FACTOR MASCULINO Y STRESS OXIDATIVO

 FACTOR MASCULINO Y STRESS OXIDATIVO Á GUEDA
ORTIZ
La fertilidad masculina en la especie humana es relativamente baja en relación con la de otras especies. El tamaño relativo del testículo de los seres humanos es no‐
tablemente menor que el de otros mamíferos y tiene una de las tasas más bajas en cuanto a producción diaria de espermatozoides por gramo de testículo, así como proporciones bajas de espermatozoides progresivamente móviles y morfológicamen‐
te normales.1 Esto hace que el varón pueda estar en mayor riesgo frente a las sustan‐
cias tóxicas que afectan la reproducción. El factor masculino está presente en aproximadamente la mitad de los casos de esterilidad y no se puede hallar ninguna causa identificable en más del 25% de los varones estériles.2 En 1979 se publicó un trabajo que relacionaba el estrés oxidativo con alteraciones en la función espermática3. Desde entonces, numerosos estudios han demostrado su importancia clínica en la etiología de la esterilidad masculina.4,5 Hoy en día se le atribuye un papel principal en la esterilidad con origen en el varón ya que no sólo disminuye la capacidad fecundante del espermatozoide, sino también su habilidad para dar lugar a embriones sanos. ESTRÉS OXIDATIVO Y FUNCIÓN ESPERMÁTICA El estrés oxidativo es la situación en la que se encuentra una célula que pre‐
senta un desequilibrio entre sustancias oxidantes y antioxidantes; bien sea por un exceso en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), bien por una defi‐
ciencia en los sistemas de detoxificación de éstas. El gameto masculino fue el primer tipo celular donde se constató la capacidad para generar ROS.6 La habilidad para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) es un aspecto fundamental de la fisiología del espermatozoide.7 Los metabolitos del oxí‐
geno están implicados en procesos tan importantes como la capacitación espermáti‐
ca, la hiperactivación, la reacción acrosómica y la fusión de membranas para la fe‐
[1] Actualización Obstetricia y Ginecología 2011
cundación.8,9 La capacitación espermática, por ejemplo, implica un gran aumento en el nivel de tirosina fosforilada en la cola y sobre todo en la pieza intermedia.10 Las señales implicadas para que tenga lugar la fosforilación son el AMPc y el estado redox de la célula.11 El anión superóxido y el peróxido de hidrógeno son dos factores impor‐
tantes en este proceso.12
Dependiendo de la naturaleza de las ROS y su concentración, así como el mo‐
mento y el lugar de la exposición, las especies reactivas tienen efectos favorables o perjudiciales sobre las funciones de los espermatozoides. ESTRÉS OXIDATIVO Y VULNERABILIDAD ESPERMÁTICA Un conjunto de enzimas antioxidantes citoplasmáticas, tales como la superóxi‐
do dismutasa (SOD), la catalasa y la glutatión peroxidasa (GPX), mantiene la concen‐
tración de ROS y protege a las células de su exceso. Pero los espermatozoides son más susceptibles ya que su reducido citoplasma hace que carezcan de estos meca‐
nismos endógenos para reparar los daños asociados al estrés oxidativo.13 La generación excesiva de ROS en el semen, principalmente por los neutrófilos, pero también por espermatozoides anormales, podría ser una causa de esterilidad14. El peróxido de hidrógeno es la principal ROS tóxica para los espermatozoides huma‐
nos. Las concentraciones moderadamente altas no afectan la viabilidad de los esper‐
matozoides, pero los inmovilizan, generalmente por agotamiento del ATP intracelular y disminución ulterior en la fosforilación de las proteínas del axonema. El plasma seminal no sólo presenta especies reactivas, también posee los me‐
canismos para mantener un estado de oxidación adecuado. Contiene enzimas anti‐
oxidantes y diversas moléculas antioxidantes no enzimáticas como la melatonina, la vitamina C, la vitamina E, el piruvato, el glutatión y la carnitina.15,16 Varios investiga‐
dores han encontrado concentraciones significativamente menores de antioxidantes en el semen de hombres estériles en relación con los controles. No obstante, las con‐
centraciones patológicas de ROS detectadas en el semen de hombres estériles se de‐
ben más probablemente al aumento de la producción de ROS que a la disminución de la capacidad antioxidante del líquido seminal. El alto contenido de los espermatozoides en ácidos grasos poliinsaturados también hace que estas células sean más sensibles al estrés oxidativo.17 La peroxida‐
ción lipídica afecta sobre todo a las membranas y se asocia a una disminución de la movilidad espermática. La pérdida de fluidez en la membrana, origina un fallo en la [2] Reproducción actividad Ca2+/Mg2+ ATPasa, que provoca un aumento del calcio intracelular y como consecuencia la pérdida de la movilidad espermática. En este sentido, Gomez y cola‐
boradores señalaron que los niveles de producción de ERO por las poblaciones es‐
permáticas puras se correlacionaron negativamente con la calidad del semen.18 Fun‐
ciones dependientes de la fluidez de la membrana como son la fusión al ovocito y la reacción acrosómica también se ven alteradas. Otra diana espermática para sufrir daño oxidativo es el material genético, siendo el agente inductor principal el peróxido de hidrógeno. El ADN nuclear está bien protegido por las protaminas, unas proteínas que sustituyen a las histonas nu‐
cleares presentes en otros tipos celulares y que ofrecen mayor estabilidad a la cade‐
na de ADN.19 El genoma del núcleo es particularmente resistente al exceso de ROS pero no acurre lo mismo con el material genético de las mitocondrias.20 De hecho, la integridad del ADN mitocondrial es un excelente marcador de estrés oxidativo. FUENTES DE ROS Las especies reactivas se generan de forma controlada en el metabolismo del espermatozoide pero varios factores pueden estimular su producción. Por ejemplo, la presencia de leucocitos activados como consecuencia de una infección del tracto re‐
productor masculino;21 las radiaciones electromagnéticas;22 las radiaciones de teléfo‐
nos móviles23 o agentes xenobióticos como las quinonas24 favorecen la producción de ROS llegando a niveles perjudiciales. Otros factores hacen a los espermatozoides más susceptibles de sufrir daños por las especies reactivas porque impiden el correcto empaquetado del ADN como ocurre con algunos pesticidas organofosforados25 y tóxicos ambientales. Algunas patologías asociadas a una espermatogénesis incompleta o a una dis‐
minución del sistema de antioxidantes también incrementan los efectos producidos por el exceso de ROS. Es lo que ocurre en casos de criptorquidia,26 torsión testicular,27 varicocele,28 hipertiroidismo29 o diabetes.30 El manejo de las muestras seminales en el laboratorio es otra posible fuente de ROS. La centrifugación a la que se someten las muestras durante la realización de Swim‐up o gradientes de densidad aumenta el contenido en ROS. Los choques térmi‐
cos y la exposición al oxígeno atmosférico durante los procesos de criopreservación [3] Actualización Obstetricia y Ginecología 2011
seminal afectan a la integridad de la membrana y se asocian al aumento en la pro‐
ducción de ROS y a la disminución de antioxidantes.31 CONSECUENCIAS DE LA GENERACIÓN EXCESIVA DE ROS Durante procesos dependientes del estado redox como la capacitación es‐
permática se han observado transformaciones morfológicas en las mitocondrias.32 Recientemente se ha demostrado que estos orgánulos, tan abundantes en la cola y la pieza intermedia, son los principales generadores de ROS en los espermatozoides33 y que cualquier factor capaz de interferir en la cadena transportadora de electrones es un potencial inductor de ROS. LA enzima mitocondrial implicada es la oxidorreducta‐
sa (diforasa) dependiente de NADPH.34 La otra vía de formación de ROS en los espermatozoides es el sistema fosfato nicotinamida adenina dinucleótido (NADPH) oxidasa a nivel de la membrana plasmá‐
tica. Prácticamente el semen de cada eyaculación está contaminado con posibles fuentes de ROS. Se deduce que en cada eyaculación algunos espermatozoides su‐
frirán daño oxidativo y pérdida ulterior de la función. De esta manera, el impacto de las ROS sobre la fertilidad masculina es un problema de grado más que de presencia o ausencia de la patología. En las mitocondrias disfuncionales la producción de ROS aumenta significati‐
vamente y estas moléculas a su vez afectan la función mitocondrial de los espermato‐
zoides. Esta relación se puede deber a dos fenómenos interconectados mutuamente: las ROS que lesionan la membrana mitocondrial, y la membrana mitocondrial lesio‐
nada que aumenta la producción de ROS. Por otro lado, las mitocondrias tienen una función clave en el mecanismo de la apoptosis. Su integridad está determinada por la presencia de citocromo c en el es‐
pacio de la membrana interna. Los niveles altos de ROS desorganizan las membranas interna y externa de las mitocondrias. Esto produce la liberación de la proteína cito‐
cromo c de la mitocondria, que activa las caspasas e induce apoptosis. Se ha demos‐
trado en varios tipos celulares que el estrés oxidativo puede ser inductor de la apop‐
tosis.35 [4] Reproducción ESTRATEGIAS PARA REDUCIR EL ESTRÉS OXIDATIVO Como ya hemos mencionado, los leucocitos y espermatozoides inmaduros o anormales presentes en el eyaculado son fuentes generadoras de un exceso de ROS. Con las técnicas de selección espermática, separamos la fracción de espermatozoides móviles y “sanos” que generan cantidades fisiológicas de ROS. Es mejor, por tanto, no quedar el eyaculado en el laboratorio y demorarse mucho en seleccionar los mejores espermatozoides, libres de plasma seminal y otras células, lo que comúnmente lla‐
mamos “técnicas de capacitación”. Además, en el desarrollo de estas técnicas se utilizan medios de cultivo suple‐
mentados con gran cantidad de antioxidantes que contribuyen al balance redox. Re‐
cientemente, se ha comprobado en las técnicas de criopreservación seminal, que la suplementación de los medios empleados con antioxidantes tiene un efecto criopro‐
tector sobre las células;36 tras la descongelación los espermatozoides muestran mejor movilidad y mayor integridad en la membrana que utilizando medios carentes de an‐
tioxidantes. El tiempo y velocidad de centrifugación también afectan a los niveles de ROS. Especies negativas para ROS se vuelven positivas tras la centrifugación a 200g ó 500g.37 El tiempo de centrifugación es más importante que la velocidad, por tanto, disminuyendo este intervalo y bajando la velocidad, obtendremos muestras menos oxidadas. Otra acción beneficiosa sería realizar el “swim‐up” previo a la centrifugación. Tanto la retirada de plasma seminal como la centrifugación contribuyen a generar ROS, así que, los espermatozoides deberían ser separados de los leucocitos cuando todavía son protegidos por los antioxidantes del plasma seminal. Las mejores técnicas de capacitación son aquellas en las que los espermatozoides móviles son separados previo a la centrifugación. MEDIDA DE LAS ROS A pesar de los numerosos estudios sobre el papel de las ROS durante tantos años y de conocer su importancia sobre la esterilidad masculina, no existen métodos fiables y reproducibles de uso clínico rutinario para calcular los niveles de ROS y com‐
plementar el estudio del varón. [5] Actualización Obstetricia y Ginecología 2011
Existen métodos para medir ROS en el interior de la célula, como por ejemplo medir superóxido implicado en la reducción de ferricitocromo C. Son métodos muy sensibles pero necesitan que la concentración de espermatozoides no sea demasiado baja.38 No sirven en caso de oligozoospermia. Otros métodos, miden ROS intra y extracelular por quimioluminiscencia. Son muy utilizados para medir peróxido de hidrógeno39 pero tienen el inconveniente de no ser tan sensibles. Dado que la capacidad de generar ROS de los espermatozoides es muy baja comparada con los leucocitos, necesitamos de métodos más sensibles. Por otro lado, tenemos el inconveniente de que aún no se ha definido el nivel normal de ROS en hombres fértiles. BIBLIOGRAFÍA Working PK. Male reproductive toxicology: comparison of the human to animal mod‐
els. Environ Health Perspect 1988; 77:37‐44. Sharlip ID, Jarow JP, Belker AM, et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril 2002; 77:873‐882. Jones R, Mann T, Sherins R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil Steril 1979; 31:531–537. Sikka SC. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. Curr Med Chem 2001; 8:851‐862. Agarwal A, Gupta S, Sikka S. The role of free radicals and antioxidants in reproduction. Curr Opin Obstet Gynecol 2006; 18:325‐332. Tosic J, Walton A. Formation of hydrogen peroxide by spermatozoa and its inhibitory effect on respiration. Nature 1946; 158:485. Agarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertil Steril 2003; 79,829‐843. Bize I, Santander G, Cabello P, Driscoll D, Sharpe C. Hydrogen peroxide is involved in hamster sperm capacitation in vitro. Biol Reprod 1991; 44:398–403. Griveau JF, Renard P, Le Lannou D. An in vitro promoting role for hydrogen peroxide in human sperm capacitation. Int J Androl 1994; 17:300–307. Visconti PE, Moore GD, Bailey JL et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP‐dependent pathway. Development 1995; 121:1139–1150. Baker MA, Hetherington L, Aitken RJ. Identification of SRC as a key PKA‐stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation‐associated hyperactivation of murine spermatozoa. J Cell Sci 2006; 119:3182–3192. de Lamirande E, Gagnon C. Impact of reactive oxygen species on spermatozoa: a balancing act between beneficial and detrimental effects. Hum Reprod 1995; 10 Suppl 1:15‐21. [6] Reproducción Aitken RJ, Clarkson JS, Fishel S. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and human sperm function. Biol Reprod 1989; 40:183–97. Garrido N, Meseguer M, Simon C et al. Proxodatove and antioxidative imbalance in human semen and its relation with male infertility. Asian J Androl 2004; 6 (1): 59‐65. Agarwal A. Role of antioxidants in the treatment of men infertility: an overview of the litera‐
ture. RBM Online 2004; 8:616‐627. Awad H, Halawa F, Mostafa T et al. Melatonin hormone profile in infertile males. Int J Androl 2006; 29:409‐413. Alvarez JG, Storey BT. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. Mol Reprod Dev 1995; 42:334–46. Gomez E, Irvine DS, Aitken RJ. Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of malondialdehyde and 4‐hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen quality and sperm function. Int J Androl 1998; 21:81–94. Sakkas D, Urner F, Bizzaro D et al. Sperm nuclear DNA damage and altered chromatin struc‐
ture: effect on fertilization and embryo development. Hum Reprod 1998; 13(Suppl 4):11–29. Sawyer DE, Mercer BG, Wiklendt AM, Aitken RJ. Quantitative analysis of gene‐specific DNA damage in human spermatozoa. Mutat Res 2003; 529:21‐34. Aitken RJ, Baker HW. Seminal leukocytes: passengers, terrorists or good samaritans? Hum Reprod 1995; 10:1736‐1739. Paul C, Murray AA, Spears N, Saunders PT. A single, mild, transient scrotal heat stress causes DNA damage, subfertility and impairs formation of blastocysts in mice. Reproduction 2008; 136:73‐
84. De Iuliis GN, Newey RJ, King BV, Aitken RJ. Mobile phone radiation induces reactive oxygen species production and DNA damage in human spermatozoa in vitro. PLoS ONE 2009; 4(7):e6446. Bennetts LE, De Iuliis GN, Nixon B et al. Impact of estrogenic compounds on DNA integrity in human spermatozoa: evidence for cross‐linking and redox cycling activities. Mutat Res 2008; 641:1.11. Piña‐Guzmán B, Solís‐Heredia MJ, Rojas‐García AE, Urióstegui‐Acosta M, Quintanilla‐Vega B. Genetic damage caused by methyl‐parathion in mouse spermatozoa is related to oxidative stress. Toxicol Appl Pharmacol 2006; 216:216–224. Smith GR, Kaune GH, Parodi ChD et al. Extent of sperm DNA damage in spermatozoa from men examined for infertility: Relationship with oxidative stress. Rev Med Chil 2007; 135:279‐286. Sarica K, Kupeli B, Budak M et al. Influence of experimental spermatic cord torsion on the con‐
tralateral testis in rats: Evaluation of tissue free oxygen radical scavenger enzyme levels. Urol Int 1997; 58:208‐212. Ozdamar AS, Soylu AG, Culha M et al. Testicular oxidative stress: Effects of experimental vari‐
cocele in adolescent rats. Urol Int 2004; 73:343‐347. Zamoner A, Barreto KP, Filho DW et al. Hyperthyroidism in the developing rat testis is asso‐
ciated with oxidative stress and hyperphosphorylated vimentin accumulation. Mol Cell Endocrinol 2007; 267:116‐126. Agbaje IM, Rogers DA, McVicar CM et al. Insulin dependent diabetes mellitus: Implications for male reproductive function. Hum Reprod 2007, 22(7):1871‐7. Bucak MN, Atessahin A, Yüce A. Effect of antioxidants and oxidative stress parameters on ram semen after the freeze‐thawing process. Small Ruminant Research 2008; 75 (2‐3) 128‐134. Vorup‐Jensen T, Hjort T, Abraham‐Peskir JV et al. R. X‐ray microscopy of human spermatozoa shows change of mitochondrial morphology after capacitation. Hum Reprod 1999; 14:880–884. [7] Actualización Obstetricia y Ginecología 2011
Koppers AJ, De Iuliis GN, Finnie JM, McLaughlin EA, Aitken RJ. Significance of mitochondrial reactive oxygen species in the generation of oxidative stress in spermatozoa. J Clin Endocrinol Metab 2008; 93:3199–3207. Gavella M, Lipovac V. NADH‐dependent oxido‐reductase (diaphorase) activity and isozyme pattern of sperm in infertile men. Arch Androl 1992; 28:135–41. Brookes PS, Yoon Y, Robotham JL, Andrews MW, Sheu SS. Calcium, ATP, and ROS: a mito‐
chondrial love‐hate triangle. Am J Physiol Cell Physiol 2004; 287:C817‐833. Bucak MN, Sariözkan S, Tuncer PB et al. The effect of antioxidants on post‐thawed Angora goat (Capra hircus ancryrensis) sperm parameters, lipid peroxidation and antioxidant activities. Small Ruminant Research 2010; 89(1):24‐30. Shekarriz M, DeWire DM, Thomas AJ Jr, Agarwal A. A method of human semen centrifugation to minimize the iatrogenic sperm injuries caused by reactive oxygen species. Eur Urol 1995; 28:31‐35. Álvarez JG, Touchstone JC, Blasco L, Storey BT. Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa: superoxidase dismutase as major en‐
zyme protectant against oxygen toxicity. J Androl 1987; 8:338‐348. Espino J, Bejarano I, Ortiz A et al. Melatonin as a potential tool against oxidative damage and apoptosis in ejaculated human spermatozoa. Fertil Steril 2010; 94:1915‐1917.
[8]