Extracción del ADN Protocolo de extracción con fenol

- Una vez fríos, en la cámara de flujo laminar, se toma de cada placa una pequeña cantidad
de(aílulaj^y se sueltan dentro del gel de sílice. El objetivo es que queden pequeños
volúmenes de^élulas^odeadas de gel de sílice. Las células permanecen así en estado
latente. Estos microtubos se conservan en nevera a 4°C. Según nuestra experiencia, las
célulasjasí conservadas volvieron a multiplicarse, en placa con PDA, al cabo de 18 meses.
2.3.3.1.3,- Extracción del A D N
En función del tipo de análisis a realizar y dependiendo de la necesidad de obtener un
ADN más o menos puro, se utilizaron los dos protocolos que se detallan a continuación.
Protocolo de extracción con fenol-cloroformo.
El protocolo de extracción de ADN al CTAB (GARDES & BRUNS, 1993) permite
obtener un ADN libre de proteínas y enzimas. Se ha utilizado con aquellas muestras cuyo
ADN amplificado se quería secuenciar y tanto a partir de las células obtenidas en cultivo,
(basidiósporas o micelio) como de teliósporas en aquellos casos en los que no hemos
podido conseguir la germinación.
- Rotura de células: En un microtubo esterilizado se ponen 200 ul de basidiósporas o, en
su caso, un volumen equivalente de teliósporas. Se añade arena esterilizada y tampón de
extracción TE (CTAB 2%, Tris 0.2 M pH 8, EDTA 0.02 M pH8, NaCl 1.4 M, (3
mercaptoetanol 0.2%) y se machaca con un varilla de punta cónica esterilizada, durante 5
mn. Se mezcla con el vórtex. Se centrifuga 15 mn a 14000 rpm y se recupera el
sobrenadante en un microtubo estéril.
- Precipitación de las proteínas: Se añade 600 ul de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.
Se agita y centrifuga 15 mn a 14000 rpm y se recupera la fase superior en un microtubo
estéril. Repetir este paso.
- Eliminación del fenol: Se añade 600 ul de cloroformo, se agita y se centrifuga 5mn a
14000 rpm. Se recupera la fase superior en un eppendorf estéril. Repetir este paso.
- Precipitación de los ácidos nucleicos: Se añade 1 mi de isopropanol. Se mezcla
suavemente y se incuba al menos 1 h a -20°C.
- Lavado del precipitado: Se centrifuga 20 mn a 14000 rpm. Se elimina cuidadosamente el
sobrenadante. Se lava con etanol 70% helado y se centrifuga 5 mn a 14000 rpm. Se