Estudio de reacciones enzimáticas sobre polímeros naturales.
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Estudio de reacciones enzimáticas sobre polímeros naturales. HOMBERT Clotilde IUT A Lille 1 Departamento de química Tutora: Margarita CALAFELL Departament d’Enginyeria Químical UPC (TERRASSA) 1 Agradecimientos Ante todo quisiera agradecer a Margarita CALAFELL por su buena acogida, su ayuda preciosa y que me haya mostrado el emocionante mundo de las enzimas. También agradezco a Gustavo GRACIA GRILLASCA, Alejendra RODRIGUEZ por su ayuda y guía a lo largo de mi proyecto. Finalmente agradezco a Kamelia TRAEGER, Angela VILCHEZ y Arfaxad REYES por la documentación. 2 INDICE: Objetivos del trabajo p5 Motivación p5 Extensión y limites del trabajo p6 Primera parte; estudio bibliográfico p7 I. Generalidades 1. p8 Estructura p8 a. Sitio activo p8 b. Estructura especifica de las enzimas p9 c. Clasificación p11 2. Mecanismos de reacción enzimática p12 3 3. Influencia de los factores p13 a. Temperatura p14 b. pH p14 Substrato c. p15 4. Mecanismos de regulación p15 a. Variación por acción de masa p15 b. Variación por activación o inhibición p16 c. Variación de la concentración de la enzima p17 II. Celulasa 1. 2. III. IV. p17 Definición p18 Propiedades químicas y físicas p19 Laccasa p21 1. Sitio activo p21 2. Mecanismo de reacción p22 Aplicaciones: 1. Degradación de la lignina p23 p24 a. Reacción p24 b. Dominios de utilización p26 4 2. Degradación de hidrocarburos aromáticos policiclicos p26 a. Reacción p26 b. Dominios de utilización p27 3. Fermentación y biocombustible Segunda parte; experiencias p29 p30 Ensayos de actividad de celulasa I. p30 Ensayos de actividad de laccasa II. p32 Tercera parte; resultados y discusión p37 Ensayos de actividad de celulasa I. p37 1. Resultados p37 2. Discusión p38 Ensayos de actividad de laccasa II. p39 1. Resultados p40 2. Discusión Conclusiones p41 p42 Cuarta parte; Referencias i bibliografía p43 Bibliografía p43 Referencia p44 5 Objetivos del trabajo: El objetivo principal de este trabajo ha sido: Estudiar las propiedades de las enzimas (laccasa y celulasa): su estructura, susbtratos, actividad y aplicaciones industriales. Los objetivos secundarios necesarios por alcanzar el estudio han sido: - Estudio bibliográfico de las distintas celulasas y laccasas conocidas; - Búsqueda de los métodos existentes para determinar su actividad; - Valoración de los métodos encontrados según su fiabilidad y facilidad de realización; - Puesta a punto de un método experimental y su valoración. Motivación: Desde el inicio de la vida, las enzimas juegan un papel muy importante en el metabolismo de hombres, animales y plantas. Se puede decir que es el inicio de la vida en el mundo. Pero no es solamente el inicio sino el porvenir. En efecto, hoy se preocupan mucho del impacto sobre el medio ambiente, la contaminación, etc. Actualmente se utilizan enzimas en muy variadas aplicaciones, desde la industria de alimentación, hasta la química verde pasando por el papel ecológico y el textil. Además, en un futuro, las enzimas serán reconocidas por su capacidad de transformar los residuos y obtener nuevos materiales con variadas propiedades como el aislamiento de viviendas, reciclado de papel i cartón la prometedora obtención de biocombustible y también la eliminación de la contaminación (eliminando la toxicidad del agua). Por ello el mundo de las enzimas es muy apasionante. A mi me parece que hacer mi proyecto con este objetivo es muy interesante e instructivo. 6 Además mi formación en IUT Lille ha sido en química y por tanto he podido adaptarme muy bien a los conocimientos de química y bioquímica que se requieren para este estudio. Extensión y limites del trabajo: El titulo de este trabajo es muy amplio, imposible de abordar en los tres meses de mi estancia en la UPC. Por ello se he optado por la caracterización de las enzimas que actúan sobre substratos poliméricos naturales y concretamente el estudio experimental de su actividad. 7 De todas formas también las enzimas que tienen como substrato polímeros naturales son muy variadas y por ello se ha decidido centrar el estudio sobre dos enzimas: celulasa y laccasa. Por tanto, se ha hecho el estudio bibliográfico de su estructura y propiedades, para la parte experimental se ha hecho el estudio de su actividad, realizando los experimentos con los criterios antes mencionados en los objetivos secundarios. 8 Estos enzimas estudiados por mi son utilizados por el grupo de la Dra. CALAFELL en aplicaciones concretas, y por tanto mi trabajo se puede considerar una parte del estudio de las aplicaciones de estas enzimas en los proyectos de este grupo y el análisis de sus aplicaciones. 9 Primera parte; estado del arte (estudio bibliográfico): Las enzimas Introducción: Las enzimas tienen una gran importancia en el metabolismo de las células. Para reproducirse la célula transcribe las proteínas. Los genes que codifican las proteínas se encuentran en el ARN mensajero (ARNm). El ARNm se desarrolla por la influencia de una enzima: ARN polimerasa, sobre el ADN. Así se produce un ARNm idéntico a la secuencia de ADN del gen. El ARNm no tiene doble hélice sino una forma secundaría compleja. Este ARNm se transduce en proteínas en el ribosoma de las células. Las enzimas, al catalizar la transcripción del código que contiene el ARNm y unir así los diferentes aminoácidos para formar una proteína, se puede decir que son el inicio de la vida. Las enzimas son proteínas constituidas por la repetición de 20 aminoácidos diferentes. Las propiedades de una molécula enzimática dependerán en cierta medida de la secuencia de aminoácidos de su cadena molecular. Cada enzima es única y cataliza una determinada reacción. Sus propiedades de aumentar la velocidad de reacción se utilizan en muchos ámbitos industriales. Al principio no se conocía ni su existencia ni su estructura ni sus mecanismos de reacción, pero se sabía que algunas plantas y animales o sus partes, tenían propiedades de acelerar procesos metabólicos y se aprovechaban para producir substancias manufacturadas. También se aprovechaba las propiedades de las enzimas microbianas en las fermentaciones controladas para la fabricación, por ejemplo, de vino y queso. Las propiedades de las enzimas dependen de su estructura (el sitio activo, su forma, etc.) y le dan el modo específico de acción para catalizar las reacciones. Su actividad también depende de factores exteriores (la temperatura, el pH, el substrato). Hay mecanismos reguladores que aumentan o disminuyen la velocidad de las reacciones (variaciones por acción de masas, variación de la actividad específica de la enzima por activación o inhibición, etc.). Las enzimas que se van a estudiar en este proyecto son la celulasa y la lacassa. 10 I. Generalidades: 1) Estructura: a) Sitio activo: Las enzimas catalizan las reacciones celulares. Para cumplir su función requieren conservar su estructura nativa en la que se destaca una región formada por un número reducido de residuos aminoacidicos que poseen afinidad por los compuestos que intervienen en la reacción. Este lugar se llama “sitio activo”. Ese centro activo se llama también la apoenzima. La apoenzima es la enzima propiamente dicha, de naturaleza proteica formada por cadenas de polipéptidos, con peso moléculas elevado, no dializable y termolábil. Algunas enzimas tienen una especificidad prácticamente absoluta para un determinado substrato y no se acoplan ni siquiera con substratos muy parecidos. Por ejemplo, la enzima aspartasa cataliza la adición reversible de amoniaco al doble enlace del acido fumárico, y a ningún otro acido no saturado. La aspartasa también presenta una rígida estereoespecificidad y regioespecificidad, por eso no desamina el D-aspartato ni adiciona amoniaco al malato, que es el isómero geométrico-cis del fumarato. Otro ejemplo de especificad absoluta es el de la maltasa, que solo hidroliza al azúcar maltosa. En el otro extremo están las enzimas que tienen une especificidad relativamente amplia y actúan sobre muchos substratos que presentan características comunes. Por ejemplo, la fosfatasa del riñón que cataliza la hidrólisis de muchos ésteres diferentes del acido fosfórico, pero a velocidades variables. Otro ejemplo lo constituyen las lipasas, que pueden romper la unión éster (hidrolizan igual etilbutirato que un triglicérido). Del estudio de especificidad de las enzimas por el substrato surgió la idea de que existe una relación complementaria, tipo llave-cerradura, entre la enzima y el substrato, denominada sitio activo o sitio catalítico, en el que se une la molécula del substrato con la enzima para poder realizar la reacción catalítica. Dos características estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato: en primer lugar, el substrato debe poseer el grupo químico específico o enlace, que debe ser catalizado por la enzima, y además el substrato debe tener habitualmente algún otro grupo funcional, un grupo de unión donde se une a la enzima y se ubica en posición de modo que, el enlace susceptible se disponga apropiadamente en relación al sitio activo de la enzima, para que tenga lugar la reacción. 11 Muchas apoenzimas tanto si están constituidas por una única cadena polipeptídica plegada o por varias unidades, requieren de otras moléculas no proteicas para funcionar. Esas moléculas (cofactores) pueden ser iones inorgánicos que se unen temporalmente a las enzimas. Por ejemplo el hierro ([Fe ] o [Fe ]) o el cobre ([Cu+] o [Cu ]) que durante 3+ 2+ 2+ la reacción catalizada, provocan las oxidaciones y las reducciones. Por ejemplo el cinc 2+ ([Zn ]) que ayuda a unir el NAD a la enzima. También pueden ser coenzimas, pequeñas moléculas orgánicas que interaccionan débilmente con la enzima y el substrato durante la catálisis. Muchos de estos coenzimas deben ser incorporados con la dieta. Las coenzimas reaccionan con las enzimas de igual modo que el substrato En la mayoría de los casos son vitaminas cómo la biotina (ayuda a transferir un grupo –COO-) o la coenzima A (transporta un grupo –CH2-CH3-) o como el NAD y el FAD que transportan electrones. Cuando estas moléculas están unidas permanentemente a la enzima y ayudan a la reacción de catálisis se llaman grupos prostéticos. Por ejemplos, el grupo hemo que transfiere O2 y electrones (contiene el cofactor hierro) y la flavina que transfiere también electrones b) Estructura de las enzimas: La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales denominados: Estructura primaria, Estructura secundaria, Estructura terciaria, Estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposición de la anterior en el espacio. La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína. Nos indica qué aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte. La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio. Los aminoácidos, a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de las proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable. Existen dos tipos principales de estructura secundaria: la configuración en alfa-hélice y en láminas beta. La configuración en alfa-hélice se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la formación de puentes de hidrógeno entre el -C=O- de 12 un aminoácido y el –NH- del cuarto aminoácido que le sigue en la cadena primaria. La configuración en laminas beta puede ser en laminas beta antiparalelas o laminas beta paralelas, según se formen los puentes de hidrogeno entre tramos de estructura primaria con terminales carboxilo-amina o carboxilo-carboxilo La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular. Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así poder realizar funciones de transporte, enzimáticas, hormonales, etc. Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los diferentes aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces: -puentes disulfuro entre aminoácidos que tiene azufre; -puentes de hidrógeno; -interacciones electrostáticas; -interacciones hidrófobas. Esta configuración proporciona la estructura tridimensional de las proteínas. Podemos observar la estructura terciara de una enzima, la laccasa, en la figura 1. Notamos la presencia de alfa-hélices y laminas beta. Vemos también los cuatros átomos de cobre en marón (el sitio activo). Figura 1: estructura tercera de la laccase Los cuatros átomos de cobre Fuente: htp://www.brendaenzymes.org/ Code PBDsum: 1kya La estructura cuaternaria la forma la unión, mediante enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptidicas recibe el nombre de subunidad. 13 c) La clasificación: Las enzimas se clasifican por un sistema numérico de cuatro dígitos. Este sistema numérico contiene una referencia al susbtrato, al tipo de reacción que cataliza, al mecanismo y a la enzima en concreto. La clasificación sistemática de una enzima se realiza según el Enzymatic Code (E.C.). [http://www.brenda-enzymes.org/] Tipo de sustrato sobre el que actúa Tipo de reacción que cataliza 1. 2. 3. 4. Identfcación de la enzima Tipo de mecanismo de la reacción Según el tipo de reacción que catalizan (primer dígito del código numérico EC), las enzimas pueden pertenecer a seis grupos: -1) Oxidoreducatasas: catalizan reacciones Red-Ox. Se las llama también deshidrogenasas. Transfieren iones H+ y electrones (están asociadas a coenzimas redox). Las enzimas pueden ser peroxidasas, reductasas, oxidasas, oxigenasas, hidrogenasas y deshidrogenasas. Todas ellas catalizan este mismo tipo de reacción: - A + B ―› A + B - -2) Tansferasas: catalizan reacciones donde se transfieren grupos funcionales de un compuesto a otro. Las quinasas representan un grupo especializado que transfiere grupos fosfato. Tipo de reacciones: A-X + B ―› A + B-X donde A es un donante (como una coenzima) y B un aceptor. -3) Hidrolasas: catalizan la rotura de un enlace, adicionando una molécula de agua: R-R’ ―› R-OH + R’H -4) Lyasas: catalizan la rotura de enlaces por mecanismo distintos a la hidrólisis o la oxidación: A―› B+C Las decarboxilasas y aldolasan son ejemplos de lyasas. 14 -5) Isomerasas: catalizan reacciones donde hay cambios en el seno de la molécula (reordenación de grupos funcionales y conversión de la molécula en un isómero). A―›B (donde B es un isómero de A). -6) Ligases: catalizan la unión de moléculas utilizando energía proveniente del ATP. También se llaman sintetesas. Catalizan la unión de dos moléculas por formación de nuevos enlaces: -C-C-, -C-S-, -C-O- y -C-N[DR. Mario Sapag-Hagar y de Hermann Schmidt-Hebbel Biblioteca digital de la universidad de Chile. Parte II: Generalidades sobre enzimas] 2) Mecanismo de acción enzimática: Cada reacción necesita una energía adicional (energía de activación) para iniciarse. Una vez iniciada la reacción, esta se realiza espontáneamente. La energía requerida es la anergia de activación. Una enzima actúa de forma que se une a los reactivos para reducir la energía de activación. El reconocimiento enzima-sustrato según el modelo de FISHER con su imagen de la “llave y la cerradura” (1894) plantea la complexidad estructural entre el sustrato transformado y una cavidad de la enzima llamada “sitio activo”. El sustrato está “atrapado” en una posición que está a favor de la estabilización de ciertas cadenas a través de ciertos residuos enzimáticos. La enzima y el sustrato, unificados por las interacciones fuertes, constituyen el intermediario de una reacción inestable, que permite la disminución de la barrera de la energía de activación. La velocidad de reacción es inversamente proporcional a esta energía de activación “Ea” o barrera de potencial. En este tipo de reacción, el estudio del mecanismo catalítico supone el conocimiento de los residuos del sitio de enlace y del sitio activo de la enzima, la naturaleza y el tipo de conexiones de los intermediaros, de los intercambios de protón, electrón y residuos funcionales. Sea cual sea el tipo de reacción catalítica, un ciclo catalítico respeta siempre cuatro etapas: -La difusión de los reactivos en el medio; -El reconocimiento especifico enzima-sustrato; -La reacción por los mecanismos implicados; 15 -La expulsión de los productos que liberan la enzima y que da su funcionalidad para otro ciclo catalítico. Figura 2: La figura 2 nos muestra la conexión del substrato en el centro activo de la enzima. A diferencia de otros catalizadores, las enzimas tienen en su estructura, el sitio activo que les permite unir y orientar las moléculas eficientemente. Una enzima es capaz de catalizar la reacción de alrededor de mil moléculas de substratos en producto por segundo. 3) La influencia de los factores: Las enzimas son catalizadores biológicos que tienen una configuración determinada por las fuerzas estabilizadoras de la proteína. Cualquier factor externo que altere esas fuerzas va a modifica la actividad de la misma. a) La temperatura: Como en todas las reacciones químicas, la velocidad de las reacciones enzimáticas depende de la temperatura y es óptima en el punto donde las enzimas son estables y mantienen su actividad más elevada. Según ARRHENIUS: Kcat = C * exp-Ea/RT C: constante R: constante de los gases ideales T: temperatura (Kelvin) 16 Ea: energía de activación de la reacción (según ARRHENIUS) La velocidad de la mayoría de las reacciones enzimáticas se dobla cuando la temperatura aumenta en 10ºC sin sobre pasar su temperatura óptima (Myron I. Bender, Lewis J. Brulacher, 1977). La temperatura óptima de una reacción enzimática se deduce del estudio de la desnaturalización o la desactivación de la proteína enzimática por el calor. Un calor extremo provoca en primer lugar una rotura de los puentes de hidrogeno, las hélices y las láminas se deforman. Después, si la temperatura sigue en aumento, existen roturas de ciertos enlaces covalentes. Cuando la estructura espacial de la enzima ya no está adaptada a su función, se dice que la enzima se ha desnaturalizado. La figura 3 muestra a la izquierda la forma activa y a la derecha la forma desnaturalizada. Figura: 3 Fuente: http://www.brenda-enzymes.org Podemos observar que las hélices de la estructura desnaturalizada son abiertas. Por eso, los aminoácidos están desplegados y el substrato no reacciona con ella. b) El pH: La mayoría de las enzimas muestran un pH óptimo característico donde su actividad esta al máxima: por encima o por debajo de este pH, la actividad de la enzima disminuye. La relación entre el pH y la actividad de una enzima seleccionada depende del comportamiento acido-básico de la enzima y de su substrato. 17 Los valores de pH y temperatura óptimos varían según la enzima pero en todos los casos permiten que la estructura del sitio activo sea la más adecuada para la catálisis. El pH tiene una influencia sobre la ionización del substrato (o del producto), la estructura de la proteína (y por tanto sobre la estabilización enzimática), el complejo substrato-enzima y la actividad catalítica de la enzima. En función del pH de la disolución, la actividad pasa por un máximo. Los residuos de aminoácidos en el sitio activo de la enzima se pueden ionizar e interferir en la catálisis. c) El substrato: Son las substancias que son transformadas específicamente por las enzimas. Se usan para medir la actividad catalítica de las enzimas y también para determinar el carácter específico de una acción enzimática. Para que una substancia sea apropiada como substrato de una enzima debe reunir los siguientes requisitos: En primer lugar es necesario que experimente una transformación bien definida por la acción catalítica de la enzima. Por ejemplo, la formación estequiométrica de un producto coloreado. Además hace falta que sea específico para la enzima estudiada o para un grupo muy restringido de enzimas. Por ejemplo, el almidón para las alfa- y beta- amilasas, que da una modificación definida detectable por absorción al ultravioleta. También es necesario que, no sufra una descomposición espontánea o produzca otras reacciones no catalizadas por la enzima, como lo confirma la liberación de ácido o de alcalino que sea medible por valoración (la liberación de ácido carboxílico en la pectina por la pectinoestearasa). Finalmente, la transformación del substrato que es catalizada por la enzima, deber ser fácilmente medible. Esta ha de tener alguna propiedad detectable, es decir un acoplamiento con otras reacciones químicas o enzimáticas, llamadas reacciones indicadoras (cómo por ejemplo, la reacción química de fosfatasa en leche, del fenol liberado con la dibromoquinonclorimida parar dar indo-fenol de color azul, etc.). Los substratos enzimáticos pueden tener dos orígenes. Por una parte pueden ser los naturales de las respectivas enzimas, como el almidón para amilasas o el etanol para la alcohol dehidrogenasa, o también pueden ser derivados de los substratos naturales. Es decir, obtenidos por síntesis con una estructura química tal que pueden ser reconocidos y transformados por la respectiva enzima con formación de productos, ya sea coloreados o fácilmente medibles por otro medios (las 4-nitroanilidas de aminoácidos como substrato de proteasas y los 4-nitrofenil derivados de azucares, como substratos para glucosidasas, son dos ejemplos). 18 4) Mecanismo reguladores: a) Variaciones por acción de masas: Las variaciones por acción de masas es el mecanismo regulador más primitivo y mediante él la velocidad de la reacción puede variarse, alterando la concentración del substrato, del producto (si la reacción es lo suficientemente reversible como para que la concentración del producto afecte significativamente la reacción opuesta) o de cualquiera de los cofactores que intervienen estequiométricamente en la reacción. b) Variación por activación o inhibición: Las enzimas están sujetas a la regulación de su capacidad catalítica, ya sea en dirección positiva, negativa, o en ambas, mediante moléculas pequeñas que han sido denominadas efectores o moduladores. Este tipo de substancias incluye substratos y productos metabólicos de rutas metabólicas aparentemente no relacionadas. En la mayoría de los sistemas multienzimáticos donde intervienen secuencialmente varias enzimas y el producto de una es el substrato de la siguiente. La primera enzima de la secuencia, funciona como reguladora de la velocidad de todo el sistema y se denomina “enzima reguladora o enzima alostérica”. Habitualmente esta enzima es inhibida por el producto final de la secuencia, de tal modo que cuando se produce acumulación del producto final sobre determinada concentración crítica, éste inhibe a la enzima reguladora, interrumpiendo o cerrando así ese segmento del metabolismo. Este tipo de inhibición se conoce como inhibición por producto final o retroinhibición (inhibición "feedback"). Las enzimas reguladoras o alostéricas están formadas por dos a más subunidades que tienen sitios de unión no sólo para su substrato normal, sino también para el metabolito regulador, el cual se denomina efector o modulador alostérico y es altamente especifico. Cuando el sitio alostérico está desocupado la enzima funciona con su velocidad catalítica normal; en cambio, si está ocupado por el metabolito regulador, la enzima sufre una modificación en su conformación a una forma menos activa o más activa, dependiendo de sí el modulador es inhibidor o estimulador. La inhibición de la actividad enzimática por moléculas especificas y por iones es importante porque sirve como mecanismo de control mayoritario en los sistemas biológicos. También muchos fármacos y agentes tóxicos actúan de este modo. Es más, la inhibición enzimática puede suministrar una idea acerca del mecanismo de la acción enzimática. 19 La inhibición enzimática puede ser reversible o irreversible. En la inhibición irreversible el inhibidor queda covalentemente unido a la enzima o ligado tan fuertemente que su disociación es lenta; produciendo una modificación permanente de algún grupo funcional del sitio activo de la enzima. Ejemplos de los inhibidores irreversibles son las sales de metales pesados y el yodoacetato que se fijan en los grupos sulfhidrílicos de la enzima y, por otra parte, el di-isopropil-fluorofosfato (uno de los más potentes gases tóxicos del sistema nervioso) que inhibe a la enzima acetilcolinoesterasa al unirse a una serina fundamental del sitio activo, bloqueándolo. La inhibición reversible, en cambio, se caracteriza por un rápido equilibrio entre el inhibidor y la enzima. Ejemplos lo constituyen la inhibición competitiva y la no competitiva. Los inhibidores competitivos son aquellos cuya acción puede ser revertida aumentando la concentración de substrato. Habitualmente forman un complejo con él uniéndose al enzima por el sitio activo. Un ejemplo es el malonato que se asemeja al succinato y por ello inhibe la succinato-deshidrogenase. El inhibidor no competitivo no se une en el sitio del substrato, sino en otro grupo de la enzima, que es esencial para su función. La inhibición no competitiva no puede ser revertida por aumento de la concentración de substrato. Un ejemplo lo constituye la inhibición por el cianuro de algunas enzimas que contienen Fe, el cual se combina reversiblemente con el cianuro, dando una forma inactiva. c) Variación de la concentración de la enzima: Hoy se reconoce que uno de los principales mecanismos reguladores se basa en la alteración de la cantidad absoluta de enzima en la célula. La concentración de la enzima es la resultante entre las velocidades de su síntesis y de su degradación. Se denomina inducción al aumento de la concentración de la enzima por aumento en su síntesis y represión a su disminución por disminuir la síntesis. La síntesis de proteínas, y por lo tanto de las enzimas, está regulada principalmente a nivel de la transcripción del DNA para dar RNA mensajero. La transcripción de un gen o de un grupo coordinado de genes (lo que se llama un operón) puede reprimirse al unirse una substancia represora a un gen operador que forma parte del operón. Se puede bloquear la represión (o sea, producir inducción) por la presencia de ciertos metabolitos reguladores (moléculas inductoras), que puede ser un substrato de la enzima codificada por el gen reprimido. Este tipo de mecanismos reguladores que implica alteración en la velocidad de síntesis de una enzima conlleva una apreciable cantidad de tiempo (desde una hora hasta varios días). II. Celulasa: 20 Las celulasas son enzimas complejas, es decir que presentan diversas estructuras que actúan sobre los mismos susbtratos. Producidas principalmente por hongos, bacterias y protozoos, existen organismo que las producen como plantas y el estómago de los rumiantes. El numero E.C. de este grupo de enzima es 3. 2. 1. 4., lo que indica que esta familia de enzimas son hidrolasas, es decir que catalizan la hidrólisis y la degradación de la celulosa. 1) Definición: Como toda enzima las celulasas se clasificadan en función de las reacciones que catalizan. Hasta ahora se han descrito 85 familias a partir de las regiones de su secuencia que se encuentran mejor conservadas. Las celulasas reconocen e hidrolizan el enlace β (1-4) de la celulosa descomponiéndola en pequeñas moléculas de glucosa. La configuración β permite a la celulosa formar puentes de hidrogeno y por tanto crear cadenas largas, lineales y tridimensionales, se conocen como micro fibrillas. Estos enlaces dan a la celulosa las características de insolubilidad, rigidez y resistencia al ataque enzimático. Existen tres tipos de celulasas no agregativas según el tipo de reacción que catalizan, como lo indica el diagrama siguiente: Endoglucanasas Sistema no agregativo Exoglucanasas Celulobiosas Degradación de la celulosa Celulosoma Sistema agregativo Por otro lado también están los celulosomas: Investigaciones sobre bacterias como el Cellulomonos thermocelluim y C. cellulovorans revelan la formación de complejos multienzimaticos de alto peso molecular (celluosomas), los cuales reconocen las fibras de celulosa desde la superficie de la célula. Un celulosoma se compone de al menos 14 proteinas distintas incluyendo varias celulasas, xilanasas y al menos una β-glucosidasa. Estos compuestos están unidos por una proteína sin actividad enzimática que se conoce como proteína de unión a 21 celulosa (CbpA: Cellulose binging protein A). La proteína de unión es necesaria para romper las estructuras amorfas de celulosa pero no puede actuar en las formas cristalinas del polímero. A B Figura 4: moléculas de celobiosa (A) y glucosa (B) Fuente: http://www.ciencia.cl/CienciaAlDia/volumen3/figura3.gif Las enzimas que pertenecen a la familia de hidrolasas glicosídicas presentan distintas actividades dentro de las que se destacan: endoglucanasa, beta-mananasa, exo-1,3-glucanasa, endo-1,6-glucanasa, xilanasa y endoglicoceramidasa. Dentro de estas estructuras proteicas encontramos alfa-hélices con forma en espiral así como también las estructuras-beta que se componen de laminas planas. Algunas de las proteínas pueden no presentar alfa-hélices mientras que otras tienen un gran número. 2) Mecanismo de reacción: 22 La hidrolisis de la celulosa a través de celulasas requiere de un sistema multienzimatico, es decir un complejo de celulasas. Sin embargo también existen los sistemas no agregativos que se dividen en tres grupos según la reacción que catalizan: 1. Exoglucanasas (o exo-β-1,4-D-glucanasas): también llamadas cellobiohidrolasas, son enzymas que cortan las cadenasde 1,4 β-D-glucano a partir del extremo no reductor de la molécula de celulosa y de las celodextrinas. Producen tetrasacaridos o disacáridos de glucosa o celobiosa. La figura 4 presenta las moléculas de celobiosa (A) y de glucosa (B) y la figura 5 muestra la hidrólisis de maltosa. 2. Endoglucanasas (o endo- β-1,4-D-glucanasa): Descomponen los enlaces internos β (14), alteran la estructura cristalina de la celulosa y producen cadenas de oligosacáridos de diferentes longitudes, los cuales mantienen la configuración beta de la celulosa. La acción de estas celulasas sobre las regiones amorfas de las moléculas de celulosa disminuye la polimerización y crea la formación de nuevos extremos que sirven de substrato para posteriores reacciones. Algunos productos como la celobiosa inhiben las exoglucanasas y endoglucanasas, lo que provoca la disminución de actividad. En cuanto las zonas amorfas de la celulosa son degradadas, la hidrólizacion comienza por la región cristalina. Son las endoglucanasas y los exoglucanasas que provocan la hidrólisis de las celulasas. 3. Beta-Glucosidasas: Cortan la celobiosa y otros oligosacáridos para producir glucosa. Las glucanasas son inhibidas por la celobiosa. Por tanto, la hidrólisis de la celulosa en glucosa mediante los β (1-4) glucidasas, limitan la degradación de la celulosa. Molécula de oxigeno Link glucósido Figura5: hidrólisis del maltosa 23 Fuente: http://i654.photobucket.com/albums/uu263/Okihita/5-pembentukandisakarida.jpg El disacárido maltosa se descompone al agregarle agua en dos moléculas de glucosa. Esto forma parte del proceso llamado catabolismo y la reacción específica se le conoce con el nombre de hidrólisis. III. Las laccasas: Las Laccasas, (benzenediol oxydoreductasas) EC: 1.10.3.2 son enzimas multi-cobre que pertenecen a los grupos de oxidasas azules. Son enzimas muy estables. Las Laccasas catalizan la oxidación de multitud de compuestos fenólicos, también diaminos y aminas aromáticas, utilizando oxigeno como transportador de electrones. Solamente la laccase puede oxidar la syringaldazine [4-hydroxy-3,5-dimethoxy benzaldehyde azine]. Se considera el substrato típico de esta enzima. También otros compuestos orgánicos con grupos hidroxilo, ácido, o amino pueden actuar como substratos. Esto es otro factor favorable de las laccasas. 1) El sitio activo: La laccasa tiene cuatro átomos de cobre. Están identificados por resonancia paramagnética de electrón (EPR: Electron Paramagnetic Resonance) que los identifica como: Tipo 1 (T1), Tipo 2 (T2) y Tipo 3 (T3) [5]. Los cuatros átomos están organizados como sigue: un átomo aislado que provoca la reducción de los fenoles y un grupo de tres átomos de cobre, uno de tipo 2 y dos de tipo 3, son los causantes de la activación del oxigeno. La organización de los cuatros átomos está representada en la figura 6. 24 a b c d Figura 6: Sitios activos de la laccasa. La espectroscopia combinada con cristalografía proporciona la descripción detallada sobre el sitio activo de la laccasa. El análisis por Dicroísmo Magnético Circular (MCD: Magnetic Circular Dichrosm) y la espectroscopia de absorción de rayos X muestra que el tipo 2 y 3 funcionan como un grupo de cobre trinuclear [6]. El cobre tipo 2 (fig 6 c) posee tres coordinaciones (es un 3-coordinador): 2 con la histidine y otro con el agua. El átomo de tipo 3 es un 4-coordinador: tres ligando con la histine y uno con agua (fig 6 b). El cobre T2 provoca la reducción del oxigeno. El sito T2 es necesario para la reducción del oxigeno. La reducción del oxígeno no se produce en el cobre T1. Así el sitio trinuclear T2/3 represente el sitio activo para la formación de enlace y reducción del oxigeno. O sea, el cobre T1 no es necesario para reaccionar con el oxigeno [8]. 2) Mecanismo de la reacción: 25 Las laccasas oxidan los substratos por sustracción de un electrón y formación de radicales libres que pueden polimerizar [8]. Las laccasas pueden reducir el oxigeno molecular por transferencia de electrones y posteriormente formar agua. El cobre T1 es el principal aceptor de electrones. Al menos uno de los dos electrones necesarios para la reducción de un átomo de oxigeno provienen de este sitio [9]. La velocidad de reacción de T1 es el paso limitante de la velocidad de la reacción global. El cobre T2 es necesario para la oxidación aeróbica del sitio reducido T3, esto permite al sitio T3 actuar como un aceptor de dos electrones [10]. El mecanismo de catálisis de la laccasa sugiere que el cobre T2 estabiliza un intermediario en la reducción del oxígeno a agua, esto indica que el cobre de tipo2 forma parte del sitio de reducción del oxígeno en la enzima. Se ha visto que la inhibición de la enzima a pH alto es debido a la formación del complejo cobre T2-OH-. Este complejo no permite la reducción del sitio T3 hasta que el grupo OH- se haya disociado o se convierta en agua. A pH bajos, una molécula de agua formada en el sitio reductor de la enzima parece que se re-oxida para uniese al sitio Cu T2. En las figuras 7 y 8 se pueden ver estos mecanismos de la laccasa. Figura7: Polimerización de los grupos fenólicos. 26 Figura 8: reacción de oxidation de la laccase IV. Aplicaciones: Las enzimas oxidantes tienen muchas aplicaciones de utilidad [11]. Las laccasas pueden degradar la lignina (para la producción del papel), pigmentos (utilizada el industria del textil), parte de la contaminación de las aguas residuales, se adiciona también a detergentes, etc. Por otro lado, la celulasa se utiliza en los procesos alimentarios, las energías renovables, la industria cosmética y farmacéutica, para controlar el crecimiento de los microorganismos, etc. A continuación se verán las principales aplicaciones de estas enzimas, relacionadas con el papel, la química alimentara, las aguas residuales y la transformación en biocombustible. 27 1) Degradación de la lignina: a) Explicaciones: Los materiales lignocelulósicos son los constituyentes principales de la pared de las células vegetales. La lignina forma una matriz amorfa en la pared secundaria de la fibra celulósica que la protege de la degradación microbiana y de la hidrólisis enzimática en general. En la pared vegetal existen enlaces interpoliméricos: enlaces éter entre grupos OH (de los polisacáridos) y fenólicos (de la lignina), y puentes formados por los ácidos p-hidroxicinámicos. Figura 9: Lignina, celulosa y hemicelulosa en la madera [12]. Fuente:José C. del Rio Valorización de productos agroforestales para la fabricación de pasta de papel: Caracterización química y modificación estructural de sus constituyentes en los procesos de cocción y blanqueo. IRNAS-CSIC, Sevilla La figura 10 nos muestra la complicada estructura de la lignina. La laccasa degrada la lignina por oxidación de los compuestos cíclicos. 28 Figura 10: Estructura de la lignina. Fuente: K. Haideer, S. Lim and W. Flaig. Holzforschung 18. 81-88 (1964). Reprinted by permission of Walter de Gruyter & Co Podemos observar la presencia de varios grupos fenólicos en formula de la lignina. Figura 11: Esquema de reacción generalizado para monómeros de lignina. Fuente: adaptado de Barth 2000; Gónzalez, 2004. 29 La figura 11 presenta la oxidación de la lignina y sus derivados fenólicos sometidos a conversión hidrotérmica en ausencia de oxigeno. La laccase es la enzima más significativa en la degradación de la lignina. Rompe las conexiones en el seno de las estructuras fibrosas para obtener los productos intermedios de la fabricación del papel [21] b) Dominios de utilización: La degradación de la lignina se encuentra en varias aplicaciones, pero la aplicación principal es en la fabricación del papel. La producción de la pulpa de papel necesita la separación y la degradación de la lignina de la madera. La optimización de los rendimientos se hace con los tratamientos preliminares de la madera con enzimas. Este paso ayuda a romper las diferentes conexiones en el seno de la estructura fibrosa y mejora el proceso de la deslignificación. Al contrario de otros compuestos oxidantes (MgO2, H2O2) la laccase es el más estable y el mas fácil de utilizar. El H2O2 se descompone fácilmente con muchas substancias como los metales de transición, etc. El MgO2 es un poderoso reductor pero no es selectivo y es irritante. 2) Degradación de los hidrocarburos aromáticos poli cíclicos: a) Definición y explicación: Los pigmentos son compuestos que se dividen en dos familias. La familia de los pigmentos minerales con conexiones metálicas (cobalto, azufre, oxido de hierro), y la familia de los pigmentos orgánicos, que están constituidos por cadenas carbonadas (perilenos, ftalocianinas, azoicos). La familia de los hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (HAP) se compone solamente de carbono e hidrógeno, cuya estructura molecular está formada al menos por dos ciclos aromáticos condensados. La pirolisis con temperaturas por encima de 500°C de estos productos provoca la formación de radicales libres (pequeñas moléculas inestables que degradan todas las partículas que encuentran). Se almacenan en las grasas de los organismos, pueden reaccionar con las moléculas biológicas, por ejemplo el ARN y el ADN, provocando su destrucción o alteración. 30 La figura siguiente muestra la estructura de los HAP. Lo que llama la atención es la repetición del compuesto “fenolico”. Ahora bien, la laccase va a reaccionar con estos compuestos cómo su substrato. El producto que se forma ya no puede actuar sobre las moleculas de nuestro organismo. 3. Utilizacionb) A Figura 12: presentación de los diferentes Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) Fuente: http//:www.personal.telefonica.terre.es/web/catastrophe/quim/nhap.html 31 b) Aplicaciones: Las propiedades oxidantes de las laccasas se utilizan en la industria textil, como en la decoloración de los pantalones tejanos “jeans” donde tradicionalmente se había utilizado la piedra pómez. Hoy se sabe que una pequeña cantidad de enzima reemplaza varios kilogramos de piedra y por eso este método causa menos daños a las telas y menos degradación de las lavadoras. Se utilizan también por su capacidad de degradar los pigmentos. Actualmente se estudian las laccasas por su capacidad de inhibir la contaminación de las aguas. En el caso de aguas residuales, se utilizan sobre los contaminantes cómo el chlorofenol y los nitro-aromáticos. Las aguas residuales contienen materiales biológicos fácilmente degradables (Daigger and Grady 1995) [13], mientras que las aguas subterráneas e industriales contienen compuestos orgánicos. El tratamiento de estas es complicado y requiere estudios sobre sus estructuras. La degradación de contaminantes en aguas residuales es un área muy prometedora de la aplicación de las laccasas. Igualmente la industria alimentaria emplea enzimas. Las celulasas se utilizan en el procesamiento de bebidas, en el ensayo del acido ascórbico, en la fabricación de azúcar de remolacha, gelatinas, pectina, bicarbonato y en biosensores. 3) Degradación de azucares: Hoy se buscan alternativas a la utilización de combustibles fósiles que tiene un gran impacto en el medio ambiente. Por eso los biocombustibles procedentes de biomasa, como el bioetanol, parecen una alternativa prometedora. Provienen de la fermentación de los azucares de los cereales como: el maíz, el trigo o de simientes oleaginosas como la soja. La lignocelulosa es la fuente mas abundancia de carbono y está constituida por un 40% a un 50% de celulosa, de un 25% a un 50% de hemicelulosa y de un 10% a un 40% de lignina, dependiendo de la planta o del tipo de madera. Los microorganismos producen enzimas con las que pueden convertir la celulosa en energía. Pero antes la celulosa debe ser hidrolizada en pequeños carbohidratos por acción de enzimas extracelulares que la hacen más accesible a otras enzimas. (Stephanopoulos 2007) [14] 32 H+ O D-glucosa O O NADH+ H+ NAD CO2 H H OH H CH3 CH3 Piruvato O Acetaldehído CH3 Etanol Dibujo1: Degradación de la celulosa en alcohol. Fuente: wikipédia El dibujo 1 muestra el mecanismo de reacción de la degradación de glucosa en alcohol. El primer paso es una glucolisis seguida de una decarboxilación del piruvato y finalmente la reducción del acetaldehído a etanol. La transformación del polímero en azucares simples (hexosas o pentosas), necesita un tratamiento posterior para eliminar los residuos que no sirven a la fabricación del papel. La conversión de la biomasa implica tres pasos: - Obtención de la celulosa (extracción de la lignina); - Hidrólisis de la celulosa que cataliza la celulasa; - Fermentación de las pentosas y hexosas en alcohol. (Lynd et al. 2005)[14]. Para completar la hidrólisis es necesaria la acción de un combinado enzimático. El problema de la hidrolisis es que no existen microorganismos capaces de hidrolizar directamente los polisacáridos y de fermentar el azúcar deseado para la producción de etanol, butanol o acido láctico. El microorganismo debería romper la celulosa de forma eficaz, y para ello debería poseer la familia de enzimas celulósicos, fermentar los azúcares a etanol y ser tolerante al alcohol producido en el proceso de degradación de la celulosa. Para ello se puede utilizar una co-cultura de levaduras Saccharomyces cerevisiae y brettanomyces clauseii para estimular la sacarificación y la fermentación (Spindler et al. 1989) [15]. →Figura13: modelo de ataque de la celulasa sobre la celulosa Fuente: https://www.ornl.gov/info/ornlreview/v40_1_07/article10.shtml 33 Uno de los factores más costosos en la producción de etanol de celulosa es el uso de enzimas y métodos mecánicos para fragmentar la celulosa. Segunda parte: Métodos Experimentales I. Ensayos de actividad de la celulasa: Método colorimétrico [2]: El método con el substrato anthrone es recomendado por DREYWOOD (1946). Este protocolo es estudiado por MORRIS en 1948. El anthrone, según Morris, actúa sobre todas las “-osas”. Por igual la glucosa y la fructosa dan la misma reacción coloreada. El anthrone tiene color amarillo claro en una disolución de ácido sulfúrico concentrado y en disolución de glucosa se vuelve de color azul. La figura 14 nos muestra la formula del anthrone. Figura 14: Anthrone Fuente: wikipedia para el dibujo de la anthrone 34 La técnica: -preparar la solución de acido sulfúrico a 95%: poner 50 mL en 1 litro de agua distilada. -pesar 1 gramo de anthrone y disolver en 500 mL de acido sulfúrico a 95%. -5 mL de la solución a analizar son puestos en un tubo de vidrio de 25mm de diámetro, después poner 10mL del reactivo sulfúrico (con el anthrone). -agitar para homogeneizar y poner en un baño de agua durante 10min a 30°C. -medir la absorbancia de la gamma glucosa a 580nm. Método de difusión en gel: La carboximetilcelulasa que hay en los extractos de fruta, rompe les cadenas de celulosa en pequeñas moléculas de glucosa. En una placa de petri, donde hemos puesto 0,5% de carboximetilcelulosa (CMC) y 1,7% de agar, se practican dos pozos y se pone el mismo volumen de extracto de frutas y de agua destilada (control). Se incuba durante 24 horas a temperatura de 30°C. Después se limpia bien la placa de petri con agua destilada y se inunda con una solución de rojo Congo durante 15 minutos. Alrededor de los pocitos con extracto de fruta, hay una zona clara cuyo diámetro nos da la medida de la actividad de la carboximetilcelulasa. Método de reducción de viscosidad: Esta técnica se basa en la acción de la celulasa del extracto de frutas, que corta la longitud de las moléculas de celulosa en una pulpa viscosa de papel de baja viscosidad. Poner suficiente pulpa de papel del 2% de consistencia, en tubos de ensayo y adicionar 2 o 5 cm3 de extracto de frutas. Mezclar cuidadamente. Después, poner el medio reaccionante en una jeringuilla. Contabilizar el número de gotas por minuto que caen de la jeringuilla. Incubar la mezcla en un baño maría a 30°C y verificar la viscosidad cada 30 minutos. Cuanto más activa es la enzima, mas reducción de viscosidad hay. Método de la Hydroxyethylcellulose Preparación de los reactivos: 35 -Tampon: pesar 8,4g de acido citrico mono hidratado (C6H8O2, H2O). Ajustar el pH con NaOH y diluirle en dos litros de agua destilada para una concentración de 0, 05M y un pH de 4,8. -Substrato : 1.0% HEC (Hydroxyethylcellulose, media viscosidad, Fluka AG pract.) en un tampon citrato 0.05 M pH 4,8. La HEC se disuelve usando un agitador magnético durante una hora, después se deja una hora más para que se clarifique. Método: 1. Adicionar 1,8mL de disolución de substrato a un tubo de 15mL; 2. Calentar a 50°C; 3. Adicionar 0,2mL de disolución de enzima en tampón citrato, mezclar; 4. Incubar a 50°C durante 10 minutos. 5. Adicionar 3,0mL de DNS, mezclar. Transferir a una gradilla 6. Hervir durante 5 minutos, todas las muestras a la vez: blanco de enzima, estándar de glucosa y el cero. Después transferir a un baño frio. 7. Medir el color formado fuerte al cero a 540nm después corregir con el blanco de la enzima. Espectro cero: 1,8mL HEC 10min, 50°C 3,0mL DNS 0,2mL tampón citrato Hervir 5min, enfriar y medir espectro a 540nm Espectro blanco enzima: 1,8mL HEC 10min, 50°C 3,0mL DNS 0,2mL dilución de enzima Hervir 5min, enfriar y medir espectro a 540nm Estandar: 1,8mL HEC 10min, 50°C 3,0mL DNS 0,2mL estándar de glucosa Hervir 5min, enfriar y medir espectro a 540nm Disoluciones de glucosa (estándar) Disolución madre de glucosa: glucosa anhidra de alta pureza 10-2 M (ejemplo: 0,18g de glucosa en 100mL en tampón citrato) Estándar 1: 1,0mL + = 10,0μmol/mL (16,67nkat/mL*) Estándar 2: 1,0mL + 1,0mL tampón = 5,0μmol/mL (8,33nkat/mL) Estándar 3: 1,0mL + 2,0mL tampón = 3,33μmol/mL (5,56nkat/mL) 36 Estándar 4: 1,0mL + 3,0mL tampón = 2,5μmol/mL (4,17nkat/mL) *Una concentración de glucosa de 10,0μmol/mL es equivalente a 16,67nkat/mL en la reacción enzimática: 10,0μmol/mL*1/600*1000=16,67nmol.s-1.mL-1 (nkat.mL-1) Calculo de las unidades de actividad: Construir una recta estándar de glucosa poniendo absorbancias a 540nm en ordenadas frente a concentración de glucosa en forma de nkat/mL en abscisas. Usar ese estándar de glucosa para leer directamente la actividad enzimática en nkat/mL. En la parte experimental se ha escogido el método de la Hydroxyethylcellulose para ensayar la actividad de la celulasa, por ser un método preciso y bien descrito. Los otros métodos encontrados en la literatura o eran cualitativos o más complicados. Ensayo de actividad de la laccase: II. Según el libro “Principes de l’analyse enzymatique” de HANS ULRICH BERGMEYER, antes de las manipulaciones, hace falta determinar la concentración óptima del substrato para los ensayos. Esta depende de algunas consideraciones metodológicas (la absorbancia, la solubilidad del substrato, etc.) y de las propiedades de la enzima (inhibición por los substratos o productos de la hidrólisis, etc.) [16]. Los substratos de la laccase son varios. Todos los compuestos que esta enzima cataliza, contienen al menos un grupo fenol, diamino o amina aromática [17]. La syringaldazine [4hydroxy-3,5-dimethoxy benzaldehyde azine] se considera el mejor substrato para el ensayo de este enzima. Método de la syringaldazine Reactivos: A. Tampón fosfato de potasio 100mM, pH 6,5 a 30°C. Se preparan 100mL en agua desionizada usando fosfato monobásico anhidro de Sigma. Se ajusta a pH 6,5 a 30°C con hidróxido potásico 1M. B. Solucion de syrigaldazina 0,216Mm. Se preparan 3mL en metanol absoluto usando syringaldazina de Sigma. C. Solución de laccasa 37 Inmediatamente antes de usarse se prepara una disolución de laccasa de 25 a 50 U/mL en agua destilada fría. Procedimiento: Se pipetean los siguientes reactivos en una cubeta de espectrofotómetro Agua destilada Reactivo A Reactivo C Test 2,2 0,5 Blanco 0,5 2,2 - Se equilibra a 30°C el espectrofotómetro termostatizado a una longitud de onda de 530nm y se añade: Reactivo B 0,3 0,3 Se homogeneíza y se lee la absorbancia a 530nm durante unos 10 minutos. Se obtiene ∆A530 /minuto usando la velocidad lineal para el test y para el blanco. Calculos: Se utiliza la siguente ecuación para determinar la actividad de la enzima: (∆A530nm/min Test – r A530nm/min Blank)* (df) Units/mL enzima = (0,001)*(0,5) - df: factor de dilución; - 0,001: el cambio en A530nm/minuto por una unidad de laccase a pH=6,5 a une temperatura de 30°C en 3mL de reacción; - 0,5: volumen de enzima utilizado en milímetro. También otras substancias orgánicas que tienen grupos hidroxilo, acido, o aminos, pueden actuar como substrato [18]. Los más famosos son ABTS [2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazothiazoline-6-sulphonic acid)], 2,6 dimethoxyphenol y L-DOPA [3,4dihydroxyphenylalanine] [11]. En la figura 15 se muestran las formulas de los diferentes substrato. 38 ABTS Syringaldazine 2,6 dimethoxyphenol L-DOPA 39 Guaiacol o-dianisidine Figura 15: Formulas de los diferentes substratos que la laccasa cataliza. Fuente: wikipedia Scholosser y colaboradores [11] utilizan estos substratos para ver la influencia del pH en la actividad de la laccasa de Trametes versicolor cultivada con diferentes nutrientes. Según estos autores el substrato que resulta más sensible en los ensayos de actividad de la laccasa es el 2,6-dimethoxyphenol. Todos los substratos presentan mayor sensibilidad en el ensayo de actividad de la laccasa a pH’s comprendidos entre 4,5 y 5 a excepción del ABTS que presenta una mayor sensibilidad a la detección de la actividad de la laccasa a pH 3,5. Según Li y colaboradores [20] el substrato que funciona mejor para analizar la actividad de la laccasa es el ABTS frente a la o-dianisidina y el guiacol. Las formulas se pueden ver en la figura 15. La comparación de los protocolos de los ensayos de actividad se muestra en la tabla 1. Tabla 1: resumen de los diferentes reactivos. 40 Substrato Absorbencia Buffer Medio de cultivo Otro reactivo ABTS 1,5 mL (0,5 mM) 420nm 1.5 mL acetato de sodio buffer (1mM, pH 5.0) o-dianisidine 0,1mL (1mM) 460nm 0,2mL citrate (0,1mM)-fosfato (0,2mM) (pH 5.0) Guaiacol 1 mL (2 mM) 450nm 3 mL buffer de acetato (10mM, pH 5.0) 1,5mL 600mL 1mL - 0,1mL (2mM) hidrogeno peróxido - Las diferencias de los resultados pueden atribuirse a los potenciales de oxidación entre la enzima y el substrato (Reinhammar and Malmström, 1981). El guaiacol es un monophenol substituido que tiene la posibilidad de actuar sobre los aldehídos. La odianisidine es una diamina que se oxida en presencia de compuestos diazo. El ABTS no es un fenol sino un heterocíclico. El ABTS puede ser oxidado en las dos formas: ABTS+ o ABTS2+ (Johannes and Majcherezyk, 2000; Fabbrini et al., 2002). El ABTS no tiene color, pero sí el ABTS+ que toma una coloración azul-verde que se ve en el dominio del visible (Solís-Oba et al., 2005) [20]. En la parte experimental se ha escogido la Syringaldazine como substrato de los ensayos de actividad de la laccase por ser un substrato muy utilizado y haber encontrado un método muy bien descrito en la literatura. 41 Tercera parte: Resultavos y Discucion I. Ensayos de actividad de la celulase: La cellulasa ensayada tiene número EC: 3.2.1.4 su nombre comercial es: Cellusoft APL y ha sido suministrada por Novozymes .El método que se ha seguido es el método de la Hidroxyethylcellulase (ver pag. 34) Una vez calculada la curva de calibración con el método de la Hidroxyethylcellulase, se ha procedido a ensayar la influencia de la temperatura en la actividad de la cellulase EC 3.2.1.4 1) Resultados: Tabla2: Datos de la curva de calibración. 42 Absorbancia a 540nm Concentracion de glucosa expresada en nKat/mL de enz. 0,01122 4,17 0 ,01912 5,56 0 ,12399 8,33 0,62878 16,7 Figura 16: actividad de la celulasa EC 3.2.1.4 en función de la temperatura. El HEC rompe las cadenas de celulosa en pequeñas moléculas de glucosa. El DNS que es un colorante naranja que reacciona con la glucosa y da diferentes tonalidades de color marrón según la concentración de la glucosa. Las soluciones de glucosa dan absorbancia que sirven para trazar la curva de calibración. Utilizamos la ecuación de la curva de calibración para calcular la actividad de la celulasa EC 3.2.1.4. 2) Discusión: La temperatura óptima de la celulasa EC 3.2.1.4 en estas condiciones de ensayo está entre 60 y 70°C. La tolerancia es muy pequeña y en la figura 16 se puede observar que a partir de los 60°C la actividad regresa rápidamente. Por otro lado también la actividad de la celulasa EC 3.2.1.4 aumenta muy rápidamente entre 40°C y 50°C. Esto podría ser interpretado quizá por alguna influencia importante de la temperatura en la estabilidad del complejo entre la celulasa EC 3.2.1.4 y el HEC. 43 II. Ensayos de la actividad de la laccase: La laccasa ensayada tiene numero EC 1.10.3.2 su nombre comercial es 51003 y ha sido suministrada por Novoenzyme. El método que se ha seguido es el método de la Syringaldazine (ver pag. 35) Primero se buscó el factor de dilución adecuado de la enzima para obtener una concentración entre 25 y 50 Unidades por mililitro de disolución, en los ensayos de actividad. El factor de dilución encontrado fue 10-4. 1) Resultados: a 44 b Figura 17: Influencia del pH a temperatura constante de 33°C. El grafico b de la figura 17 muestra que, el pH óptimo de la laccase esta alrededor de 6 Figura 18: Influencia de la temperatura a un pH constante de 6,55. Una vez hallado el factor de dilución para la concentración de enzima se procedió a estudiar la influencia de la temperatura y el pH en la actividad de la laccasa EC 1.10.3.2. sobre la syringaldazine. 45 Se lee la absorbancia del producto a 530nm. Para una concentración del substrato superior a 5mM se forma un precipitado que toma la coloración del medio, cuando se calienta la mezcla en el baño maría después de la reacción. La velocidad inicial en las gráficas de las figuras 17 y 18 (a), se ha expresado en términos de unidades de actividad/mL de enzima. Pero la definición de una unidad de actividad enzimática es la liberación de 1 μmol de substrato por minuto, por tanto es proporcional a la velocidad inicial de reacción. Por otro lado: Vmax = kcat* [E]o Pero si la velocidad de reacción es proporcional a las unidades de actividad de la enzima, tenemos que: U ~ V ~ kcat Y podemos describir la afinidad enzimática: kcat/Km, con la expresión: U/Km por mL de enzima. 2) Discusión: A pH de 6,55 y a 33°C se ve la mejor actividad de la laccasa EC 1.10.3.2 en las condiciones de la reacción. A la temperatura de 65°C, la actividad enzimática es muy pequeña y presenta una curva muy irregular en la que es difícil calcular la actividad máxima aunque seguramente no supere las dos unidades por mililitro de enzima. La actividad de la laccasa no está favorecida a pH altos. Normalmente la actividad de las enzimas está muy determinada por el pH, esto es debido a los mecanismos de reacción. Se puede suponer que, en estas condiciones de reacción, la estabilidad del complejo ES esta más favorecido a pH bajos, o que la k de velocidad de la reacción es mayor a pH bajos y a 33°C. Tabla 3: resumen de resultados. pH Temperatura (°C) 4,5 33 Km (mM) 1,63 U/mL enz. 15,09 6,55 8,5 33 - 45 - 65 33 0,73 – 1,08 - 1,17* 1,57 15,95 – 11.21 -1,49 6,38 46 U/Km 9,26 21,85 – 10,38 – 1,27 4,06 *Valor dudoso por la irregularidad de la curva. Si observamos la tabla 4, vemos que las condiciones de pH y temperatura en las que se obtienen una actividad mayor de la laccasa son pH 6,55 y temperatura 33°C, pero si observamos le relación que nos da la afinidad E-S, la diferencia con la afinidad con las otras condiciones es aun mayar. Conclusiones: Hay muchos métodos para ensayar la actividad de las enzimas. En general cada ensayo con un substrato diferente puede variar la actividad de la enzima correspondiente y también las condiciones óptimas de pH y temperatura. Lo mejor escoger un método simple y sensible para tenerlo como referencia. La actividad de la celulasa ensayada tiene un rango de temperaturas óptimas muy estrecho. Esto hace suponer que su mecanismo de reacción es muy sensible a la temperatura. 47 La actividad de la laccasa en las condiciones ensayadas tiene un pH óptimo de 6,55 y una temperatura óptima de 33°C. Éstos son más evidentes si se calcula la relación de afinidad E-S. A un pH 6,55 la Km es más pequeña que a un pH 4,55 y la actividad de la laccasa es prácticamente la misma; lo que implica que a pH 6,55 la actividad es mejor que a 4,55. Cuarta parte: Bibliografía y referencia A lo largo de las búsquedas, se aprendió a utilizar diferentes bases de datos como BRENDA, PDBsum y PUBMEB. Estos sitios permiten encontrar los diferentes protocolos que se describen en el proyecto. Bibliografía: - Biochemistry-Styper-Freeman (temperatura) Proteine Science-TA Zenko and VV Maroz, (1994), Mechanical deformation enhances catalytic activity A. Protein Sci; - Mèmoire de Lemiri Wafâa, Université des sciences Abou-Bekr Belkaid Tlemcen, 48 (2005-2006), thème “Contribution à l’étude des paramètres cinétiques de l’ascorbate oxidase de courgette verte”, p. 19; - Marco Ludena Universidad Peruana Cayetano Heredia (1999) La enzimología published en monografía; - Vallhandt, Química orgánica , p.1039-1081, (1990); - Myron I. Bender, Lewis J. Brulacher, (1977),Catálisis y acción enzimática, Capitulo 1: Introduccion y capitulo 2: Las enzimas como catalizadores - Loera Corral Octavio et al. Enzyme technology, laccase p.323-330 - Hans Ulrich Bergmeyer (1979) Principe de l’analyse enzymatique p17, p75-88. - José C. del Rio Valorización de productos agroforestales para la fabricación de pasta de papel: Caracterización química y modificación estructural de sus constituyentes en los procesos de cocción y blanqueo. IRNAS-CSIC, Sevilla Proyecto AGL2005-01748 - Gary S. Sayler, John Sanseverino and Kimberly L. Davis (1997) Biotechnology in the Environment Environment Science Research, Volume 54. P307-343 - http://www-saps.plantsci.cam.ac.uk/osmoweb/cellulase.htm (2010) (ensayo de la celulosa con los métodos de la viscosidad y de la Petri de baja. Referencias: [1] Netter, H. (1959), Theoretische Biochemie, p.554 ff., Springer-Verlag, Göttingen, Heidelberg. [2] G. Bachelier et R. Gavinelli (1966) Dosage global des glucides du sol par les methods colorimétriques a l’anthrone et a l’ orcinol Cach. ORSTOM. Sér. Pédol. Vol. IV,3 [3] Shijie Liu (2010), Woody biomass: Niche position as a source of sustainable renewable chemicals and energy and kinetics of hot-water extraction/hydrolysis JBA-06312; No of Pages 20 [4] Mèmoire de Lemiri Wafâa, Université des sciences Abou-Bekr Belkaid Tlemcen, (2005-2006), thème “Contribution à l’étude des paramètres cinétiques de l’ascorbate oxidase de courgette verte”, p. 19; 49 [5] Duran N, Rosa M.A., d’Annibale A, Gianfreda L. (2002) Applicatios of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review; Enzyme and Microbial Technology 31: 907-931 [6] Cole J.L., Tan G.O., Yang E.K., Hodgson K.O., Solom E.I. (1990) Reactivity of the laccase trinuclear copper active site with dioxygen: an X-ray absorption Edge Study.J Am Chem Soc; 112: 2243-2249; [7] Magnus K.A, Ton-That H, Carpenter J.E. In: Karlin KD, Tyklar Z, editors, (1993). Bioinorganic chemistry of copper. Chapman and Hall, p.143 [8] Bourbonnais R. and Paice M.G. (1990) Oxidation of non phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation FEBS Lett, 267: 99-102 [9] Andreasson L.E. and Reinhammar B. (1976) Kinetic studies of Rhus vernicifera laccase. Role of the metal centers in electron transfer. Biochimica et Biophysica Acta, 445: 579-597 [10] Penner-Hahn J.E., Hedman B., Hodgson K.O., Spira D.J. and Solomon E.I. (1984) On the spectra features associated with peroxide reactivity of the coupled binuclear copper active site in type 2 depleted and native RHUS Laccase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 119 (2): 567-574 [11] D. Schlosser, R. Grey, W. Fritsche, Appl Microbiol Biotechnol (1997) 47/ 412-418 Patterns of ligninolytic enzimes in Trametes versicolor. Distibution of extra- and intracelular enzyme activities during cultivation on glucose, wheat Straw and beech wood [12] C. Gómez-Dorado, M-Martínez-Salgado, D. Nieto-Mosquera, A. Pedrosa- Rodríguez, R. Rodríguez-Vázquez, J. Rosas-Acosta a Mexico Estudio del efecto de dos inductores y un protector enzimático sobre la actividad de las enzimas Mn peroxidasa y lacasa producidas por tramestes versicolor y su efecto en la decoloración de efluentes de la industria papelera Vol 10, Nº2, pagina 38 [13] Minard et al. 1981; Leonowicz et al. (1984); Dec et Bollag (1990-1994); Valli et Gold (1991), (1992); Wariishi et al. (1992); Lundell et al. (1993); Tuor et al. (1993) [14] Daniel C. la Grange & Riaan den Haan & Willem H. van Zyl, (2010), Engineering cellulolytic ability into bioprocessing organisms Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-010-2660-x [15] Measurement and characterization of cellulose activity in sclerophyllous forest litter, published in pubmeb [16] Hans Ulrich Bergmeyer con la colaboración de K. Gawehn y al. (1978), Principe de l’analyse enzymatique p.88 [17] Thurston C.F., (1994) The structure and function of fungal laccases. Microbiology, 140: 19-26. 50 [18] Gardiol A.E., Hernandez R.J. and Harte B.R. (1998) Device for detecting oxygen with oxidase. United States Patent 5, 804,401. [19] Said Galai & Ferid Limam & M. Nejib Marzouki Humana Press (2008) A New Stenotrophomonas maltophilia Strain Producing Laccase. Use in Decolorization of Synthetics Dyes [20] Airong Li, Yue Zhu, Liang Xu, Wenqing Zhu and Xingjun Tian School of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093, P.R. China. (2008) Comparative study on the determination of assay for laccase of Trametes sp. [21] R. Boeva-Spiridonova, E. Petkova, N. Georgieva, L. Yotova, and I. Spiridonov (2007) Utilization of a chemical-mechanical pulp with improved properties from composition of packing papers “Enzyme-pretreated poplar poplar wood in the pulp”, BioResources (2), 34-40.34 51
