CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 FÁRMACOS PARA DESPERTAR UN GEN PATERNAL EN EL SÍNDROME DE ANGELMAN Inhibidores de topoisomerasas eliminan el silenciamiento del alelo dormido de UBE3A en neuronas. 1. INTRODUCCIÓN El síndrome de Angelman es un grave trastorno neurológico caracterizado por retraso mental grave, falta de habla, ataxia, convulsiones, características únicas de comportamiento, tales como sonrisa y risas únicas (Jana 2012) y rasgos faciales característicos (Figura 1) Figura 1. Rasgos faciales característicos de un paciente con síndrome de Angelman. La enfermedad es causada principalmente por deleción o mutación en el alelo materno del gen ubiquitina ligasa E3A (UBE3A). Dicho gen se localiza en el cromosoma 15q11-q13 y codifica una proteína de 100 kDa con función ubiquitina ligasa y coactivador transcripcional (Jana 2012). Últimos estudios han demostrado que dicha proteína juega un papel muy importante en la función sináptica neuronal y en la regulación de la actividad dependiente de dicha plasticidad. La disminución de los niveles de UBE3A da lugar a una pérdida de la señalización dopaminérgica en las vías motoras subcorticales, pérdida responsable de la sintomatología característica de dicho síntoma. El síndrome de Angelman es un ejemplo clásico de enfermedad con herencia epigenética (Figura 2). El desarrollo de la enfermedad viene dado en función de si la copia del gen alterado proviene del padre o de la madre. CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 Figura 2. Regulación diferencial de los alelos materno y paterno del gen UBE3A. De las dos copias del gen, solo la copia materna es expresada en tejido neuronal, mientras que la copia materna permanece silenciada por imprinting. Concretamente, la expresión del gen paterno UBE3A es inhibida mediante la transcripción en dirección antisentido de una larga secuencia que incluye no sólo este gen, sino también el centro de control que regula su expresión. En el cromosoma materno equivalente, la secuencia que codifica el centro de control está metilada (Me) de forma que no se expresa, la transcripción antisentido queda inhibida permitiéndose la activación de la expresión de UBE3A. En el síndrome de Angelman, mientras que el gen UBE3A materno está mutado, el paterno permanece intacto pero inhibido epigenéticamente de forma que los niveles proteicos de UBE3A son mínimos. La sintomatología de este síndrome aparece a partir de los 6-12 meses de vida, durante estos primeros meses la arquitectura y función del cerebro permanecen normales. El equipo de Huang se planteó por tanto la posibilidad de curar el trastorno recuperando la proteína UBE3A funcional mediante la activación del gen paterno silenciado durante estas primeras etapas de vida de forma que las consecuencias físicas aún no hubieran aparecido. CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 2. MÉTODOS EXPERIMENTALES Se procedió a buscar fármacos que activaran la copia paterna de dicho gen. Para ello se usaron como modelo ratones modificados genéticamente de forma que el gen UBE3A codificaba para una proteína transgénica UBE3A fluorescente (UBE3A-YFP) (Figura 1) Se trabajó in vitro con neuronas corticales de estos ratones (Figura 2). Figura 2. a. Creación de ratones transgénicos que codificaban para una proteína recombinante UBE3A-YFP y posterior tratamiento con 2.306 fármacos. Para comprobar si realmente la copia de UBE3A paterna estaba silenciada en neuronas corticales se crearon dos tipos de ratones: ratones que sintetizaban la proteína UBE3A-YFP a partir del alelo paterno (m+/pYFP) y por otro lado ratones que la sintetizaban a partir del alelo materno (m YFP/p+ ). Los resultados mostraron solo presencia de UBE3A-YFP en los ratones mYFP/p+ (Figura 3). CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 Figura 3. Ensayo ex vivo. Imagen microscopio de fluorescencia de neuronas corticales aisladas a partir de embriones de ratones con UBE3A-YFP heredado por vía YFP + + YFP materna-YFP (m /p ) y paterna (m /p ). Contratinción de núcleos con DAPI. Las neuronas corticales aisladas a partir de los embriones transgénicos fueron tratadas con 2.306 fármacos (figura 2). Los resultados mostraron que ningún compuesto de los que normalmente se usan para conseguir modificaciones epigenómicas, como fármacos remodeladores de la cromatina o inhibidores de ADN metilasas, revertían el silenciamiento del alelo paterno. En cambio, se encontró un compuesto, el irinotecán (inhibidor de la topoisomerasa I) que sí revertía dicho silenciamiento. Finalmente se aislaron doce inhibidores para la topoisomerasa I (TOP1) y cuatro para la topoisomerasa II (TOP2) con los que se conseguía el efecto deseado. Uno de estos 16 inhibidores de topoisomerasas, el topotecán, resultó ser mucho más eficaz que el resto de forma que los siguientes estudios se centraron en dicho compuesto (Figura 4). El topotecán necesita de menores concentraciones para llegar a su máximo de efectividad (Figura 4.a) y además, los niveles de expresión de UBE3A-YFP resultan más altos en periodos de tratamiento más cortos (Figura 4.b). CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 Figura 4. El topotecán tiene mayor eficiencia en el revertimiento del silenciamiento del gen paterno UBE3A que otros inhibidores de topoisomerasas. a. Curva dosis-respuesta para el estudio del efecto revertimiento del silenciamiento del gen paterno UBE3A mediante el uso de topotecán e irinotecán. b. Curva concentración de UBE3A-YFP en tejido neuronal respecto a los días de tratamiento. Se comprobó que el topotecán regulaba positivamente la expresión de UBE3A tanto en células procedentes de ratones con UBE3A materno afectado, es decir ratones con el síndrome de Angelman (m-/pYPF), como en ratones con fenotipo salvaje (m+/pYPF), lo que se explicaba por la eliminación del silenciamiento del alelo paterno. El topotecán reduce notablemente los niveles de TOP1 activa al unirla covalentemente con el ADN. Se vio que aparentemente este compuesto no modificaba los patrones de metilación del centro de regulación (Figura 5) sino que actuaba reduciendo la transcripción de un ARN a partir de un patrón de lectura antisentido que en cis reprimía a UBE3A (Figura 6). Figura 5. Esquema representativo del grado de metilación de los centros control de los UBE3A materno y paterno. En presencia de topotecán estos patrones de metilación aparecen intactos, el materno aparece totalmente metilado mientras que el paterno permanece sin metilar. CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 Figura 6. Regulación diferencial de los alelos materno y paterno del gen UBE3A. La expresión del gen paterno UBE3A es inhibida mediante la transcripción en dirección antisentido de una larga secuencia que incluye snoRNAs reguladores. In vitro se vio que, una vez detenido el tratamiento con topotecán, la inhibición del silenciamiento, es decir la expresión de UBE3A-YFP, se mantenía. Tras todos estos trabajos in vitro, se procedió a su estudio in vivo. Primero se identificó una dosis de topotecán que era correctamente tolerada por los ratones. Posteriormente se les inyectó dicha dosis en el ventrículo lateral vía intraventricular pero los resultados no mostraron un aumento relevante de los niveles de UBE3A-YFP. En cambio, al usar dosis más elevadas sí se comprobó un aumento de dichos niveles en el sistema nervioso sin que los niveles de topotecán en sangre fueran significantes. Figura 7. El topotecán revierte el silenciamiento de UBE3A in vivo. Suministro unilateral de topotecan (icv) usando una bomba miniosmótica en el ventrículo lateral de ratones Ube3a m+/pYFP vivos. El tratamiento durante dos semanas con infusión de topotecán revierte el silenciamiento del gen paterno en el hemisferio infundido del hipocampo, mientras que en el hemisferio no infundido no se revierte el silenciamiento. CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 La concentración de topotecán, una vez cesado el tratamiento, en menos de cinco horas disminuía notablemente pero en cambio los efectos sobre UBE3A se mantenían durante días (Figura 8). Figura 8. El topotecán revierte irreversiblemente el silenciamiento de UBE3A in vivo. Una vez cesado el tratamiento los efectos de reversión del silenciamiento permanecen incluso semanas después del tratamiento. Por otro lado, el uso de topotecán llevó en algunos casos a relevantes efectos secundarios. El topotecán inhibe la TOP1 y esta inhibición puede afectar a la transcripción de otros genes cuya transcripción es requerida en condiciones normales. Uno de ellos es el gen implicado en el síndrome de Prader-Willi, trastorno genético que se caracteriza por la ausencia de expresión de un alelo paterno, al contrario que el síndrome de Angelman en el que el alelo afectado era el materno. Al inhibir TOP1, se inhibe también la expresión de dicho gen materno comprobándose in vitro una transformación de células inicialmente afectadas por el síndrome de Angelman, a células afectadas por Prader-Willi. En cambio, el topotecán se está usando actualmente en algunos CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 tratamientos de quimioterapia y en ningún caso se han dado síntomas de Prader-Willi. En Estados Unidos ya se han hecho inyecciones de topotecán en el fluido cerebroespinal de adultos para tratar otras enfermedades. Aun así, el tratamiento para el síndrome de Angelman debe hacerse en niños muy pequeños lo que es mucho más arriesgado. CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 3. CONCLUSIONES El síndrome de Angelman es un trastorno genético causado por inactivación del alelo materno del gen UBE3A, gen regulado por imprinting cuya copia paterna aparece silenciada. Este síndrome puede llegar a curarse mediante el tratamiento con fármacos inhibidores de topoisomerasas durante los primeros meses de vida del paciente. Dichos fármacos revierten el silenciamiento del alelo paterno de UBE3A que permanece sano en los pacientes, al inhibir la transcripción en dirección antisentido de la secuencia que incluye la región control, con lo que se inhibe la transcripción de los snoRNAs reguladores. El fármaco inhibidor de topoisomerasa más efectivo para la reversión de dicho silenciamiento y además aceptado para la aplicación humana es el topotecán cuya aplicación in vivo revierte el silenciamiento de la copia paterna del gen de forma permanente, incluso una vez finalizado el tratamiento. Este tratamiento con topotecán debe realizase con concentraciones reguladas ya que un exceso podría llevar a la aparición del síndrome de Prader-Willi. Hoy en día, los estudios se centran en la búsqueda de tratamientos con topotecán viables y efectivos para niños menores de seis meses de edad. CAROLINA GARCÍA POYATOS GENÉTICA MOLECULAR GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012 BIBLIOGRAFÍA o Arthur L. Beaudet . Angelman syndrome. drugs to awaken a paternal gene. Nature 2012 vol 481: 150-152 o Hsien-Sung Huang1*, John A. Allen2*, Angela M. Mabb1, Ian F. King1, Jayalakshmi Miriyala1, Bonnie Taylor-Blake1, Noah Sciaky2,J. Walter Dutton Jr1, Hyeong-Min Lee2, Xin Chen3, Jian Jin3, Arlene S. Bridges4, Mark J. Zylka1,5,6, Bryan L. Roth2,5,6,7,8& Benjamin D. Philpot1,5,6 Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature 2012 vol 481: 185-191 o Jana NR. Understanding the pathogenesis of Angelman syndrome through animal models. Neural Plast. 2012: 10.1155/2012/710943. o Riday TT, Dankoski EC, Krouse MC, Fish EW, Walsh PL, Han JE, Hodge CW, Wightman RM, Philpot BD, Malanga CJ. 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