis está encuadrada como subgrupo de las llamadas miopatías inflamatorias idiopáticas. Las miopatías inflamatorias idiopáticas comprenden varios subgrupos heterogéneos, caracterizados por ser adquiridos y no hereditarios, de causa no conocida y con indicios de mecanismos patogenéticos Autoinmunes, de naturaleza inflamatoria con afectación muscular más o menos focal en base a los estudios biópsicos y con incrementos de la creatin-kinasa (CK) Las miosítis inflamatorias idiopáticas incluyen: Dermatomiosítis Polimiosítis Miosítis con cuerpos de inclusión Enfermedades “Autoinmunes” asociadas a miosítis (Lupus sistémico. Esclerodermia. Enfermedad mixta del colágeno. Sjögren. Poliarterítis nodosa. Artritis reumatoide. Síndrome de Behçet. Sarcoidosis.) Miosítis, fasciítis eosinofílicas. Miosítis focales. Diagnóstico algunos datos de laboratorio, tanto para apoyar el diagnóstico como para descartar enfermedades similares. La CK suele estar aumentada, pero su normalidad no excluye el diagnóstico, ya que en fases de cierta inactividad o en fases avanzadas de la enfermedad puede estar dentro de los límites de referencia. El seguimiento de la CK es de ayuda para ver la evolución y la respuesta terapéutica. Lo mismo puede decirse pero con menos sensibilidad de la aldolasa y de la transaminasa SGOT. La VSG y la PCR pueden estar moderadamente elevadas. No suele haber leucocitosis ó desviación a la izquierda de los polinucleares. También son frecuentes aumentos globales de la gamma globulina. Los Anticuerpos antinucleoproteína pueden ser positivos. Si son positivos los Anticuerpos anti-ADN es más lógico inclinarse inicialmente por el diagnóstico de lupus sistémico y pensar en miopatía asociada al mismo. También se ha descrito una incidencia elevada de Anticuerpos Jo-1 de significación indeterminada. Es deseable una prospección limitada, que complemente la clínica, en busca de alteraciones biológicas que permitan descartar las neoplasias más frecuentes. 19.9SíndromedeSjögren El sindrome de Sjögren (SS) es una enfermedad Autoinmune, crónica, inflamatoria que se caracteriza por infiltración de las glándulas exocrinas por linfocitos y células plasmáticas. Los síntomas clínicos principales y las complicaciones están relacionados con la destrucción de las glándulas y la sequedad de las mucosas. Los síntomas típicos son la keratoconjuntivitis sicca por disminución de la secreción lacrimal, la xerostomía por 227 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico disminución de la secreción de saliva y la sequedad vaginal. Aunque son esos los síntomas predominantes se puede afectar todo el sistema de glándulas exocrinas. La enfermedad puede ser órgano específico comprometiendo sólo al sistema exocrino o una enfermedad sistémica comprometiendo por infiltración linfoide a los pulmones, riñones, vasos sangíneos, músculos o transformarse en una enfermedad proliferativa de las células B. El SS se divide en SS Primario o no asociado con la presencia de otra enfermedad inmunológica y en SS Secundario que se asocia con la presencia de enfermedades Autoinmunes como la artritis reumatoídea (AR), lupus, esclerodermia, miositis, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica, crioglobulinemia, vasculitis y tiroiditis. Patogénesis: Al igual que en la mayoría de las enfermedades del tejido conectivo se involucra la tríada de Autoinmunidad, susceptibilidad genética y desencadenante ambiental. En este sentido es interesante que los individuos HIV (+) presenten algunas manifestaciones de SS pero sin tener autoAnticuerpos. Los hallazgos inmunológicos del SS en sangre y en el tejido se muestran a continuación: Sangre periférica Glándulas salivales Hipergamaglobulinemia policlonal Linfocitos T de ayuda Múltiples autoAnticuerpos Células B activadas Inmunoglobulina policlonales Células epiteliales HLA-DR + Déficit de la producción de IL-2 Subgrupo monoclonal de células B Diminucion de la función de las células natural killer Ausencia de células natural kille La presencia de autoAnticuerpos es frecuente en el SS. La frecuencia con que se presentan se muestra en la tabla de alteraciones de laboratorio en el SS primario: Alteraciones de Laboratorio en SS primario Porcentaje Anticuerpos antinucleares (+) en células HEp-2 90 Factor reumatoídeo (+) por aglutinación de látex 60 Crioglobulinemia 30 Proteína C reactiva elevada 5 Anemia (hematocrito < 30%) Leucopenia (<3.500 cel/mm3) 10 Trombocitopenia (<10.000/mm3) 228 VHS elevada (> 25 mm/h) 60 anti-Ro (SSA) 55 anti-La (SSB) 40 AutoinmunidadHumana Las crioglobulinas circulantes en el SS consisten en factor reumatoídeo monoclonal e Inmunoglobulina policlonales de isotipo IgA o IgG, precipitan en frío, se presentan en pacientes con enfermedad sistémica y autoAnticuerpos más disminución del complemento. 19.10SíndromedeReiter Las artropatías reactivas y el síndrome de Reiter son dos términos que son usados más o menos en forma intercambiable. Se trata de una enfermedad encuadrada dentro de las artritis reactivas, que, a su vez, se clasifican dentro de las espondiloartropatías. Hoy en día, no obstante, el término síndrome de Reiter ha caído en desuso, siendo más correcto referirse a ella simplemente como artritis reactiva. El síndrome de Reiter define una triada, o más características, mientras que la artritis reactiva es más un proceso inflamatorio relacionado con infección; en teoría la artropatía reactiva puede ser definida como una artropatía inflamatoria distante en tiempo y en lugar de la infección original que la dispara lo cual usualmente esta en el tracto genito-urinario o a nivel intestinal, más recientemente se ha sospechado que organismos respiratorios también pueden precipitar la enfermedad y ya es aceptado que aún la articulación sinovial no está libre de este insulto bacteriano. Ya hay evidencia que fragmentos de organismos y determinantes antigénicos se encuentran en la cavidad sinovial o en los tejidos sinoviales. La importancia de este fenómeno y la relación a una terapia potencial con antibiótico no permanece claro, pero si permanece el interés. La relación estrecha entre estos disparadores infecciosos específicos como Shigella, Salmonella y otros organismos y el fondo genético específico junto con una historia claramente definida aguda o crónica, lleva a decir que son pocas las áreas de la medicina donde se unen estos tres aspectos en forma muy precisa. La artritis reactiva (ARe) incluyendo el síndrome de Reiter varía con la prevalencia del B27 y las infecciones bacterianas que la disparan; ocurre del 1 al 4% de los individuos siguiendo una infección urogenital por Chlamidia o una enteritis debido a bacterias gramnegativas. Informes recientes indican, que la incidencia de artritis reactiva después de una enteritis por salmonella es casi del 7% y mientras el episodio inicial de artritis es relativamente débil asociado con HLA B27 lo más probable es que llegue a ser crónica y se demuestre una uveitis anterior aguda y otras características extra-articulares. Respecto a datos de laboratorio, durante las fases inflamatorias se encuentran elevados la velocidad de sedimentación globular y los reactantes de fase aguda en el análisis de sangre. En algunos casos puede existir anemia. Cuando se inicia la afectación articular, de la infección desencadenante sólo quedan como dato identificador (y no en todos los casos) los hallazgos de las pruebas serológicas (existencia de determinados Anticuerpos). Si se analiza el líquido sinovial de las articulaciones afectas, éste muestra alteraciones inflamatorias inespecíficas. En el 60-80% de los casos se da para el HLA B27. 229 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 19.11SíndromedeGoodpasture El síndrome de Goodpasture (SGP) se caracteriza por la asociación de glomerulonefritis rápidamente progresiva (GNRP) con hemorragia pulmonar (HP) y Anticuerpos contra la membrana basal glomerular (MBG) y alveolar. Hay positividad lineal especialmente para IgG, después, también para C3. Dos tercios de las glomerulonefritis crecénticas de este tipo corresponden al síndrome de Goodpasture y el otro tercio carece de manifestaciones pulmonares (síndrome de Goodpasture sin compromiso pulmonar). La lesión glomerular es similar en ambos grupos y se produce por un mecanismo inmunológico anti-membrana basal glomerular. Se desencadena por un defecto de un componente proteico de la cadena a-3 del colágeno IV. Este componente, desenmascarado por diversas causas de su condición oculta, permite que se formen Anticuerpos contra la membrana basal glomerular. - Proteinuria, hematuria (severa) - Anticuerpos antinucleares (ANAS), Anticuerpos anti DNA. - Hematuria severa, Anticuerpo citoplasmáticos, antineutrófilos (ANCAS) - Anticuerpo antimembrana basal glomerular. 19.12SíndromedeGuillain‐Barré El Síndrome de Guillain-Barré es un trastorno en el que el sistema inmunológico del cuerpo ataca a parte del sistema nervioso periférico. Los primeros síntomas de esta enfermedad incluyen distintos grados de debilidad o sensaciones de cosquilleo en las piernas. En muchos casos, la debilidad y las sensaciones anormales se propagan a los brazos y al torso. Estos síntomas pueden aumentar en intensidad hasta que los músculos no pueden utilizarse en absoluto y el paciente queda casi totalmente paralizado. En estos casos, el trastorno pone en peligro la vida potencialmente interfiriendo con la respiración y, a veces, con la presión sanguínea y el ritmo cardíaco y se le considera una emergencia médica. Característicamente se ha demostrado una inflamación linfocitaria multifocalde extensión variable asociada con desmielinización.La degeneración axonal puede ocurrir como un fenómeno secundario.Se han encontrado niveles séricos elevados de IL-6, IL-2, TNF-alfa y lapresencia de Anticuerpos antigangliosidos (GM1). - Se reconoce un antígeno b. - Se activan linfocitos T que cruzan la barrera hemato neural. Esto es mediado por quimioquinas, moléculas de adhesión celular y metaloproteinasasc.- Dentro del sistema nervioso periférico los linfocitos T activan macrófagos que aumentan la producción de citoquinas, NO y TNF alfa. Este fenómenoaumenta la permeabilidad de la barrera y así pasan los Anticuerpos antimielina.La terminacion de la respuesta inflamatoria se produce con aumento de IL10 yTGF beta Características de laboratorio: Aumento de las proteínas en el LCR, con menos de 4 cel/ml. después deuna semana del inicio. 230 AutoinmunidadHumana 19.13EsclerosisMúltiple Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante que afecta el Sistema Nervioso Central. Si bien su causa aún no es totalmente conocida, diferentes evidencias soportan una etiología Autoinmune como la más probable. El procedimiento de laboratorio se llama electroforesis de LCR, un método utilizado para estudiar los niveles de proteína en el líquido cefalorraquídeo (LCR). En la electroforesis, se aplica un gel (un medio sólido que permite el movimiento de las proteínas) a una muestra de LCR y luego se aplica un voltaje. Las proteínas migran a lo largo del gel sobre la base de su carga (aproximadamente de acuerdo con su tamaño). Se tiñe el gel y las cantidades significativas de proteínas similares harán que se presente una "banda" visible. El término bandas oligoclonales se refiere a la presencia en el LCR de dos o más bandas de proteínas de una Inmunoglobulina específica (IgG) que tienen mayor intensidad que en la muestra concurrente de suero. Este patrón de bandas se observa en pacientes con esclerosis múltiple y otras condiciones. Es normal que se encuentren una o más bandas en el LCR. Anormal: Los resultados se consideran anormales si se encuentran dos o más bandas en el LCR y no en el suero de la sangre, lo cual puede ser indicio de esclerosis múltiple. Las bandas oligoclonales del LCR se encuentran en un 83 a 94% de los pacientes con esclerosis múltiple definida. Otras causas de este bandeo oligoclonal en LCR son, entre otras: encefalitis, meningitis, síndrome de Guillain-Barré, polineuritis, dolor de cabeza y otras condiciones. 19.14Miasteniagrave La miastenia grave es una enfermedad Autoinmune, de etiología no conocida, que afecta la unión neuromuscular. Clínicamente se caracteriza por la aparición de debilidad muscular tras una actividad prolongada, con tendencia a la recuperación después de un período de inactividad o con la administración de fármacos anticolinesterásicos. El mecanismo patogénico consiste en la destrucción específica de los receptores de acetilcolina de la membrana postsináptica de la placa motora mediada por Anticuerpos. El tratamiento inmunomodulador que se realiza actualmente en la miastenia ha cambiado su pronóstico, que raramente es ahora grave o fatal. Test serológico: Los Anticuerpos anti-ACHRA se detectan utilizando un método de inmunoprecipitación en el cual los ACHRA del músculo esquelético se marcan con I 125-a Bungarotoxina. Si bien el título de Anticuerpos no se correlaciona con la severidad de la enfermedad, son útiles para el seguimiento de la misma. Sí existe relación entre el tipo de Anticuerpos y la gravedad. El receptor de acetilcolina esta formado en el adulto por dos subunidades a, una ß, una d y una e. Se realiza por RIA y los valores de referencia son los siguientes: < 0,2 nmol/l: negativo 0,2-0,5 nmol/l: otras enfermedades Autoinmunes no M.G. 231 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 19.15EnfermedaddeGraves La enfermedad de Graves es un desorden Autoinmune caracterizado por hipertiroidismo, bocio difuso, oftalmopatía y, raramente, dermopatía. La susceptibilidad a la enfermedad de Graves es determinada por una mezcla de los factores genéticos, ambientales, y endógenos, que son responsables de la aparición del auto reactividad de las células de T y de B al receptor del tirotrofina. El examen más sensible para detectar hipertiroidismo es la medición de TSH con un método de segunda o de tercera generación. La generación se reconoce porque el límite inferior de detección es 0,05 mUI/ml para los métodos de segunda generación, y 0,005 mUI/ml para los de tercera. Una TSH normal descarta el diagnóstico de hipertiroidismo, con la sola excepción de los rarísimos casos en que el cuadro se debe a hipersecreción de TSH. La TSH debe medirse junto con T4 total o T4 libre, ya que existen sujetos eutiroideos (tienen T4 normal) cuya TSH es baja o está suprimida. En estos casos se debe plantear un hipertiroidismo subclínico o bioquímico, pero también tener presente que esta combinación se suele ver en sujetos eutiroideos de edad avanzada, en pacientes eutiroideos con alguna enfermedad grave, en sujetos psicóticos y con el uso de glucocorticoides o de dopamina. La medición de T3 total o libre es de poca utilidad en el diagnóstico del hipertiroidismo, excepto en los raros casos de T3 toxicosis o muy al comienzo de la enfermedad, en que la hiperproducción tiroidea de T3 puede anteceder a la de T4. Una vez establecido que el paciente tiene hipertiroidismo, es necesario efectuar una captación de radioyodo de 24 horas para determinar si el cuadro se debe a enfermedad de Graves-Basedow, o a bocio nodular tóxico, en cuyo caso la captación estará elevada (>20%); o bien a causas sin hiperfunción glandular, como la tiroiditis subaguda o la tirotoxicosis facticia. En estos casos la captación será baja (<3%) y el manejo clínico muy diferente. 19.16ArtritisPsoriásica(Psoriasis) La artritis psoriásica es una enfermedad articular de naturaleza inflamatoria que aparece en pacientes afectos de psoriasis o que la padecerán mas adelante. La psoriasis en general tiene una prevalencia en el mundo occidental entre el 1 al 3 %. La artritis psoriásica aparece entre el 5 y el 7 por ciento de los pacientes con psoriasis. También todos hemos visto, pero su prevalencia es difícil de establecer (estaría alrededor del 20 %), pacientes que padecen inicialmente solo artritis y que más tarde desarrollan psoriasis. La etiología de la enfermedad no es conocida, pero existe una asociación genética heterogénea y compleja. La psoriasis cutánea se asocia con determinados antígenos de histocompatibilidad (HLA-B13, HLA-Bw17 y HLA-Cw6). La artritis psoriásica asociada a sacroilitis y afectación axial con HLA-B39 y HLA-B27. La artritis psoriásica con afectación articular periférica con HLA-Cw6, HLA-Bw38, HLA-DR4 y HLA-DR7. Se aceptan, y es útil bajo diferentes puntos de vista, sobre todo pronóstico y terapéutico, diferentes patrones de expresión clínica de la artritis psoriasica: 1- Mono u oligoartritis. 2- Afectación exclusiva o predominante de las interfalángicas distales. 3Poliartritis que semeja la artritis reumatoide. 4- Espondilitis psoriásica. 5- Artritis mutilante. 1. Afecta una o pocas articulaciones y en este caso de forma en general asimétrica. Pueden ser articulaciones grandes o pequeñas. En esta forma es donde es más frecuente la afectación tendinosa en su inserción o en forma 232 AutoinmunidadHumana de tendosinovitis en particular en los flexores de los dedos de la mano o del pie. En ocasiones todo el dedo puede aparecer tumefacto, inflamado (dactilitis). El curso con este patrón es variable y la tendencia es a la cronicidad, pero la artritis puede debutar de un modo bastante abrupto y semejar una artritis por cristales o una artritis séptica. Esta artritis aguda es a veces recurrente. Por otro lado y en general la evolución suele ser más favorable que las formas de comienzo poliarticular. En menos casos evolucionan a formas poliarticulares, indistinguibles de las formas ya inicialmente poliarticulares. Las lesiones cutáneas o ungueales son a veces muy leves y requieren una búsqueda intencionada. Entre el 30-50 % de las artritis psoriásicas podrían estar comprendidos en este subgrupo. 2. Se caracteriza por la afectación exclusiva o predominante de alguna, varias o hasta todas la interfalángicas distales. Se asocia muy frecuentemente con la afectación de las uñas (pocillos o punteado ungueal, surcos horizontales, hiperqueratosis, leuconiquia, onicolisis, rojez y edema periungueal). Representa entre el 10-15 % de las artritis psoriásicas. 3. Poliartritis simétrica que remeda el patrón clínico y evolución de la artritis reumatoide. Sin embargo no hay factor reumatoide y tampoco nódulos subcutáneos. Algunos casos de los patrones mencionados mas arriba pueden con el tiempo ir evolucionando hacia este tipo. Comprendería del 15 al 30 % de los casos. 4. Forma espondilítica. Representa entre el 10 al 20 % de las artritis psoriásicas. Aproximadamente la mitad de ellos poseen el antígeno de histocompatibilidad HLA-B27. La expresión clínica es la de una espondilítis anquilosante. 5. La forma mutilante que representa el 5 % de los casos. Como su nombre indica manifiesta lesiones geódicas y mas aún, destructivas del hueso rebasando ampliamente la articulación, ello sobre todo en manos y pies. Los datos de laboratorio son contributorios para el conocimiento de la actividad de la enfermedad. Los reactantes de fase aguda (VSG, proteína C reactiva) son muchas veces, aunque no siempre, reflejo de la actividad de la enfermedad. La correlación no es tan fiel como en la artritis reumatoide. Muchos datos de laboratorio serán útiles en el diagnóstico diferencial y en la valoración del estado general. También son importantes en el seguimiento de la enfermedad y en la apreciación y detección de efectos secundarios posibles de los medicamentos. La presencia de HLA-B27 es de ayuda en los periodos iniciales para la caracterización y diagnóstico de la forma espondilítica. 19.17GranulomatosisdeWegener(GW) La Granulomatosis de Wegener (GW), es una enfermedad relativamente rara, pero que cuando se presenta al clínico plantea diversos aspectos diagnósticos y terapéuticos complejos. Para los investigadores, es motivo de una gama bastante interesante de aspectos patogénicos desde el descubrimiento de los Anticuerpos anticitoplasmáticos del neutrófilo (ANCAs), y sus interacciones diversas con el endotelio y diferentes células del sistema inmune. Alteraciones del Sedimento Urinario: microhematuria (más de 5 hematies por campo) o cilindros hemáticos. 233 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 19.18Esclerodermia Nombres alternativos: Esclerosis sistémica progresiva; Esclerodermia; Síndrome de CREST. Es una enfermedad del tejido conectivo difuso caracterizada por cambios en la piel, vasos sanguíneos, músculos esqueléticos y órganos internos. Datos de laboratorio: - Antígeno antinuclear positivo (1:16+). - Anticuerpo anticentrómero (1:40+). - Anticuerpo Anti-Scl 70 positivo (cualquier titulación). - Un examen de Anticuerpos antinucleares generalmente es positivo. - Un análisis de orina puede revelar proteína y sangre microscópica. 19.19Enfermedadcelíaca La enfermedad celiaca (EC) es una intolerancia permanente al gluten (fracción de prolaminas del trigo) y más especificamente a su fraccion proteica la gliadina, así como a las proteinas análogas del centeno (o secalina), de la cebada (hordeina) y de la avena (avenina). La ingesta de dichas proteinas induce, en personas genéticamente predispuestas, una lesión severa de la mucosa intestinal, que se caracteriza histologicamente por una hiperplasia de criptas con atrofia total o subtotal de las vellosidades intestinales. Se ha establecido una fuerte asociación entre el sistema mayor de histocompatibilidad (HLA) localizado en el cromosoma 6, y muy especialmente con el Antígeno DQ2,.que es una molécula heterodímera formada por dos cadenas (alfa y beta), codificadas por las alelos HLA DQA* 0501 y HLA DQB* 0201 respectivamente. El DQ2 se encuentra en 90-95% de enfermos celiacos y en 20-30% de controles sanos europeos. Se describe asimismo asociación con DQ8 (A1* 301/B1* 0302). Sin embargo no todos los enfermos celiacos comparten los alelos de riesgo y todos los individuos portadores de dichos alelos no desarrollan una EC. Debe existir por ellos otro gen de susceptibilidad implicado, no identificado por el momento. No se conoce con exactitud el mecanismo por el cual el gluten produce la lesión intestinal, aunque en el momento actual se propugna la Teoría Inmunológica., según la cual estos pacientes presentan una respuesta inmunológica desencadenada por la ingesta de gluten cuyo resultado final es la destrucción de la mucosa intestinal y secundariamente una alteracion de la función absortiva. Sin embargo, no todas las manifestaciones clinicas y/o biologicas de los individuos celiacos son justificables por un síndrome de mal absorción de macro o micronutrientes. La evidencia de que ciertas enfermedades fundamentalmente de base Autoinmune se asocian con mayor frecuencia a EC, ha motivado la utilización de marcadores serologicos como métodos de screening en estos grupos, observándose una proporción importante de casos silentes en enfermos Diabéticos Insulinodependientes o en pacientes con síndrome de Down. La descripción y observación de todas estas formas clínicas nuevas está en relación con el desarrollo de los marcadores serologícos o Anticuerpos circulantes en pacientes con EC y dirigidos frente a distintos Antígenos. Los primeros en ser utilizados fueron los Anticuerpos Antigladina (AAG); Se determinan mediante técnicas de ELISA que son Técnicamente fáciles, reproducibles y baratas. 234 AutoinmunidadHumana Los Ac de clase IgM determinados sueros sonde escasa utilidad por su baja sensibilidad y especificidad. Los de clase IgG son sensibles, pero muy poco específicos, con un alto porcentajes (30-50 %) de falsos positivos. Los Ac de clase IgA son muy sensibles (superior al 90%) con una especificidad variable según la población a la que se aplique; puede ser superior al 85-90% en pacientes con patología digestiva. Sin embargo existe una gran discrepancia de resultados entre distintos autores, debida fundamentalmente a la diversidad de métodos utilizados. Los Anticuerpos antiendomisio, AAE, se detectan en la muscularis mucosa del esófago de mono y más recientemente se está investigado la utilización de otros substratos, como cordón umbilical humano, con objeto de abaratar la técnica .En estos Ac tisulares la experiencia y valoración de los Ac de clase IgG está todavía por definir; los de clase IgA se relacionan más estrechamente con el daño de la mucosa, en los pacientes celiacos, que los AGA. La sensibilidad y especificidad que la EMA es superior al 90%; la especificidad cuando es discretamente inferior en adultos que en niños.Su sensibilidad varía según los grupos de población y la edad, siendo menos sensibles que los AGA en niños menores de 2 años y en los adolescentes y similar a los AGA en los otros grupos de edad. La Transglutaminasa tisular (TGt) seria el principal y probablemente único Antígeno de la enfermedad celiaca, que seria reconocido tanto por Anticuerpos antitransglutaminasa como por los AAE. 19.20 Mixedemaprimario(Hipotiroidismosevero) Los exámenes de laboratorio para determinar la función tiroidea son, entre otros: - T4 (baja) - T3 total o T3 libre (baja) - TSH sérica (alta) Las anomalías de laboratorio adicionales son: - Niveles de colesterol elevados - Nivel de enzimas hepáticas elevado - Prolactina sérica elevada - Sodio sérico bajo - Conteo sanguíneo completo (CSC) que muestra anemia 19.21GastritisAtróficaAutoinmune Se trata de una entidad clínica poco frecuente, con un importante componente genético y familiar, más frecuente en poblaciones de origen escandinavo y en el grupo sanguíneo A. La frecuente asociación con enfermedades de origen inmunológico y la demostración de Anticuerpos frente a las células parietales y frente al factor intrínseco con mucha mayor frecuencia que en la población general argumentan a favor de un mecanismo Autoinmune. Las concentraciones séricas de vitamina B12 estarán bajas, y la prueba de Schilling confirmará que su déficit de absorción oral se corrige al administrar factor intrínseco 235 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 19.22AnemiaHemolíticaAutoinmune(AHAI) Las pruebas de laboratorio presentan: - El examen de Coombs directo es positivo. - Examen de Coombs indirecto (Examen de antiglobulina indirecto). - Los niveles de bilirrubina están elevados. - La haptoglobina sérica es baja. - Se presenta hemoglobina en orina. - El conteo de reticulocitos es elevado. - El conteo de glóbulos rojos y de hemoglobina sérica es bajo. 19.23PénfigoVulgar Enfermedad Autoinmune, caracterizada clínicamente por vesículoampollas y erosiones localizadas en la piel y/o mucosas. Los pacientes presentan autoAnticuerpos IgG circulantes en sangre periférica dirigidos contra diferentes proteínas de los desmosomas, produciendo una rotura de las uniones intercelulares entre los queratinocitos, y la aparición posterior de ampollas. Se produce por autoAnticuerpos frente a glucoproteinas transmembrana que forman parte de los desmosomas, mecanismos de anclaje de los queratinocitos entre sí. Las glucoproteinas que actúan como antígeno son la desmogleina 3 en los pacientes con lesiones exclusivamente cutáneas y la desmogleina 1 y desmogleina 3 en pacientes que asocian clínica en mucosa oral. La unión del autoAnticuerpo al antígeno rompe los desmosomas originando despegamiento de los queratinocitos. A este tipo de despegamiento se le denomina acantolisis. Laboratorio: IFD: Depósitos intercelulares de IgG en casi el 100% de los casos y de C3 en el 50%. IFI: Anticuerpos circulantes del tipo IgG. 236 UNIDADDIDÁCTICAXX ESTUDIODELOSAUTOANTICUERPOS AutoinmunidadHumana 20.1EstudiodelosAuto‐Anticuerpos Se puede dividir el estudio de los diferentes Auto-Anticuerpos en 3 categorías claramente definidas: 1. Auto-Anticuerpos contra estructuras Nucleares (ANAs) y Citoplasmáticas: Las Técnicas utilizadas para su detección son el ELISA (ANA Screening y Anti-dsDNA específico), la IFI (células Hep-2 y de Crithidea luciliae) y el LIPA (específicos de ANAs y citoplasmáticos). 2. Auto-Anticuerpos contra Orgánulos Subcelulares: ELISA (AMA-M2) e IFI (células Hep-2 y de Triple tejido). 3. Auto-Anticuerpos contra componentes de Órganos: ELISA (AntiTransglutaminasa tisular IgA, Anti-Gliadina IgG e IgA, Anti-Peroxidasa Tiroidea y Anti-Tiroglobulina) e IFI (células de Triple tejido y de Esófago de mono). Los Antígenos más relevantes implicados, según la Técnica analítica empleada y haciendo un breve repaso serían: 20.1.1ELISA ANA Screening: dsDNA, Histonas, SS-A/Ro, SS-B/La, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Centrómero y otros ENA (Antígenos nucleares extraibles). Anti-dsDNA: DNA de doble cadena o nativo específico. Anti-Gliadina: Gliadina purificada de Trigo. Anti-Transglutaminasa: Enzima activa tisular humana unida al Calcio (mayor poder Antigénico). AMA-M2: Subunidad E2 del Complejo enzimático Piruvato Deshidrogenasa de la membrana interna Mitocondrial. Anti-TPO: Enzima Peroxidasa del Tiroides purificada. Anti-TG: Tiroglobulina altamente purificada. 20.1.2LIPA LIPA-ANAupdate: Anclados en la tira de papel aparecen Antígenos nucleares (Sm [SmB y SmD], RNP [RNP-70k, RNP-A y RNP-C], SS-A [Ro52 y Ro60], SS-B/La, Centrómero [Cenp-B], Scl-70 [Topoisomerasa I] e Histonas) y citoplasmáticos (Jo-1 [HistidiltRNAsintetasa] y Ribosomal P). 20.1.3IFI Hep-2: En este tipo de células (cáncer de Laringe humano) se detectan Antígenos como Nucleosomas, Histonas, ss y dsDNA, RNP de varios grupos, Jo-1, Nucléolo, Centrómero, Scl-70, Centriolo/Centrosoma, PCNA, Mitocondriales, Ribosómicos y otros ENA y Antígenos Citoplasmáticos. Crithidea luciliae: Contenido dentro de su Kinetoplasto aparece el Antígeno nuclear dsDNA. 239 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Triple tejido: Entre otros, contiene Antígenos Mitocondriales, de Músculo liso, Microsómicos, de Reticulina, de Células parietales, Citosólicos hepáticos, del Tracto gastrointestinal, etc…. Un examen más pormenorizado de los Antígenos arriba reseñados, así como las Técnicas recomendadas para el estudio de sus Anticuerpos asociados (si la Técnica aparece subrayada significa que se realiza en nuestro Laboratorio) y su Utilidad Clínica, se detallan a continuación. 20.2Estructurasnuclearesycitoplasmáticasmásrelevantes 20.2.1HistonaslibresyNucleosomas En el proceso de apoptosis o muerte celular programada los Nucleosomas quedan expuestos al sistema inmunitario y pueden, en algunos pacientes, provocar una respuesta autoinmunitaria. Los Nucleosomas actúan de manera bipotencial como dianas autoantigénicas, ya que son capaces de generar tanto Anticuerpos (Ac) contra el DNA como contra las Histonas. Entre las Histonas, proteínas de carácter básico fundamentales en la formación de la Cromatina, destacan la H1 (la más específica del fenómeno de las células LE), H2B, H3 y H4 que son las que provocan mayor respuesta inmunitaria, y la H5 que provoca una respuesta menor. Los Nucleosomas están formados por un núcleo proteico de Histonas sobre el que se enrolla el DNA y otras Histonas que actúan de puente entre un Nucleosoma y otro; de entre ellos el que tiene mayor poder antigénico es un complejo formado por el dímero H2A-H2B y el DNA (subpartícula H2A-H2B-DNA). A pesar de la posible implicación de estos ANAs (generalmente de la clase IgG) en el Lupus eritematoso sistémico (SLE), Esclerodermia, Artritis reumatoide (AR) y otros, su utilidad clínica radica en el diagnóstico y seguimiento del Lupus inducido por Fármacos. Como técnicas recomendadas para su detección están la IFI (patrón homogéneo con refuerzo periférico en células de riñón de ratón y células Hep-2, aunque es poco sensible), los Enzimoinmunoensayos ELISA y los LIPA. 20.2.2DNA Se divide en dos categorías fundamentales, el ssDNA o de cadena sencilla en el que sus ANAs asociados reaccionan con secuencias de nucleótidos específicos (también pueden unirse al dsDNA pero con baja avidez), y el dsDNA o de doble cadena o nativo cuyos ANAs asociados reaccionan ávidamente con el esqueleto azúcar-fosfato de la molécula. La utilidad clínica de los ANAs (de la clase IgG; con menor frecuencia IgM e IgA) contra el ssDNA es muy limitada (sólo si acaso en el Lupus inducido por Fármacos) y aparecen en mayor o menor medida en muchas enfermedades autoinmunitarias sistémicas. Los ANAs contra el dsDNA son muy específicos del SLE y permiten monitorizar el curso clínico de la enfermedad. Las técnicas recomendadas para su detección son la IFI (con células de Crithidea luciliae los ANAs contra dsDNA dan fluorescencia sólo en el kinetoplasto, dejando libres de ésta al núcleo y al corpúsculo basal del flagelo), el Radioinmunoensayo (RIA) y los ELISA. 240 AutoinmunidadHumana 20.2.3Ribonucleoproteínas Compuestas por una o más moléculas de RNA que se asocian con una o más proteínas. De entre los muchos grupos existentes destacan tres, las scRNP (son citoplasmáticas o nucleares de pequeño tamaño y su RNA está transcrito por la RNA polimerasa III; sus Antígenos [Ag] más inmunógenos y específicos son el Ro52/SSA, Ro60/SSA y el La/SSB), las snRNP (son nucleares de pequeño tamaño y su RNA está transcrito por la RNA polimerasa II; sus Ag más inmunógenos son aquellos cuyo RNA es rico en Uracilo, por eso se les denomina UsnRNP, siendo los más específicos los U1snRNP [sobresalen los Ag RNP-70 Kd, RNP-A y RNP-C] y los SmUsnRNP [o simplemente Sm, como los Ag Sm B/B’ y Sm D]) y las snoRNP (son nucleolares de pequeño tamaño y su RNA está transcrito por la RNA polimerasa I; sus ANAs asociados se incluyen dentro de una de las clases de Ac contra el nucléolo). La utilidad clínica de los ANAs (clase IgG) contra todos estos Ag se suele asociar con: Ro52 y 60/SSA: En el Síndrome de Sjögren (SS), SLE, Lupus cutáneo subagudo y Lupus neonatal (muy específicos de esta enfermedad Autoinmune). La/SSB: En el SS (muy específicos). Si los ANAs contra éste aparecen conjuntamente con los Ro/SSA en mujeres embarazadas, la probabilidad de que sus hijos desarrollen Lupus neonatal está prácticamente asegurada (> 95%). U1snRNP: Si se presentan sólos y en alta concentración identifican a un subgrupo de pacientes con Enfermedad mixta del tejido conjuntivo. Sm: Se asocian generalmente con ANAs contra los U1snRNP, y son muy específicos del SLE (incluidos en uno de los criterios de diagnóstico). snoRNP: Asociados a ANAs contra el nucléolo parecen ser específicos de la Esclerodermia Las técnicas utilizadas para su detección son la IFI (con células HEP-2 se emplea sobre todo para descartar su presencia: scRNP patrón nuclear moteado fino, snRNP patrón nuclear moteado grueso y snoRNP patrón nucleolar moteado), los ELISA, la Contrainmunoelectroforesis (CIE), la Inmunodifusión doble (ID) y los LIPA (de elección). 20.2.4Nucléolo Pequeño cuerpo denso dentro del núcleo de las células Eucariotas que contiene RNA y Proteínas, en donde se sintetiza el RNAribosomal. Los principales Ag nucleolares son las RNApolimerasas I, II y III, la Fibrilarina, la proteína Th (To) y el Pm/Scl. Ya menos frecuentes son la NOR 90 (región organizadora del nucléolo), la Nucleolina y la Nucleofosminaproteína B23. Su utilidad clínica radica en que los ANAs asociados identifican a un gran número de pacientes con Esclerodermia y los específicos del complejo proteico Pm/Scl se asocian con Síndromes de solapamiento Polimiositis/Esclerodermia. Su detección se lleva a cabo por IFI (con células HEP-2: patrón nucleolar moteado salvo el de ANAs asociados a Pm/Scl cuyo patrón es nucleolar homogéneo), Inmunoprecipitación (IP, por Turbidimetría o Nefelometría) o LIPA (de elección). 241 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 20.2.5Centrómero Constricción primaria que conecta las 2 Cromátides que constituyen un Cromosoma. A ambos lados de éste se sitúan unas estructuras proteicas denominadas Cinetocoros, a las que se asocian las fibras del Huso acromático (microtúbulos) durante la Metafase y la Anafase. Los ANAs (de clase IgG) contra el Centrómero (ACA) se dirigen contra tres tipos fundamentales de proteínas llamadas CenpA, CenpB y CenpC (también existen las CenpD, E y F pero sus ACAs son menos frecuentes). Estas proteínas aparecen en la célula durante la división celular en el Cinetocoro. Su utilidad clínica radica en que la presencia de ACAs son muy específicos del Síndrome de CREST (Esclerosis cutánea limitada, fenómeno de Raynaud [siempre], dismotilidad esofágica, Esclerodactilia y Telangiectasias). Las técnicas utilizadas para detectar ACAs son la IFI (con células HEP-2, patrón centromérico), los ELISA y los LIPA. Topoisomerasa I: Es una enzima nuclear que produce la relajación o superenrollamiento de la hélice de DNA. Los ANAs (de clase IgG e IgA; en menor medida IgM) contra este Ag se denominan Ac anti-Scl-70 (el Ag Scl-70 es un producto de degradación de la Topoisomerasa I). Los Ac anti-Scl-70 aparecen en el 20-30% de pacientes con Esclerodermia difusa. Algunos estudios han demostrado una asociación significativa entre su presencia y el Cáncer o futuro desarrollo de Cáncer. Como técnicas diagnósticas se utilizan la IFI (ídem al patrón de Histonas, aunque es poco sensible), la ID, los ELISA y los LIPA (de elección). Aminoacil tRNA sintetasas: Son enzimas citoplasmáticas que catalizan la carga de Aminoácidos (Aa) a su tRNA específico. Hasta la fecha se han determinado seis Ac (de clase IgG; en una pequeña proporción pueden ser IgM) contra seis aminoacil tRNA sintetasas. El Ag más frecuente es la histidil tRNA sintetasa, también llamado autoAg Jo-1. Los Ac contra las aminoacil tRNA sintetasas son específicos del Síndrome Polimiositis/Dermatomiositis, concretamente del tipo Síndrome anti-sintetasa (Miositis, Enfermedad pulmonar intersticial, Artritis, Fenómeno de Raynaud y manos de mecánico [hiperqueratosis con fisuras en los bordes de los dedos]), si bien son poco sensibles. Suelen asociarse con ANAs y otros Ac anticitoplasmáticos típicos de Polimiositis / Dermatomiositis. Como técnicas analíticas se utilizan la IFI (con células HEP-2 y Triple tejido dan un patrón citoplasmático [fluorescencia como cables y filamentos, o ligeramente moteado, a lo largo del eje de las células]), ELISA (sólo contra Jo-1), IP y LIPA. 20.2.6Otros Son de prevalencia menor pero aún así relevantes (existen muchos más, aunque de carácter secundario o inespecíficos). Están: Ribosomal: Los Ag son las Fosfoproteínas P0, P1, P2 y S10 de la subunidad ribosomal 60S. Destaca el llamado Ag Ribosomal P. Los Ac asociados contra éste aparecen en el 15% de SLE. Para su análisis se utilizan los ELISA y LIPA. Partícula de reconocimiento de la señal: Denominado Ag SRP. Los Ac asociados se encuentran en pacientes con Miopatía inflamatoria idiopática, con especial mal pronóstico. 242 AutoinmunidadHumana Helicasas: Son enzimas implicadas en la regulación de la replicación genómica, así como en la expresión, reparación y segregación de cromosomas. Sobresalen los Ag de la familia de helicasas 54 SNF/RAD, específicamente el Ag Mi-2. Los Ac asociados son ANAs puros que se dirigen contra estructuras nucleares, no citoplasmáticas (NOTA: muchos de los Ac contra estructuras citoplasmáticas [como los Ac anti-SRP, anti tRNA sintetasas,…, que suelen detectarse casi exclusivamente en Síndromes de Miositis/Polimiositis] son calificados como ANAs en un contexto general aunque no sean puros, ya que reaccionan con Ag diferentes a los nucleares). Los Ac antiMi-2 se asocian con Dermatomiositis. Centriolo/Centrosoma: Cuerpo que se divide en la Profase ubicado en los polos y que con ayuda del Huso citoplasmático dirige los cromosomas a los polos de la célula, durante la Anafase. Un Centrosoma está formado por dos Centriolos. Uno de sus Ag principales, la Enolasa 48, es una de las proteínas blanco de los ANAs asociados. Aparecen en pacientes con Síndrome de CREST. Se utilizan la IFI (células HEP-2 con fluorescencia en puntos vértice del huso mitótico en células en división) y los LIPA como técnicas diagnósticas. Ag nuclear de proliferación celular: Partícula PCNA, cuyo Ag principal es la Ciclina. Sus ANAs asociados son muy específicos en el SLE. Se detectan por IFI (células HEP-2 con patrón nuclear pleomórfico), ID, ELISA, IP y LIPA. 20.3Orgánulossubcelularesmásrelevantes 20.3.1Mitocondrias Sus Ac asociados son los AMA (principalmente de la clase IgG, aunque también se pueden detectar de la clase IgA e IgM). Los Ag primarios reconocidos por los AMAs pertenecen todos a complejos enzimáticos que se encuentran en la membrana interna mitocondrial, principalmente los de la familia 2-cetoácido-deshidrogenasa, destacando la del PDC (complejo Piruvato-deshidrogenasa). Los más específicos son los Ac AMAM2, dirigidos contra la subunidad E2 de la PDC. La utilidad clínica fundamental de estos Ac es la identificación de pacientes afectos de Cirrosis biliar primaria (PBC; los títulos > 160 por IFI sugieren su presencia). Respecto de las técnicas analíticas son apropiadas la IFI (con células HEP-2 se observa un patrón mitocondrial, y con Triple tejido a una dilución de cribado de 1/20 aparece fluorescencia en células hepáticas, renales y parietales), los ELISA y los LIPA (tiene muchos problemas). 20.3.2Músculoliso Sus Ac asociados son los ASMA (predominan los de clase IgG, si bien dependiendo de la enfermedad a la que estén ligados y los Ag contra los que reaccionen pueden ser de clase IgM). Los autoAg específicos contra los que se unen los ASMAs residen en tres grupos de filamentos del citoesqueleto: la F y G-actina, la Vimentina y Desmina, y la Tubulina. Su utilidad clínica viene determinada por el autoAg considerado y su ASMA asociado, a saber: F-actina y ASMAs asociados sólo de clase IgG (a títulos elevados) aparecen en el 90% de Hepatitis autoinmunitarias de tipo I (AIH-1). Se debe tener presente que con ASMA y ANA negativos en un mismo paciente es prácticamente imposible padecer una AIH; por 243 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico otro lado con ASMA positivo puede no tenerse una AIH, ya que existen varias especificidades diferentes a la de F-actina. F-actina y ASMAs asociados de clase IgG e IgM (ambas a títulos elevados) se detectan en la cuarta parte de pacientes afectos del Síndrome de solapamiento AIH-PBC. G-actina y ASMAs asociados sólo de clase IgM (a títulos bajos) se encuentran en pacientes con Cirrosis alcohólica. Los ASMAs asociados al resto de autoAg del músculo liso son todos de la clase IgM (a títulos bajos), relacionándose en mayor o menor medida los de la Vimentina con Infecciones microbiológicas de cualquier tipo (sobre todo Hepatitis víricas), otras Enfermedades autoinmunitarias y en Rechazos de Injertos, los de la Desmina con Miocarditis y los de la Tubulina con la Mononucleosis infecciosa. Las técnicas analíticas utilizadas para la detección de ASMAs son la IFI (con Triple tejido, con una dilución de cribado de 1/20, los específicos de actina tiñen fluorescentemente las células musculares, renales y un poco el intersticio de las células hepáticas [la unión entre ellas, no la propia célula]; con las células HEP-2, aunque no son adecuadas para el estudio de ASMAs, a veces aparece un patrón citoplasmático), los ELISA y el LIPA. 20.3.3Microsomashepáticosyrenales: Sus Ac asociados son los anti-LKM (de clase IgG) y están dirigidos contra Ag del Retículo endoplásmico del hepatocito y túbulos proximales renales, en concreto contra miembros de la superfamilia de enzimas del Citocromo p450. Se han descrito de tres tipos: LKM-1 (el Ag más específico es de 50 Kd y corresponde al Cit. P450IID6), LKM-2 (el Ag específico es el Cit. P450IIC9, que al metabolizar al Ácido Tienílico produce un metabolito con capacidad de unión al Cit., convirtiéndose en autoAg) y LKM-3 (el Ag específico es un epítopo de la familia de las Uridin-difosfato-glucuroniltransferasas [UGTs], que está alterado en pacientes con infección por virus de la Hepatitis delta [VHD]). Existe un cuarto tipo de reactividad, diferente de las anteriores, contra los microsomas hepáticos y renales denominado Ac LM (el Ag específico es el Cit. P450IA2, el cual metaboliza a la Dihidralazina y su metabolito actúa como un Hapteno que se une a éste convirtiéndolo en autoAg). La principal utilidad clínica de los Ac LKM-1 es la de marcadores de AIH tipo 2. Estos Ac también pueden detectarse en Hepatitis crónicas por el VHC, pero los LKM-1 asociados son heterogéneos y reaccionan contra otros determinantes Ag además del Ag de 50 Kd del Cit. P450IID6. Los LKM-2 solo se encuentran en las Hepatitis inducidas por Ácido Tienílico, los LKM-3 en algunos pacientes con hepatitis por VHD y los LM en Hepatitis inducidas por Dihidralazina. Como métodos de detección están la IFI (con Triple tejido se observa fluorescencia en las células hepáticas y renales [diferentes reactividades según sean LKM-1 ó LKM-2], y nunca en las parietales), LIPA (de elección para los LKM-3 y LM) y ELISA. 20.3.4Citosolhepático Sus Ac asociados se denominan anti-LC1, y el/los autoAg que provocan su síntesis es/son desconocido/s. Se piensa pueda ser una proteína citosólica tipo 1 del hígado. Los LC1 suelen aparecer conjuntamente con los LKM-1 y son confirmatorios de una AIH de tipo 2. Los LC1 tienen un mayor valor predictivo positivo que los LKM-1, pero son 244 AutoinmunidadHumana menos sensibles. Unas pocas veces los LC1 se presentan sólos (en pacientes adultos) y están asociados con Hepatitis por el VHC. Tras tratamiento inmunosupresor contra la AIH de tipo 2, los títulos de LC1 disminuyen o aumentan (si reactivación de la enfermedad) en paralelo con la concentración de GPT. Las pruebas analíticas incluyen la IFI (con Triple tejido [T.t.], dilución 1/20, exclusivamente fluorescencia hepática [el problema es que casi siempre están asociados con los LKM-1 y también aparecerá fluorescencia renal]), la ID, el LIPA y la CIE (de elección). 20.4Componentesdeórganosmásrelevantes 20.4.1Reticulina Comprende a un grupo de Proteínas que forman parte del Tejido Conectivo. Sus Ac asociados se engloban dentro de los principales autoAc contra componentes del tracto gastrointestinal. Existen cinco tipos diferentes de Ag: reticulina R1 (cuyos Ag más destacados son el Colágeno de tipo III y la Fibronectina [forman estructuras fibrosas que se localizan entre los Hepatocitos y entre las Células Endoteliales]), reticulina R2, reticulina R3, reticulina R4 y reticulina Rs. De todos sus autoAc asociados solo los anti-R1 (generalmente de la clase IgA) contra la reticulina R1 tienen significado clínico definido, observándose en los pacientes con Enteropatía sensible al gluten, Enfermedad celíaca y Dermatitis herpetiforme. Los Ac R1 son bastante específicos y suelen ir acompañados por Ac anti-gliadina y anti-endomisio de la clase IgA. También pueden observarse en el 20% de pacientes con Enfermedad de Crohn y en un 5% de personas sanas. El resto de autoAc (R2, R3, R4 y Rs) contra la reticulina no tienen significado patológico (y frecuentemente son de la clase IgG). El método de medida más recomendado para la detección de Ac R1 es la IFI (con Triple tejido y con conjugado de fluoresceína específico anti-IgA humano aparece fluorescencia en las células renales, formando hilos en el parénquima de las células hepáticas y en forma de hebras entre las glándulas gástricas; si únicamente existen Ac R2 de clase IgA sólo aparece fluorescencia de hebras en las células gástricas. El resto de Ac R3, R4 y Rs, si son de clase IgA, sólo dan fluorescencia en las células hepáticas). 20.4.2Endomisio Estructura de soporte que, entre otras, recubre la combinación de fibras musculares lisas y estriadas que se encuentran en el tercio medio del esófago. Contiene Colágeno y Reticulina junto con el Ag específico contra el cual se dirigen los Ac (de clase IgA; también a veces se estudian los de clase IgG) contra el endomisio, la enzima Transglutaminasa tisular. Los Ac contra el endomisio de la clase IgA son muy específicos de los pacientes con Enteropatía sensible al gluten, Enfermedad celíaca activa o con Dermatitis herpetiforme. Su VPP y VPN es muy elevado (próximo al 100%). En pacientes únicamente afectados por la Enfermedad de Crohn siempre son negativos (a diferencia de en algunas ocasiones los Ac R1 contra la reticulina que pueden ser positivos). La sensibilidad disminuye en niños menores de dos años. En pacientes con una mucosa intestinal normal que posteriormente desarrollan la Enfermedad celíaca pueden ser positivos, sirviendo así para detectar casos de Enfermedad celíaca latente que precede a la enfermedad activa. Los Ac contra el endomisio de clase IgA pueden ser negativos en celíacos con deficiencia de IgA. Ésto es importante, ya que la Enfermedad celíaca es más frecuente en pacientes con déficit 245 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico selectivo de IgA; en estos pacientes se investiga la presencia de Ac IgG contra el endomisio, reticulina y gliadina (la especificidad de estos Ac siempre es menor que los de clase IgA). El método más utilizado para detectar Ac contra el endomisio de clase IgA es la IFI (con Esófago de mono [las secciones deben mantenerse congeladas para que conserven la especificidad Ag] y utilizando un conjugado específico anti-IgA; se recomienda la dilución 1/5 del suero para despistaje y 1/50 para evitar fenómenos de prozona y enmascaramiento por ASMAs que pueden coexistir con los Ac anti-endomisio) y los ELISA (en el fondo de los pocillos está anclada la enzima activa Transglutaminasa tisular unida al Calcio [de mayor poder Ag]). La concordancia entre los dos métodos es del 95%. 20.4.3Gliadina Es la fracción del Gluten de Trigo soluble en alcohol. Está formada por una mezcla de unos 50 componentes Glucoproteicos que pueden dividirse en 4 grupos: a, b, g y wgliadinas. Éstas y Proteínas similares de Cebada, Centeno y posiblemente Avena tienen efectos tóxicos en pacientes Celíacos.. Existe la posibilidad de que algún virus ADV desencadene la enfermedad Celíaca, ya que se ha visto que la Gliadina-A (componente de la a-gliadina) tiene gran similitud con la proteína Elb del Adenovirus serotipo 12. Los Ac anti-gliadina más importantes son de la clase IgA (más específicos) e IgG (más sensibles); se recomienda el estudio conjunto de las 2 clases (debido a los pacientes con déficit de IgA). Como utilidad clínica de los Ac anti-gliadina destaca el diagnóstico y seguimiento de la Enfermedad celíaca. En los pacientes menores de 2 años son de elección. Se ha visto que en pacientes mayores de 60 años hasta un 10% con Ac + no padecen la enfermedad. Las Técnicas utilizadas para su diagnóstico son la IFI, el RIA, la FIA (inmunoanálisis de fluorescencia) y los ELISA. Células parietales gástricas: Sus Ac asociados son los PCA. El Ag contra el que se dirigen estos Ac es la enzima H+/K+ ATPasa gástrica (bomba de protones responsable de la secreción de ácido al contenido gástrico). Esta enzima tiene dos subunidades (a y b), para las que existen Ac PCA específicos de cada una de ellas. Se han encontrado otros posibles autoAg para los PCA, como son los Microsomas gástricos y los Receptores de gastrina (los PCA asociados contra éstos últimos pueden inhibir la producción gástrica de ácido). La principal utilidad clínica de los PCA es su contribución al diagnóstico de la Anemia perniciosa (suelen asociarse con Ac contra el Factor intrínseco, y en ocasiones con Ac contra el Pepsinógeno secretado por las células principales gástricas; es frecuente la relación de esta enfermedad con otras Enfermedades autoinmunitarias endocrinas) y la Gastritis atrófica autoinmunitaria. También se encuentran los PCA en un 30% de pacientes con Atrofia de mucosa gástrica por Helicobacter pylori y en el 32% con Hepatitis crónica por el VHC. Los métodos de medida más utilizados en los Laboratorios clínicos es la IFI (como células de elección se utiliza el Estómago de ratón; si se utilizan las de Triple tejido de rata se debe tener presente que solo deben aparecer fluorescentes las células parietales gástricas [las células principales, insertadas entre las parietales, no se tiñen], ya que si también aparecen fluorescentes las células renales, se considera que es debido a la presencia de Ac heterófilos contra rata en la muestra del paciente), los ELISA y los LIPA. 246 AutoinmunidadHumana 20.4.4Desmosomas Son las moléculas que mantienen la unión entre los Queratinocitos epidérmicos. Los Ag específicos están formados por Proteínas desmosómicas, entre las que destacan la Desmogleína 3, la Desmogleína 1, las Desmoplaquinas I y II, y la Desmocolina 1. Las utilidades clínicas de los Ac (de clase IgG) asociados contra estas proteínas son: Los Ac contra la Desmogleína 3 son patonogmónicos del Pénfigo vulgar (PV; enfermedad ampollosa de la piel caracterizada por la formación de vesículas intraepidérmicas). Los neonatos de madres con PV pueden desarrollar la enfermedad de forma transitoria debido al paso de estos Ac antiepidérmicos de clase IgG a través de la placenta. Lo mismo ocurre al transferir pasivamente el suero de pacientes con PV a animales de experimentación (Acantolisis suprabasilar), y la gravedad está relacionada con el título de Ac administrado. El mecanismo de acción por el cual estos Ac producen la Acantolisis parece ser un aumento de la actividad de diversas proteasas a nivel local, ya que estos autoAc estimulan la síntesis del activador del Plasminógeno (no parece ser necesaria la activación del Complemento para la producción de las lesiones). Los Ac contra la Desmogleína 1 aparecen en el Pénfigo foliáceo (con ampollas intraepidérmicas, solo afecta a las capas más altas de la epidermis). Si estos Ac están asociados con los Ac contra la Desmogleína 3 se presenta el denominado PV mucocutáneo (existe afectación tanto de la piel como de las mucosas). Los Ac contra las Desmoplaquinas I y II se detectan en el Pénfigo paraneoplásico (lesiones ampollosas intraepidérmicas con necrosis). Los Ac (de clase IgA) contra la Desmocolina 1 causan el Pénfigo IgA (se ven dañadas con ampollas intraepidérmicas las capas superiores de la epidermis). Las Técnicas diagnósticas que se utilizan son la Inmunofluorescencia directa (IFD) en biopsias de piel perilesional, la IFI (de elección Esófago de mono para el PV con conjugado polivalente o anti-IgG humano donde se observan altos títulos [la utilización de tampones de lavado con suplementos de Calcio aumenta la sensibilidad]; para el Pénfigo foliáceo la sección de tejido de elección es el de Esófago de cobaya [a tener en cuenta que en pacientes hiperglucémicos o diabéticos tanto el título como la intensidad de la IFI disminuye por la glucosilación no enzimática de los Ac]), el LIPA y el ELISA (de elección para cualquier tipo de Ac a investigar). 20.4.5Membranabasalepidérmica La zona de la membrana basal epidérmica posee varias estructuras encargadas de realizar la unión entre la Dermis y la Epidermis. Estas estructuras están formadas por Hemidesmosomas, Filamentos y Fibras de anclaje y las Membranas basales. Sus Ac (generalmente de clase IgG agrupados o no junto con Ac contra C3 del complemento; en ocasiones existen patologías solo de clase IgA) se denominan BMZA y están dirigidos principalmente contra Proteínas específicas de esta zona, en concreto la BP230 Kd (Ag 1 del BP), BP180 Kd (Ag 2 del BP o Colágeno VII) y las a6b4 integrinas. Los Ac BMZA se detectan en el Penfigoide ampolloso (BP; con ampollas de distribución subepidérmica), Herpes gestacional (HG; con ampollas subepidérmicas), Penfigoide cicatricial (CP; ampollas subepiteliales), Epidermolisis ampollosa (ampollas subepiteliales) y en las Erupciones ampollosas del SLE. 247 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Como métodos de medida están la IFD en material de biopsia, la IFI (de elección Esófago de mono con conjugados polivalentes [si se sospecha que los Ac implicados pueden ser de clase IgA es preferible el conjugado anti-IgA] para el despistaje), los ELISA (solo para detección de Ac contra el Ag 2 del BP o Colágeno VII) y los LIPA (menor sensibilidad que los ELISA). 20.4.6Peroxidasatiroidea La TPO es la principal enzima de síntesis de las hormonas tiroideas. Es una glucoproteína de membrana (con un grupo prostético hemo) que se expresa en la superficie apical de los Tirocitos. Contiene 2 dominios, denominados A y B, que son los epítopos principalmente reconocidos (uno de ellos es el lugar catalítico de la peroxidación). Sus autoAc asociados son predominantemente de tipo IgG y, a veces, también IgA (algunos reaccionan de forma cruzada contra la Tiroglobulina). Las concentraciones de Ac contra la TPO están correlacionadas con la fase activa de la enfermedad. Los Ac contra la TPO son característicos, en orden decreciente de sensibilidad y especificidad, de la Tiroiditis de Hashimoto (cursa con Bocio, Hipotiroidismo o ambos; sensibilidad > 80%), Enfermedad de Graves, Tiroiditis subaguda y de la Tiroiditis idiopática, respectivamente. Debido a que estos Ac están presentes en todas las formas de Enfermedad tiroidea, no pueden utilizarse para diferenciar entre las distintas enfermedades. Si acaso, destaca la correlación existente entre la presencia de Ac anti-TPO y enfermedad en mujeres embarazadas tras el parto (mujeres embarazadas que en el 1er trimestre tienen altas concentraciones de Ac anti-TPO, son las que tienen mayor probabilidad de desarrollar Hipotiroidismo tras el parto). En cuanto a las Técnicas diagnósticas, ya casi no se utilizan aquellas que emplean extractos microsómicos de Tiroides (Hemaglutinación) ni la IFI (sustrato: tiroides de mono), habiendo sido sustituidas por la enzima TPO purificada (incluso se ha desarrollado un ELISA con TPO recombinante). Actualmente los Análisis específicos más empleados son los ELISA, Precipitación de TPO marcada con 125I con la proteína A, Captura de los autoAc con lechos recubiertos de TPO y detección con TPO quimioluminiscente. 20.4.7Tiroglobulina Glucoproteína tetramérica segregada por la célula Tiroidea al coloide, interviene en los procesos de acoplamiento implicados en la formación y almacenamiento de las hormonas Tiroideas. Se cree que sus autoAc asociados participan en la génesis de la Tiroiditis autoinmunitaria, aunque la enfermedad solo puede desarrollarse si se generan linfocitos T citotóxicos específicos. Los Ac contra la Tiroglobulina pueden aparecer, además de en Enfermedades Tiroideas Autoinmunitarias, en un gran número de Endocrinopatías autoinmunitarias (Anemia perniciosa, enfermedad de Addison, Diabetes mellitus…) y a títulos bajos en algunos pacientes sanos (hasta un 18% en mujeres y un 5% en hombres). En cuanto a las Enfermedades Tiroideas, y a pesar de no ser tan sensibles y específicos como los Ac antiTPO, se asocian en orden decreciente con la Tiroiditis linfocítica crónica, Mixedema primario, Hipertiroidismo, Adenoma y Cáncer de Tiroides, Bocio coloidal y nodular y también en las mismas patologías detectadas por los Ac anti-TPO. Como métodos de medida destacan la Hemaglutinación, IFI (con Tiroides de mono o humano fijados con metanol), RIA y los ELISA. 248 AutoinmunidadHumana 20.5Pruebasdelaboratorio 20.5.1Prueba:AnticuerposAntinucleares(AAN) Descripción: En una versión de esta prueba, se coloca suero del paciente en una platina que ya tiene fija, en la superficie una célula epitelial humana. Utilizando una técnica de iluminación fluorescente mediante la cual se pueden ver los Anticuerpos bajo un microscopio especial. El lector puede interpretar el resultado ya bien sea positivo o negativo en diferentes bajo diferentes diluciones y a su vez puede determinar el patrón actual cuando el resultado es positivo. Normal: Negativo. Anormal: Positivo. Patrones principales: 1. Patrón no específico homogéneo (o difuso). Observado en lupus eritematoso sistémico (LES) y artritis reumática y fármacos que inducen el lupus. 2. Patrón moteado que se observa en LES, en el síndrome de Sjögren, en esclerodermia y en enfermedades de tejido conectivo mixto. 1. Periférica (o borde) asociado con Anticuerpos de ADN de doble hebra, que se encuentran en la zona periférica del núcleo y que generalmente se observa en LES. 2. Nucleolar y generalmente se observa en esclerodermia. Enfermedades asociadas: Se observa un AAN positivo en el 99% de los pacientes de LES sintomáticos y que no han sido tratados al ser diagnosticados. Pacientes con otras enfermedades como esclerodermia, dermatomiostitis/-polimiostitis, el síndrome de Sjögren y artritis reumatoide. Todas estas enfermedades pueden tener un AAAN positivo. Enfermedades de hígado y enfermedad Autoinmune pueden llevar a un resultado de prueba positivo. Medicamentos cómo, Isoniazid, Hydralazine, Dilantin y Procainamide pueden inducir un patrón homogéneo positivo que puede resolverse con el transcurso del tiempo si se descontinúa el medicamento. Muchos pacientes con un AAN positivo son incorrecta-mente informados que tienen LES. Un AAN positivo no es equivalente a este diagnóstico. El paciente aún tendría que reunir otros criterios para tener esta enfermedad. Con frecuencia nos refieren pacientes con un AAN positivo a ser evaluados y sin embargo, muchos pacientes no tienen ninguna enfermedad significativa (especialmente con resultados anormales de bajo título). En estos casos, es crítico asegurar al paciente acerca de esta prueba. Incluso el envejecer puede dar un resultado anormal de título bajo. Al volver a realizar esta prueba al cabo de varios meses, puede haber revertido a normal. 20.5.2Prueba:AnticuerposAnti‐ADN Descripción: Esta prueba puede realizarse en diferentes maneras, incluyendo una técnica que contiene ADN E. Coli o la cola de un organismo llamado critidia que tiene presente ADN. La prueba de laboratorio mide la presencia de los Anticuerpos en el suero del paciente, a ADN de hebra doble (o nativa). Normal: Negativo. 249 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico Anormal: Positivo con diferentes laboratorios cada uno con diferente título o rangos de anormal. La presencia de Anticuerpos de ADN de hebra doble en títulos altos, se asocia con LES. Con frecuencia los títulos se asocian con los riñones o el sistema nervioso central así como síntomas activos. Enfermedades Asociadas: La medición de estos Anticuerpos anti-ADN en diferentes intervalos es una parte importante del monitoreo del paciente con LES. En ocasiones, un aumento en el título, puede preceder un brote. Con frecuencia, títulos altos pueden cambiar a un rango negativo, con tratamiento, lo cual puede ser un buen indicador de que la actividad de la enfermedad ha disminuido. 20.5.3Prueba:Nivelesdecomplementodesuero(C3,C4) Descripción: Las proteínas del complemento son una parte importante del sistema inmuno-lógico. Las personas que nacen sin componentes específicos del complemento, pueden desarrollar enfermedades como LES. Dado que las proteínas del complemento son consumidas en el proceso de inflamación, se pueden reducir los niveles de éstas enfermedades activas como sucede con el lupus vasculitis (LES). Estas generalmente son medidas de lo que se llama una técnica de inmunodifusión en una placa de Petri con una muestra del suero del paciente, interactuando con material colocado en las ranuras del agar de la placa. Normal: Definido por cada laboratorio pero recayendo dentro de cierta zona y calculada en mg por 100. Anormal: Un resultado que esté por encima o por debajo del rango establecido. Disminuciones de los niveles C3 y C4, generalmente están asociadas con enfermedad activa en pacientes con LES. Enfermedades Asociadas: Los componentes específicos tal como C3 y C4, se miden en intervalos cuando se hace un seguimiento a pacientes con LES. Niveles bajos de C3 tienden a ser indicadores más fiables de que hay enfermedad activa que los de C4. En vez de solamente observar estos componentes de complementos, por separado, es posible que el médico pida un complemento hemolítico total (CH50) que evalúa todos los componentes de C1 hasta C9. 20.5.4Prueba:Velocidaddesedimentaciónglobular(VSG) Descripción: Se recoge la sangre en un tubo especial para que no se coagule y de ahí se traslada a una columna calibrada. Se permite que los eritrocitos se asienten en el fondo de la columna en un periodo de una hora. Al final de este tiempo, se deja una zona clara por encima de los eritrocitos compactos. Al medir esta zona clara, podemos descifrar la velocidad de sedimentación de las células, por ejemplo la velocidad de sedimentación globular o VSG. La velocidad de asentamiento depende de la presencia de inflamación y de otras proteínas en el suero. Normal: 0-20 mm por hora. (En la tercera edad, el nivel normal puede ser aumentado a 30 mm por hora). Anormal: Un resultado que exceda el nivel normal. Un VSG que sea por encima de 100 mm/hr se considera muy anormal con alguna enfermedad significativa. Enfermedades Asociadas: Formas activas de artritis inflamatoria que están asociadas con una VSG elevada. Enfermedades de tejido conectivo, tal como, LES, esclerodermia y dermatomios-titis/-polimiostitis, todas pueden tener un resultado elevado 250 AutoinmunidadHumana durante la actividad de la enfermedad, pero no cuando las cosas son quiescentes. La polimialgia reumática casi siempre está asociada con un VSG elevado que generalmente excede los 80-100mm/hr. Esta prueba es una de dos que se realiza para estimar y medir la inflamación en el cuerpo. La otra prueba de inflamación se llama proteína C reactiva (PCR). La velocidad de sedimentación globular (VSG) es una forma excelente de buscar procesos inflamatorios o escondidos (ocultos) en el cuerpo. La osteoartritis(que no es un tipo de enfermedades de inflamación de articulaciones, sino más bien una enfermedad de cartílago) la VSG, generalmente es normal. La artritis reumatoide activa, la VSG se eleva moderada-mente o significativa-mente, dependiendo de que tan implicadas estén las articulaciones o implicación sistémica (de órgano). La interpretación de la VSG, siempre debe ser correlacionada con los hallazgos clínicos. 20.5.5Prueba:FactorReumatoide Descripción: El factor reumatoide es un Anticuerpo (IgM) formado hacia un Anticuerpo IgG que se observa y asocia, generalmente con la artritis reumatoide. La técnica tradicional conlleva el mirar por un microscopio para ver si hay aglutinamiento de las partículas de látex que hayan sido revestidas con IgG humano. Éste Anticuerpo IgM antiIgG, también puede medirse en una máquina llamada nefelómetro para obtener un resultado cuantitativo. Otra técnica es utilizando células de carnero que han sido revestidas con IgG de conejo. Normal: AR látex < 1:80 Título de aglutinación de células de carnero (SCAT) <1:10. Factor reumatoide por nefelome-tría (el nivel normal dependerá de los niveles de ese laboratorio en particular). Anormal: AR látex ≥ 1:80 SCAT ≥ 1:10 elevado, Por encima del nivel normal del laboratorio. Enfermedades Asociadas: Un factor reumatoide positivo generalmente se observa en artritis reumatoide y en altas cantidades se asocia con enfermedades más agresivas con más erosión de hueso y articulación. Se puede observar un factor reumatoide positivo en otras enfermedades crónicas que incluye enfermedades de hígado o de pulmones, o infecciones crónicas como por ejemplo, endocarditis bacteriana subaguda (Infección en las válvulas del corazón). Un nivel bajo o título puede también observarse en personas de la tercera edad sin tener presente ninguna enfermedad significativa y que simplemente está relacionado al envejecimiento. 20.5.6Prueba:NivelesdeSuerodeÁcidoÚrico Descripción: Esto generalmente se incluye como parte de un panel de química general, o se puede pedir por separado y ser determinado del suero del paciente. Normal: Dependiendo del laboratorio específico, generalmente menos de 8.0 mg por 100. Anormal: Un resultado que exceda el nivel normal del laboratorio. Enfermedades Asociadas: Un nivel de ácido úrico elevado se asocia con gota. En esta forma de artritis, cristales de ácido úrico se introducen en los espacios de las articulaciones incitando una reacción inflamatoria bastante potente. En ocasiones, el ácido úrico en el paciente puede haber caído dentro del nivel alto del nivel normal, si han 251 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico esperado varios días tras el ataque de la enfermedad antes de ir al médico. (Especialmente si el ataque está relacionado a un consumo excesivo de alcohol). Altos niveles de ácido úrico, generalmente son el resultado de una eliminación inadecuada del ácido úrico por los riñones. En niños, hay un estado inherente llamado síndrome Lesch-Nyhan, donde hay una sobre-producción de ácido úrico resultando en niveles muy altos de ácido úrico en la sangre. En adultos, adicional a un gran consumo de bebidas alcohólicas, tratamientos diuréticos para otros problemas, tal como, hipertensión, también puede contribuir a niveles de ácido úrico elevados. 20.5.7Prueba:ProteínaCreactiva(PCR) Descripción: Esta es una prueba utilizada para medir inflamación en el cuerpo. Se puede realizar mediante varias técnicas en diferentes laboratorios, incluyendo en un nefelómetro o mediante radioinmuno-análisis inmunodifusión. Normal: Menos de 2-.4 mg% con problemas menores, elevando esto a 1 mg% Anormal: Se pueden observar elevaciones moderadas de 1-10 mg% en enfermedades reumáticas, tal como artritis reumatoide y LES. Se pueden observar elevaciones más marcadas, por encima de 10 mg% en casos severos de vasculitis o en infecciones severas que amenazan contra la vida. Enfermedades Asociadas: Se observan niveles elevados de PCR en artritis reumatoide activa. Niveles más elevados pueden variar en LES con el interrogante de si los niveles más altos pueden ser observados en infecciones superpuestas en lupus. La vasculitis también puede aumentar la PCR, significativamente. 20.5.8Prueba:Anti‐Sci‐70oAntitopoisomerasa Descripción: Esta prueba es una prueba de inmunodifusión que muestra este autoAnticuerpo en hasta un 70 por ciento de los pacientes con esclerodermia. Este es un Anticuerpo de una enzima llamada ADN topoisomerasa, que es una enzima importante implicada en replicar y transcribir el ADN en el núcleo. Normal: Negativo. Anormal: Positivo, Tinción positiva en el patrón anti-centrómero. Enfermedades Asociadas: muy específico para el síndrome de Crest. En ocasiones se observa en un porcentaje bajo de pacientes con el fenómeno de Raynaud (50-90%). También se observa en esclerodermia sistémica difusa (5%). Pueden ser útiles las pruebas del paciente para buscar esclerodermia. 20.5.9 Prueba: Anticuerpo Anti‐Ribonucleoproteína (Anticuerpo anti‐ RNP) Descripción: Los Anticuerpos a ésta proteína celular, producen una patrón moteado en el AAN inmuno-fluorescente. Normal: Negativo. Anormal: Positivo. Enfermedades Asociadas: Un título más alto de Anticuerpos anti-U1 RNP, está asociado con enfermedades de tejido conectivo mixto, con características de LES, esclerodermia, y polimiostitis. Altos (niveles) de título de este Anticuerpo indica mucho hacia enfermedades de tejido conectivo mixto. 252 AutoinmunidadHumana 20.5.10Prueba:Anticuerpoanti‐Sm Descripción: Anticuerpo a un antígeno Sm asignando snRNP o pequeña ribonucleoproteína nuclear. Normal: Negativo. Anormal: Positivo. Enfermedades Asociadas: Esto se observa en aproximada-mente una tercera parte de pacientes de LES y es muy específica de lupus. Los niveles de este Anticuerpo, generalmente no fluctúan con la actividad de la enfermedad. 20.5.11Prueba:Anti‐SS‐A(anti‐Ro) Descripción: Los Anticuerpos están dirigidos a las proteínas citoplásmicas en un complejo con varios Anticuerpos ARN pequeños. Normal: Negativo. Anormal: Positivo. Enfermedades Asociadas: Esto se observa en el síndrome de Sjögren. También se le asocia con ocasionar bloqueo completo al corazón en recién nacidos, si la madre es antiSS-A positivo. Se observa en casi el 50 % de los pacientes con LES que también tienen síntomas del síndrome de Sjögren. Puede ser la causa de erupción en recién nacidos si la madre es SS-A positivo. Los pacientes SS-A positivo pueden tener lesiones de piel específicas denominada lupus cutáneo sub-agudo. Es importante hacer la prueba a madres que han tenido varios abortos naturales. Es posible que esta sea la única prueba en pacientes con lupus AAN-negativo. También se asocia en ocasiones con un bajo recuento de plaquetas. 20.5.12Prueba:Anti‐SS‐B(anti‐La) Descripción: Anticuerpos a pequeñas proteínas ARN que regulan la transcripción de ARN polimerasa 3. Normal: Negativo. Anormal: Positivo. Enfermedades Asociadas: Se observa en asociación con el síndrome de Sjögren y es menos común en LES. Esto ayuda con el diagnóstico del síndrome de Sjögren, pero los niveles pueden fluctuar. 20.5.13Prueba:Anticuerpoanti‐histona Descripción: Anticuerpo a estructuras celulares llamadas histonas cuya función es parte de la estructura nucleosoma. Normal: Negativo. Anormal: Positivo. Enfermedades Asociadas: Anticuerpos para el componente histona del núcleo que se observan con frecuencia en el lupus inducido por fármacos. Esto le puede suceder al paciente que esté bajo algún medicamento que se sabe que, induce al síndrome de lupus. Si se presenta un Anticuerpo antinuclear positivo, entonces se puede realizar la prueba de Anticuerpos histona para esclarecer si puede ser una situación de lupus producido por un fármaco o si es un LES típico. Es útil cuando se trata de diferenciar si el lupus es inducido por fármacos o es un lupus idiopático. 253 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 20.5.14Prueba:Anticuerpoanti‐cardiolipina Descripción: Esta es una prueba de sangre en busca de presencia de Anticuerpos IgG, IgM e IgA contra material cardiolipina fosfolípido, en el cuerpo. Normal: Negativo, < 10 unidades. Anormal: Positivo, Resultado alto > 80 unidades, Resultado medio de 20 a 80 unidades y resultados bajos de 10-20 unidades. Enfermedades Asociadas: Anticuerpos anti-cardiolipina se pueden encontrar en pacientes de lupus. En este caso hay una predilección por eventos trombóticos con pérdida de feto recurrente durante el embarazo, así como trombosis venosa profunda. Los Anticuerpos anti-cardiolipina pueden estar presentes en lo que se denomina el síndrome de episodios antifosfolípidos. Esto puede llevar a un infarto, a oclusión coronaria, a necrosis vascular de hueso y pérdida de feto recurrente. Niveles medios a altos de Anticuerpos anti-cardiolipina IgG son más específicos de APS. La prueba de niveles deberá repetirse cada tres meses si el diagnóstico (APS) está en duda ya que ciertas infecciones pueden ocasionar Anticuerpos positivos. 20.5.15Prueba:Lupusanti‐coagulante Descripción: Esta es una prueba que se realiza para identificar Anticuerpos que ocasionan anti-coagulación en pruebas de laboratorio y que están asociados con predilecciones de coagulación cuando hay trombosis en el cuerpo. Esto se puede observar en pacientes con el síndrome de anti-fosfolípido, o en LES. Puede ser responsable de un informe falso-positivo de una prueba VDRL de sífilis. Normal: Negativo. Anormal: Positivo. Enfermedades Asociadas: El lupus anti-coagulante positivo se puede observar en asociación con LES o con el síndroma anti-fosfolípido (APS). 20.5.16Prueba:HLA‐B27 Descripción: Esta es una prueba de sangre que debe ser realizada a tiempo para que aún haya linfocitos viables para una prueba de laboratorio. Esta prueba identifica la presencia del antígeno HLA-B27 en la superficie de las células del paciente. Normal: Resultado negativo. Anormal: Positivo para HLA-B27. Enfermedades Asociadas: El 90% al 95% de los pacientes con espondelitis anquilosante, tienen un resultado HLA_B27 positivo. El 8% de la población caucásica es B27 positivo. Entre los que tienen el gen HLA-B27, solamente aproximadamente el 20 % desarrollarán enfermedades reumáticas. El síndrome de Reiter también tiene una asociación de aproximadamente el 70% con el gen B27. En enfermedades de inflamación intestinal, especialmente con implicación de columna, el B27 puede estar presente en el 50% de las personas. Esta es una prueba útil si el diagnóstico no es claro, más no es necesaria para el diagnóstico de espondelitis anquilosante si hay radiografías de diagnóstico. También está asociado conuveítis recurrente, en un estado de inflamación de ojo. 254 AutoinmunidadHumana 20.5.17Prueba:Recuentosanguíneocompleto(RSC) Descripción: Este es un análisis completo de las células sanguíneas y que incluye las células rojas, así como las blancas y las plaquetas. También puede incluir un “diferencial” que es un porcentaje de los distintos tipos de células blancas presentes. Las plaquetas, que son un elemento esencial para la coagulación en el cuerpo, se cuantifican como parte del RSC. Normal: Hemoglobina 12-14 gm% con un recuento de leucocitos mayor a 4.000 por milímetro cúbico. Las plaquetas entre 150.000 y 450.000. Anormal: Valores que están por fuera del nivel normal. Una hemoglobina inferior a 12 mg%, representa anemia. Un conteo de leucocitos inferior a 4.000 se considera leucopenia. Un conteo de plaquetas inferior a 150.000 se considera trombocitopenia. Enfermedades Asociadas: La anemia puede ser el resultado de pérdida de sangre gastrointestinal. También puede ser el resultado de enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide. Puede ser ocasionado por deficiencias de hierro, de B12 o deficiencia fólica. Un recuento de leucocitos bajo puede observarse en pacientes con LES también se observa en pacientes con artritis reumatoide y con crecimiento de bazo en un estado conocido como el síndrome de Felty. Un recuento de plaquetas bajo se observa como manifestación de lupus. Todos estos elementos celulares pueden disminuir como respuesta a una supresión de la médula ósea ocasionada por varios fármacos utilizados en el tratamiento de enfermedades reumáticas, especialmente los fármacos inmunosupresores que tienen toxicidad de médula ósea como por ejemplo, pueden ser Cytoxan o Imuran. Si se siguen observando más leucocitos polimorfonucleares, ésto puede significar la presencia del proceso inflamatorio. Una alta predominancia de leucocitos se observa en enfermedades virales. Una disminución de hemoglobina y de glóbulos rojos se observan seguido de una pérdida de sangre o en enfermedades de inflamación crónicas. 20.5.18Prueba:PerfiltiroideoyTSH Descripción: Esta es una prueba de sangre que mide los niveles de hormonas de tiroides en el estado libre y proteico y crea un anexo que puede ser utilizado para determinar si el resultado es normal o no. Los niveles de hormona estimuladora de tiroides (THS) es la forma más sensata de diagnosticar hipotiroidismo. THS es producida por la glándula pituitaria y puede alcanzar niveles anormalmente altos si no se produce suficiente hormona de tiroides por la glándula de la tiroides. Por lo tanto un nivel de TSH elevado, es una indicación de la presencia de hipotiroidismo. Estos niveles pueden volver a su estado normal con los medicamentos de tiroides apropiados. Normal: El índice libre de tiroides varía dependiendo del laboratorio. (En nuestro laboratorio es de 1.24 a 4.5). Los niveles totales de T4 generalmente son de 4.5 a 12 o 12.5 mcg/100cc. Este nivel, general-mente es aproximada-mente 0.3 micro-unidades por mililitro hasta 4 micro-unidades por mililitro. Anormal: THS por encima de del nivel normal, generalmente 4.5 o más, es una indicación de hipotiroidismo Un FTI inferior al rango normal (menos de 1.2) también puede ser indicación de hipertiroidismo. Un nivel más elevado de 4.5 en el índice de libre de tiroides, puede ser una indicación de hipertiroidismo. Enfermedades Asociadas: El hipotiroidismo puede estar asociado con un elevado THS que está asociado con varios problemas reumáticos que incluyen síntomas de fibromialgia. También hay un aumento se síndrome de túnel de carpiano que está 255 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico asociado con hipotiroidismo. El hipertiroidismo puede estar asociado con un recambio de hueso excesivo con el desarrollo de la osteoporosis. También los pacientes con hipertiroidismo pueden desarrollar debilidad de músculos en aquellos músculos que están más cerca del cuerpo. (Miopatía). 20.5.19Prueba:Análisisdeorina Descripción: Se coloca una tira en contacto con la orina para buscar evidencia de glucosa o proteína excesiva presente. Se realiza una evaluación microscópica en busca de glóbulos rojos o blancos anormales, en la orina. Normal: No se ven cantidades significati-vas de células en el análisis bajo microscopio. Un resultado negativo de la tira sin proteína ni glucosa en la orina. Anormal: 1+ o más proteína en la tira, puede ser anormal y puede necesitarse un seguimiento de análisis de orina a las 24 horas, para cuantificar la proteína en la orina. Un nivel de glucosa elevado en la orina, deberá ser correlacionado con un suero de glucosa tomado en ayunas para ver si éste es anormal. Si hay un recuento alto de leucocitos en la orina y un historial que pudiera sugerir una infección del tracto urinario, entonces quizá sea necesario hacer un cultivo a la orina en busca de una infección activa. Si existe una cantidad persistente de glóbulos rojos en la orina (y no está cerca de la fecha del ciclo menstrual en la mujer), entonces será necesaria más investigación para encontrar la fuente de éstos glóbulos rojos. Enfermedades Asociadas: La proteína en la orina puede estar presente con cualquier enfermedad intrínseca de riñones, como en la nefritis lúpica. La presencia de glóbulos rojos o de lo que llamamos cilindros de células rojas sanguíneas, también pueden ser una indicación de nefritis lúpica. La proteína puede aparecer en la orina como consecuencia de una toxicidad de medicamentos que incluyen la terapia con oro o con penicilamina. 20.5.20Prueba:Nitrógenoureicosanguíneo(BUN)ysuerodecreatinina Descrición: Estas son pruebas de sangre que tienen que ver con la función de los riñones. La creatinina es el más fiable asesor del funciona-miento renal con una creatinina de 24 horas, y el laboratorio, calculando lo que llamamos una prueba de aclaración de creatinina. Este es un indicador prematuro y específico de disfunción renal. Las pruebas de BUN y de creatinina son análisis de sangre. Normal: Los niveles BUN varían dependiendo del laboratorio, pero pueden ser de 7 a 8 mg% hasta 26 mg%. Niveles normales de ceatinina son 0.6 mg% hasta 1.4 o 1.5 mg% dependiendo del laboratorio. Anormal: Los niveles que caen más allá del rango normal. Enfermedades Asociadas: Con una enfermedad renal activa como ocurre con nefritis lúpica, la creatinina puede elevarse hasta niveles muy altos. Ciertos medicamentos como cyclosporin, deben de ser monitoreados muy de cerca en busca de cambios en los niveles de creatinina aunque sean muy leves, con una disminución del fármaco posteriormente. Si se desarrolla una disfunción renal y los niveles de creatinina comienzan a elevarse, entonces se deberá ajustarse las dosis, diminuyéndolas, de ciertos medicamentos para prevenir niveles excesivos de estos medicamentos. Esto significa ajustes del metotrexate y de la leufonomida, por ejemplo, basándose en el nivel de creatinina. Un BUN elevado con niveles normales de creatinina, en ocasiones, 256 AutoinmunidadHumana sencillamente indica solamente una deshidratación o una diuresis excesiva, y esta situación necesita ser corregida. Es importante controlar los niveles de creatinina cuando los pacientes están bajo el tratamiento de fármacos antiinflamatorios, especialmente en la población de la tercera edad en la cual puede haber disfunción renal, como respuesta a estos medicamentos. 20.5.21 Pruebas de función de hígado, AST, (SGOT), ALT, (SGPT), fosfatasaalcalina,gammaglutamiltranspeptidasa(GGTP) Descripción: Estas son pruebas de sangre que se obtienen para controlar la función del hígado. Ésta es una parte vital en el tratamiento con metotrexate y leflunomida, para asegurarse que no se está desarrollando toxicidad. Normal: Un rango en particular de ese laboratorio en particular, en cada prueba. Anormal: Elevaciones por encima del rango alto normal, para ese laboratorio en particular. Enfermedades Asociadas: Elevaciones de fosfatasa alcalina puede provenir del hígado, pero también pueden provenir de huesos. Las pruebas especiales pueden ayudar a esclarecer la fuente de estas elevaciones. Mediante la fosfatasa alcalina es una forma importante de monitorear la enfermedad de Paget durante el tratamiento. Los resultados de esta prueba son elevados en la enfermedad de Paget, activa, pero con un tratamiento adecuado, pueden disminuir hasta llegar al rango normal. Los niveles de transaminasa con elevaciones de ALT y de AST, se pueden observar como resultado de medicamentos que ocasionan inflamación de hígado. También pueden ser indicativos de una hepatitis, tal como hepatitis C, infección (que puede tener síntomas músculo-esqueléticos asociados, como dolor de articulación en conjunto con anormalidades de hígado). Se sabe que Clinoril (sulindac) ocasiona anormalidades en el funcionamiento del hígado, en un pequeño porcentaje de pacientes, y ésto debe ser monitoreado. Una causa común de elevaciones de ALT/AST, es un hígado graso, que es un estado benigno. 20.5.22Prueba:Calcio Descripción: Esta es una prueba de sangre utilizada para medir el nivel de calcio en el suero. Normal: Generalmente de 8.5 a 10.5 mg%. Anormal: Resultados que puedan estar por encima del rango normal. Enfermedades Asociadas: Un resultado elevado de calcio, puede estar asociado con un exceso de hormona paratiroidea (PTH). Esto puede suceder secundario a un tumor en la glándula paratiroides (que está ubicada detrás de la glándula tiroides). Con una elevación de los niveles de PTH, los pacientes pueden estar predispuestos a depositar cristales de calcio en el cartílago de las articulaciones. (cóndor-calcinosis). 257 CUESTIONARIO AutoinmunidadHumana Cuestionario 1. La respuesta inespecífica o innata es: a. Suficiente para defender eficazmente al organismo b. La primera barrera defensiva del organismo c. Puede ser humoral y celular 2. Los linfocitos pueden ser: a. De dos tipos: B y T b. De tres tipos: B, T y S c. De un tipo sólo: B 3. La respuesta inmune es regulada por moléculas conocidas como: a. Linfocinas b. Antígenos c. Citotóxicas 4. Cuando por primera vez un antígeno se pone en contacto con el organismo, se produce una respuesta inmune que se denomina: a. Respuesta secundaria b. Respuesta adaptativa c. Respuesta primaria 5. Los sistemas de defensa: a. No pueden ser causa de enfermedad b. No actúan frente componentes propios c. En ocasiones son en sí una causa de enfermedad y se llama reacciones de hipersensibilidad 6. La Autoinmunidad Patológica viene definida por: a. Reacciones de base inmunológica, habitualmente persistentes y de corta duración, en las que intervienen antígenos propios (autoantígenos) b. Reacciones de base inmunológica, habitualmente persistentes y de larga duración, en las que intervienen antígenos propios (autoantígenos) c. Reacciones de base inmunológica, habitualmente persistentes y de larga duración, en las que no intervienen antígenos propios (autoantígenos) 261 7. Una enfermedad autoinmune: a. Frecuentemente viene precedida de una enfermedad infecciosa b. No viene predecida de una enfermedad infecciosa c. Siempre viene precedida de una enfermedad infecciosa 8. Las proteínas de estrés son producidas: a. Exclusivamente por las células procariotas b. Exclusivamente por las células eucariotas c. Por todas las células eucariotas y procariotas 9. Pueden inducir a la aparición de enfermedades autoinmunes: a. Ciertas drogas b. Las hormonas sexuales femeninas c. Ambas 10. Las células inmunocompetentes están: a. En concentración mínima en los ganglios linfáticos y bazo b. En concentración máxima en los ganglios linfáticos y bazo c. No se encuentran en ninguna de éstas zonas 11. El timo es un órgano: a. Donde maduran los linfocitos B. b. Que presenta su máximo desarrollo en el feto y en el niño c. Que está situado en la parte inferior del mediastino anterior 12. El marcador dará origen a los linfocitos T supresores circulantes: a. CD8 b. CD2 c. CD7 13. El proceso de diferenciación de los timocitos a linfocitos maduros: a. Se crean nuevos timocitos b. Se crean gran número de células c. Se destruyen gran número de células 14. La denominación de macrófagos engloba: a. Una serie de células con características similares y con funciones distintas b. Una serie de células con características distintas y con funciones similares c. Una serie de células con características funciones similares 15. Los granulocitos neutrófilos se caracterizan por: a. Poseer una vida muy larga (más de 48 h) b. Poseer una vida muy corta (menos de 48 h) c. Por ser células de pequeño tamaño AutoinmunidadHumana 16. ¿Qué tipos de cadenas ligeras hay? a. Cadenas ligeras tipo kappa (k) b. Cadenas ligeras tipo lambda (l) c. Ambas son correctas 17. La cadena L tiene: a. 2 dominios b. dominios c. dominios 18. La consecuencia final de la acción de las inmunogoblinas es: a. Destruir al antígeno b. Neutralizar los efectos nocivos de los mismos c. Ambas son correctas 19. La concentración de inmunoglobulina D en suero es: a. Muy alta b. Muy baja c. Nula 20. Las moléculas de histocompatibilidad se localizan: a. En el interior de las células de las distintas especies animales b. En la superficie de las células de las distintas especies animales c. En las cadenas L 21. Se conocen 2 tipos de endocitosis a. Pinocitosis y excrocitosis b. Endocitosis y sacrocitosis c. Pinocitosis y fagocitosis 22. Las citocinas son moléculas: a. De bajo peso molecular constituidas por 120-180 aminoácidos b. De bajo peso molecular constituidas por 220-280 aminoácidos c. De alto peso molecular constituidas por 220-280 aminoácidos 23. La molécula CD4: a. Pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y está formada por dos cadenas b. Pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y está formada por una cadena c. Pertenece a la superfamilia de los receptores de citocinas y está formada por dos cadenas 263 TécnicosSuperioresSanitariosdeLaboratoriodeDiagnósticoClínico 24. La citotoxicidad natural consiste en: a. Lisis de una gran variedad de células de manera espontánea y sin necesidad de un periodo de sensibilización previa b. Lisis de un único tipo de células de manera espontánea y sin necesidad de un periodo de sensibilización previa c. Lisis de una gran variedad de células de manera espontánea y con necesidad de un periodo de sensibilización previa 25. La activación del complemento puede iniciarse por: a. La vía clásica b. La vía alternativa c. Ambas son correctas 26. La citotoxicidad celular consiste en: a. La capacidad para unirse a otras células y formar otras nuevas b. La capacidad para introducir en otras células factores externos c. La capacidad para interaccionar con otras células y destruirlas 27. La tolerancia: a. Es un fenómeno de naturaleza inmunológica b. Es específica de cada antígeno c. Las dos son correctas 28. Los procedimientos inmunológicos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac: a. Son los más útiles y prácticos b. Son inespecíficos c. No son eficaces 29. En la anemia perniciosa la bilirrubina indirecta sérica es: a. Normal b. Elevada c. Baja 30. El lupus eritomatoso sistémico (LES): a. Es una enfermedad de etiología desconocida b. Es un padecimiento autoinmune agudo con componente inflamatorio leve c. Las dos son correctas 264
