1 LAS SEMAFORINAS: MOLÉCULAS IMPLICADAS EN

LAS SEMAFORINAS: MOLÉCULAS IMPLICADAS EN EL GUIADO
AXONAL
RESUMEN
Los axones alcanzan sus dianas mediante señales atractivas o repulsivas del
medio extracelular, que actúan regulando la dinámica del citoesqueleto en el cono de
crecimiento. Hay diversas moléculas implicadas en el guiado axonal: netrinas, efrinas,
slits y semaforinas. Las semaforinas actúan principalmente como señales inhibitorias
sobre el axón, y juegan un papel importante en la regulación de la inmunorrespuesta,
angiogénesis y el cáncer. Las plexinas, solas o en asociación con las neuropilinas,
constituyen los receptores de semaforinas de alta afinidad, sin embargo otras moléculas
transmembrana se han implicado en los complejos receptores de semaforinas, e
interacciones entre plexinas, y una gama de efectores intracelulares.
INTRODUCCIÓN
Para que el sistema nervioso sea funcional, las neuronas extienden sus axones, a
menudo, a largas distancias, hasta alcanzar sus dianas. En este proceso se ven
implicadas señales moleculares específicas que guían los axones hacia sus objetivos y
estas señales, son reconocidas por el cono de crecimiento. En función de las señales, el
cono de crecimiento elabora una respuesta dentro de un determinado contexto celular,
es decir, el ambiente que rodea las células proporciona un juego complejo de órdenes
para el axón en vías de crecimiento.
Los conos de crecimiento tienen tres regiones principales. El núcleo central es
rico en microtúbulos, mitocondrias y otras organelas. Del cuerpo proliferan largas y
delgadas extensiones conocidas como filopodios. Entre los filopodios están los
lamelopodios, que son también móviles y dan al cono de crecimiento su característico
aspecto erizado.
La capacidad sensitiva del cono de crecimiento depende en gran parte de sus
filopodios. Estas estructuras en forma de cilindro, ricas en actina y con una membrana
1
limitadora, son muy móviles. Sus membranas poseen receptores para las moléculas que
sirven como señales de dirección para el axón. La longitud de los filopodios les permite
tantear el terreno mucho antes que el núcleo central, sus rápidos movimientos les
permite hacer un inventario detallado del ambiente y su flexibilidad les permite navegar
a través de células y de otros obstáculos.
Cuando los receptores de los filopodios encuentran señales en el medio
ambiente, el cono es estimulado para avanzar, retraerse o girar. Para el guiado es
particularmente importante, el acoplamiento entre las capacidades sensitiva y motora
del cono de crecimiento. Es decir, que los receptores en los filopodios no intervengan
simplemente en la adherencia sino más bien sean receptores transmisores de señales
acoplados a numerosas vías de segundos mensajeros. Los segundos mensajeros afectan
a su vez a la organización del citoesqueleto, y regulan de esa manera la dirección y la
velocidad a la que se mueve el cono de crecimiento. Varios motores con actina, miosina
y componentes de la membrana impulsan estas reacciones y la contribución de cada
motor molecular al avance del cono de crecimiento probablemente varía de una
situación a otra. Con todos los motores, sin embargo, el paso final implica el flujo de
microtúbulos desde el núcleo central a la protusión recientemente creada, de forma que
el cono de crecimiento se mueve hacia delante y deja atrás un nuevo fragmento axónico.
El “nuevo” cono de crecimiento se forman otra vez lamelipodios y filopodios, y el
proceso comienza de nuevo. (Kandel, 2001).
Diversas moléculas actúan como señales en el guiado del axón. Las integrinas de
los conos de crecimiento interactúan con laminitas en la matriz extracelular. Moléculas
que intervienen en la adherencia intercelular también favorecen el crecimiento del axón.
Hace diez años, muy pocas de las moléculas de guiado axonal eran conocidas.
Pero en los años 70 y 80 aparecieron varios análisis in vitro de gran importancia, para
detectar actividades de guía en el desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados , y
también por el interés, cada vez mayor, de los genetistas en relación al problema de guía
axonal en los invertebrados. El comienzo de los años 90 condujo al descubrimiento de
varias familias de moléculas conservadas de guiado axonal . Entre éstas están las
netrinas, slits, efrinas y semaforinas, todas ellas pertenecientes a familias de moléculas
altamente conservadas (Dickson B.J. 2002).
2
Las netrinas fueron descubiertas como resultado de la búsqueda de un
quimioatrayente para axones comisurales en vertebrados y tras el análisis de los genes
requeridos para la guía circunferencial del axón en el gusano Caenorhabditis elegans.
Estas moléculas han conservado su función como factores quimiotácticos, atrayendo y
rechazando axones hacia la línea media. Sus receptores son el unc-5, que parece ser que
actúa sólo en la repulsión, y el unc-40, que actúa en la atracción y repulsión y pertenece
a la familia DCC.
Las slits son proteínas grandes con una función repulsiva altamente conservada
en vertebrados. Sin embargo, puede afirmarse que las slits son multifuncionales puesto
que, además, estimulan la ramificación sensorial y alargamiento de los axones. A través
de receptores de la familia Robo, cumplen funciones como el guiado de la línea media
en Drosophila y en la formación del quiasma óptico en vertebrados.
Las efrinas actúan de forma repulsiva mediante receptores de la familia Eph,
dirigiendo los axones retinianos de los vertebrados hacia sus localizaciones topográficas
apropiadas en el techo óptico por un sistema ortogonal de gradientes moleculares en la
retina y el techo.
En este trabajo nos centraremos en el papel de las semaforinas en el guiado
axonal. Algunas están unidas a la membrana y actúan a corta distancia, pero otras son
secretadas en forma soluble y pueden servir como quimiorrepelentes. Cada una de ellas
tiene una distribución única y afecta a distintos tipos de neuronas, y muchas están
presentes y activas en tejidos de neuronas, y otras en tejidos no neuronales. Los
receptores esenciales de las semaforinas son unas moléculas de la superfamilia de las
inmunoglobulinas conocidas como neuropilinas y una familia de proteínas, llamadas
plexinas, que muestran algunos aspectos estructurales de las mismas semaforinas.
3
DISCUSIÓN
•
SEMAFORINAS. FUNCION, ESTRUCTURA Y CLASES
Las semaforinas se definen por la presencia de un dominio amino-terminal. Este
se denomina “sema”, y es un dominio clave para la señalización debido a su
conservación (proteínas que sólo contienen el dominio sema son biológicamente
activas). Es una extensión de aproximadamente 500 aminoácidos que contienen 17
cisteínas conservada y una secuencia rica en cisteínas denominada Met Related (MRS)
que es la que confiere la especificad biológica. ( Raper J. 2000, Artigiani S. et al
1999).
Además del dominio sema existen otros como el PSI (plexina semaforina y
integrina), el dominio carboxi-terminal que contiene aminoácidos básicos con un
dominio de inmunoglobulina adyacente ayuda a reafirmar la unión de la clase III de
semaforinas a sus receptores, otro ejemplos pueden ser los de las clases II,III,IV y VII
donde se ha encontrado un dominio IG-like, mientras que la clase V contiene siete
dominios trombospondina. (Kruger R. et al, 2005. Raper J. 2000).
Se ha descubierto recientemente que estas regiones MRS de los dominios
extracelulares presentan homologías con proteínas de la familia de las integrinas.
(Artigiani S. et al, 1999).
Las semaforinas han sido clasificadas según sus dominios adicionales en ocho
clases y están localizadas cerca de las células que las originan (RaperJ. 2000):
•
La clase I y II se encuentran en invertebrados.
•
De las clases III a la VII se encuentran en vertebrados : De la clase IV a la
VI son transmembranas, III y VII son secretadas.Ésta última se ancla a la
superficie de la célula por acoplamiento fosfotidilinositol.
•
La clase VIII está codificada por virus.
4
Fig 1: Representación esquemática de las distintas clases de semaforinas y plexinas, con los dominios
que las componen.
Las semaforinas secretadas actúan de forma inhibitoria sobre el axón. Lo que
hacen es rodear la trayectoria del axón inhibiendo el que este tenga acceso a las zonas
que son inadecuadas. Estas funciones no sólo son cruciales durante el desarrollo del
embrión sino también en el adulto, controlando la trayectoria del axón después de una
lesión ( Artigiani S. et al, 1999).
Las semaforinas transmembranas (asociadas a glicoproteínas), pueden también
lanzar una señal al dominio extracelular ó al revés, recibir una señal, funcionando como
receptores. Los experimentos in vitro e in vivo han implicado a las semaforinas en la
dirección de alargamiento de los axones y las dendritas, así como en la ramificación del
axón, acortamiento y degeneración del axón (Raper J. 2000).
Numerosos estudios han revelado que las semaforinas, plexinas y otros factores
implicados poseen similitudes estructurales y, no solo eso, sino que también muestran
similitud en su función biológica (en el guiado de la célula), por lo que se cree que
puedan tener un origen común (Artigian i S. et al, 1999).
5
•
COMPLEJOS RECEPTORES
Se han identificado los receptores de alta afinidad de las semaforinas. Entre ellos
están las plexinas, que son una gran familia de moléculas transmembranas que se
conservan de invertebrados a humanos, y las neuropilinas (NP1 y NP2) que se
encuentran solamente en vertebrados. En el límite de la membrana de vertebrados las
semaforinas se unen directamente a las plexinas, mientras que las semaforinas
secretadas (clase 3) también requieren neuropilinas como correceptores obligatorios.
Varias evidencias indican que el dominio citoplásmico de las plexinas es requerido en la
señalización por semaforinas, mientras que el lado citosólico de las neuropilinas es
prescindible (Tamagnone L. & Comoglio P. 2004).
Fig. 2 Representación esquemática de los complejos receptores de membrana de las semaforinas.
La neuropilina-1 une a SEMA-3A, pero no a SEMA-3F, ya que lo hace la neuropilina-2
con una afinidad más alta que a SEMA-3A. Algunos estudios concluyeron que las
neuropilinas eran producidas como dímeros, estos son independientes, así la
neuropilina-1 y-2 pueden formar heterodímeros cuando son coexpresados. Estas
conclusiones sugieren que un modelo homodimérico confiere respuesta a SEMA-3A, la
neuropilina-2 homodimérica confieren respuesta a SEMA-3F, y una cooperación de
neuropilinas-1 y-2, quizás por la formación de un heterodímero, confiera respuesta a
SEMA-3C. Las neuropilinas son importantes en la determinación de la especificidad en
la actividad de la clase III de semaforinas hasta en el contexto de transformación de la
6
señal por
las plexinas. SEMA-3A inicia la desestructuración
celular cuando
la
neuropilina-1 y plexina-A1 son coexpresadas, pero no cuando neuropilina-2 y plexinaA1 son coexpresadas. A la inversa, SEMA-3F inicia el desestructurado celular cuando
neuropilina-2 y plexina-A1 son coexpresadas, pero no cuando neuropilina-1 y plexinaA1 son coexpresadas (Raper J. 2000).
Las plexinas se pueden agrupar en 4 subfamilias: A, B, C, D y son los receptores
específicos de las semaforinas. El dominio citoplásmico de las plexinas es grande (600
aa) y esta muy conservado en todos los miembro de la familia (semejanza del 57-97%)
y en la evolución (semejanza mayor del 50% entre invertebrados y seres humanos).
Aunque este dominio de la plexina no tenga homología con ninguna otra proteína, ni
posea actividad tiroxina-kinasa, el hecho de que este muy conservado sugiere que será
importante para la función biológica (papel crucial en la transducción de la señal). Los
dominios de las plexinas, tienen alfa hélices, que sirven para la interacción proteínaproteína y mediar la interacción con una molécula citosólica. Las Plexinas están
implicadas en el guiado axonal específico durante el desarrollo. Hay pruebas evidentes
de que las plexinas transforman las señales de la clase III de semaforinas cuando el
complejo con neuropilinas es muy fuerte (Artigian i S. et al, 1999).
Fig. 3 Representación esquemática de las distintas plexinas y semaforinas de vertebrados e invertebrados.
Recientemente, dos moléculas que no tienen relación con las plexinas o con las
neuropilinas, CD72 y Tim2, se encontraron para interactuar funcionalmente (aunque en
afinidad baja) con las semaforinas
transmembranas en el sistema inmune. Los
receptores en la membrana plasmática a menudo se oligomerizan en complejos, lo cuál
7
permite escoger entre diversos caminos de señalización. Los complejos receptores de
semaforinas parecen ser buenos ejemplos de estos centros de interacción. De hecho, así
como plexinas y neuropilinas, otras moléculas transmembranas se unen funcionalmente
a los receptores de semaforinas, incluyendo la molécula de adhesión celular L1, el
receptor tiroxina-kinasa OTK, y el factor de dispersión Met.
Evidencias indican que las semaforinas pueden inducir diversas respuestas
funcionales, dependiendo de las moléculas señalizadoras que se encuentran en el
complejo receptor. Por ejemplo, Sema 4D puede mediar la atracción a través de la
activación de Met, mientras que inhibe la adherencia y migración de la célula a través
de la señalización por plexinas específicas y Met independientes. Por analogía, en
respuesta a su nuevo ligando identificado, la plexina-A1, Sema 6D puede mediar
alternativamente señales atractivas o repulsivas en diversas poblaciones de células,
dependiendo de su asociación con receptores tiroxina-quinasa de los factores de
crecimiento endotelial vascular (VEGFs) o con OTK.
Las neuropilinas son
correceptores de VEGF, sin embargo, los mecanismos por los cuales las neuropilinas
cambian entre semaforinas y VEGF en la señalización son confusos. Se ha demostrado
que Sema3A compite con VEGF165 para unir a NP1 y que ello inhibe la función de
VEGF en las células endoteliales (Tamagnone L. & Comoglio P. 2004).
•
IMPLICACIONES TERAPÉUTICAS DE LAS SEMAFORÍNAS
Las semaforinas no se expresan exclusivamente en tejido nervioso en desarrollo,
sino también en tejidos adultos donde cumplen una variedad de funciones.
Recientes estudios demuestran que SEMA-3A puede inhibir la movilidad de células
endoteliales, ramificación de capilares y la formación de microvellosidades.
Estos resultados in vitro sugieren que SEMA-3A actúe como un repelente.
Estudios recientes indican, sin embargo, que SEMA-3A y otras señales de guiado,
pueden actuar como repelente o atrayente dependiendo de los niveles de cGMP en las
neuronas que actúen (Raper J. 2000).
Se ha visto que en el sistema nervioso central de mamíferos adultos se produce
una inhibición de la regeneración de los axones tras una lesión. Recientemente se ha
demostrado que Sema 3 A es un potente inhibidor de la regeneración axonal. Estos
resultados sugieren la posibilidad de usar a Sema 3 A en las lesiones medulares en
humanos. (Kaneco et al, 2007)
8
Se ha encontrado sobreexpresión de semaforinas asociadas a la invasión y
metástasis en la producción de tumores. Sema 3C está sobreexpresada en células
cancerosas resistentes a radiación y drogas citostáticas, en algunos tipos de cancer, por
ejemplo el adenoma de pulmón. Otras semaforinas secretadas, (sema3E) se encuentran
sobreexpresadas en lineas celulares metastásicas en comparación con otras lineas
celulares emparentádas pero no metastásicas. La sema 3A tiene una función antagónica
a sema 3C y sema 3B, (también implicada en la proliferación del cáncer) implicada en
la señal apoptótica de la célula (Artigian i S. et al, 1999).
Las semaforinas virales son expresadas en las células infectadas para impedir la
respuesta inmunológica, por lo tanto su descubrimiento ha sido de vital importancia en
la función de las semaforinas en el sistema inmune. Las semaforinas virales tiene
homología con semaforinas del sistema inmune endógeno(sema 7A), que es expresada
por células T. El papel de sema 7A en el sistema inmune es confuso, pero teniendo en
cuenta lo que se conoce sobre las semaforinas virales, es probable que tenga una
función importante en la interacción células T-antígeno ( Kruger R. et al, 2005).
ALGUNAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN NEUROFISIOLOGÍA
•
Técnica de hibridación in situ
La hibridación consiste en la formación de dúplex entre secuencias de DNA-
DNA, DNA-RNA o RNA-RNA, que normalmente no se encuentran asociadas.
Cuando esta técnica se realiza sobre cortes histológicos se denomina
Hibridización in situ (ISH). La ISH es una técnica relativamente reciente (1969) que
permite la demostración de secuencias de ácidos nucleicos en su propio entorno (es
decir en su localización en el interior de la célula)
Para realizar una ISH es preciso contar en primer lugar con la sonda adecuada.
Esta sonda consiste en una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia
diana que queremos demostrar. Tras realizar un pretratamiento adecuado de las
muestras, se procede a la hibridación propiamente dicha, es decir a que la sonda y la
diana se unan. Se concluye la técnica detectando (visualizando) la sonda hibridada.
9
Previamente, la sonda se sintetizará de forma específica mediante la técnica PCR
(oligonucleótidos de unas 20 bases) y se marcará , para poder detectarla posteriormente,
bien con un fluorocromo (como por ejemplo fluoresceína) o bien con una molécula que
pueda detectarse como la biotina o digoxigenina.
Se secciona el cerebro fresco y se congela rápidamente. Posteriormente se
secciona mediante un criostato el área del cerebro donde se va a aplicar la técnica. Las
secciones de cerebro se fijan con paraformaldehído al 4%. Seguidamente, las secciones
se aclaran durante toda la noche en PBS a 4 ºC, se deshidratan en una bateria de
alcoholes de gradación creciente y se permeabilizan en PBS más 1 % Tritón X-100.
Entonces se procede a la hibridación con la sonda durante toda la noche a 37 ºC. Al día
siguiente, las secciones se aclaran con SSC y se lavan con PBS. A continuación, se
realizará un tratamiento distinto, en función del marcaje, para detectar la sonda.
Si se trata de una sonda fluorescente, tras la hibridación, las muestras se someten
a microscopia de fluorescencia.
Cuando las sondas utilizadas están marcadas con
biotina, el método de detección exige tratar los cortes con un complejo avidina-biotinaperoxidasa que se une a la biotina de la sonda. Seguidamente se revela la peroxidasa
mediante agua oxigenada y diaminobenzidina. Si la sonda utilizada estaba marca con
digoxigenina, la detección se realiza mediante una técnica inmunocitoquímica
utilizando anticuerpos contra la digoxigenina, conjugados con un marcador
fluorescente, enzimático o metálico (Shepherd I. et al, 1996).
•
Cultivos de células nerviosas.
Las crías son anestesiadas con fluotano antes de ser degolladas y proceder con la
disección del cerebro. Se localiza la zona a diseccionar estereotaxicamente y es
sumergida en una solución de disección que contiene : NaCl, KCl, CaCl, Mg Cl2,
25mM HEPES a pH7,4, glucosa y sorbitol a 37º C.
Dependiendo de la zona a diseccionar se procede de distinta manera. Los fragmentos de
tejido son transferidos a un frasco de cultivo con una solución enzimática, para eliminar
las posibles uniones entre células. El frasco se coloca bajo un baño de agua a 37º C y se
agita suavemente durante un tiempo. Con una pipeta Pasteur
de punta fina, se
transfieren los fragmentos de tejido a un tubo estéril. Se aclara (se aspira y suelta) el
tubo con el medio de cultivo en el que se ha hecho la disección.
10
Se coge una alícuota, y se tritura el tejido, después se centrifuga y retira el sobrenadante,
repitiendo la operación según el estudio a realizar, triturando cada vez más
vigorosamente. El resultado es una cantidad determinada de suspensión de células, que
se cuentan con un hemocitómetro. Se preparan placas con una determinada cantidad de
suspensión y se incuban a 37º C con CO2 del 5%.
Una vez que tenemos conservadas las células en suspensión, las cultivamos en un medio
que permite su crecimiento. Suele utilizarse suero ( factores de crecimiento, hormonas y
proteínas, factores de adhesión e inhibidores de proteasas, antibiótico y antifúngico). El
medio de cultivo es un preparado comercial, que contiene aminoácidos ,
oligoelementos, vitaminas, carbohidratos, glucosa, soluciones salinas, bicarbonato
sódico e indicador de pH. (Matthews C. et al, 2007).
•
Técnica inmunocitoquímica.
Las técnicas inmunocitoquímicas, son aquellas en las que se emplean anticuerpos, el
tipo IgG es el comúnmente utilizado en inmunocitoquímica. En ocasiones se utilizan
también IgM marcados, para detectar sustancias específicas, antígenos o inmunógenos,
contenidas en las células.
Para desarrollar las técnicas inmunocitoquímicas en el laboratorio se recurre a la
adquisición de anticuerpos. En función del método utilizado para su producción se
distingue entre los anticuerpos monoclonales, clones de linfocitos B que reconocen un
único epítopo, y los policlonales, que reconocen varios epítopos.
Para detectar el antígeno del estudio se marcan los anticuerpos bien por métodos
directos (conjugado directamente con fluorocromo o enzimas como la peroxidasa de
rabano o el complejo ABC) o indirectos (muy utilizado para amplificar la señal, donde
un anticuerpo secundario marcado reconoce a uno primario):
El
procedimiento
inmunohistoquímica
convencional
consiste
en:
que
se
Generalmente
realiza
se
para
perfunde
el
técnicas
de
animal
en
paraformaldehído al 4%. Seguidamente, se secciona el cerebro ya fijado en un criotomo
o criostato en secciones del grosor que nos interese, normalmente 30-50 micras, se
recogen en PBS, se permeabilizan en PBS que contiene Tritón X-100 1% y se bloquean
11
con BSA o suero de animales Después las secciones se lavan en buffer fosfato salino
(PBS). La inhibición de la peroxidasa endógena tisular se hace
con peróxido de
hidrógeno al 0.3% dando un producto con una coloración marrón, insoluble y estable.
Luego se lavan las muestran en PBS, se incuban con suero bloqueante o BSA durante 1
hora. La incubación con el anticuerpo primario es a temperatura ambiente durante toda
la noche. Tras dos lavados en PBS se incuban con el anticuerpo secundario biotinilado o
con fluorocromo durante 1-2 horas. Se procede a nuevos lavados en PBS y se incuban
durante 45' con el complejo ABC kit para finalmente exponer las muestran al revelado
durante 5' con diaminobencidina y 0.2 % de peróxido de hidrógeno en 50mM buffer
Tris, ph 8. (Shepherd I. et al, 1996).
BIBLIOGRAFÍA
Armengol. J.A. y MIñano, F.J. Bases experimentales para el studio del sistema nervioso.
Vol. 1, Cap.2 y 3. Servicio de publicaciones de la Universidad de Sevilla.
Artigiani S., Comoglio P. and Tamagnone L. Plexins, Semaphorins, and Scatter Factor
Receptors: A Common Root for Cell Guidance Signals? 477–482, (1999).
Dickson B., Molecular Mechanisms of Axon Guidance SCIENCE VOL 298 6
DECEMBER 2002 (1959-1963)
Matthews C. , Shaw J. Hooper J. , Young I. Crouch M. and Campbell H. Expression
and evolution of the mammalian brain gene. Ttyh1Journal of Neurochemistry, 100,
693–707(2007).
Kandel, E. , Schwartz J. & Jesse T. Principios de neurociencia Ed. McGraw-Hill /
INTERAMERICANA DE ESPAÑA, S.A.U. 2001.
Kaneco S, Iwanami A, Nakamura M, Kishino A, Kikuchi K, Shibata S, Okano HJ,
Ikegami T, Moriya A, Konishi O, Nakayama C, Kumagai K Kimura T, Sato Y, Goshima
Y, Taniguchi M, Ito M, He Z, Toyama Y, Okano H. A selective Sema 3A inhibitor
12
enhances regerative responses and functional recovery of the injured spinal cord.
Nature Medicine 251-5 (2007)
Kruger*. R.. , Aurandt J. and Guan K. Semaphorins command cells to move vol 6
october 789-800 (2005).
Raper. J. Semaphorins and their receptors in vertebrates and invertebrates Current
Opinion in Neurobiology 10, 88–94 (2000).
Shepher. I. , Luo Y. ,Raper J. and Chang S. The Distribution of Collapsin-1 mRNA in
the Developing Chick Nervous System Article No. 0016
developmental biology 173, 185–199 (1996)
Tamagnone. L. & Comoglio P. To move or not to move? Semaphorin signalling in cell
migration EMBO reports VOL 5 NO 4 European molecular biology organization 356361 (2004 ).
http:// dieumsnh.qfd.umich.mx/patología_pract/pagina_nueva_1htm
http://
Server.nat.es/histología/docencia/HMA2005/temasteoria/tema5/T5index.html-
26k-
13