Anexo al TEMA 1: Muerte celular. Apoptosis y otras

BC. Migueláñez Medrán
Anexo al TEMA 1: Muerte celular. Apoptosis y
otras formas alternativas de muerte celular.
Enero de 2007, Revisado Enero de 2008
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Denición de Muerte Celular
Clasicaciones de la Muerte Celular
Formas de Muerte Celular
Apoptosis (Muerte celular del desarrollo o muerte celular inducida por
disminución de la IL-3)
+ Autofagia
+ Necrosis, Oncosis y Necroptosis
Piroptosis
Paroptosis
Catástrofe Mitótica
Mitoptosis
Organelos involulcrados en la Apoptosis
Morfología de la apoptosis
Resumen de la biología molecular de la apoptosis
Regulación genética de la apoptosis
Moléculas anti-apoptóticas y señalización de la supervivencia celular
Denición muerte celular:
La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso celular genéticamente controlado por el que las células inducen su propia muerte en respuesta
a determinados estímulos. De ahí que frecuentemente se describa el proceso
apoptótico como "suicidio celular" a la hora de denirlo conceptualmente. La
metaforización "suicidio celular" es doblemente signicativa si consideramos que
la muerte celular programada es un proceso irreversible, al menos durante sus
etapas iniciales. Conceptualmente la apoptosis puede ser considerada opuesta a
la muerte celular por necrosis, en la que las células son sujetos pasivos irremediablemente abocados a morir. En este sentido, lo distintivo de la apoptosis radica
en el control que ejercen las células sobre su propio destino, cuando deciden
seguir el camino apoptótico. En condiciones normales la apoptosis constituye un
mecanismo fundamental para el mantenimiento de la homeostasis del organismo.
Pongamos un ejemplo: como respuesta frente a la agresión que supone la entrada
de un microorganismo, las células encargadas de la defensa del organismo, las
células del sistema inmune, son activadas. Dicha activación supondrá, entre
otras cosas, la proliferación de aquellas células del sistema inmune capaces de
parar de forma especíca dicha agresión. Como resultado, buena parte de estas
células, que en su momento eran necesarias, dejan entonces de serlo, iniciando
muchas de ellas el proceso de muerte celular programada, en este caso inducido
por la ausencia del estímulo agresor. En otras palabras, cuando una infección
es controlada, gran parte de las células del sistema inmune que contribuyeron
a atajar dicha infección, dejan de ser necesarias, siendo eliminado el excedente
celular generado por apoptosis. Durante el desarrollo embrionario, los patrones
morfofuncionales denitivos de los órganos son modelados gracias a la muerte
por apoptosis de un buen número de células que inicialmente contribuyeron
a la formación de las mismas. Se estima que aproximadamente la mitad de
las neuronas que inicialmente contribuyen a la formación del sistema nervioso
mueren por apoptosis durante el desarrollo. También en diversas situaciones
patológicas la apoptosis desempeña una importante función. Así, en el cáncer y
en las infecciones víricas la apoptosis constituye un mecanismo de defensa por
el que se eliminan células neoplásicas y se pretende evitar la propagación de
virus. De otro lado, la apoptosis supone la última causa responsable de ciertas
enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades
propias del envejecimiento.
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Clasicación muerte celular
Una de las primeras clasicaciones de la muerte celular viene de mano de
Schweichel y Merker que identicaron tres tipos distintos de muerte celular:
Tipo 1. Se maniesta por: Condensación nuclear y picnosis con reducción
del volumen citoplasmático, con fragmentación celular tardía y fagocitosis.
Tipo 2 o también llamada degeneración autofágica, se caracteriza por la
vacuolización autofágica del citoplasma.
Tipo 3 o muerte citoplasmática, se caracteriza por una desintegración general
con perdida de los organelos.
Leist y Jäättelä han propuesto un modelo descriptivo, el cual clasica la muerte
celular en 4 subclases según su morfología nuclear:
La apoptósis es denida por una cromatina condensada en guras compactas,
a menudo globulares o con forma de medialuna.
Levemente diferente es la MCP Apoptosis-símil, que se caracteriza por una
cromatina condensada más laxamente.
En contraste, la MCP necrosis-símil no presenta condensación de la cromatina, sino que su apariencia va desde una cromatina agrupada a una con
gránulos laxos.
Por último la necrosis se caracteriza por el edema celular con ruptura de la
membrana.
Formas de muerte celular
Autofagia: Signica autodigestión. Este proceso ocurre virtualmente en
todas las células eucariotas.
Es un proceso en el cual citoplasma y organelos son secuestrados en vesículas
con membrana celular duplicada, liberando su contenido dentro de lisosomas,
para su posterior degradación y reciclaje de macromoléculas.
La autofagia sirve como respuesta al estrés producido por la falta de alimentos y es uno de sus principales roles en los organismos unicelulares. A nivel de
membrana, existen moléculas que actúan como sensores del medio extracelular,
activando vías regulatorias intracelulares.
Uno de estos sensores es la proteína TOR (Target de rapamicina) el cual
inhibe la Autofagia en un medio rico en nutrientes. La autofagia también tiene
funciones homeostáticas y de biosíntesis. Por ejemplo en condiciones en las
cuales los peroxisomas no son necesitados, son degradados a través de un tipo
especico de autofagia denominado pexofagia. Además la autofagia puede promover un tipo de muerte celular programada
El mecanismo mediante el cual se lleva a cabo la autofagia se divide en estos
7 pasos secuenciales:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Inducción
Selección carga y embalaje
Nucleación y formación de la vesícula
Expansión de la vesícula y maduración
Direccionamiento
Contacto y fusión de la vesícula con el lisosoma
Quiebre de la vesícula intraluminal con formación del cuerpo autofágico y
reciclaje de las macromoléculas constituyentes.
Necrosis, oncosis y necroptosis:
La oncosis sirve para designar cualquier muerte celular caracterizada por una
importante tumefacción, ruptura de la membrana plasmática, dilatación de
organelos citoplasmáticos (mitocondria, retículo endoplasmático y Golgi), así
como una moderada condensación de la cromatina.
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Necrosis : La característica fundamental que distingue la mayoría de las
formas de necrosis de la apoptosis es la rápida perdida de los potenciales de
membrana. Esto puede ser consecuencia de depleción de la energía celular,
daño en los lípidos de membrana y/o perdida de la función de bombas iónicas
o canales homeostáticos. Entre ellos hay sinergia, ya que la alteración de uno
produce un efecto en la función de los otros.
Necroptosis : Es la muerte celular estimulada por TNF-/alpha, con una inhibición previa de caspa, adquiriendo una morfología necrótica. Esta vía de
muerte celular puede ser inhibida por medio de una sustancia denominada
Necrostatin-1.
Piroptosis : Esta vía de muerte celular es dependiente únicamente de la caspasa 1. Esta caspasa no esta involucrada en la muerte celular apoptótica y su
función es procesar los precursores de las citoquinas inamatorias, activándolos.
Paraptosis : La Paraptosis ha sido recientemente caracterizada como la vacuolizacion con aumento de volumen mitocondrial y de retículo endoplasmático,
el cual no responde a la inhibición de las caspasas. No existe formación de
cuerpos apoptóticos.
Catástrofe mitótic a: Se produce por fallas en los sistemas de chequeo del ciclo
celular (checkpoints), que fallan en detener la mitosis antes o durante el proceso,
permitiendo una segregación aberrante de los cromosomas, lo que determina la
activación de una apoptosis defectuosa y muerte celular. Se forman células con
múltiples micronúcleos y cromatina no condensada.
Mitoptosis: Suicidio mitocondrial debido a la sobreproducción de ROS. Una
masiva mitoptosis desencadena una muerte celular programada por liberación
masiva de proteínas mitocondriales y el bloqueo de la vía apoptótica ha demostrado que la células siguen produciendo energía a través de la autofagia de
sus propias mitocondrias.
Organelos involucrados en la apoptósis
Característica especíca de la apoptosis es la preservación, al menos en la
fase inicial de la apoptosis, de la integridad estructural y de la mayoría de las
funciones de la membrana plasmática.
La célula tiene varios componentes que deben estar en buen estado para su
buen funcionamiento. Los componentes de la célula que en forma selectiva se
pueden convertir en blancos son la membrana plasmática, el citoesqueleto los
lisosomas y el retículo endoplasmático. El daño al citoesqueleto a su vez, causará
daño a la membrana plasmática. Los lisosomas contienen enzimas digestivas y
su destrucción causará que estas enzimas se liberen produciendo lesiones graves
en el citoplasma.
La célula necesita tener los siguientes caminos metabólicos en buen estado:
la producción de ATP mitocondrial, el metabolismo de calcio, la síntesis de
proteínas, la regulación del ADN, la glicólisis y el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs. Estos dos últimos proporcionan los precursores para síntesis de
aminoácidos y los equivalentes reducidos cuya oxidación genera la mayoría de
los ATP.
Los daños a la membrana plasmática, a la producción de ATP mitocondrial y al control de los niveles de calcio intracelular son rutas comunes para la
destrucción nal de la célula.
Membrana plasmática
Es utilizada por la célula para mantener los gradientes iónicos que a su vez
regulan el volumen celular. Si se daña la membrana entran iones Na y Ca y salen
iones K (responsables de los fenómenos de polarización y despolarización de la
membrana y, en denitiva, de la transmisión eléctrica del impulso nervioso).
El agua y los cloruros se redistribuyen de acuerdo al gradiente electroquímico
y hay incremento neto intracelular del agua. El aumento de agua intracelular
es visible al microscopio por el aumento de tamaño de la célula que se hincha.
Si ésto no se corrige la célula se puede romper. Hay varios mecanismos que
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pueden inducir estos cambios, algunos ejemplos son el trauma físico, uidización
de la membrana, peroxidación de lípidos (tetracloruro de carbono), daño al
citoesqueleto, bloqueo de canales y ataque viral.
Independiente de la agresión tóxica, la membrana plasmática es uno de los
componentes que primero responde al daño y la pérdida de integridad es el punto
nal del daño. En la mayoría de las células las mitocondrias son responsables
de la síntesis de ATP vía la respiración aeróbica. El ATP es la fuente de energía
más importante de la célula, se utiliza en las reacciones biosintéticas, y es necesario para la activación de compuestos endógenos por fosforilación o adenilación,
para incorporarse en cofactores, para la funcionabilidad del citoesqueleto y para
operar las bombas iónicas de la membrana celular.
La producción de ATP por las mitocondrias requiere oxígeno para funcionar,
así que una de las rutas para dañar el proceso es la hipoxia (baja concentración
de oxígeno). El principal agente que priva a la célula de oxígeno es el monóxido
de carbono el cual se liga a la hemoglobina inhibiendo la unión de ésta con
el oxígeno. La anemia (baja concentración de hemoglobina en la sangre) y la
isquemia (bajo ujo arterial o del drenaje venoso), reducen la capacidad de
transporte de oxígeno y pueden contribuir a la deciencia de este compuesto a
nivel celular.
La producción de ATP también se puede impedir por: agentes que interrumpen la cadena de transportes de electrones a través de inhibidores de enzimas
como la rotenona (inhibe la NADH-coenzima Q reductasa) y el cianuro (inhibe
la citocromo oxidasa). por substancias que inhiben o desacoplan la fosforilación
oxidativa tales como el DDT (inhibe la ATP sintetasa) y el arsenato (substituye
al fósforo y produce intermediarios de baja energía).
El incremento del nivel de Calcio intracelular produce la disociación de la
actina de los microlamentos en el citoesqueleto y la activación de fosfolipasas
y proteasas. Estos cambios producen fragmentación del ADN, condensación de
la cromatina, ruptura de membranas y degradación de proteínas.
El control de calcio se puede romper por el incremento del ingreso o por la
salida de este ión de sus depósitos celulares. Los agentes que inducen la entrada
de calcio son metilmercurio que produce poros y, el tetracloruro de carbono
que rompe la membrana. Los agentes que inhiben la exportación de calcio del
citoplasma son inhibidores de la calcio-ATPasa en la membrana celular o en el
retículo endoplásmico.
Morfología de la apoptósis
Es una forma de muerte celular caracterizada por hipereosinolia y retracción citoplasmáticas con fragmentación nuclear (cariorrexis) desencadenada por
señales celulares controladas genéticamente. Estas señales pueden originarse
en la célula misma o de la interacción con otras células. La apoptósis tiene
un signicado biológico muy importante, que es opuesto al de la necrosis en la
regulación del volumen tisular. La apoptósis contribuye a dar la forma a los
órganos durante la morfogénesis y elimina células inmunológicamente autorreactivas, las células infectadas y las genéticamente dañadas, cuya existencia es
potencialmente dañina para el huésped. La apoptósis no presenta las fases de
necrobiosis, necrofanerosis y necrólisis. Los signos morfológicos de la apoptósis
son muy semejantes a los de la necrofanerosis. En la apoptósis las alteraciones
nucleares representan los cambios más signicativos e importantes de la célula
muerta y los organelos permanecen inalterados incluso hasta la fase en que
aparecen los cuerpos apoptóticos. En la apoptósis destacan las alteraciones
morfológicas del núcleo frente a las del citoplasma, a la inversa de lo que ocurre
en la necrosis en general. A diferencia de la apoptósis, la necrosis es una forma
de muerte celular que resulta de un proceso pasivo, accidental y que es consecuencia de la destrucción progresiva de la estructura con alteración denitiva
de la función normal en un daño irreversible; este daño está desencadenado por
cambios ambientales como la isquemia, temperaturas extremas y traumatismos
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mecánicos. Digestión enzimática del citoplasma y núcleo, fuga de compuestos
intracelulares y entrada de macromoléculas extracelulares. La apoptósis se ha
conocido con otros nombres: cuerpos de Councilman (hígado), cuerpos cariolíticos (criptas intestinales), cuerpos tingibles (ganglio linfático), cuerpos de
Civatte (piel), cuerpos hematoxilínicos (varios)
Al microscopio de luz, las células apoptóticas se observan como células pequeñas, hipereosinólas, de citoplasma redondeado u oval con o sin material
nuclear basólo. El citoplasma en fases más avanzadas aparece fragmentado,
que varían de tamaño considerablemente. La cromatina aparece como masas
hiperbasóas, densas. La fagocitosis de los cuerpos apoptóticos no induce a los
macrófagos para que estimulen una respuesta inamatoria.
Al microscopio electrónico, en la fase temprana hay condensación de la cromatina, para formar masas crescénticas uniformemente densas, delimitadas; el
nucleolo presenta disposición periférica de la cromatina con formación de gránulos osmiofílicos hacia el centro del núcleo; el núcleo brilar proteico forma una
masa granular compacta usualmente adosada a la supercie interna de la cromatina condensada. Los desmosomas aparecen desestructurados y estructuras
de supercie como microvellosidades están desorganizadas. El volumen celular
está disminuido y la densidad celular aumentada, los organelos citoplasmáticos
aparecen compactos y la silueta de la célula (citoplasma y núcleo) está convoluta.
En la fase avanzada el núcleo se observa fragmentado y con condensación de la
cromatina.
En el citoplasma hay agregación de lamentos intermedios, formación de
grumos de proteínas ribosomales, agrupación concéntrica de retículo endoplásmico rugoso, las células con abundante citoplasma forman prolongaciones muy
prominentes. Finalmente éstas se separan para formar los fragmentos denominados cuerpos apoptóticos. In vivo, estos cuerpos son rápidamente fagocitados
por células epiteliales adyacentes, fagocitos mononucleares e incluso células neoplásicas. Esta fagocitosis y degradación rápida pueden explicar la ausencia de
inamación en este fenómeno. Esta secuencia de alteraciones ocurre muy rápidamente: la retracción citoplasmática y la aparición de prolongaciones sucede
en minutos y los cuerpos apoptóticos son digeridos en algunas horas.
La fragmentación rápida y regular del ADN es característica. Hay fragmentación inicialmente en trozos de 300 pares de bases y luego de 50 pares
de bases con división del ADN internucleosomal de doble hebra. Esto origina
fragmentos de 186 pares de bases y múltiplos de ellos (multímeros), lo cual se
observa en electroforesis en gel de agarosa como el llamado "patrón en escalera".
La fragmentación se produce por activación de endonucleasas dependientes de
calcio. Muchos de los cambios celulares se atribuyen a la acción de enzima
convertidora de interleuquina 1b y granzima B. La transglutaminasa tisular
produce agregados proteicos que evitan la liberación de enzimas intracelulares
particularmente dañinas.
Resumen de la biología molecular de la apoptosis.
Regulación genética de la apoptosis
Señalización de la supervivencia celular
Las caspasas son proteasas que juegan un papel clave en el proceso de apoptosis. La familia de las caspasas está constituida por más de doce proteasas
caracterizadas por la presencia de residuos de cisteína en su sitio activo. Estas
proteínas están ampliamente conservadas en el proceso evolutivo y comparten
secuencias estructurales comunes. Las caspasas se sintetizan como precursores
inactivos que se convierten en la forma activa por rotura proteolítica. Una vez
activas, las caspasas producen la hidrólisis a partir de residuos de ácido aspártico
en la proteína sustrato. Así, la activación inicial de una caspasa provoca una
reacción en cadena que conduce a la activación de otras caspasas y a la muerte
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de la célula. Por lo tanto, la regulación de la activación de las caspasas es
fundamental para determinar la supervivencia celular.
Aunque la familia de las caspasas comparte una estructura común, los análisis logenéticos han demostrado la existencia de subfamilias que presentan diferentes características y que por lo tanto pueden tener distinto papel en el proceso
de apoptosis. Así, las caspasas iniciadoras (caspasas -2, -8, -9, -10) presentan
pro-dominios funcionales que permiten la asociación de estas moléculas con complejos de señalización; las caspasas ejecutoras (caspasas -3, -6 -7) son activadas
por las caspasas iniciadoras y son las responsables de la interacción con otras
moléculas que desencadenan la apoptosis. La tercera subfamilia de caspasas es
la de las caspasas procesadoras de citoquinas (caspasas-1, -4, -5, -12, -13, -14).
Se ha descrito que las caspasa 1 se activa por la ausencia de factores de
crecimiento, que hidroliza a la caspasa 3 in vitro y que promueve el procesamiento y activación de la interleucina-1b (IL-1b), sustancia implicada en la
muerte neuronal. En cuanto a la caspasa 2, se sabe que se activa tras su unión
a una molécula adaptadora que a su vez se une a una parte del complejo de
señalización del receptor de factor de necrosis tumoral (TNF). La caspasa 2
activa puede procesar su propio precursor.
La caspasa 9, que en situación siológica se encuentra en su forma inactiva en
el citosol, se activa tras la salida de citocromo c desde la mitocondria. Ante un
determinado daño se produce una alteración en la membrana mitocondrial que
desencadena la salida de citocromo c al citosol. El citocromo c forma entonces
un complejo con el factor activador de proteasa (Apaf-1), dATP y procaspasa
9, lo que conduce a la activación de la caspasa. Una vez activa, la caspasa 9
puede activar otras caspasas.
Las caspasas 3, 6 y 7 son las principales responsables de los cambios morfológicos y bioquímicos que ocurren en las células apoptóticas. Entre sus sustratos se encuentran un factor responsable de la fragmentación del ADN. Además
las caspasas eliminan la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), molécula implicada en la maquinaria celular que repara el daño en el ADN. Por otro lado,
activan la vía que conduce a la condensación de la cromatina y participan en la
destrucción de la lámina nuclear y de las proteínas del citoesqueleto.
Moléculas anti-apoptóticas
La apoptosis está reducida por el efecto de ciertas drogas que inhiben las
topoisomerasas, por la exposición o acción de diversos inhibidores de las cinasas,
por la interferencia en la homeostasis del calcio, por el efecto de un shock térmico
breve, en algunas infecciones virales o la exposición a linfocitos T citotóxicos.
En algunos casos, la muerte celular programada está controlada genéticamente o por la acción de diversas moléculas anti-apoptóticas:
Las proteínas de la familia Bcl-2, derivadas del proto-oncogén blc-2, intervienen en la regulación de la apoptosis. Aquellas células que expresan Bcl-2,
fácilmente demostrable mediante inmunohistoquímica, son resistentes a la apoptosis promoviendo de esta manera la supervivencia celular, pero también facilitando con esa supervivencia la adquisición de mutaciones y la transformación
maligna.
La proteína Myc, derivada del proto-oncogén myc, promueve, según las circunstancias, la muerte celular o su proliferación.
La proteína p53, producida por el gen supresor de tumores p53, estabiliza a
la célula en la fase G1 del ciclo a n de controlar la existencia de daños en el
ADN; pero en sentido contrario, si éstos fueran peligrosos para las células hijas,
activaría la apoptosis.
La proteína p35, descubierta en los bacuolavirus pero presente también en los
vertebrados superiores, inhibe la apoptosis. Los virus mutantes que no poseen
el gen p35 provocarían la muerte de las células huésped por apoptosis, pero las
formas salvajes inhibirían ésta.
Los mamíferos (aunque también se ha demostrado en Drosophyla), poseen
una familia de genes que codican potentes inhibidores de las caspasas, cuyos
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productos de expresión se conocen como proteínas inhibidoras de la apoptosis
(IAP)
A propósito de éstos inhibidores, también se conocen sus correspondientes
neutralizadores de la actividad anti-apoptótica como serían las proteínas Smac
(second mitochondrial-derived activator of caspases) o DIABLO (direct IAP-binding
Protein with low pI)
Se han descrito también moléculas bajo el nombre de "receptores cebo" como
el DcR3 (decoy receptor 3) que se sobre-expresan en algunas neoplasias como
las de pulmón o las de colon y que actuarían uniéndose al FasL, bloqueando con
ello su unión con el receptor Fas, con la consiguiente inhibición de la apoptosis.
ENFERMEDADES ASOCIADAS A INHIBICION DE
APOPTOSIS
(aumento de la proliferación).
1. Cancer
linfoma no Hodgkin folicular (bcl2 +)
carcinoma (p53 +)
tumores hormono-dependientes
carcinoma de mama
carcinoma de próstata
carcinoma de ovario
2. Enfermedades Autoinmunitarias
Lupus eritematoso sistémico
Glomerulonefritis autoinmunitaria
3. Infecciones Virales
virus herpes
poxvirus
adenovirus (E1B)
ENFERMEDADES ASOCIADAS A AUMENTO DE
APOPTOSIS
(disminución de proliferación = aumento de muerte celular)
1. Sida
a) Enfermedades Neurodegenerativa
Enf. de Alzheimer
Enf. de Parkinson
Esclerosis lateral amiotróca
Retinitis pigmentosa
Degeneración cerebelosa
2. Sindrome Mielosdisplásticos
Anemia Aplástica
3. Daño Isquemico
Infarto del miocardio
Apoplejía
Daño por reperfusión
4. Daño Hepatico por Alcohol
Fuentes
Denición muerte celular:
http://elies.rediris.es/elies6/cap4211.htm
Resumen general:
http://es.wikipedia.org/wiki/Apoptosis
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Morfología de la apoptosis:
http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-4-1-2.html
Vías de señalización implicadas en la supervivencia:
http://www.bq.uam.es/doctorado/cursos/actual/muertecelular/mfernandez.pdf
Señalización de l supervivencia celular:
http://www.oftalmo.com/seo/2003/07jul03/04.htm
Vías de señalización de la apoptosis:
http://www.bq.uam.es/doctorado/cursos/actual/muertecelular/senalizacionapoptosis.pdf
Datos de la apoptosis:
http://escuela.med.puc.cl/publ/PatologiaGeneral/Patol_033.html
Horvitz HR. A rst insight into the molecular mechanisms of apoptosis Cell.
2004 Jan 23;116(2 Suppl):S53-6, 1 p following S59.
Lawen A. Apoptosis-an introduction Bioessays. 2003 Sep25(9):888-96.
Regulación genética de la apoptosis:
http://www.campusvirtual.urjc.es/SCRIPT/2006-07_1004407_1/scripts/student/dropbox_stud_home.
Formas de muerte celular:
http://www.uchile.cl/instituto/medicina/boletin/boletin36/conf4.html
Organelos involucrados en la apoptósis:
http://www2.uah.es/daviddiaz/Apoptosis/caracteristicas.htm
http://www2.uah.es/sancho/quimica/Tema%2015/TEMA%2015.pdf
Bibliography
[1] Horvitz HR. A rst insight into the molecular mechanisms of apoptosis Cell. 2004
Jan 23;116(2 Suppl):S53-6, 1 p following S59.
[2] Lawen A. Apoptosis-an introduction Bioessays. 2003 Sep25(9):888-96.
[3] Robbins Patología Humana. Kumar. I.S.B.N.:8481746665. 7a ed. 2003, Español.
[4] Principios de Patología. Pérez Tamayo