Análisis de impurezas en heparina Unidad repetitiva mayoritaria de

Análisis de impurezas en heparina
Unidad repetitiva mayoritaria de heparina
Unidad repetitiva mayoritaria de dermatán
sulfato
Unidad repetitiva mayoritaria de condroitín
sulfato sobresulfatado (OSCS)
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La calidad de un espectro de RMN depende de:
• Calidad de la muestra
• Solvente utilizado
• Aspectos instrumentales
• Procesado de la señal
j calidad nos dará información incompleta
Un espectro de baja
o engañosa
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Calidad de muestra
• partículas en suspensión
• impurezas paramagnéticas
• tubos rayados o con imperfecciones
• baja concentración
• contaminación con sustancias extrañas, solventes, etc
•
Las partículas en suspensión y las interfases aire-solución
generan distorsiones en el campo magnético
•
Si Bo no es constante sobre todo el volumen de la muestra, la
frecuencia de resonancia de un determinado núcleo tendrá
distintos valores según su ubicación en el espacio
•
En la práctica ese campo no homogéneo generará una línea
con un ancho mayor al “natural” (que es 1/T2) ya que habrá
un rango de frecuencias de resonancia para un mismo núcleo
Bo
ν = γ (Bo ± ΔB)(1 - σ) / 2π
1/T2* = 1/T2 + γΔB
Ancho a media altura:
FWHM = 1/T2*
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Muestra muy diluida
ó
Núcleo poco sensible y/o
de baja abundancia
Líneas anchas
Aumentar concentración
(linealidad sobre un amplísimo rango de
concentración)
Acumular (sumar) un mayor
número de espectros
S/R = √N
reajustar homogeneidad
hay material en suspensión, burbujas, etc
nivel de solución bajo (agregar solvente)
tubo mal posicionado
Relación señal/ruido pobre
si todo esto falla todavía podemos mejorar
la calidad con un procesado adecuado
Un cambio de solvente puede tener efectos importantes en la
resolución del espectro
solvente: CDCl3
solvente: D2O
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solvente: CDCl3
solvente: D2O
Aspectos instrumentales
• campo magnético del espectrómetro
• ajuste de homogeneidad del campo magnético
• correcta elección de parámetros de acuerdo a las
características de la muestra y del núcleo observado
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CH3
H
7
1"
8 8a 1
6
5
4a
N
+
6'
5'
2'
1'
C(CH3)3
4'
RMN 1H 200 MHz
3'
2
Cl-
3
4
Terbinafina HCl
CH3
H
1"
8 8a 1
RMN 1H 500 MHz
Cl-
3
Terbinafina HCl
Terbinafina
Lote
TF018F05
1.242
1.859
1.832
1.809
1.777
2.631
2.623
4
3.628
3.619
4a
3'
2
8.109
8.092
8.065
8.051
7.967
7.951
7.940
7.924
7.669
7.666
7.655
7.652
7.650
7.638
7.636
7.593
7.579
7.567
7.564
7.553
6.395
6.380
6.364
6.349
6.334
5.877
5.846
12.779
12.778
5
C(CH3)3
4'
3.859
6
1'
6'
5'
2'
4.774
4.767
4.747
4.740
4.604
4.595
4.578
4.568
7
N
+
HCl
Current Data Parameters
NAME
U06-070306
EXPNO
1
PROCNO
1
F2 - Acquisition Parameters
Date_
2006-03-23
Time
16.55
INSTRUM
Avance 500
PROBHD
5 mm PABBI 1H/
PULPROG
zg30
TD
65536
SOLVENT
CDCl3
NS
16
DS
2
SWH
8152.174 Hz
FIDRES
0.124392 Hz
AQ
4.0195913 sec
RG
161
DW
61.333 usec
DE
6.00 usec
TE
298.0 K
D1
1.00000000 sec
TD0
1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1
1H
P1
7.00 usec
PL1
0.00 dB
SFO1
500.1334221 MHz
13.0
12.5
12.0
11.5
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
9.00
1.06
2.95
1.96
1.96
0.97
0.98
2.95
3.96
0.98
F2 - Processing parameters
SI
32768
SF
500.1300061 MHz
WDW
GM
SSB
0
LB
-0.30 Hz
GB
0.5
PC
1.00
1.5
1.0
0.5
ppm
13
mayor campo magnético
mayor resolución y sensibilidad
6.395
6.380
6.364
6.349
6.334
7.669
7.666
7.655
7.652
7.650
7.638
7.636
7.593
7.579
7.567
7.564
7.553
7.967
7.951
7.940
7.924
8.109
8.092
8.065
8.051
Terbinafina HCl (4,7 T, 1H a 200 MHz)
Terbinafina HCl (11,75 T, 1H a 500 MHz)
8.1
8.0
7.9
7.8
7.7
7.6
7.5
7.4
7.3
7.2
7.1
7.0
6.9
6.8
6.7
6.6
6.5
6.4
6.3
6.2
6.1
6.0
Parámetros del espectro
Si el tiempo de repetición τ es insuficiente la señal se atenúa
τ < 5T1
se puede compensar parcialmente
usando un ángulo de pulso menor
Distorsiones por FID truncada
ganancia excesiva
tiempo de adquisición muy corto
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
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Procesado de la señal
• resolución digital
• filtrado de la señal / apodización
• corrección de fase y ajuste de línea de base
Resolución digital
FID:64K
64K
FID:
FID: 64K
64K
FID:
Espectro:512K
64K
Espectro:
Espectro:256K
64K
Espectro:
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Resolución digital
FID:64K
64K
FID:
FID: 64K
64K
FID:
Espectro:512K
64K
Espectro:
Espectro:256K
64K
Espectro:
Resolución digital
FID:64K
64K
FID:
FID: 64K
64K
FID:
Espectro:512K
64K
Espectro:
Espectro:256K
64K
Espectro:
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En el caso ideal la señal decae en forma de una exponencial decreciente y la
transformada de Fourier dará líneas Lorenzianas puras
En la práctica diversos factores instrumentales pueden afectar la forma de la
señal haciendo que su decaimiento no sea exponencial
para corregir esta distorsión la señal se multiplica por una exponencial decreciente
EM
Cuanto más pronunciada es esa exponencial las señales luego de la transformada de
Fourier serán más anchas y la relación señal/ruido aumentará
Como este proceso provoca un ensanchamiento de las líneas el parámetro utilizado
se suele expresar en Hz (LB).
Valores típicos: 0,25 Hz para RMN 1H y 0,8 a 1 Hz para RMN 13C
Fase del espectro
Mx’
Si la señal es un coseno la
TF da una línea Lorenziana
Espectro de “absorción”
TF
absorción
M
x’
y’
Myy’
Si lla señal
ñ l es un seno lla TF
da una línea que pasa por
cero en resonancia
Espectro de “dispersión”
TF
dispersión
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En el caso ideal el espectro es el de absorción puro con líneas Lorenzianas
En la práctica la señal no es ni un coseno ni un seno y debe hacerse una
combinación de 2 señales medidas con una relación de fase de 90°
Además la línea de base debe ser perfectamente recta y sin deriva
Puede corregirse manualmente o en forma automática
Generalmente se hace una corrección con un polinomio que se
ajusta a la forma de la línea de base
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