anexo i

ANEXO I
Medios de Cultivo
NOTA
Los medios de cultivo son presentados
independientemente de su estado físico.
en
orden
alfabético,
Agua Peptonada.
Peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada
1,0 g
8.5 g
1,0 L
Disolver los componentes de la formulación en un litro de agua y ajustar la
solución a pH de 7,0, con solución de hidróxido de sodio 1N; distribuir en matraces
o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la técnica y esterilizar a 121°C±1°C
durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes y el pH de la
solución deben ser iguales a los iniciales.
Agua Peptonada Alcalina (APW).
Peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada
10,0 g
10,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar
éste sea de 8,5± 0,2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121ºC.
Principio de acción
Medio utilizado para enriquecimiento selectivo del género Vibrio ya que las
condiciones óptimas de desarrollo se favorecen por un pH alcalino.
Agua de Peptona amortiguadora.
Peptona
Cloruro Sódico
Fosfato sódico dibásico
Fosfato potásico monobásico
10,0 g
5,0 g
3,5 g
1,5 g
Agua destilada
1,0 L
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH,
después de la esterilización a 7,0 en caso de ser necesario. Distribuir en
recipientes de vidrio con la capacidad necesaria para obtener las porciones
necesarias para la prueba. Esterilizar a 121±1°C durante 20,0 minutos.
Principio de acción
El agua de peptona tamponada al ser un medio nutritivo no selectivo, puede ser
utilizada como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo
de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperación de
células dañadas por los procesos de conservación de alimentos.
Almidón, agar.
Peptona
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Almidón de maíz
Agar
Agua destilada
5,0 g
3,0 g
5,0 g
10,0 g
20,0 g
1,0 L
Suspender homogéneamente el almidón, en 100 mL de agua destilada fría, hasta
eliminar cualquier grumo. Por otra parte, disolver los demás ingredientes en 900
mL de agua, calentar y agitar continuamente. Ajustar el pH a 7.2±0,1 y añadir la
suspensión de almidón a la solución anterior, agitar continuamente hasta completa
homogeneización. Esterilizar a 121°C, durante 15 minutos
Principio de acción:
Esta prueba se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos de
hidrolizar el almidón (polisacárido); este compuesto está constituido por un
conjunto de unidades de α-D-glucosa cuya estructura química es una hexosa. Por
otra parte, se sabe que el almidón forma un complejo de color azul intenso en
presencia de yodo, en ocasiones la coloración es rojiza debido al alto contenido de
dextrinas que presenta el almidón, sin embargo los mono y disacáridos no se
enlazan con el yodo, por lo tanto no dan coloración azul ni rojiza. Algunos
microorganismos contienen enzimas como las α o β amilasas, capaces de
hidrolizar el almidón dando como productos de la reacción mono o disacáridos, por
lo que al adicionar a estos azúcares la solución de yodo, no aparecerá coloración
azul ni rojiza (no confundir con el color de la solución de yodo que es café).
Arginina y glucosa, agar.
Peptona
Extracto de levadura
Triptona
Cloruro de sodio
Glucosa
Clorhidrato de L-arginina
Citrato férrico amónico
Tiosulfato de sodio
Púrpura de bromocresol
Agar
Agua destilada
5,0 g
3,0 g
10,0 g
20,0 g
1,0 g
5,0 g
0,5 g
0,3 g
0,2 g
13,5 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en agua destilada y hervir hasta disolución del agar;
envasar cantidades de 5,0 mL en tubos de 13 X 100 mm. Ajustar el pH entre 6.8 y
7,0, Esterilizar en autoclave a 121°C durante 10 a 12 minutos. Dejar solidificar el
medio inclinando los tubos.
Principio de acción:
La descarboxilación del aminoácido L-arginina, es realizada por microorganismos
que poseen la enzima descarboxilasa y se lleva a cabo cuando se rompe la unión
del grupo carboxilo, liberando dióxido de carbono (gas) y formando putrescina,
esta última es una diamina que se caracteriza por presentar reacción alcalina. Por
otra parte el indicador, púrpura de bromocresol en medio alcalino presenta una
coloración púrpura y en medio ácido es amarillo. Por lo tanto si se produce
putrescina el medio intensifica el color púrpura por la alcalinidad producida, en
caso contrario el medio no cambia de color; finalmente también se podrá observar
la fermentación de la glucosa con su respectiva producción de acidez, virando el
medio a color amarillo verdoso.
ASTEL, agar. (Ver: Soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura,
agar).
Baird Parker, agar.
Ingredientes del medio base*
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Extracto de carne
Glicina
Cloruro de litio
Piruvato de sodio
Agar
Agua destilada
10,0 g
1,0 g
5,0 g
12,0 g
5,0 g
10,0 g
15,0 g
950,0 mL
Suspender 58,0 g del medio en 950 mL de agua y calentar con agitación
constante, dejando hervir durante un minuto, posteriormente esterilizar a
121°C±1,0°C durante 15 minutos. Enfriar y mantener el medio a 45°C.
Solución de telurito de potasio:
Preparar una solución de telurito de potasio al 1% en agua, esterilizar a 121°C
durante 15 minutos. La solución puede ser almacenada por varios meses a una
temperatura entre 0 y 5°C.
Emulsión de yema de huevo:
La preparación de la emulsión de yema de huevo, también se realiza por
separado, para lo cual lavar los huevos frescos con agua y jabón, enseguida
limpiar los cascarones con una solución de tintura de yodo (solución alcohólica al
2%), o bien sumergirlos en una solución de cloruro mercúrico (1:1000); enjuagar
con agua estéril y secar con gasa también estéril. En una campana de flujo
laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador
de claras estéril. Transferir las yemas en una probeta, hasta un volumen de 60,0
mL y completar a 90,0 mL con solución salina isotónica estéril, posteriormente
verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer que contenga perlas de vidrio estériles
y agitar fuertemente para que se forme la emulsión, después se filtra sobre gasa
estéril.
Preparación del medio:
Medio base
Solución de telurito de potasio
Emulsión de yema de huevo
95,0 mL
1,0 mL
5,0 mL
Mezclar perfectamente bien los ingredientes, manteniendo el medio a 45°C,
posteriormente repartir en cajas de Petri entre 15,0 y 20,0 mL de este medio, dejar
enfriar hasta solidificación del medio. Las cajas pueden almacenarse hasta por 48
h. después de su preparación, conservándolas a una temperatura entre 0 y 5°C.
Principio de acción:
S. aureus tiene la capacidad de reducir el telurito de potasio (K2O3Te) a telurio
metálico (Te), por esta razón las colonias se presentan de color negras metálicas
de acuerdo a la siguiente reacción:
Te4+
Te0
Las lecitinas son fosfoglicéridos, cuya estructura corresponde a ésteres de ácidos
grasos unidos con el ácido fosfórico, glicerol y colina; son componentes normales
de la yema de huevo. Las lecitinas pueden ser hidrolizadas por enzimas
denominadas lecitinasas, existen 4 tipos de ellas, la A; B; C y D, siendo la “C” la
producida generalmente por las bacterias; los productos de dicha hidrólisis son
ácido fosfórico y colina, por esta razón las colonias de S. aureus patógeno, al
llevar a cabo la hidrólisis de la lecitina, forma halos transparentes alrededor de la
colonia negra (reducción del telurito), además al romperse las uniones
lipoprotéicas, se liberan grasas que son insolubles en el medio provocando una
opalescencia alrededor de la colonia.
Bilis rojo violeta, agar.
Peptona de carne
Extracto de levadura
Cloruro de sodio
Lactosa
Mezcla de sales biliares
Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
Agua destilada
7,0 g
3,0 g
5,0 g
10,0 g
1,5 g
0,03 g
0,002 g
13,0 g
1,0 L
Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750,0 mL de agua,
posteriormente ajustar el pH a 7.4±0,1 y esterilizar en matraz durante 30 minutos
en baño de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento.
Principio de acción:
La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en
el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el
desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se
presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química
básica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno.
Bilis verde brillante, agar.
Bilis de buey deshidratada
Lactosa
Peptona de gelatina
Verde brillante
Agar
Agua destilada
20,0 g
10,0 g
10,0 g
0,0133 g
18,0 g
1,0 L
Suspender 40,0 g del medio en un litro de agua destilada, agitando
constantemente para ayudar a la humectación, después hervir con agitación
constante para evitar que éste se queme. Se esteriliza en matraz a 121°C±1,0°C
durante 15 minutos.
Principio de acción:
La bilis de buey que contiene el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram
positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes Gram negativas. Las
sales biliares son derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química
básica es la del ciclo pentano perhidrofenentreno. Salmonella, desarrolla bien en
este medio y presenta colonias rosas. Sus requerimientos nutricionales se
satisfacen con la lactosa y la peptona de gelatina.
Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila).
Bilis de buey deshidratada
Lactosa
Peptona de gelatina
Verde brillante
Agua destilada
20,0 g
10,0 g
10,0 g
0,0133 g
1,0 L
Suspender 40,0 g de medio en un litro de agua destilada, agitar constantemente
para ayudar a la disolución. Distribuir el medio de cultivo en tubos de ensayo que
contengan campanas de Durham. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Tener
cuidado que ninguna campana de Durham presente gas después de la
esterilización.
Principio de acción:
La enzima β-D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, hidroliza a la
lactosa presente en el medio de cultivo, produciendo glucosa y galactosa,
monómeros que, secuencialmente, son metabolizados hasta ácidos y CO2; este
último subproducto se detecta en las campanas de fermentación después de
incubar de 24 a 48 h.
Este medio de cultivo posee dos inhibidores bacterianos: las sales biliares y el
verde brillante. Las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos Gram
positivos y también tienen efecto tóxico sobre algunos microorganismos Gram
negativos. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y
desoxicólico, su estructura química básica es la de ciclo pentano
perhidrofenantreno.
El verde brillante es un colorante que inhibe el desarrollo de bacterias Gram
positivas y la mayoría de bacilos Gram negativos excepto los coliformes. Incluso
suprimen el crecimiento de los microorganismos anaerobios fermentadores de la
lactosa como el Clostridium perfringens que daría reacciones falsas positivas.
BPLS modificado, agar.
Peptona de carne
Extracto de levadura
Extracto de carne
Fosfato monobásico de sodio
10,0 g
3,0 g
5,0 g
0,6 g
Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4)
Lactosa
Sacarosa
Rojo de fenol
Verde brillante
Agar
Agua destilada
1,0 g
10,0 g
10,0 g
0,09 g
0,0047 g
12,0 g
1,0 L
Suspender 52,0 g del medio en 750,0 mL de agua, para humectar los polvos
insolubles, después adicionar el resto del agua y calentar a ebullición durante un
minuto, el pH final debe ser de 6.9. No esterilizar el medio y repartirlo en cajas
Petri.
Principio de acción:
En este medio se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa, las
cuales presentan colonias que viran el medio a color amarillo por la formación de
acidez a partir del azúcar. Las colonias rojas indican que los microorganismos no
fermentan la lactosa.
Brewer anaeróbico, agar.
Peptona de caseína
Peptona de soya
Cloruro de sodio
L-cistina
Dextrosa
Tioglicolato de sodio
Formaldehído sulfoxilato de sodio
Azul de metileno
Agar
Agua destilada
10,0 g
5,0 g
5,0 g
0,4 g
10,0 g
2,0 g
1,0 g
0,002 g
12,6 g
1,0 L
Suspender 55,0 g del medio en 750,0 mL de agua para humectar perfectamente
bien, posteriormente adicionar el resto del agua, agitar y calentar hasta ebullición
durante un minuto o bien hasta que el medio se disuelva por completo. Esterilizar
en autoclave a 121°C durante 15 minutos; el pH final debe ser de 7.2±0,2.
Principio de acción:
El tioglicolato de sodio consume el oxígeno ambiental, creando una atmósfera
anaeróbica, que es el objetivo de este medio. Además este medio contiene más
sustancias reductoras como la cistina, el sulfoxilato y el formaldehído, los cuales
garantizan una anaerobiosis suficiente para los microorganismos. El azul de
metileno es un indicador para reacciones de óxido reducción.
Bismuto sulfito, agar.
Extracto de carne de res
Mezcla de peptonas
Glucosa
Fosfato sódico dibásico (anhidro)
Sulfato ferroso (anhidro)
Sulfito de bismuto
Verde brillante
Agar
Agua destilada
pH final
5,0 g
10,0 g
5,0 g
5,0 g
0,3 g
8,0 g
0,025 g
20,0 g
1,0 L
7,6±0,2
Suspender todos los ingredientes en el agua destilada. Calentar hasta su
disolución completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45°C y
verter en cajas de Petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el
precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, ce color verde
pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la coloración es parda,
no deben utilizarse. El medio no debe esterilizarse en autoclave; el
sobrecalentamiento afecta su selectividad.
Principio de acción:
En este medio el sulfito de bismuto actúa con el verde brillante como agente
selectivo para la inhibición de coliformes, permitiendo el desarrollo de Salmonella.
Los compuestos de azufre funcionan como sustrato para la producción de ácido
sulfhídrico, mientras que la reducción de las sales de bismuto a bismuto metálico
tiñe las colonias de un brillo negro o café metálico por la reducción del sulfito a
sulfuro, produciendo ácido sulfhídrico.
BRILA, caldo (Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo).
Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar (mCPC)
Solución 1:
Peptona
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Solución Stock de colorante 1000 X
Agar
Agua destilada
10,0 g
5,0 g
20,0 g
1,0 mL
15,0 g
0,9 L
Ajustar el pH a 7.6, posteriormente hervir hasta que el agar se funda, después
esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 55°C.
Solución stock de colorantes 1000 X:
Azul de bromotimol
Rojo de cresol
Etanol al 95%
4,0 g
4,0 g
100,0 mL
Para obtener un color firme del medio, usar una solución colorante stock, en lugar
de estar pesando repetidamente los colorantes en polvo. Disolver los colorantes
en el alcohol etílico hasta obtener una concentración de 4% (peso/volumen); de
esta solución se toma un mililitro y se adiciona a un litro del medio mPCP (solución
1), que se encuentra enfriado entre 48 y 55°C.
Solución 2:
Celobiosa
Colistina
Polimixina B
Agua destilada
10,0 g
400000 UI
100000 UI
0,1 L
Disolver la celobiosa por calentamiento en agua destilada, enfriar y agregar los
antibióticos. Esterilizar por filtración y adicionar la solución 2 a la solución 1,
mezclar y distribuir en cajas Petri.
Principio de acción:
La polimixina B, es un antibiótico que inhibe el crecimiento de microorganismos
Gram positivos, esto es un antibiótico de espectro reducido. Permite entre otros, el
desarrollo del género Vibrio, por ser éstos Gram negativos. Además contiene una
alta concentración de cloruro de sodio, en el que desarrollan los microorganismos
halotolerantes.
Cianuro, caldo (KCN).
*Cianuro de potasio
0,5 g
Polipeptona
3,0 g
NaCl
5,0 g
KH2PO4
0,225 g
Na2HPO4
5,64 g
Agua destilada
1,0 L
Disolver todos los ingredientes excepto el cianuro de potasio, esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 min.
Principio de acción.
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último
eslabón de la cadena respiratoria aerobia, transfirió electrones al oxígeno con
formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en oganismos aerobios y
anaerobios facultativos, lo que posibilita la identificación de aquéllos que carecen
de dicha enzima. El cianuro interrumpe el último eslabón de la cadena respiratoria,
sin embargo hay microorganismos que generan su energía metabólica por vías
alternas.
Cuenta Estándar, agar (Ver Métodos estándar, agar).
Citrato Simmons, agar.
Sulfato de magnesio
Fosfato dihidrogenado de amonio
Fosfato dipotásico
Citrato de sodio tribásico
Cloruro de sodio
Azul bromotimol
Agar
Agua destilada
pH
0,2 g
1,0 g
1,0 g
2,0 g
5,0 g
0,08 g
15,0 g
1,0 L
7,0 ±0,2
Disolver 23,0 g en 1 litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para disolver
completamente los ingredientes. Distribuír en tubos y esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 min. Inclinar los tubos después de esterilizar. Enfriar antes de su
uso y conservar en refrigeración (4-10 °C). La caducidad es aproximadamente de
6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo en medio sólido (se recomienda
agar Kligler hierro); no se recomiendan las suspensiones en caldo. Estriar SOLO
EN EL PICO DE FLAUTA
Principio de acción.
El agar Citrato de Simmons se recomienda para la diferenciación de la familia
Enterobacteriaceae basada en la capacidad de utilizar el citrato como única fuente
de carbono. La energía puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia
de fermentación o producción de ácido láctico por la utilización del citrato como
única fuente de carbono. Los microorganismos podrán introducir el citrato al
citoplasma por una permeasa, donde ocurre un desdoblamiento a través de la
enzima citrato oxaloacetato liasa, dando como productos acetato, formato, lactato
y/o dióxido de carbono. El medio contiene también sales inorgánicas de amonio.
Un microorganismo que puede utilizar el citrato como fuente de carbono también
utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno, éstas son degradadas
a amoniaco alcalinizando el medio con lo cual se genera el vire del indicador azul
de bromotimol de verde a pH neutro a un color azul a pH alcalino, considerándose
de esta forma la reacción como positiva.
Descarboxilasa (arginina, lisina y ornitina), medio base.
Peptona
Extracto de levadura
Dextrosa (D-glucosa)
Púrpura de bromocresol
Agua destilada
•
•
5,0 g
3,0 g
1,0 g
0,02 g
1,0 L
Se sugiere añadir 20,0 g de cloruro de sodio, en cada litro de medio de cultivo,
cuando se desee identificar Vibrio cholerae; para Vibrio spp. halofílicos,
adicionar 15,0 g de cloruro de sodio en cada litro de medio base; para otros
géneros y especies de microorganismos seguir la formulación descrita.
Adicionar 5,0 g del aminoácido de prueba; arginina, lisina y ornitina, en cada
litro de medio base.
Como control, usar base sin suplemento (aminoácido). El medio se distribuye en
tubos y se esterilizan a 121°C durante 10 minutos; el pH del medio después de
esterilizar debe estar en 6.5±0,2
Principio de acción
La base de nutrientes de este medio, permite las mejores condiciones de
desarrollo de los microorganismos. La descarboxilación del aminoácido que
contiene el medio de cultivo y que se realiza por la enzima descarboxilasa que
poseen algunos microorganismos, provocan la liberación del grupo carboxilo,
quedando el grupo amino en el medio de cultivo, por lo que el medio se alcaliniza,
dando una coloración púrpura.
La lisina al ser descarboxilada, da como producto la cadaverina, en tanto que la
ornitina y arginina, dan como productos finales putrescina. Debido a que la
descarboxilación solamente se lleva a cabo en medio ácido (por debajo de pH
6,0), el medio debe acidificarse mediante la fermentación de la glucosa; esto
quiere decir que este medio sólo se utiliza para la diferenciación de
microorganismos fermentadores de la glucosa y que posean la enzima
descarboxilasa.
Los microorganismos que son descarboxilasa negativos, pero son fermentadores
de la glucosa, ocasionan que el medio se acidifique, por lo que el indicador vira a
amarillo. En períodos de incubación muy prolongados, se puede presentar
alcalinización de la superficie del medio, dando por consecuencia un cambio en el
color del medio, esto es se intensifica el color violeta.
DNA, agar.
Ácido desoxirribonucléico (DNA) helicoidal de timo de ternera o 0,03 g
equivalente
Agar
1,0 g
Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01M
0,1 mL
Cloruro de sodio
1,0 g
Solución de azul de toluidina 0,1M
0,3 mL
Solución de Tris-(hidroximetil- aminometano) 0,05M, pH 9,0
100,0 mL
Mezclar todos los ingredientes, excepto el azul de toluidina y agitar hasta
disolución del ácido desoxirribonucléico, calentar a ebullición. Posteriormente
adicionar el azul de toluidina y distribuir en frascos pequeños con tapón de hule;
NO ES NECESARIO ESTERILIZAR. Este medio es estable a temperatura
ambiente aún después de 4 meses, funciona de manera correcta aún después de
fundido varias veces.
Principio de acción:
Los ácidos nucleicos, están constituidos por azúcar-fosfato-bases nitrogenadas, el
azúcar es la β-D-desoxirribosa, que forma uniones éster con el ácido fosfórico,
unidas también a bases nitrogenadas como la adenina, guanina, timina y citosina,
dando una forma en el espacio de una espiral o helicoidal. Estos ésteres pueden
ser hidrolizados por enzimas; en el caso de la hidrólisis del DNA por la nucleasa
microcóccica (S. aureus), se producen principalmente mono y dinucléotidos, son
productos de la ruptura del azúcar (carbono 3´ y 5´) con el fosfato. Es importante
hacer notar que la enzima DNAasa, es más activa sobre el DNA desnaturalizado
(por calentamiento) que sobre el DNA original, además es una característica de S.
aureus patógeno.
Dulcitol rojo de fenol, caldo.
Peptona de caseína
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Rojo de fenol
Dulcitol
Agua destilada
pH
10,0 g
1,0 g
5,0 g
0,018 g
10,0 g
1,0 L
7,4±0,2
Pesar con precisión la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua
destilada. Calentar suavemente la solución. El carbohidrato se puede agregar
antes de la esterilización. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar
116-118°C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilización del medio
base SIN EL CARBOHIDRATO a 121°C durante 15 min, enfriar el medio base a
±45°C y agregar la solución del carbohidrato esterilizada por filtración en
membrana. Distribuir en tubos estériles. Conservar en refrigeración (4-10°C). La
caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo
puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubación.
Principio de acción
Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato
específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible. La
fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un
sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos
característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos
acético y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y
CO2, f) ácido succínico a ácido propiónico y CO2, g) CO2 y acetona a alcohol
isopropílico y h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para
demostrar la fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la
mayoría de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y
generaran un vire del indicador a amarillo.
EC, caldo (Escherichia coli, caldo para).
Bacto triptosa
Bacto lactosa
Bacto sales biliares No. 3
Fosfato dipotásico
Fosfato monopotásico
Cloruro de sodio
Agua destilada
20,0 g
5,0 g
1,5 g
4,0 g
1,5 g
5,0 g
1,0 L
Disolver todos los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente
para una mejor disolución. Ajustar el pH a 6.9 ± 0,2 (25ªC) y distribuir 10 mL del
medio a cada tubo de ensayo, con campanas de Durham. Esterilizar en autoclave
durante 15 minutos a 121°C. Se recomienda que antes de abrir la autoclave, se
deje bajar la temperatura a 75°C para evitar que se introduzcan burbujas de aire
en las campanas de Durham.
Principio de acción:
La lactosa es hidrolizada por la enzima β-D-galactosidasa presente en las
bacterias coliformes, generándose como subproductos glucosa y galactosa que,
secuencialmente, son metabolizados hasta ácidos y CO2; este último se detecta
en las campanas de Durham. Cuando la fermentación de lactosa se lleva a cabo a
44.5 °C la prueba positiva indica presencia de Escherichia coli.
Las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas
particularmente los bacilos y los estreptococos fecales. La triptona constituye la
fuente más importante de nutrimentos y los fosfatos constituyen el sistema
regulador del pH. El cloruro de sodio regula el equilibrio osmótico.
EC-MUG, caldo (Escherichia coli, caldo con metilumbeliferil glucurónido).
Preparar el caldo EC y adicionar 50,0 mg de 4-metilumbeliferil- (MUG) por cada
litro medio de cultivo antes de esterilizar (121°C por 15 minutos).
Principio de acción:
Alrededor del 97% de las cepas de E. coli (incluidas las no productoras de gas)
producen la enzima β -D-glucuronidasa (GUD), la cual escinde al sustrato MUG
dando como producto final la 4-metilumbelliferona; este último compuesto es
fácilmente detectable cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta.
Eosina azul de metileno de Levin, agar (EMB-L).
Peptona
Lactosa
Fosfato dibásico de potasio
Eosina Y
Azul de metileno
Agua destilada
10,0 g
10,0 g
2,0 g
0,4 g
0,065 g
1,0 L
Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua, calentar a ebullición
hasta la disolución completa. Posteriormente distribuir en porciones de 100 ò 200
mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos; el pH debe ser de 7.1 ± 0,2.
Fundir el medio antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 mL:
a) 5 mL de solución de lactosa al 20%
b) 2 mL de solución acuosa de eosina al 2%
c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%.
Nota: Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Principio de acción
El agar eosina azul de metileno es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La
acción selectiva se debe a la presencia de los colorantes eosina y azul de
metileno, los cuales inhiben el crecimiento de las bacterias Gram-positivas.
El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos
fermentadores de lactosa y productores de una gran cantidad de ácido, de
aquellos microorganismos que producen poco ácido, o que no fermentan la
lactosa. Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa
productores de gran cantidad de ácido se observan de color verde metálico, esto
se debe a la precipitación de los colorantes -sobre la superficie de las colonias e
incluso en la superficie del medio de cultivo-, cuando las condiciones son
extremadamente ácidas.
Eosina azul de metileno, agar (EMB-lactosa sacarosa, agar).
Peptona
Lactosa
Sacarosa
K2HPO4
Eosina Yellow
Azul de metileno
Agar
Agua destilada
10,0 g
5,0 g
5,0
2,0 g
0,4 g
0,065 g
13,5 g
1,0 L
Humectar y disolver los ingrediente, posteriormente hervir el medio y ajustar el pH
a 7.1 ± 0,2, esterilizar a 121ºC durante 15 minutos y finalmente verter en placas.
Principio de acción
La sacarosa y lactosa permiten distinguir al género Salmonella y Shigella, (porque
ambas no fermentan dichos azúcares), de la flora acompañante, por ejemplo
Citrobacter, Aeromonas y Proteus las cuales no fermentan la lactosa pero sí la
sacarosa; cuando el resto de la flora acompañante son bacterias Gram positivas,
éstas son inhibidas por la eosina y el azul de metileno.
Entérico de Hektöen, agar.
Proteosa peptona
Extracto de levadura
Lactosa
Sacarosa
Salicina
Sales biliares
12,0 g
3,0 g
12,0 g
12,0 g
2,0 g
9,0 g
Cloruro de sodio
Tiosulfato de sodio
Citrato férrico amoniacal
Azul de bromotimol
Fucsina ácida
Agar
Agua destilada
5,0 g
5,0 g
1,5 g
0,064 g
0,1 g
13.5 g
1,0 L
pH final
7,5±0,2
Suspender los ingredientes en el agua destilada estéril, hervir con agitación hasta
la disolución completa del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar entre 55 y 60°C,
posteriormente distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.
Principio de acción
La concentración alta de peptona, disminuye la actividad inhibitoria de las sales
biliares en contra de las especies de Shigella. Los carbohidratos adicionales
(sacarosa y salicina) mejoran la diferenciación con respecto a la lactosa, y la
menor toxicidad del doble indicador mejora la recuperación. Debido a los dos
indicadores, azul de bromotimol y fucsina ácida, las colonias lactosa-positivas
muestran una diferencia cromática de color amarillo, frente a las colonias lactosanegativas (colonias azules o verdes). Igual ocurre en el caso de colonias que
fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina,
sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de
patógenos falsamente positivos. El incremento en el contenido de lactosa ayuda al
reconocimiento principal de los organismos que fermentan la lactosa lentamente.
El tiosulfato y el citrato férrico se utilizan para la detección de los organismos
productores de ácido sulfhídrico por reducción del tiosulfato. Una mezcla de sales
biliares inhibe a una gran parte de la microbiota acompañante. Se recomienda la
adición de novobiocina en una concentración de 15,0 mg/mL, lo cual mejora la
selectividad del medio inhibiendo a especies de Citrobacter y Proteus.
Esculina bilis, agar.
Extracto de carne
Peptona
Sales biliares
Citrato férrico amoniacal
Esculina
Agar
Agua destilada
3,0 g
5,0 g
40,0 g
0,50 g
1,0 g
15,0 g
1000,0 mL
Disolver por calentamiento el extracto de carne, la peptona y el agar en 400,0 mL
de agua destilada.
Por otra parte, se disuelven las sales biliares en 100,0 mL de agua destilada y el
citrato férrico amoniacal en otros 100,0 mL de agua destilada. Mezclar todas las
soluciones y completar hasta 1000,0 mL con agua destilada. Calentar la mezcla
hasta la completa disolución de los ingredientes. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en
autoclave a 121ºC durante 15 min. Enfriar a temperatura de 50ºC y añadir 100,0
mL de solución de esculina al 1% esterilizada por filtración. Distribuir
asépticamente en tubos de ensayo y dejar solidifcar en posición inclinada.
Principio de acción
La peptona y extracto de carne proveen de carbono, nitrógeno, minerales,
vitaminas y otros factores de crecimiento para que los organismos crezcan. La
esculina es hidrolizada por las especies de Listeria para formar esculetina y
dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de fierro (citrato férrico amoniacal)
que contiene el medio para producer un complejo negro a café rojizo que aparece
en el medio rodeando las colonias. La Listeria monocytogenes es tolerante a las
sales biliares. El agar es el agente solidifante.
Extracto de Malta, agar.
Extracto de malta
Peptona de harina de soya
Agar
Agua destilada
30,0 g
3,0 g
15,0 g
1,0 L
Suspender 33.6 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar
humectar el polvo, calentar y agitar frecuentemente, dejar hervir durante un
minuto. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Ajustar el pH a 5.6 ± 0,1.
Principio de acción:
Se utiliza para la demostración, aislamiento y numeración de hongos y levaduras.
A partir del extracto de malta y la harina de soya se observa que éstos favorecen
el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo
se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las
levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%,
adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido.
Fraser base, caldo.
Digerido pancreático de caseína
Proteosa peptona No. 3
Extracto de carne
Extracto de levadura
Cloruro de sódio
5,0 g
5,0 g
5,0 g
5,0 g
20,0 g
Fosfato disódico
Fosfato monopotásico
Esculina
Acido nalidíxico
Acrilflavina HCl
Cloruro de lítio
9,6 g
1,35 g
1,0 g
0,02 g
24,0 mg
3,0 g
Fraser caldo, suplemento
Vial com 10 mL de citrato férrico amoniacal
0,5 g
Suspender 55 g de polvo en un 1,0 L de agua destilada. Mezclar para
homogeneizar. Calentar con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto hasta
disolución completa. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a temperatura
ambiente. Asépticamente añadir 10,0 mL del suplemento para caldo Fraser.
Mezclar bien.
Principio de acción
Las peptonas, extracto de carne y extracto de levadura proporcionan nitrógeno,
vitaminas y minerales. El fosfato de sódio y potasio son los agentes
amortiguadores. La diferenciación se ve estimulada por la adición del citrato férrico
amoniacal. Debido a que todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, la
adición de iones fierro al medio detectará la reacción. Un ennegrecimiento del
medio por las bacterias que hidrolizan la esculina da como resultado la formación
del 6,7-dihidroxicumarina que reacciona con los iones fierro.
La selectividad es propiciada por la presencia del cloruro de lítio, ácido nalidíxico y
acrilflavina en la fórmula. La alta tolerancia de Listeria a la sal se utiliza como
medio para inhibir el crecimiento de los enterococos.
Gelatina, agar (GA).
Tripticasa (digerido pancreático de caseína)
Cloruro de sodio
Gelatina
Agar
Agua destilada
10,0 g
10,0 g
30,0 g
15,0 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolución de la gelatina y el
agar; ajustar el pH a 7.2±0,2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50°C y distribuir en cajas de Petri.
Principio de acción:
En el caso específico de la determinación de V. cholerae se utiliza este medio de
cultivo para purificación de colonias sospechosas provenientes de los medios de
cultivo TCBS o mCPC, utilizando el principio de la halofilia o halotolerancia.
Gelatina con sal, agar (GS).
Tripticasa (digerido pancreático de caseína)
Cloruro de sodio
Gelatina
Agar
Agua destilada
10,0 g
30,0 g
30,0 g
15,0 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en agua y hervir hasta disolución de la gelatina y el
agar; ajustar el pH a 7.2±0,2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50°C y distribuir en cajas de Petri. Si es
necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp, tal como Vibrio alginolyticus,
usar entre 25,0 y 30,0 gramos de agar por litro del medio.
Principio de acción:
En este medio se puede observar si los microorganismos licuan la gelatina o no,
en caso afirmativo, se interpreta que el microorganismo contiene enzimas
proteolíticas. Por otra parte el medio contiene 3% de cloruro de sodio, lo cual sirve
para poner de manifiesto la tolerancia que un microorganismo puede tener a estas
concentraciones de sal.
Gelatina con sal, caldo (GS).
Tripticasa (digerido pancreático de caseína)
Cloruro de sodio
Gelatina
Agua destilada
10,0 g
30,0 g
30,0 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en agua y calentar si es necesario para ayudar a la
disolución del medio; ajustar el pH a 7.2±0,2 y esterilizar en autoclave a 121°C
durante 15 minutos en tubos de 13 x 100,
Principio de acción:
Este medio se utiliza para observar la tolerancia al cloruro de sodio que presentan
algunos microorganismos.
Hierro y tres azúcares, agar (TSI).
Peptona de carne
Peptona de caseína
10,0 g
10,0 g
Cloruro de sodio
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Agar
Rojo de fenol
Sulfato ferroso amónico pentahidratado
Tiosulfato de sodio
Agua destilada
5,0 g
10,0 g
10,0 g
1,0 g
13,0 g
0,025 g
0,20 g
0,20 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar a ebullición agitando
ocasionalmente hasta disolución completa. Enfriar a 60°C y ajustar el pH a 7.3 ±
0,2. Distribuir en volúmenes de 3,0 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a
121°C durante 15 minutos. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en
el fondo alcance una altura de 3,0 cm. y una profundidad de 4,0 cm. El medio es
de color rojo.
Principio de acción
En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes
azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido
sulfhídrico H2S.
En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en
condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacárido lo degrada la βgalactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 últimos azúcares pueden
ser metabolizados en condiciones aerobias a través del ciclo de Krebs, dando
como productos finales CO2, H2O y energía: pero si el metabolismo se realiza en
condiciones anaerobias por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como
producto intermedio, ácido pirúvico, llegando finalmente a través del ciclo de Krebs
a CO2, H2O y energía. El indicador rojo de fenol, en medio ácido es amarillo y en
alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentación de los azúcares es
de color rojo.
La glucosa (0,1%) se detecta en el fondo del tubo (bioquímica) y es metabolizada
en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando
como productos intermedios ATP y ácido pirúvico y como productos finales: ácidos
orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2, H2O y energía.
La sacarosa (1%) se pone de manifiesto virando todo el tubo a una coloración
amarilla, esto puede traer confusión, cuando se encuentra un microorganismo que
no fermenta la lactosa, pero sí la sacarosa, sin embargo el resultado del resto de
bioquímicas ayudarán a la interpretación de esta prueba.
Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de ácido
sulfhídrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio férrico, y otro
producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar
presentes. En una primera etapa de la reacción el microorganismo en ambiente
ácido reaccionará con el tiosulfato de sodio para generar el ácido sulfhídrico. En la
segunda etapa de la reacción este compuesto reaccionará con los iones férricos
generando un precipitado negro insoluble debido a la formación del sulfuro ferroso.
Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente ácido, sin embargo
para la formación del ácido sulfhídrico existe una condición ácido aunque no sea
visible.
El TSI es un medio para la diferenciación de Enterobacterias de acuerdo a su
capacidad para fermentar la lactosa, sacarosa y/o glucosa, y para producir ácido
sulfhídrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar
reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de
éstas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razón se recomienda
realizar al mismo tiempo otra prueba bioquímica como el caldo urea o el agar urea.
Hugh Leifson con glucosa 1%, medio.
Peptona
Extracto de levadura
Cloruro de sodio
Dextrosa
Púrpura de bromocresol
Agar
Agua destilada
2,0 g
0,5 g
20,0 g
10,0 g
0,015 g
3,0 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta que se disuelva el agar;
ajustar el pH a 7.4±0,2, posteriormente colocar el medio en tubos y esterilizar a
121°C durante 15 minutos. El medio debe quedar de color verde.
Principio de acción
El metabolismo de los carbohidratos se lleva a cabo en condiciones aerobias o
anaerobias, sin embargo la fermentación es un proceso anaerobio y las bacterias
que realizan este proceso por lo general son anaerobias facultativas.
Los microorganismos al fermentar un azúcar, hidrolizan el carbohidrato, dando
como productos finales, compuestos que contienen entre uno y cuatro carbonos,
dependiendo de las diferentes bacterias, siendo el principal intermediario el ácido
pirùvico. La más importante vía metabólica para fermentar la glucosa es la de
Embden-Meyerhof-Parnas.
Al añadir un carbohidrato al medio de cultivo, se puede llevar a cabo la
degradación de éste con la subsecuente producción de ácido, lo que se hace
evidente por el indicador de pH, púrpura de bromocresol, el que vira a color
amarillo. La degradación se lleva a cabo mientras el medio está expuesto al aire
(esta degradación puede ser oxidativa o fermentativa), o en ausencia del aire
(degradación fermentativa solamente).
Para cada carbohidrato, inocular un tubo con un cultivo puro del microorganismo
seleccionado como patrón positivo, la inoculación se hace por picadura hasta el
fondo de los tubos, después de lo cual un tubo se sella con parafina estéril y otro
no se sella. El microorganismo utilizado para la inoculación deberá estar en fase
logarítmica de desarrollo.
Incubar de 24 a 48 h a temperatura de 35°C ± 2°C de incubación. Una coloración
amarilla en ambos tubos, abierto y sellado con parafina, significa una degradación
fermentativa, mientras que una coloración amarilla sólo en el tubo abierto, indica
que el carbohidrato en cuestión es degradado solamente por vía oxidativa. La
degradación oxidativa se presenta sólo o cercanamente en la superficie del medio,
mientras que la degradación fermentativa, se presenta en todo el tubo, inclusive
en la superficie de éste. Se comprueba finalmente el crecimiento microbiano
producido mediante la observación de turbidez, si ésta se observa solamente a lo
largo de la línea de la picadura (cepa no móvil) o a lo largo de todo el medio (cepa
móvil).
Infusión cerebro corazón, caldo. Infusión cerebro corazón, agar (BHI, caldo/
BHI, agar).
Infusión de cerebro de ternera
Infusión de corazón de res
Peptona de gelatina
Cloruro de sodio
Fosfato dibásico de sodio, dodecahidratado
Glucosa
Agar bacteriológico a
Agua destilada
a
En caso de requerirse agar infusión cerebro corazón
200,0 mL
250,0 mL
10,0 g
5,0 g
2,5 g
2,0 g
15,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolución de los cristales de agar
si es necesario, posteriormente distribuir en matraces o tubosde acuerdo a la
monografía correspondiente y esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. En
caso de requerirse en cajas de Petri deberá enfriarse a 45°C y verter en
condiciones de asepsia.
Principio de acción:
Los componentes de la infusión de cerebro de ternera y de la infusión de corazón
de res hacen del medio BHI un medio de cultivo de enriquecimiento ideal para
microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes.
Kligler hierro, agar.
Extracto de carne
Extracto de levadura
Peptona
Proteosa peptona
Lactosa
Glucosa
Sulfato ferroso heptahidratado
ó Citrato de amonio férrico / citrato de amonio
Cloruro de sodio
Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar
Agua desionizada
pH
3,0 g
3,0 g
15,0 g
5,0 g
10,0 g
1,0 g
0,2 g
0,5 g
5,0 g
0,3 g
0,024 g
12,0 g
1,000 mL
7,4±0,2
Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolución de los cristales de agar
si es necesario, posteriormente distribuir en tubos de acuerdo a la monografía
correspondiente y esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Deberá enfriarse
a 45°C e inclinar.
Principio de acción
En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes
azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido
sulfhídrico H2S.
En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en
condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacárido lo degrada la βgalactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 últimos azúcares pueden
ser metabolizados en condiciones aerobias a través del ciclo de Krebs, dando
como productos finales CO2, H2O y energía: pero si el metabolismo se realiza en
condiciones anaerobias por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como
producto intermedio, ácido pirúvico, llegando finalmente a través del ciclo de Krebs
a CO2, H2O y energía. El indicador rojo de fenol, en medio ácido es amarillo y en
alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentación de los azúcares es
de color rojo.
La glucosa (0,1%) se detecta en el fondo del tubo (bioquímica) y es metabolizada
en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando
como productos intermedios ATP y ácido pirúvico y como productos finales: ácidos
orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2, H2O y energía.
Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de ácido
sulfhídrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio férrico, y otro
producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar
presentes. En una primera etapa de la reacción el microorganismo en ambiente
ácido reaccionará con el tiosulfato de sodio para generar el ácido sulfhídrico. En la
segunda etapa de la reacción este compuesto reaccionará con los iones férricos
generando un precipitado negro insoluble debido a la formación del sulfuro ferroso.
Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente ácido, sin embargo
para la formación del ácido sulfhídrico existe una condición ácido aunque no sea
visible.
El agar Kligler hierro es un medio para la diferenciación de Enterobacterias de
acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa y/o glucosa, y para producir
ácido sulfhídrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar
reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de
éstas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razón se recomienda
realizar al mismo tiempo otra prueba bioquímica como el caldo urea o el agar urea
Koser citrato de, caldo.
NaNH4HPO4 •4H2O
1,5 g
KH2PO4
1,0 g
MgSO4 •7H2O
0,2 g
Citrato de sodio •2H2O
3,0 g
Agua destilada
1,0 L
Disolver todos los ingredientes en el agua, si es necesario calentar para ayudar a
la disolución, después ajustar el pH final de 6,7 ± 0,2 y distribuir preferentemente
en tubos de ensayo con tapa de rosca. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.
Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en
los Métodos Estándares para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA).
Principio de acción:
En ausencia de carbohidratos fermentables como la glucosa y lactosa, algunos
microorganismos son capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono para la
obtención de energía. Esta capacidad depende de la presencia de la enzima
citrato permeasa, la cual facilita el transporte del citrato dentro de la célula. El
citrato es el principal intermediario del ciclo de Krebs y es producido por la
condensación del acetilo activo con el ácido oxaloacético. El citrato es hidrolizado
por la enzima citrasa, generando como productos ácido oxaloacético y acetato.
Estos productos son convertidos enzimáticamente a ácido pirúvico y dióxido de
carbono. La presencia de turbidez en el medio de cultivo indica que la prueba es
positiva.
Lactosa bilis (2%) verde brillante, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa,
caldo (Brila).
Lactosa verde brillante bilis al 2%, caldo (Brila). Ver: Bilis verde brillante con
lactosa, caldo (Brila).
Lactosado, caldo.
Extracto de carne
Peptona
Lactosa
Agua destilada
3,0 g
5,0 g
5,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando a 65°C. Distribuir en
porciones de 225,0 mL, en frascos de 500 mL de capacidad. Esterilizar a 121±1°C
durante 15,0 min.
Principio de acción
El caldo lactosado se utiliza para la identificación presuntiva de organismos
coliformes en leche, agua y alimentos. Por ser un medio nutritivo no selectivo,
puede también utilizarse como medio de preenriquecimiento, antes del
enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones
para la recuperación de células dañadas por los procesos de conservación.
Lauril sulfato de sodio, caldo.
Bacto triptosa
Bacto lactosa
Fosfato potásico, dibásico
Fosfato potásico, monobásico
Cloruro de sodio
Lauril sulfato de sodio
Agua destilada
20,0 g
5,0 g
2,75 g
2,75 g
5,0 g
0,1 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentando si es necesario,
para ayudar a la disolución; posteriormente ajustar el pH a 6.8 ± 0,2 a 25°C y
distribuir en tubos de ensayo conteniendo campanas de Dirham la cantidad
necesaria del medio. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Antes
de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75°C para que no queden
burbujas en las campanas de Durham.
Preparación de caldo lauril sulfato de sodio de acuerdo con el inóculo utilizado
INOCULO
(mL)
CANTIDAD
MEDIO
TUBO (mL)
DE VOLUMEN
DE CALDO LAURIL
POR MEDIO
MAS TRIPTOSA
REQUERIDO g/L
INOCULO (mL)
1
10 o más
11 o más
35,6
10
10
20
71,2
10
20
30
53,4
20
10
30
106,8
100
50
150
106,8
100
35
135
137,1
100
20
120
213,6
Principio de acción
Este medio se usa como prueba presuntiva en la detección del grupo coliforme. El
lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de
bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de éstos,
sin embargo sí se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La triptona
proporciona nitrógeno, azufre, carbono y algunos minerales que son esenciales
para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como amortiguadores del
pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico.
La lactosa es utilizada como fuente de carbono por los microorganismos. La
fermentación de la lactosa da como productos finales ácido y gas, este último es
detectado en las campanas de fermentación (Durham).
Leche descremada reconstituida
Leche descremada
Verde brillante al 0,1%
Agua destilada
100,0 g
0,45 mL
1,0 L
Diluirla leche descremada reconstituida en el agua destilada. Agitar circularmente
hasta disolución. Distribuir en volúmenes de 225,0 mL en matraces Erlenmayer de
500 mL. Esterilizar a 121±1°C por 15 min.
Principio de acción
La leche por ser un alimento rico en nutrientes (proteínas y azúcares) puede
utilizarse para el preenriquecimiento de Salmonella en ciertos alimentos. Para
inhibir la microbiota acompañante se debe adicionar 0,45 mL de una solución de
verde brillante al 0,1%.
Lisina Hierro, agar (LIA).
Peptona de gelatina
Extracto de levadura
Glucosa
L-Lisina
Citrato férrico de amonio
Tiosulfato de sodio
Púrpura de bromocresol
Agar
Agua destilada
5,0 g
3,0 g
1,0 g
10,0 g
0,5 g
0,04 g
0,02 g
15,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta
ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar
en autoclave 12 minutos a 121ºC. Enfriar de 50-60ºC y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1.
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en
posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una
parte inclinada de 2 cm.
Principio de acción
La lisina puede ser descarborxilada por los microorganismos y transformarla en la
amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de
bromocresol. Puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH
inferior a 6,0), es necesario que se produzca previamente la acidificación de medio
de cultivo, por fermentación de la glucosa. Por este motivo, este medio de cultivo
sólo puede utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa.
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina, pero fermentadores de la
glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar una alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La
formación de HxS produce una coloración negra debida al sulfuro de hierro
producido.
Las cepas del grupo Proteus-Providencia, con excepción de algunas cepas de
Proteus morganii, desamina a la lisina a ácido α-cetocarbónico. Este último forma
compuestos pardo-rojizos en la región superficial del medio de cultivo con la sal de
hierro y bajo la influencia de oxígeno.
Listeria para enriquecimiento (EB) pH 7,3, caldo.
A 500 mL de caldo soya tripticaseína con extracto de levadura (CSTEL) estéril se
le añade asépticamente 5,0 mL de cada una de las siguientes soluciones que
integran el medio (solución de acrilflavina, solución de cicloheximida y solución de
ácido nalidíxico). El caldo de enriquecimiento así preparado (EB), se distribuye en
matraces Erlenmeyer de 500,0 mL estérilies a razón de 250,0 mL.:
Solución de acriflavina
Clorhidrato de acriflavina
Agua destilada
Solución de ácido nalidíxico
Acido nalidíxico (sal sódica)
Hidróxido de sodio 0,05N
Solución de cicloheximida
Cicloheximida
Etanol
Agua destilada
15,0 mg
1.0
mL
40,0 mg
10,0 mL
50,0 mg
4,0 mL
6,0 mL
Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante
su manejo deben emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos
Principio de acción
Las peptonas y el extracto de levadura son fuente de nitrógeno, vitaminas y
minerales. La dextrosa es la fuente de carbohidratos. El cloruro de sodio mantiene
el balance osmótico del medio. Los fosfatos proveen de capacidad amortiguadora.
El piruvato de sodio ayuda a resucitar organismos estresados. El ácido nalidíxico
inhibe el crecimiento de organismos gram-negativo. El clorhidrato de acrilflavina
suprime el crecimiento de bacterias gram-positivo. La cicloheximida se incorpora
para inhibir hongos saprofíticos.
LMP, medio. Cloruro de litio feniletanol-moxolactam (para Listeria).
Fenil etanol agar
35,5 g
Glicina anhidra
10,0 g
Cloruro de litio
5,0 g
Soluciòn de moxolactam al 1% disuelto en soluciòn amortiguadora 2,0 mL
de fosfatos de pH 6,0
Agua
1,0 L
Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos.
Enfriar entre 48 y 50ºC y agregar la solución de moxolactam previamente
esterilizada por filtración. Distribuir volúmenes de 12 a 15 mL del medio en cajas de
Petri estériles. Las placas delgadas facilitan la observación de las colonias.
Mac Conkey, agar.
Proteasa peptona o polipeptona
Peptona o gelizante
Lactosa
Sales biliares No. 3
Cloruro de sodio
Rojo neutron
Cristal violeta
Agar
Agua destilada
3,0 g
17,0 g
10,0 g
1,5 g
5,0 g
0,03 g
0,001 g
13,5 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar si es necesario para
disolver, ajustar el pH a 7.1 ± 0,2 a 25°C y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri.
Principio de acción
El agar Mac Conkey es un medio
esta dada por las sales biliares
positivas. El cristal violeta es un
algunas bacterias Gram-positivas.
fuente de nutrimentos.
selectivo y diferencial. La selectividad del medio
que inhiben el desarrollo de bacterias Gramcolorante que también inhibe el crecimiento de
Finalmente, las peptonas constituyen la principal
El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos
fermentadores de lactosa de los que no lo son, mediante el indicador de pH rojo
neutro. Cuando la lactosa es fermentada, el medio de cultivo se acidifica, esto
provoca el vire del indicador a rojo; por lo que las colonias de los microorganismos
fermentadores de lactosa aparecen de color rojo oscuro o rosadas. Las colonias de
las bacterias no fermentadoras de lactosa son transparentes, incoloras o ámbar.
Manitol rojo de fenol, caldo
Peptona de caseína
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Rojo de fenol
Manitol
Agua destilada
pH
10,0 g
1,0 g
5,0 g
0,018 g
10,0 g
1,0 L
7,4±0,2
Pesar con precisión la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua
destilada. Calentar suavemente la solución. El carbohidrato se puede agregar antes
de la esterilización. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar 116118°C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilización del medio base
SIN EL CARBOHIDRATO a 121°C durante 15 min, enfriar el medio base a ±45°C y
agregar la solución del carbohidrato esterilizada por filtración en membrana.
Distribuir en tubos estériles. Conservar en refrigeración (4-10°C). La caducidad es
aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar
Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubación.
Principio de acción
Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un
carbohidrato específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible.
La fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un
sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos
característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acético
y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f)
ácido succínico a ácido propiónico y Co2, g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico y
h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para demostrar la
fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayoría de los
productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y generaran un vire
del indicador a amarillo.
Malonato, caldo.
Extracto de levadura
Sulfato de amonio
Fosfato dipotásico
Fosfato monopotásico
Cloruro de sodio
Malonato de sodio
Glucosa
Azul de bromotimol
Agua desionizada
pH
1,0 g
2,0 g
0,6 g
0,4 g
2,0 g
3,0 g
0,25 g
0,025 g
1,000 mL
6,7±0,2
Pesar la cantidad exacta como se indica en el rótulo. Rehidratar en el agua
desionizada. Calentar la solución suavemente. Colocar a proximadamente 3,0 mL
en tubos de 13 x 100, Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
Principio de acción
Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio
como única fuente de carbono con la resultante alcalinidad. El malonato es un
inhibidor enzimático competitivo de la enzima succinato deshidrogenada. El
amonato se une a la enzima y ocupa los sitios activos de tal manera que la enzima
no puede combinarse con el sustrato normal, el ácido succínico, cesando de esta
manera la función normal del ciclo de Krebs. El resultado final es que los
microorganismos no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentarn
o utilizar el malonato como única fuente de carbono. Microorganismos que pueden
realizar esta actividad metabólica pertenecen al grupo de Klebsiella-Enterobacter.
mCPC, agar. Ver: Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar
Métodos Estándar, agar
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Dextrosa
Agar
Agua destilada
5,0 g
2.5 g
1,0 g
15,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para
disolver por completo y ajustar el pH a 7,0  0,2 a 25°C. Distribuir en tubos de
ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15
minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola
vez cuando se necesite.
Principio de acción
La peptona de caseína proporciona aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas
complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura
proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los
microorganismos como la fuente de carbono y energía. Es un medio general por lo
que no contiene inhibidores.
MTM, medio.
Extracto de carne
Peptona
Cloruro de sodio
Agar
Agua destilada
3,0 g
10,0 g
5,0 g
4,0 g
1,0 L
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL
en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos y
ajustar el pH final a 7,4 ± 0,2 con HCl 0,1 N o NaOH 0,1 N.
Nitratos, caldo.
Nitrato de potasio
Cloruro de sodio
1,0 g
0,5 g
Peptona
Agua destilada
2,0 g
1,0 L
Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa. Verter
en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C
durante 15 minutos.
Principio de acción
En el presente medio se pretende poner de manifiesto, si el microorganismo tiene
reductasas, para lo cual se utiliza como sustrato la sal de nitrato, en caso afirmativo,
este sustrato se puede reducir a nitritos (se pueden detectar por una reacciòn de
diazoaciòn y copulaciòn) o bien llegar a nitrògeno libre, que se detecta por burbujas
en el medio.
Oxford, medio base (OXA).
Base de agar Columbia
Esculina
Citrato férrico amónico
Cloruro de litio
Agua
39,0 g
1,0 g
0,5 g
15,0 g
1,0 L
Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullición hasta disolución
completa. Posteriormente esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos.
Enfriar el medio base a 50ºC y en condiciones asépticas agregar los siguientes
suplementos:
Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos:
Cicloheximida
400,0 mg
Sulfato de colistina
20,0 mg
Acriflavina
5,0 mg
Cefotetan
2,0 mg
Fosfomicina
10,0 mg
Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetán y la
fosfomicina en 10 mL de una mezcla 1:1 de etanol:agua. Esterilizar por filtración
antes de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas Petri estériles.
Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como máximo dos semanas.
Principio de acción:
La flora acompañante indeseable se inhibe con el cloruro de litio, acrilflavina, sulfato
de colistina, cefotetán, cicloheximida y fosfomicina. L. monocytogenes degrada la
esculina presente en el medio de cultivo, dando esculetina, con formación de hierro
(III), que producen compuestos complejos negros, que luego tiñen de negro las
colonias de L. monocytogenes.
Papa dextrosa, agar.
Infusión de papa
Dextrosa
Agar
Agua destilada
200,0 g
20,0 g
15,0 g
1,0 L
Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectación
de los polvos, para evitar la formación de grumos que son difíciles de disgregar,
calentar el medio hasta ebullición y finalmente esterilizar en autoclave a 121°C
durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en baño de agua hasta 45°C ± 1°C,
después acidificar a un pH de 3.5±0,1, con ácido tartárico al 10% previamente
esterilizado (1.4 mL de ácido tartárico por cada 100 mL de medio de cultivo).
Después de adicionar el ácido tartárico al medio de cultivo, medir el pH con un
potenciómetro.
Principio de acción
A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusión de papa, se observa
que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que de otras
bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen
los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido
tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido.
Púrpura de bromocresol para fermentación de carbohidratos, caldo.
Proteosa peptona No. 3
Cloruro de sodio
Extracto de carne
Púrpura de bromocresol
Agua destilada
10,0 g
5,0 g
1,0 g
0,02 g
1,0 L
Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave
durante 15 minutos a 121 ± 1°C. El pH final debe ser de 6,8 ± 0,2. Posteriormente
agregar la solución del carbohidrato que se desee, previamente esterilizada por
filtración, para obtener una concentración final de 0,5 %.
Principio de acción
Este medio sirve para observar la fermentaciòn de azùcares con producciòn de
acidez.
Nota: Los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden usarse como
alternativa para las pruebas bioquímicas convencionales.
RM-VP, caldo (prueba de rojo de metilo y Voges Proskauer).
Peptona tamponada
7,0 g
Glucosa
5,0 g
K2HPO4
5,0 g
Agua destilada
1000,0 mL
Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario, distribuir en
volúmenes de 10 mL en tubos de ensayo de 16x150 mm y esterilizar a 121°C por
15 minutos. El pH final debe ser de 6,9 ± 0,2.
Principio de acción
La glucosa es el principal sustrato utilizado por los microorganismos para la
obtención de energía. Los productos finales de la oxidación de la glucosa varían
dependiendo de la ruta metabólica y de las enzimas presentes en la bacteria. Por
lo tanto se describen a continuación dos vías:
Prueba de Rojo de metilo
La prueba de rojo de metilo se lleva a cabo para determinar la capacidad de un
microorganismo de producir y mantener estables los ácidos orgánicos generados
por la fermentación de la glucosa. El indicador de pH rojo de metilo a pH de 4.4
tiene un color rojo y a pH de 6,0 o superior, su color es amarillo. Aunque todos los
microorganismos entéricos fermentan la glucosa y producen ácidos orgánicos,
esta prueba se emplea para diferenciar Escherichia coli de Enterobacter
aerogenes
Estos microorganismos en las primeras h. de incubación producen ácidos
orgánicos. Escherichia coli es capaz de estabilizar y mantener el pH ácido (4,04.4) hasta finalizar el periodo de incubación (24-48 h) debido a que produce más
ácidos por lo que vence el sistema amortiguador. Por su parte, Enterobacter
aerogenes es capaz de convertir estos ácidos en productos neutros como etanol y
acetilmetilcarbinol (acetoina) por lo que el pH se eleva aproximadamente a 6.
Prueba de Voges-Proskauer
Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos de generar
como productos finales del metabolismo de la glucosa, compuestos neutros como
el acetilmetilcarbinol (acetoina).
La glucosa es metabolizada por algunas bacterias hasta ácido pirúvico, la
descarboxilación de dos moléculas de este ácido producen la acetoina, que es un
precursor del 2,3-butanodiol. Tanto la acetoina como el 2,3-butanodiol son
compuestos neutros.
En presencia de oxígeno atmosférico y álcali, la acetoina como el 2,3-butanodiol
reaccionan con el alfa-naftol generando diacetilo este compuesto se condensa con
la guanidina presente en el medio de cultivo generando un compuesto de color
rojo o rosa (prueba positiva) en un tiempo aproximado de 15 minutos.
Si la acetoina no esta presente los reactivos no cambian de color (prueba
negativa)
Salmonella y Shigella, agar (SS).
Extracto de carne
Polipeptona
Lactosa
Sales biliares
Citrato de sodio deshidratado
Tiosulfato de sodio pentahidratado
Citrato férrico
Agar
Rojo neutro
Verde brillante
Agua destilada
5,0 g
5,0 g
10,0 g
8,5 g
8,5 g
8,5 g
1,0 g
13.5 g
0,025 g
0,330 mg
1,0 L
Suspender los ingredientes en agua destilada estéril y calentar hasta disolución
completa. Ajustar el pH a 7,0 ± 0,2. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50°C y
distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. El aspecto del medio
fundido es claro y de color rosado.
Principio de acción
El agar SS es un medio selectivo diferencial para el aislamiento de especies de
Salmonella y Shigella a partir de muestras patológicas, alimentos contaminados,
etc. Los organismos coliformes, Gram-negativos y la microbiota acompañante son
inhibidos por los componentes inhibitorios como el verde brillante, sales biliares. El
tiosulfato en combinación con el fierro actúa como indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico, lo cual se evidencia por el oscurecimiento en el centro de las
colonias. Las colonias de coliformes quedan señaladas por la demostración de la
degradación de la lactosa a ácido, a cargo del indicador de pH rojo neutro, de tal
forma que las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras, y las
de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas.
Sangre de carnero, agar
Base de agar sangre
Sangre de carnero desfibrinada
95,0 mL
5,0 mL
Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 ±
2ºC y agregar asépticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe
encontrar a temperatura ambiente (20 - 25°C). Homogeneizar el medio y verter en
las cajas Petri estériles de 12 a 15 mL para la prueba de CAMP y de 15 a 20 mL
para la prueba de hemólisis.
Principio de acción
Este medio detecta a los microorganismos que pueden lisar los eritrocitos,
pudiendo diferenciar las hemòlisis alfa o beta.
Selenito-cistina, caldo.
Triptona o polipeptona
Lactosa
Fosfato sódico dibásico
Selenito ácido de sodio
L-cistina
Agua destilada estéril
pH final 25°C
5,0 g
4,0 g
10,0 g
4,0 g
0,01 g
1,0 L
7,0 ± 0,2
Disolver los ingredientes en el agua destilada estéril. Distribuir en volúmenes de
10,0 (tubos de ensayo) o bien, 225,0 mL en (matraces) recipientes estériles, según
se requiera. El caldo así preparado es transparente de color ladrillo. De
preferencia usarlo el mismo día de su preparación. Si se desea conservar el medio
por varios días, puede exponerse al calor en autoclave a 110 ± 1°C durante 5
minutos tomando entonces un color salmón.
Precaución: Descartar el medio preparado si se observan grandes cantidades de
precipitado rojo debidas al selenito reducido. No se incube por más de 24 h.
porque el efecto inhibitorio del selenito disminuye después de 6-12 h. de
incubación. El biselenito de sodio es tóxico por inhalación o ingesta. Existe peligro
de efectos acumulativos. Cuando se utilice no coma, beba o fume. Después del
contacto con la piel, enjuague inmediatamente con abundante agua. En caso de
ingestión accidental acuda al médico inmediatamente.
Principio de acción
El caldo selenito-cistina se utiliza como medio de enriquecimiento de Salmonella a
partir de heces, alimentos y otros materiales. El selenito inhibe el crecimiento de
bacterias coliformes y enterococos en las primeras 6-12 h. siguientes al inicio de la
incubación. La toxicidad del selenito para ciertos microorganismos no es del todo
clara, se sugiere que reacciona con los grupos sulfuro y sulfhidrilo de ciertos
componentes celulares esenciales. Proteus y Pseudomonas parecen ser
resistentes a sus efectos. La lactosa se adiciona como carbohidrato fermentable
para prevenir un incremento en el pH durante la incubación ya que cualquier
aumento en el pH puede reducir la actividad selectiva del selenito. El hecho de
que Proteus y Pseudomonas, y naturalmente Salmonella, no fermenten la lactosa
puede explicar que resistan la inhibición. El efecto de la cistina puede deberse a
dos factores: 1) Su capacidad reductora, que disminuye la toxicidad microbiana del
selenito y 2) Suministra compuestos azufrados adicionales primordiales para la
bacteria, reduciendo de nuevo la actividad inhibitoria del selenito.
Sulfuro Indol Movilidad, medio (SIM).
Peptona de caseìna
Peptona de carne
Sulfato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio
Agar
Agua
20,0 g
6,1 g
0,2 g
0,2 g
3,5 g
1,0 L
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL
en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15
minutos. El pH final deberà estar en 7,3 ± 0,2.
Principio de acción
El presente medio pone de manifiesto: a) si el microorganismo es móvil, esto es
que presente flagelos, lo cual se observa si después de incubar existe desarrollo
más allá de donde pasó el asa microbiológica al inocular al medio, b) si el
microorganismo es capaz de reducir el tiosulfato hasta ácido sulfhídrico, que al
estar este último en presencia de sales de hierro, se forma el sulfuro ferroso que
es de color negro y c) si el microorganismo es capaz de desdoblar el triptofano
que se encuentra en las peptonas, hasta formar el indol, esto implica la
eliminación del grupo alquilo, que está constituido por un aminoácido,
transformándose esta fracción a ácido pirúvico y amoníaco, gracias a la presencia
de la triptofanasa.
Sodio lauril sulfato de, caldo. Ver: Lauril sulfato de sodio, caldo.
Soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura, agar (ASTEL). (Listeria).
Agar soya tripticaseìna
Extracto de levadura
Agua
40,0 g
6,0 g
1,0 L
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante
15 minutos, el pH final serà de 7,3 ± 0,2.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc.
Soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura, caldo (CSTEL.
(Listeria).
Caldo soya tripticaseìna
Extracto de levadura
Agua
30,0 g
6,0 g
1,0 L
Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 minutos.
El pH final de la solución debe ser 7,3 ± 0,2.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc.
Soya tripticaseína, caldo / Soya tripticaséina, agar.
Tripticasa o triptosa
Fitona
Glucosa
Cloruro de sodio
Agar bacteriológico
Agua destilada
17,0 g
3,0 g
2,5 g
2,5 g
15,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando lentamente hasta su
disolución completa. Distribuir porciones de 225,0 mL dentro de matraces de 500
mL y esterilizar en autoclave a 121±1°C durante 15 minutos. En caso de
requerirse en cajas de Petri enfriar el agar a 45°C y verter en condiciones de
asepsia. El pH final debe ser de 7.3±0,2.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El
caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el
preenriquecimiento de Salmonella.
Soya tripticaseína estéril adicionado con sulfito de potasio, caldo.
Caldo soya tripticasa
Sulfito de potasio
1,0 L
5,0 g
Adicionar al caldo soya tripticaseína el sulfito de potasio por cada 1,0 L de medio,
de tal forma que la concentración final del sulfito de potasio sea 0,5%. Esterilizar a
121±1°C por 15 minutos.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, se recomienda para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El
caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el
preenriquecimiento de Salmonella. El sulfito de potasio actúa como un agente
selectivo para inhibir el crecimiento de coliformes, mientras que permiten el
desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre fungen como sustrato para la
producción de ácido sulfhídrico.
SS, agar. Ver Salmonella Shigella, agar.
Sulfito de Bismuto agar. Ver: Bismuto sulfito, agar.
Surraco, caldo
Sacarosa
Urea
Azul de timol
Base caldo rojo de fenol
Agua destilada
0,8 g
0,8 g
4 gotas
1,5 g
100,0 mL
Disolver 1.5 g del medio base caldo rojo de fenol en 100 mL de agua destilada,
agregar 0,8 g de sacarosa y 4 gotas de azul de timol SI. De esta solución se
toman 10 mL en un matraz Erlenmayer de 10 mL. Esterilizar ambas soluciones en
autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 10 minutos (EVITAR
SOBRECALENTAMIENTO). Esterilizar un equipo de microfiltración, agujas y
jeringas. Una vez esterilizado el material y los médios, dejar enfriar. Al matraz con
los 10 mL de caldo sacarosa adicionar en condiciones de esterilidad 0,8 g de urea,
agitar para disolver completamente. En condiciones de esterilidad tomar el
contenido del matraz con una jeringa de 10 mL y pasar por el filtro (ya preparado)
al matraz que contiene los 90 mL restantes del medio. Agitar la mezcla estéril y
distribuir volúmenes de 3,0 mL en tubos de ensayo de 13 X 100 mm esterilizados
previamente.
Principio de acción.
Medio para la diferenciación de microorganismos, especialmente de la familia
Enterobacteriaceae basándose en la producción de ureasa y/o de fermentar la
sacarosa. El medio de cultivo está libre de carbohidratos fermentables, si el
microorganismo en estudio es capaz de fermentar la sacarosa, se produce vire del
indicador a amarillo. Los microorganismos que tienen la capacidad de utilizar la
urea, forman amonio, produciendo reacción alcalina en el medio que se manifiesta
por un color rosa fuerte por vire de los indicadores rojo de fenol y azul de timol.
TCBS, agar. Ver: Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar.
T1N1, agar (tripticasa y sal, agar).
Triptona o tripticasa o digerido pancreático de caseína
Cloruro de sodio
Agar
Agua destilada
10,0 g
10,0 g
20,0 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolución del agar. En caso
de desearlo inclinado, distribuirlo en tubos y después de esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 minutos, inclinarlos; el pH final deberá estar en 7.2±0,2. Para el
llenado de placas, dejar enfriar el medio a una temperatura entre 45 y 50°C antes
de llenar las cajas.
Principio de acción
Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las
diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de
sodio de esta fórmula por la deseada.
Tripticasa y sal, caldo (T1N1, caldo).
Triptona o tripticasa o digerido pancreático de caseina
Cloruro de sodio
Agua destilada
10,0 g
10,0 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en el agua y calentar si es necesario. Esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 minutos; el pH final deberá estar en 7.2±0,2.
Principio de acción
Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las
diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de
sodio de esta fórmula por la deseada.
Triptosa agar / Triptosa caldo.
Triptosa (digerido enzimático protéico)
Dextrosa
Cloruro de sodio
Agar
Agua destilada
20,0 g
1,0 g
5,0 g
15,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes (para preparación del caldo omitir el agar) en el el agua
destilada, mezclar y calentar lentamente hasta su disolución completa. Esterilizar a
121 ± 1ºC durante 15 minutos.
Principio de acción.
El medio de triptosa es un medio para propósitos generales, no selectivo. La
triptosa es una mezcla de un hidrolizado enzimático con propiedades nutricionales
distintivas. El medio de triptosa posee péptidos de alto peso molecular adecuado
para requerimientos de amino ácidos de cadena larga. Proporciona nitrógeno,
amino ácidos y vitaminas.
Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar (TCBS).
Peptona de caseína
Peptona de carne
Extracto de levadura
Sacarosa
Tiosulfato de sodio pentahidratado
Citrato de sodio dihidratado
Colato de sodio
Bilis de buey
Cloruro de sodio
Citrato férrico
Azul de bromotimol
Azul de timol
Agar
Agua destilada
5,0 g
5,0 g
5,0 g
20,0 g
10,0 g
10,0 g
3,0 g
5,0 g
10,0 g
1,0 g
40,0 mg
40,0 mg
15,0 g
1,0 L
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen
requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar
con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No
esterilizar y ajustar el pH a 8.6±0,2 a 25°C; enfriar a 50°C y colocar el medio en
cajas Petri. Dejar secar las placas entre 37 y 45°C antes de usarlas.
Principio de acción
La alta concentración de tiosulfato y citrato, así como la fuerte alcalinidad de este
medio, inhiben el crecimiento de la familia Enterobacteriaceae. Las sales biliares y
el colato de sodio suprimen primariamente a los enterococos. Cualquier bacteria
coliforme que pudiera crecer, no puede metabolizar la sacarosa; solamente unas
cuantas especies de Proteus, sacarosa positivas, pueden crecer para formar
colonias amarillas, parecidas a las colonias de los vibrios. La mezcla de
indicadores azul de timol y azul de bromotimol, cambian a color amarillo cuando
hay liberación de ácido, aún en este medio fuertemente alcalino. Se debe incubar
a 35°C aeróbicamente durante 18 a 24 h.
De acuerdo a las características metabólicas del microorganismo, se presentan las
colonias en este medio, como se describen en el siguiente cuadro:
Apariencia de las colonias
Amarillas, planas, con diámetro entre
2 y 3 mm
Pequeñas con centro azul verde
Grandes amarillas
Azules
Muy pequeñas, transparentes
Microorganismos
V. cholerae, V. cholerae variedad El
Tor
Vibrio parahemolyticus
Vibrio alginolyticus
Pseudomonas y Aeromonas
Enterobacteriaceae y otros
Tetrationato, caldo.
Proteosa peptona o triptona
Sales biliares
Carbonato de calcio
Tiosulfato de sodio pentahidratado
Agua destilada
5,0 g
1,0 g
10,0 g
30,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en el agua destilada estéril y ajustar el pH a 7,0±0,1.
Distribuir, agitando constantemente en porciones de 10,0 y 225,0 mL, en
recipientes estériles, de acuerdo a las necesidades. Guardar en refrigeración.
Antes de usar el medio agregar 2,0 mL de una solución de yodo-yoduro de potasio
y 1,0 mL de solución de verde brillante al 0,1% por cada 100,0 mL de medio. El
medio deberá utilizarse el mismo día.
Principio de acción
El caldo tetrationato se recomienda para el enriquecimiento selectivo de
Salmonella typhi y otras especies de Salmonella, presentes en heces, ensilados,
etc. Las sales biliares estimulan el crecimiento de las bacterias intestinales e
inhiben junto con la solución de verde brillante especialmente a la microbiota
Gram-positiva. La adición de la solución yodo-yoduro funciona para formar el
tetrationato. Los organismos que poseen la enzima tetrationato reductasa se
desarrollan bien en este medio, como por ejemplo Salmonella y Proteus, mientras
que muchos microorganismos fecales como E. coli y Shigella son inhibidos.
Miembros del grupo Proteus, reducen el tetrationato y en consecuencia
disminuyen la selectividad. Esta desventaja se puede disminuir adicionando al
medio de cultivo 40,0 µg de novobiocina por cada mililitro de medio antes de la
adición del yodo-yoduro.
Triptona al 1%, caldo (Prueba de indol).
Triptona o tripticasa
Agua destilada
10,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes y si es necesario calentar. Distribuir porciones de 5 mL
del medio, en tubos de ensaye de 16 x 150 mm. Esterilizar a 121°C por 15
minutos. El pH final debe ser de 6.9 ± 0,2
Principio de acción
La triptona es un compuesto rico en triptofano y por lo tanto se utiliza para la
diferenciación de bacterias con base en la prueba de indol. El triptofano es un
aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias hasta indol, escatol e
indolacétco.
La enzima triptofanasa cataliza la reacción de desaminación del triptofano
produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco. El ácido pirúvico puede ser
catabolizado por las bacterias mediante el ciclo de Krebs hasta CO2 y agua; el
amoníaco producido puede ser utilizado por el microorganismo para sintetizar
nuevos aminoácidos. El indol puede ser detectado si se combina con el
paradimetilaminobenzaldehido, el producto de esta combinación es un una
quinona de color rojo.
TSI, agar. Ver: hierro y tres azúcares, agar.
Urea, caldo.
Fosfato monopotásico
9,1 g
Fosfato disódico
Extracto de levadura
Urea de alta pureza (20%)
Rojo fenol
Agua desionizada
pH
9,5 g
0,1 g
20,0 g
0,01 g
1,0 L
6,8
Pesar la cantidad con precisión según las directivas del rótulo. Rehidratar con el
agua desionizada. No calentar la solución, con el calor la urea se descompone.
Esterilizar el resto de los componentes del medio (medio base) a 121°C durante
15 minutos y enfriar. Esterilizar la urea por filtración en membrana y agregar al
medio base ya estéril y frío. De manera aséptica distribuír aproximadamente 3,0
mL en tubos de 13 x 100 con tapón de rosca.
Principio de acción
El sustrato urea, a menudo se designa como una carbamida. Todas las amidas
son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada por una enzima específica, la
ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos moléculas de amoniaco. En
solución, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final. La
ureasa es una enzima constitutiva microbiana importante relacionada con la
descomposición de compuestos orgánicos, clasificada como una amidasa. La
ureasa actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos
que contienen puestes peptídicos. El indicador rojo de fenol virará a un colo rosarojo intenso cuando la prueba sea positiva.
Urea rápido, caldo.
Extracto de levadura
Urea
Fosfato monopotásico
Fosfato disódico
Rojo fenol
Agua desionizada
pH
0,1 g
20,0 g
0,091 g
0,095 g
0,01 g
1,0 L
6,9
Esterilizar por filtración utilizando una membrana de 0,45 µm. Fraccionar en
condiciones asépticas 3,0 mL en tubos de 13 x 100 con tapón de rosca estériles.
Principio de acción
Ver caldo urea. Para la prueba rápida de la urea el indicador virará a color cereza
(púrpura rojizo), en caso de ser positiva.
Urea y sacarosa, caldo. Ver: Surraco, caldo.
Vassiliadis-Rappaport, caldo.
Solución A
Triptona
Cloruro de sodio
Fosfato monobásico de potasio
Agua destilada
5,0 g
8,0 g
1,6 g
1,0 L
Disolver los componentes en el agua destilada por calentamiento a ±70°C.
Solución B
Cloruro de magnesio hexahidratado
Agua destilada
400,0 g
1,0 L
Disolver el cloruro de magnesio en el agua destilada. Como esta sal es muy
higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio
desde un envase recientemente abierto, de tal modo que la concentración de la
solución sea de 0,4 g/mL. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.
Solución C
Oxalato de verde de malaquita
Agua destilada
0,4 g
100,0 mL
Disolver el oxalato de verde de malaquita en el agua destilada. Conservar en
frasco ámbar a temperatura ambiente.
Preparación del medio completo
Solución A
Solución B
Solución C
1000,0 mL
100,0 mL
10,0 mL
Preparar el medio completo con las proporciones descritas para cada una de las
soluciones. Distribuir antes de usar dentro de tubos estériles en cantidades de
10,0 mL. Esterilizar a 115°C durante 15 min. Ajustar el pH si es necesario para
que al final de la esterilización sea de 5.2. Almacenar en refrigeración.
Principio de acción
Este medio se recomienda para el enriquecimiento selectivo durante el aislamiento
de Salmonella de alimentos y muestras ambientales. Puede también utilizarse
para aislar Salmonella de heces humanas sin el preenriquecimiento utilizando una
cantidad de inóculo pequeña. La formulación se desarrolló denotando cuatro
características que posee Salmonella cuando se compara con la familia
Enterobacteriaceae:
1. Habilidad para sobrevivir a presiones osmóticas relativamente altas
2. Habilidad para multiplicarse a valores de pH relativamente bajos
3. Resistencia ligeramente mayor al verde de malaquita
4. Requerimientos nutricionales relativamente menos estrictos
Puede utilizarse novobiocina para inhibir el crecimiento de Proteus.
Verde brillante, agar.
Extracto de levadura
Polipeptona (proteosa peptona No. 3)
Cloruro de sodio
Lactosa
Sacarosa
Rojo de fenol
Agar
Verde brillante
Agua destilada
3,0 g
10,0 g
5,0 g
10,0 g
10,0 g
0,08 g
20,0 g
0,0125 g
1,0 L
Suspender los ingredientes en el agua destilada y calentar a ebullición, hasta
disolución completa. Ajustar el pH a 6.9 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121±1°C
durante 15 minutos. Enfriar el medio a 50°C y distribuirlo en cajas de Petri
estériles. El aspecto del medio es oscuro color marrón.
Principio de acción
El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce por el
viraje a amarillo del rojo de fenol, que actúa como indicador de pH. En ambiente
alcalino presenta color rojo intenso. La microbiota acompañante Gram-positiva, así
como Salmonella typhi y Shigella resultan muy reprimidas por la presencia del
verde brillante. Puesto que Salmonella no puede degradar ni la lactosa ni la
sacarosa, el contenido en sacarosa permite el reconocimiento de la microbiota
acompañante lactosa-positiva débil o lactosa negativa pero sacarosa-positiva.
Para la inhibición de Proteus se recomienda la adición de desoxicolato de sodio al
0,2%. La adición de sulfonamidas mejora el aislamiento de Salmonella. Adicionar
1,0 g de sulfonamida o 0,8 g de sulfadiazina por cada litro de medio y esterilizar en
la forma habitual.
Verde brillante bilis al 2 % lactosa, caldo. Ver: Bilis verde brillante con
lactosa, caldo (Brila).
Xilosa lisina desoxicolato, agar (XLD).
Xilosa
L-lisina
Lactosa
3,75 g
5,0 g
7,5 g
Sacarosa
7,5 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Rojo de fenol
0,08 g
Agar
15,0 g
Desoxicolato de sodio
2,5 g
Citrato férrico amoniacal
0,8 g
Tiosulfato de sodio
6,8 g
Agua destilada
1,0 L
±0,2
Suspender los ingredientes en el agua destilada, y calentar en baño de agua a
55°C, agitando frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH a 6.9
±0,2. Enfriar a 50°C y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice. El
sobrecalentamiento produce una precipitación, la reactividad del medio puede ser
satisfactoria, pero las colonias sueles ser muy pequeñas.
Principio de acción
Este es un medio selectivo ideal para el aislamiento e identificación presuntiva de
Salmonella y Shigella. Basado en la fermentación de la xilosa, la descarboxilación
de la lisina y la producción de ácido sulfhídrico para la diferenciación inicial entre
Shigella y Salmonella de otras bacterias no patógenas. La Salmonella es
reductora de las sales de azufre como el tiosulfato, cuyo producto final es el ácido
sulfhídrico, que en presencia de sales de hierro forma el sulfuro ferroso, que es un
compuesto de color negro. La fermentación rápida de la xilosa es casi universal
entre las bacterias entéricas excepto para los miembros de los géneros Shigella,
Providencia y Edwardsiella. La xilosa se incluye al medio de tal forma que las
especies del género Shigella pueden identificarse por una reacción negativa. Las
especies de Salmonella se diferencian de los fermentadores no patogénicos por la
incorporación de lisina al medio. Salmonella consume la xilosa y descarboxila la
lisina, alterando el pH hacia la alcalinidad, simulando la reacción presentada por
Shigella. Sin embargo, la presencia de los géneros Salmonella y Edwardsiella se
diferencia de las de Shigella por un indicador de la producción de ácido sulfhídrico.
Por otra parte, la gran concentración de ácido producido por la fermentación de la
lactosa y sacarosa, evita que los coliformes lisin descarboxilasa-positivos reviertan
el pH a un valor alcalino. Los microorganismos no productores de ácido sulfhídrico
no descarboxilan la lisina. El nivel de acidez evita el oscurecimiento de estos
microorganismos hasta después de 18-24 h. de incubación. El desoxicolato de
sodio se incorpora al medio como un inhibidor de coliformes sin disminuir el
desarrollo de Shigella y Salmonella.
DILUYENTES, SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES.
Azul de toluidina, solución 0,1M.
Azul de toluidina
Agua destilada
3,05 g
100,0 mL
En un matraz aforado de 100,0 mL disolver el azul de toluidina y aforar a volumen
con el agua.
Calcio cloruro, solución 0,01M.
Cloruro de calcio anhidro (peso molecular 110,99)
Agua destilada
1,199 g
1,0 L
Disolver el cloruro de calcio en agua y llevar a un litro.
Etanol 70 %.
Alochol etílico absoluto
Agua destilada
70,0 mL
100,0 mL
Solución de desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estéril.
Desoxicolato de sodio
Agua destilada estéril
0,5 g
99,5 mL
Disolver el desoxicolato de sodio en agua destilada estéril.
Solución reguladora de Fosfatos pH 7.2, (solución concentrada).
Fosfato monobásico de potasio
Agua destilada
34,0 g
1,0 L
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2, con solución de
hidróxido de sodio 1N, aforar con agua a un litro. Esterilizar la solución a
121°C±1,0°C y conservar en refrigeración.
Solución de trabajo: Tomar 1.25 mL de la solución anterior (solución
concentrada) y transferirlos a un matraz volumétrico de un litro, aforando con
agua; después de distribuir en matraces o tubos, los volúmenes especificados en
cada monografía, se debe esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Después
de la esterilización, los volúmenes finales y el pH, deben ser iguales a los iniciales.
Reactivo de Kovac’s.
p-dimetilaminobenzaldehído
5,0 g
Alcohol amílico (normal)
75,0 mL
HCI concentrado
25,0 mL
Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal y adicionar
lentamente el HCl. Almacenar a 4°C.
Para la prueba de indol:
Adicionar de 0,2 a 0,3 mL del reactivo anterior, a 5 mL del cultivo de bacterias en
caldo triptona. Destapar el tubo e inclinarlo para permitir la entrada de una mayor
cantidad de oxígeno ambiental que ayude a la reacción. Se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rojo en la superficie del tubo.
Principio de acción
El triptofano es un aminoácido, que por acción de la triptofanasa lo degrada en
indol, escatol y ácido indolacético . Un intermediario importante es el ácido
indolpirúvico, que al desaminarse forma el indol. En caso de que se descarboxile
el ácido indolacètico, se forma el escatol
Prueba del Ortonitrofenil galactósido (ONPG).
Reactivos
Buffer de fosfato de sodio, 1M, pH 7.
o-nitrofenil-β-galactosido (ONPG), 0,75 M
Solución fisiológica
Tolueno
Realizar la prueba a partir de agar-hierro de Kligler (KIA) ó agar triple azúcar hierro
(TSI). Emulsificar un asa cargada de desarrollo bacteriano con 0,5 mL de solución
fisiológica hasta producir una suspensión abundante. Añadir a dicha suspensión
una gota de tolueno y mezclar enérgicamente unos segundos para liberar la
enzima de las células bacterianas. Añadir a la suspensión igual cantidad de
solución buffer de ONPG y colocar la mezcla en baño de agua a 37ºC.
Interpretación. La velocidad de hidrólisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser
rápida en algunos organismos, produciéndose una reacción que se visualiza por la
aparición de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayoría de las pruebas son
positivas en una hora, sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como
negativas antes de las 24 horas de incubación. El color amarillo indica que el
organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por acción de la
β-galactosidasa.
Principio de acción
El ortonitrofenil galactósido (ONPG) es estructuralmente similar a la lactosa, salvo
que la glucosa ha sido substituida por el ortonitrofenil.
Por acción de la β-galactosidasa, el ONPG se hidroliza en dos residuos, galactosa y
ortonitrofenol. El ONPG es un compuesto incoloro mientras que el ortonitrofenol es
amarillo, lo cual es una evidencia de la hidrólisis.
Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen dos enzimas, permeasa y βgalactosidasa, requeridas para la producción de ácido a partir de la fermentación de
lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa penetre en la
célula bacteriana, donde la β-galactosidasa puede romper la unión galactósido,
produciendo glucosa y galactosa. Los no fermentadores de lactosa carecen de
ambas enzimas y son incapaces de producir ácido a partir de lactosa. Algunas
especies bacterianas aparecen como no fermentadoras de lactosa pues carecen de
permeasa pero si tienen β-galactosidasa y dan una prueba de ONPG positiva. Los
llamados fermentadores tardíos de lactosa pueden demorar en producir ácido a
partir de la lactosa debido a una lenta actividad de permeasa. En estos casos una
prueba de ONPG positiva puede proveer una identificación rápida de los
fermentadores tardíos.
Reactivo de oxidasa.
N-Tetrametil-p-Fenilendiamina
Agua destilada
0,5 g
100,0 mL
Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días.
Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de
NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil
consiste en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo
con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un
mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa y
tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se
tornará púrpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de
Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii).
Interpretación. La reacción positiva se observa por la producción de un color azul
en un minuto.
Principio de acción
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último
eslabón de la cadena respiratoria aerobia, tranfiriendo electrones (hidrógeno) al
oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los
microorganismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de
oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la
enzima o son anaerobios obligados.
La prueba de citocromo oxidasa utiliza
el diclorhidrato de Tetrametil-pFenilendiamina, que acúa como aceptor artifical de electrones, sustituyendo al
oxígeno. La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de
citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.
Plasma de Conejo.
Emplear plasma de conejo liofilizado rehidratado, siguiendo las instrucciones del
fabricante. El anticoagulante que se debe de utilizar para obtener el plasma es
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza
plasma deshidratado, diluir con agua estéril en proporción 1:3. Puede utilizarse
plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse plasma de
sangre citratada.
Principio de acción
El plasma en presencia de la enzima coagulasa bacteriana, forma un coágulo de
fibrina. El mecanismo esta dado porque la protrombina en presencia de sales de
calcio y la enzima trombocinasa (tromboplastina), forman la trombina y ésta última
al encontrarse frente al fibrinógeno, forma un coágulo de fibrina.
La técnica para determinar la coagulasa ligada o factor de agregación, se realiza
en un portaobjetos. Es responsable de la absorción del fibrinógeno, el cual
precipita sobre los estafilococos, propiciando la agregación de estos
microorganismos, observándose una aglutinación celular. En este caso, el factor
de agregación, transforma el fibrinógeno en fibrina de manera directa, no toman
parte los factores plasmáticos, tampoco se inhibe por los anticuerpos contra la
coagulasa libre.
La prueba de la coagulasa en tubo, detecta tanto la coagulasa libre como la ligada;
la coagulasa libre extracelular, reacciona con una sustancia denominada factor de
reacción de la coagulación, que se abrevia CRF, (sustancia termoestable parecida
a la trombina), formando un complejo, el cual transforma el fibrinógeno en fibrina,
liberando péptidos. En este caso el CRF, reacciona con la coagulasa, sin necesitar
iones de calcio para formar el coágulo.
Rojo de metilo, reactivo.
Rojo de metilo
0,2 g
Etanol al 95 %
300,0 mL
Agua destilada
200,0 mL
Mantener el reactivo en refrigeración cuando no se utilice, el reactivo es estable de
2 a 3 semanas.
Prueba de Rojo de metilo
Transferir 2.5 mL del cultivo a probar con 48 h. de incubación a un tubo de ensayo.
Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo e interpretar el color de inmediato:
Una coloración roja indica producción de acidez por lo que la prueba es positiva.
Salina isotónica, solución.
Cloruro de sodio
Agua destilada
8,5 g
1,0 L
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15
minutos.
Tartárico ácido al 10%.
Ácido tartárico
Agua destilada
10,0 g
100,0 mL
Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121°C durante 15 minutos, o bien por
filtración a través de una membrana de 0,45 µm.
Tris-(hidroximetilaminometano), solución amortiguadora 0,05M.
Tris-hidroximetilaminometano, (peso molecular 121.1), pH 9,0
Agua destilada
6,055 g
100,0 mL
Disolver el Tris-(hidroximetilaminometano) en un matraz volumétrico de 100,0 mL
y llevar a volumen con el agua.
Voges-Proskauer, reactivos (VP).
VP 1
alfa-naftol
5,0 g
Alcohol absoluto
100,0 g
VP 2
Hidróxido de potasio
40,0 g
Agua destilada
cbp 100,0 mL
Prueba de Voges-Proskauer (VP):
Transferir 1 mL del cultivo a probar, con 48 h. de incubación, a un tubo de ensayo.
Después adicionar 0,6 mL de la solución VP 1 y 0,2 mL de la solución VP 2. Agitar
después de la adición de cada solución.
Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina
y mezclar. Dejar a temperatura ambiente y leer los resultados después de 4 h. de
adicionados los reactivos. El desarrollo de una coloración rosa es una prueba
positiva.
Nitritos, reactivos para la determinación de.
Reactivo A
Alfa-naftilamina
Àcido acètico 5N
0,5 g
100,0 mL
Reactivo B
Àcido sulfanìlico
Àcido acètico 5N
1,0 g
125,0 mL
Reactivo C
Alfa-naftol
Àcido acètico 5N
1,0 g
200,0 mL
Solución de sulfato de cadmio al 20%
Colocar granallas de zinc en solución de sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h.
Disolver el precipitado de cadmio, adicionando ácido clorhídrico 1N.
TINCIONES
Gram
Alcohol-acetona
Etanol (95%)
Acetona
700,0 mL
300,0 mL
Mezclar perfectamente ambos líquidos.
Cristal violeta
Solución A
Cristal violeta
Etanol (95%)
2,0 g
20,0 mL
Disolver el cristal violeta en el etanol.
Solución B
Oxalato de amonio
Agua
0,8 g
80,0 mL
Disolver el oxalato de amonio en el agua. Después de preparar las soluciones A y
B, verter una en la otra y agitar hasta que se mezclen perfectamente.
Solución de Yodo
Yodo
Yoduro de potasio
Agua
1,0 g
2,0 g
300,0 mL
Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en
una campana de extracción. Añadir una pequeña cantidad de agua para lavar el
mortero, agregar el resto del agua y agitar. Guardar la soluciòn en envases de
color ambar.
Nota: ¡Evitar el contacto de los reactivos con la piel!
Solución de Safranina
Safranina
Etanol (95%)
Agua
0,25 g
10,0 mL
100,0 mL
Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar
la solución con papel filtro.
Técnica de la tinción de Gram:
1. Colocar sobre un porta-objetos una gota de agua y la colonia que se desea
teñir, fijando a calor moderado la preparación. En caso de utilizar un cultivo
líquido, omitir la gota de agua y colocar directamente sobre un porta-objetos
una gota del cultivo líquido.
2. Adicionar cristal violeta a la preparación y dejarlo durante un minuto
3. Lavar con agua (usar de preferencia una piceta) y dejar escurrir
4. Cubrir la preparación el lugol (solución yodo-yodurada), y dejarlo actuar
durante un minuto.
5. Lavar con agua y decolorar con etanol al 95%, hasta que deje de salir
colorante, (aproximadamente 30 segundos).
6. Inmediatamente después enjuagar con agua y escurrir.
7. Aplicar el colorante de contraste (safranina), esperar durante 30 segundos y
8. Enjuagar con agua, escurrir y dejar secar, para posteriormente hacer la
observación microscópica.
Impronta Húmeda
Lactofenol azul algodón
Agua destilada
Cristales de fenol QP
Ácido láctico
Glicerina
Azul algodón
20,0 mL
20,0 g
20,0 mL
20,0 mL
0,05 g
Disolver el fenol en el agua, agregar el ácido y la glicerina y calentar a 70°C y
adicionar el colorante. Filtrar. Conservar en frascos de vidrio ámbar perfectamente
tapados.
Técnica de la impronta húmeda para observación de hongos.
1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodón sobre un portaobjetos
2. Utilizando técnica aséptica y con asa micológica tomar una muestra del hongo
(desarrollado sobre la caja de Petri), tratando de no romper las estructuras.
3. Si se tiene un cultivo puro, utilizar un bisturí estéril y cortar una porción muy
delgada del agar en el que se desarrolló el hongo, transferirlo al portaobjetos y
calentarlo suavemente para fundir el agar, de esta manera no se rompen las
estructuras y se asegura una buena observación.
4. Cubrir la preparación, colocarla en la platina del microscopio.
5. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para
mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X.
6. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las características
observadas.
Técnica de la impronta húmeda para observación de hongos (DIUREX)
1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodón sobre un portaobjetos
2. Colocar en el último tercio del asa micológica un pedacito de diúrex de 1.5 cm
de largo, enrollándolo ligeramente.
3. En condiciones de asepsia, destapar la caja de Petri que contiene el cultivo del
hongo, introducir el asa con el diúrex y presionar ligeramente sobre una
fracción de la colonia, tratando de no romper las estructuras.
4. Depositar la muestra en el portaobjetos que contiene el colorante, extender el
diúrex y colocar encima un portaobjetos.
5. Colocar la preparación en la platina del microscopio.
6. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para
mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X.
7. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las características
observadas.