Receptores Estrogénicos: Valoración de procedimientos

Receptores Estrogénicos:
Valoración de procedimientos
Histoquímicos e Inmunohisoquímicos
para su detección
Ji,
RESUMEN
Los receptores estrogénicos (RE) son marcadores
asociados a tumor de mama, que se encuentran en el
núcleo de las células epiteliales de mama y endometrio.
La utilidad de su detección radica en que los tumores
que presentan los RE tienen buen pronóstico posttratamiento y la aplicación de terapia anti-estrogénica
da muy buenos resultados y evita recidivas tumorales.
Se plantea un modelo experimental para evaluar el
método Histoquímico (HQ). En la detección de RE, se
usó tejido bovino: de mama como control positivo e
hígado y parótidas como controles negativos.
Se estandarizó el método Inmunohistoquímico (IHQ),
aplicando variables en presión y temperatura, para la
recuperación del epítope del RE que se reconoce mediante
anticuerpos monoclonales. Como controles se usaron
tejidos humanos: biopsia de hiperplasia de endometrio
como control positivo y biopsia de cáncer de colon como
control negativo.
* SELADIS, Fac. Ciencias
Farmacéuticas y Bioquímicas,
U.M.S.A.
** Servicio de Patología, Hospital
N°1, CNS.
Correspondencia: Dra. Lilia Sánchez, Instituto
SELADIS.
Solicitud de copias: Lic. Carmiña García, Instituto
SELADIS.
Fuente de Apoyo: Instituto SELADIS dependiente 0
de la Fac. Cs. Farmacéuticas y Bioquímicas y
1 Servicio de Patología del Hospital N°1 de la Caja
Nacional de Salúd.
Los procedimientos HQ e IHQ se aplicaron luego a 8
tumores extirpados mediante cirugía, 2 biopsias y 2
aspirados de carcinoma de mama, detectándose RE en
el 50% de las muestras analizadas.
Se observó que el procedimiento IHQ identifica
epítopes presentes en los RE con mayor sensibilidad que
el HQ, pero la utilidad del último radica en que mide la
funcionalidad de los RE, por lo cual se recomienda el
uso de ambos procedimientos simultáneamente para una
evaluación completa de presencia y funcionalidad de los
RE.
INTRODUCCION.El cáncer de seno tiene una alta predominancia en la población
femenina en el ámbito mundial, siendo una de las tres primeras causas
de muerte, después de las infecciones y enfermedades
cardiovasculares, en países industrializados. Afecta especialmente
a la mujer por los cambios hormonales en la adolescencia, vida fértil,
embarazo, menopausia y durante su vida reproductiva.
La población femenina es la más afectada por el cáncer en Bolivia
(1)(2). Las estadísticas señalan que esta enfermedad.afecta a 6 000
de cada 10 000 mujeres (3).
Vol. VII - Diciembre de 1999 grangaw~
GARCIA, SANCHEZ, CARVAJAL, WAYLLACE
En los últimos años el surgimiento de métodos
inmunohistoquímicos e histoquímicos ha contribuido
enormemente a la identificación de células tumorales no
diferenciadas.
Un nuevo marcador asociado a tumor de mama son
los receptores para hormonas estrogénicas, en las células
del epitelio mamario. La detección de receptores
estrogénicos (RE) en tumores de seno se ha constituido
en un procedimiento muy útil en el pronóstico de respuesta
a la terapia endócrína (anti-estrogénica), que en forma
rutinaria se instaura a la paciente después de la
quimioterapia, la ablación del órgano y la radioterapia,
como tratamiento para evitar recidivas tumorales a largo
plazo, como consecuencia de la metastización del tumor
inicial. La identificación de los RE de seno es de buen
pronóstico para la paciente ya que los estudios de
seguimiento por más de 5 años en pacientes con RE (+),
han mostrado una correlación con una excelente respuesta
a la terapia anti-estrogénica, sin evidencia de recidiva en
más del 80% de ellas.
Actualmente el método utilizado, para identificar la
presencia de RE, es el inmunohistoquímico que usa cortes
de tejido de seno incluidos en parafina. Utiliza la fijación
de receptores para evitar su pérdida por su marcada
labilidad y, finalmente la identificación por anticuerpos
monoclonales hacia el RE, por visualización microscópica,
gracias a una amplificación enzimática (4)(5)(6)(7).
La probabilidad de introducir un procedimiento
hístoquímico (HQ) de menor costo, que permita monitorear
a estos pacientes periódicamente para evitar posibles
recidivas tumorales, resulta muy atractiva.
Por tanto se plantó desarrollar un procedimiento
alternativo para detectar estos marcadores en ensayos
con precisión y especificidad equivalente al
Inmunohistoquímico (IHQ).
Aquí reportamos la optimización del método
Inmunohistoquímico por anticuerpos monoclonales,
paralelamente se reportan los resultados preliminares de
un método histoquímico alternativo de menor costo y rápida
ejecución.
METODOS
METODO INMUNOHISTOQUIMICO (IHQ)
MATERIAL BIOLOGICO:
Para evaluar la especificidad de los anticuerpos y
precisión del método, se usaron biopsias de tejido mamario
humano que presentan receptores para estrógeno (RE)
provenientes de pacientes en tratamiento con estrógenos
exógenos y biopsias de tejido que no presentaban RE:
endometrio humano hiperplásico (en fase luteal) y colon
humano.
Las muestras por el procedimiento inmunohistoquímico
fueron:
- 8 tumores de cáncer de seno.
- 2 biopsias de cáncer de seno.
- 2 aspirados de cáncer de seno.
REACTIVOS:
Anticuerpos monoclonales anti-RE humano,
adquiridos comercialmente de la firma Dako.
* Sistema de amplificación Dako Strep ABComplex/
HRP Duet, mouse/rabbit.
PROCEDIMIENTO:
Se recuperó el epítope del RE, que es reconocido por
el anticuerpo monoclonal 1 D5. Debido a la imprescindible
necesidad de exposición del epítope del RE, se ensayaron
diferentes técnicas. La recuperación del epítope
reconocido por el anticuerpo monoclonal de forma
específica, se ve favorecida por el uso de un tampón ácido
de citratos, con un pH óptimo de 6.1 +/- 0.1, es posible
que exista un rango de variación de 6.0 a 6.2 a una
temperatura de ebullición de 95-99 °C, se sumergen los
tejidos durante 20 minutos, pasados los cuales se debe
proceder de forma adecuada a la amplificación de la
técnica inmunohistoquímica.
Para lograr la temperatura de 95-999C se combinó
temperatura más presión ya que el agua en la ciudad de
la Paz hierve a 809C.
Se ensayaron 9 diferentes procedimientos que
permitieron aproximarse a la temperatura deseada. La
observación de intensidad de núcleos teñidos y de la
proporción de células teñidas, fue relacionada en un score
semicuantitativo. Para elegir el mejor método para la
recuperación de epítopes del receptor no solo se eligió el
score más alto obtenido (score=75 fue establecido como
el umbral de positividad), si no que también se observó la
influencia de diferentes parámetros morfológicos e
histológicos como ser: homogenicidad, precipitado
inespecífico de sustrato, diferenciación de tinción entre
núcleo teñido y citoplasma y destrucción del tejido.
Las muestras (biopsias o tumores) se fijaron
adecuadamente dentro las 24 horas después de su
obtención para evitar pérdida del epítope con el cual
reacciona el anticuerpo monoclonal.
A todos los cortes histológicos provenientes de 12
muestras de diferentes pacientes, se les aplicó el
procedimiento de recuperación de epítopes que obtuvo el
mayor score=380 (olla a presión 10Psi por 10 minutos)
luego fueron analizados por el método
inmunohistoquímico.
METODO HISTOQUIMICO ENZIMATICO
MATERIAL BIOLOGICO:
Para estandarizar el Ensayo Histoquímico Enzimático
(HQ) se usaron tejidos bovinos (mama y parótida como
control positivo y negativo respectivamente), fue más
conveniente usar tejidos provenientes de animales por la
facilidad de obtener grandes cantidades y en forma
inmediata después de sacrificado al animal.
REACTIVOS:
* Hormona 17-beta-estradiol libre y conjugada con
peroxidasa
Vol. VII- Diciembre de 1999
0
o
RECEPTORES ESTROGENICOS: VALORACION DE PROCEDIMIENTOS
PROCEDIMIENTO:
Se estandarizó otro método simultáneo, alternativo por
ser económico que podría eliminar el paso de recuperación
de epítopes, algo problemático por la presión atmosférica
de la ciudad de La Paz el método histoquímico (IH); que
determina la capacidad de asociación de la hormona 17beta-estradiol a los RE de mama bovina, se procedió a
determinar la especificidad de unión entre el receptor
bovino y la hormona mediante la obtención de núcleos de
tejido mamario como fuente de RE bovinos.
conjugado, para determinar la afinidad de ambos ligandos.
Se estandarizó una prueba de EIA de competición por
los RE con hormona marcada con peroxidasa (hormona
conjugada) y hormona libre, previa estandarización de
densidad de núcleos fijados a la fase sólida y
concentraciones óptimas de ligando libre y ligando
RESULTADOS
Una vez establecido este parámetro, se procedió a
estandarizar el procedimiento histoquímico en cortes de
mama bovina y humana.
Se aplicaron los mismos criterios de selección de
intensidad y de proporción para hallar la cuantificación de
receptores para tejido de mamabovinay humana mediante
un score y relacionando con otros parámetros morfológicos
e histológicos.
PROCEDIMIENTO INMUNOHISTOQUIMICO:
La tabla N°1 describe los resultados de los
procedimientos utilizados que permitieron aproximarse a
la temperatura deseada:
TABLA N° 1
TÉCNICAS DE RECUPERACIÓN DEL EPÍTOPE EN CONTROLES DE TEJIDO POSITIVO (HE) Y NEGATIVO (EC).
TÉCNICAS
DE
RECUPERACIÓN
DEL EP (TOPE.
SCORE
=
(Pi(i+1)*
PARÁMETROS MORFOLÓGICOS HISTOLÓGICOS.
Homogeneidad .
Precipitado Diferenciación
inespecífico entre núcleo
teñido y
del sustrato.
citoplasma
4
2
Destrucción
del tejido.
1
HE. (-)
37°C sin
recuperación
del antígeno.
Score
=0
1
HE. (-) sin
monoclonal
Score
=0
1
2
1
1
EC. (-) sin
monoclonal
HE. (+) tampón
citrato a ebullición
EC. (-) tampón
citrato a ebulición
1
1
1
3
1
1
2
1
1
1
1
3
HE. (-)
Baño María
EC. (-)
Baño María
HE. (+)
Score
=0
Score
= 150
Score
=0
Score
= 100
Score
=0
Score
Autoclave
HE. (+)
10 Psi, tampón
citrato a ebullición, 10'
HE. (+)
10 Psi, tampón
= 285
Para el Score: i, intensidad
de la tinción que va de 0 a
4; p, porcentaje de células
teñidas. Score (a 75 fue
establecido como el umbral
para una reacción positiva.
HE: Hiperplasia de
Endometrio, control
positivo.
EC: Epitelio Colónico, control negativo.
1) negativo. Aplicado para
cada parámetro. Significa :
sin homogenicidad, sin
precipitado inespecífico, sin
diferenciación entre núcleo
y citoplasma, o sin destrucción del tejido.
1
1
1
1
1
1
1
2
= 40
1
1
2
4
Score
= 380
3
1
4
1
3
3
2
1
(3) positivo intermedio. Aplicado para cada parámetro de
tinción.
1
1
1
1
(4) positivo fuerte. Aplicado
para cada parámetro de
tinción.
2
1
1
1
1
1
2
1
2
1
2
3
1
1
1
2
Score
citrato a 302C, 10'.
HE. (+) 12 Psi,
tampón citrato
HE. (+)
14 Psi, tampón
citrato a ebullición, 5'.
HE. (+) 14 Psi, tampón
Score
= 3501
Score
= 360
citrato a ebullición, 8'.
= 210
HE. (+) 14 Psi, tampón
citrato a 702 C, 12'.
EC. (-) para
todos los casos.
Score
= 320
Score
=0
Score
Vol. VII - Diciembre de 1999
(2) positivo débil. Aplicado
para cada parámetro de
tinción.
GARCIA, SÁNCHEZ, CARVAJAL, WAYLLACE
Los resultados inmunohistoquímicos de los cortes histológicos que obtuvieron el mayor score = 380 fueron aplicados
a cada muestra de biopsia de las diferentes pacientes y se muestran en la tabla N22:
TABLA N22.
TÉCNICAS DE RECUPERACIÓN DEL EPÍTOPE EN MUESTRAS DE CÁNCER DE SENO.
MUESTRAS
TUMORES
CÁNCER
DE SENO .
SCORE
Homoge
neidad
Precipitado
Diferenciación
entre núcleo
inespecífico
del sustrato teñido y cito plasma
Destrucción
del tejido
8650 (-)
Score
=0
1
1
1
1
7618(-)
Score
=0
1
1
1
1
Score
1
1
1
1
7122(-)
=o
8566 (-)
Score
=0
1
1
1
1
7604 (-)
Score
=0
1
1
1
1
1354(+)
Score
= 350
2
1
3
1
Score
2
2
3
1
4
1
4
1
1
1
1
1
9618+)
= 400
200(+)
Score
(1) negativo. Aplicado para
cada parámetro. Significa
: sin homogenicidad, sin
precipitado inespecífico,
sin diferenciación entre
núcleo y citoplasma, o sin
destrucción del tejido.
(2) positivo débil. Aplicado
para cada parámetro de
tinción.
(3) positivo intermedio. Aplicado para cada parámetro
de tinción.
(4) positivo fuerte. Aplicado
para cada parámetro de
tinción.
= 500
3976 (-)
Score
=0
4089(+)
Score
=100
1
1
1
1
224 (-)
Score
=0
2
1
1
1
Score
2
1
1
1
229 (-)
=0
PROCEDIMIENTO H/STOQUIMICO ENZIMATICO:
Se obtuvieron diferentes gráficas de titulación para
encontrar las concentraciones óptimas de núcleos y de
saturación de la hormona con su receptor, como se observa
en las gráficas 1 y 2 , se determinó la capacidad de unión
por competición al receptor entre el ligando conjugado y
el ligando libre.
El método de competición fue realizado para ver la
especificidad de unión. Se encontró que desde una
concentración de 9.3x10-10 mol/ml (dilución 1:20) de
hormona marcada hasta 4.065x1 0-9 mol/ml (dilución 1:60)
hay linearidad que no excede la Ley de Lambert y Beer lo
que demuestra igual afinidad de los RE por ambos
ligandos, por tanto el desplazamiento de la hormona libre
es proporcional a la ocupación de los RE por hormona
conjugada.
Una vez determinada la afinidad de los ligandos por
los RE se estandarizó la prueba HQ en cortes histológicos
de tejido mamario bovino, obteniéndose una intensa tinción
de los núcleos de células epiteliales. Como control negativo
se utilizó cortes histológicos de parótida bovina, no se
observó tinción en los núcleos. Sin embargo al ser aplicado
en cortes histológicos humanos en los controles positivos,
la intensidad de la tinción u el score fue inferior al observado
en método IHQ (con el anticuerpo monoclonal).
0.
-0.05
LOG. DEL INVERSO DE LA DILUCION DE
ESTRADIOL PEROXIDASA
GRAFICA N° 1.- Se expresa la relación entre diferentes
concentraciones (mol/l) de 17-beta-estradiol marcado con
peroxidasa expresada en Log inverso de la dilución, con sus
respectivas absorbancias reveladas en presencia de sustrato, para
obtener la concentración de saturación máxima de la hormona
en los RE de mama bovina con una concentración constante de
2.2x105 núcleos/ml.
Vol. VII- Diciembre de 1999
RECEPTORES ESTROGENICOS : VALORACION DE PROCEDIMIENTOS
se ha efectuado pero, faltaría un buen sistema de
amplificación, por lo que se recomienda analizar este
aspecto, el usado en la prueba no sería suficiente ya que
la hormona unida directamente a la peroxidasa evidencia
una sola molécula de hormona por receptor, requiriéndose
incrementar esta unión en una proporción de uno a cinco.
El uso simultáneo de ambos procedimientos
inmunohistoquímicos e histoquímico, podría ser de mayor
valor predictivo y además evaluaría la unión específica de
la hormona a estos receptores.
BIBLIOGRAFÍA
1
2
3
4
5
6
LOG. INVERSO DE LA DILUCION DE ESTRADIOL
SULFATO.
GRAFICA N°2.- Se determinó la relación entre una concentración
constante de estradiol marcado con peroxidasa (hormona
marcada) en presencia de una concentración constante de
núcleos y con la adición de diferentes concentraciones de hormona
estradiol sulfato, (hormona no marcada), para evaluarla afinidad
en este sistema ligando receptor.
1.- RIOS DALENZ, Jaime . Historias y Perspectivas de
Salud Pública en Bolivia . En : Sociedad Boliviana de Salud
Pública OPS / OMS (Secretaría de Salúd): Bolivia. 1983.
2.- RIOS DALENZ, Jaime. Curso de Patología . 1 Tomo.
Juventud : Bolivia. 1995.
3.- Asociación de Ligas Iberoamericanas contra el Cáncer.
ALICC (sin datos de fecha ni lugar de origen).
4.- BULLOCK, Gillian R. Techniques in Immunocytochemistry . Vol.1, 2 y 3. Academic Press Limited: London. 1985.
DISCUSION
5.- CUELLO.A. C. Inmunochistochemistry . International Brain Research Organisation:Great Britain. 1986.
Para la correcta aplicación del procedimiento
inmunohistoquímico hubo que adecuar y hacer ajustes
importantes ala técnica para la cual se aplicaron diferentes
variantes como la temperatura ambiente de incubación y
la de fijación rigurosamente controlada y ajustada a
nuestras condiciones ambientales.
6.- FARR, Andrew. Inmunohistoquímica de
anticuerpos marcados con enzimas , una breve revisión.
En : Journal of Immunological Methodos. Noth Holland:
47: 129 - 144.1981.
Un factor decisivo para la obtención de un resultado
óptimo fue la correcta fijación del tejido obtenido de biopsia
o cirugía, en formo) al 10%, antes de los 24 horas de
extirpado.
La obtención de temperaturas de 952C consume tiempo
y atención por 10 minutos exactamente, a parte de estos
detalles el procedimiento IHQ resultó reproducible,
específico y con alto valor predictivo para su aplicación en
pacientes.
La sensibilidad y especificidad del procedimiento
histoquímico (HQ) enzimático se evaluó con tejido de
mama bovino que contienen RE, se obtuvieron resultados
positivos en tejidos mamarios y negativos en parótida.
Se verifico la especificidad de la reacción obtenida en
el procedimiento histoquímico enzimático, para lo cual se
estandarizó el ensayo hormono-enzimático de competición, con núcleos de tejido con RE (+) y RE (-); se verificó
la especificidad de la reacción hormona peroxidasa al RE
bovino.
Sin embargo al ser aplicado a los controles positivos
humanos la intensidad de la tinción y el score fue inferior
al observado en el método IHQ. Suponemos que en tejido
mamario bovino esta prueba fue óptima dando una tincíón
más intensa probablemente por una existencia mayor
cantidad de RE en relación al humano y posiblemente
porque el tejido fue procesado inmediatamente después
de obtenido, lo cual no ocurre con colecciones,
histopatológicos con varios meses o años de antiguedad.
7.- TIJSEN, P. Laboratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology : Practice and Theory of
Enzime Inmunoassays . Vol 15, Elsevier Science Publishers B.: New York - USA. 1985.
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La débil tinción obtenida en tejido humano, además
pudo deberse a que si bien la interacción hormona-receptor
Vol. VII - Diciembre de 1999
IMM r4r
GARCIA, SÁNCHEZ, CARVAJAL, WAYLLACE
Figura N° 1
Tejido Hiperplasia
de Endometrio RE (-),
sin Anticuerpo Monoclonal.
Figura N9 2.
Tejido de Hiperplasia
de Endometrio (10 x).
Té cn ica Inmunohisto q uimica
con recuperación del epítope mediante
Tampón Citrato
a Ebullición.
Figura N° 3.
Tejido Cáncer de Colon (10 x). Técnica
Inmunohistoquímica
con recuperación del epítope mediante
Tampón Citrato
a Ebullición.
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