A primera instancia, las extremidades de los vertebrados están

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE
MÉXICO.
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS.
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.
LA EXPRESIÓN Y REGULACIÓN DE SMAD8, Y LA ACTIVACIÓN
DE LAS R-SMADS DE BMPS EN LA ZONA NECRÓTICA
ANTERIOR, SUGIEREN LA ACTIVACIÓN DE UNA CASCADA
MOLECULAR INDUCIDA POR LAS BMPS QUE CULMINA EN LA
MUERTE CELULAR PROGRAMADA.
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS
PRESENTA: RENÉ FERNANDO ABARCA BUIS.
EL PRESENTE TRABAJO SE REALIZÓ BAJO LA DIRECCIÓN DEL DR.
JESÚS CHIMAL MONROY.
COMITÉ TUTORAL:
DR. HORACIO MERCHANT LARIOS.
DR. LUIS FERNANDO COVARRUBIAS ROBLES.
2012
1
AGRADECIMIENTOS.
Este trabajo se realizó bajo la dirección y en el laboratorio del Dr. Jesús Chimal Monroy
del departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental del Instituto de
Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).
Este trabajo fue parcialmente financiado por los fondos otorgados por el Consejo Nacional
de Ciencia y Tecnología (CONACYT) a los proyectos 53484, 42568-Q y 34334-N, por la
Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) de la UNAM a los
proyectos IN220808, IN200205, IN218104, IN216701 y IX200410 y al programa de Apoyo
a los Estudios de Posgrado (PAEP) de la UNAM al proyecto 20201 otorgados al Dr. Jesús
Chimal Monroy.
También se recibió fondos del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e
Innovación Tecnológica (PAPIIT) al proyecto IN220808 otorgado a René Fernando Abarca
Buis.
Agradezco:
Al CONACYT por la beca para realizar estudios de posgrado con número de registro
166622 y por la beca 14107 del proyecto CB-2007/84683 otorgado al Dr. David
Garciadiego Cázares.
A la Dirección General de Estudios de Posgrado UNAM por la beca otorgada para realizar
estudios de posgrado.
A los revisores y jurado de este trabajo: Dr. Jaime Iván Velasco Velázquez, Dra. Marina
Macías Silva, Dr. Ernesto Maldonado, Dr. Enrique Salas Vidal y Dr. Jesús Chimal Monroy.
Al Dr. Jesús Chimal Monroy por su dirección, asesoría y colaboración.
Al Dr. Horacio Merchant Larios y al Dr. Luis Covarrubias, miembros del Comité Tutorial,
por su asesoría.
A la Maestra en Ciencias Marcia Bustamante Zepeda por su asistencia técnica.
2
Al Biólogo Dante Aguilar Fernández-Lara por su apoyo en la realización de los
experimentos de inyección de vasos sanguíneos con CellTracker y al experimento de
pulsos con BMP7.
A la Dra. Marina Macías Silva por su colaboración y donación del plásmido pCMVAlk2KR.
Al Dr. Jesús Ramírez por la inserción y clonación de la secuencia ALk2KR al plásmido
pCX-IG.
Al Dr. Kerby Oberg por la donación del plásmido pCX-GFP y pCX-IG.
Al Maestro en Ingeniería Raúl Ruvalcaba Morales del Centro de Ciencias Aplicadas y
Desarrollo Tecnológico (CCADET) de la UNAM por la construcción del electroporador.
Al Dr. Horacio Merchant Larios y a la Maestra en Ciencias Silvia Reyes por su apoyo en la
captura de imágenes de microscopia confocal.
Al Dr. Edgar Krötzsch Gómez del Centro Nacional de Atención a Quemados por su apoyo
y asesoría en el uso del microscopio de fluorescencia.
Al Candidato a Dr. Miguel Tapia Rodríguez del Instituto de Investigaciones Biomédicas
por su apoyo en el uso del microscopio de fluorescencia.
Al Dr. David Garciadiego por sus sugerencias y recomendaciones.
A la licenciada Lucía Brito Ocampo y María Petra Muñoz García por su apoyo
bibliotecario.
Al Biólogo Alejandro Farrera Hernández por el diseño y realización de la figura 1.
A Laura Elena Valverde Islas, Fernando Abarca Valverde y María Esther Abarca Buis por
su apoyo invaluable.
3
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS…………………………………………………………….....….7
RESUMEN…………………………………………………………………………….…...….10
ABSTRACT………………………………………………………………………….…..…….11
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….…..…...12
La muerte celular programada contribuye a la formación de la extremidad…….....12
Las áreas de muerte celular programada durante el desarrollo de la
extremidad presentan rasgos característicos de la apoptosis………………............19
La señalización de los miembros de la superfamilia del Factor de
Crecimiento Transformante (TGF) promueve distintas respuestas
celulares……………………………………………………………………………..……..27
La señalización mediada por las BMPs regula la muerte celular
programada durante la morfogénesis de la extremidad………………………………32
Otras señales regulan la muerte celular programada durante el
desarrollo de la extremidad………………………………………………………...…….41
JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………….……......45
HIPÓTESIS…………………………………………………………………………….….......46
OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………….………….46
OBJETIVOS PARTICULARES………………………………………………….………......46
MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………….…………......48
Manipulación de los embriones………………………………………….………………48
Sondas generadas a partir de cDNA de extremidades de pollo en desarrollo.....….48
Hibridaciones in situ Whole Mount y en cortes histológicos……………………..…...49
Aislamiento de tejido interdigital……………………………………………………..…..49
Electroporación…………………………………………………………………..………..50
Tinción para visualizar la muerte celular y expresión de transcritos por
hibridación in situ en Whole Mount……………………………………………..….……50
Tinción para visualizar la muerte celular y los vasos sanguíneos………..………….50
Tinción con Rojo Neutro………………………………………………………..………...51
4
Inmunofluorescencia para Caspasa 3 activa y doble marcaje con
Inmunofluorescencia para fosfo-SMAD1/5/8 y TUNEL…………………….…...…….51
Análisis cuantitativo de fosfo-SMAD1/5/8 y células positivas a TUNEL…....……….52
RESULTADOS………………………………………………………………………...……...53
Alk2 es expresado en el mesodermo interdigital de la extremidad
posterior del pollo…………………………………………………………..………...…...53
La transfección de la forma dominante negativa de ALK2 en el
interdígito de la extremidad del pollo no modificó la muerte celular
programada………………………………………………………………………..……….55
La expresión de Alk2 es regulada por la señalización FGF…………………………..57
La expresión de las R-SMADs de BMPs es diferencial y dinámica………………….61
El patrón de expresión de Smad8 precede al patrón de la muerte celular………….64
La expresión de Smad8 es regulada en la ANZ por BMP7……………………..…....66
El ácido retinoico promueve la muerte celular y regula la expresión
de Smad8 en el mesodermo anterior de la extremidad posterior del
pollo en etapas 25 y 26…………………………………………………………….….....67
SHH inhibe la expresión de Smad8 en el mesodermo anterior y la
promueve en el mesodermo posterior del primordio de la extremidad
posterior del pollo………………………………………………………………………....68
Las células de la ANZ no expresan Smad8 ni presentan las formas
fosforiladas de las R-SMADs de BMPs………………………………………….……...71
La señalización de las BMPs promueve una cascada molecular que
culmina en la muerte celular de la ANZ…………………………………………..….....75
Las células de la ANZ se localizaron en el tejido avascular de la extremidad……..77
DISCUSIÓN…………………………………………………..………………………..……...79
CONCLUSIONES……………………………………………………………………………..91
PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………...92
REFERENCIAS…………………………………………………………………………….…93
GLOSARIO……...……………………………………………………………………………102
5
ANEXO
Transfección del Tejido Interdigital del Pollo por Microelectroporación
Confinada de Bajo Costo……………………………………………………………..…107
6
LISTA DE ABREVIATURAS.
ActRII = Activin Receptor type II; Receptor tipo II de Activinas.
ActRIIB = Activin Receptor type IIB; Receptor tipo II de Activinas.
AER = Apical Ectodermal Ridge; Cresta Ectodérmica Apical.
AIF = Apoptosis Inducing Factor; Factor Inductor de la Apoptosis.
ALK = Activin Like Kinase.
AMNZ = Anterior Marginal Necrotic Zone; Zona Necrótica Marginal Anterior.
ANZ = Anterior Necrotic Zone; Zona Necrótica Anterior.
APAF1 = Apoptosis Protease–Activating Factor.
ATP = Adenosine Triphosphate; Trifosfato de Adenosina.
BAK = BCL2 Homologous Antagonist/Killer.
BAMBI = BMP and Activin membrane-bound inhibitor.
BAX = BCL2 Associated X Protein.
BCL-XL = B-Cell Lymphoma-Extra Large.
BCL2 = B-Cell Lymphoma-2; Proteína 2 del Linfoma de células B.
BH = BCL2 Homology Domain; Dominio de Homología de BCL2.
BID = BCL2 Interacting Domain; Dominio de Interacción con BCL2.
BIM = BCL2 Interacting Mediator of Cell Death.
BMP = Bone Morphogenetic Protein; Proteína Morfogenética del Hueso.
BMPRIA = BMP Receptor Type IA; Receptor Tipo IA de BMP.
BMPRIB = BMP Receptor Type IB; Receptor Tipo IB de BMP.
BMPRII = BMP Receptor type II; Receptor tipo II de BMP.
CAD = Caspase-Activated DNase; DNasa Activada por Caspasas.
CARD = Caspase Activation and Recruitment Domain.
cDNA = Complementary DNA; DNA complementario.
CD 95 = Cluster of Differentiation 95.
COL2 = Collagen type II; Colágena tipo II.
DAN = Differential Screening-selected gen Aberrative in Neuroblastoma.
DAPI = 4’, 6-diamidino-2-phenylindole; 4’, 6-diamino-2-fenilindol.
DcR = Decoy Receptor.
CDMP = Cartilage Derived Morphogenetic Protein; Proteína Morfogenética Derivada del
Cartílago.
DED = Death Effector Domain; Dominio Efector de Muerte.
7
DKK = Dickkopf Protein.
DNA = Deoxyribonucleic Acid; Ácido Desoxirribonucleico.
DNasa = Desoxirribonucleasa.
DNasa IIB = DNasa II Beta.
dpc = días post coito.
DR = Death Receptor; Receptor de Muerte.
Endo G = Endonuclease G; Endonucleasa G.
ERK = Extracellular-signal-Regulated Kinase.
FasL = Fas Ligand; Ligando de Fas.
FGF = Fibroblast Growth Factor; Factor de Crecimiento Fibroblástico.
FLIP = FLICE-like Inhibitory Protein.
FOXG1 = Forkhead box G-1.
fpp = foyer préaxiale primaire.
gbb-60A = glass bottom boat-60A.
GDF = Growth Differentiation Factor; Factor de Crecimiento y Diferenciación.
HOXC8 = Homeobox Protein-8.
ID1 = Inhibitor of DNA binding-1.
INZ = Interdigital Necrotic Zone; Zona Necrótica Interdigital.
JNK = c-Jun-N terminal Kinase.
L-DNasa II = Acid cation-independent DNase II.
MAPK = Mitogen-Activated Protein Kinase.
MCL1 = Myeloid Cell Leukemia.
MH = Mad Homology.
MSX1 = Msh Homeobox-1.
MyoD = Myogenic differentiation-1.
NKX 2.5 = NK2 Homeobox-5.
OP = Osteogenic Protein; Proteína Osteogénica.
OPN = Osteopontin; Osteopontina.
PCD = Programmed Cell Death; Muerte Celular Programada.
PMNZ = Posterior Marginal Necrotic Zone; Zona Necrótica Marginal Posterior.
PNZ = Posterior Necrotic Zone; Zona Necrótica Posterior.
PRX1 = Peroxiredoxin-1.
PUMA = p53 Upregulated Modulator of Apoptosis.
RA = Retinoic Acid; Ácido Retinoico.
RAR = Retinoic Acid Receptor; Receptor del Ácido Retinoico.
8
RCAS = Replication-Competent Avian Virus Sarcoma Leucosis Long Terminal Repeat
with a Splice Acceptor.
RNA = Ribonucleic Acid; Ácido Ribonucleico.
RT-PCR = Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction.
RXR = Retinoid X Receptor.
SAMNZ = Sub AER Marginal Zone; Zona Marginal Subyacente a la AER.
SBE = SMAD Binding Element; Elemento de Unión de las SMADs.
SHH = Sonic Hedgehog.
SIP1 = SMAD-Interacting Protein-1.
SMAC = Second Mitochondrial-derived Activator of Caspase.
SMAD = Combinación de los nombres de dos proteínas homólogas; la proteína Sma (S)
de Caenorhabditits elegans y de la proteína Mothers Against Decapentaplegic (MAD) de
Drosophila melanogaster.
TAK = TGF Activated Kinase.
TGF = Transforming Growth Factor-; Factor de Crecimiento Transformante-.
TUNEL= Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling.
VGFR2 = Vascular Growth Factor Receptor-2; Receptor 2 del Factor de Crecimiento
Vascular.
YY1 = Yin Yang-1.
ZPA = Zone of Polarizing Activity; Zona de Actividad Polarizante.
ZVAD-FMK
=
Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp
(OMe)
Fluoromethylketone;
Benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp (OMe) Fluorometilcetona.
4-OOHCPA = 4-Hydroperoxiciclofosfamide; 4-Hidroperoxiciclofosfamida.
9
RESUMEN.
Las Proteínas Morfogenéticas del Hueso (BMPs) son importantes reguladores de la
Muerte Celular Programada (PCD) durante el desarrollo de las extremidades de los
vertebrados amniotas. Patrones de expresión y experimentos de funcionalidad han
involucrado a tres receptores tipo I que median la señal de las BMPs en la morfogénesis
de la extremidad del pollo. BMPRIA/ALK3 promueve la muerte celular interdigital mientras
que BMPRIB/ALK6 y ALK2 promueven la condrogénesis del esqueleto apendicular.
Aunque Alk2 se expresa en el mesénquima indiferenciado durante el desarrollo del ala del
pollo no se ha evaluado su función durante la PCD. Las proteínas SMAD1, SMAD5 y
SMAD8 son transductores de la vía canónica de las BMPs. Smad1 y Smad8 se expresan
en el interdígito de la extremidad del pollo y la fosforilación de SMAD1 se incrementa
durante la regresión interdigital, sin embargo, no ha sido demostrada aún su participación
en la regulación de la muerte celular. En este trabajo se evaluó por hibridación in situ la
expresión de Alk2, Smad1, Smad5 y Smad8 durante el desarrollo de la extremidad del
pollo y la posible función de ALK2 en la muerte interdigital electroporando la forma
dominante negativa del receptor. Alk2 se expresó endógenamente en el mesénquima
interdigital antes y durante la regresión interdigital de la extremidad posterior del pollo. Sin
embargo, la sobreexpresión de la forma dominante negativa del receptor no alteró el
patrón de muerte celular. Smad1 se expresó en el mesénquima indiferenciado y en los
tendones en desarrollo. Los transcritos de Smad5 se visualizaron en la Cresta
Ectodérmica Apical (AER) y en la región posterior del primordio de la extremidad. Smad8
se expresó específicamente en el mesénquima anterior vascular, subyacente a la Zona
Necrótica Anterior (ANZ) y en el tejido interdigital. La implantación de perlas embebidas
con BMP7 o con Ácido Retinoico, los cuales actúan como factores promotores de la PCD,
incrementó el área de expresión de Smad8 en el mesénquima anterior, mientras que la
implantación de perlas embebidas con SHH, que actúa como un factor de sobrevivencia
en esa región restringió la expresión de Smad8 al mesénquima anterior proximal. Sin
embargo, las formas fosforiladas de SMAD1/5/8 no colocalizaron con las células
apoptóticas en la ANZ ni en el mesénquima interdigital, y un pulso de solo 4 horas de
liberación de BMP7 en la ANZ fue suficiente para promover la muerte celular. Estos
resultados sugieren que la señalización de las BMPs dispara una cascada molecular que
culmina en la PCD.
10
ABSTRACT.
The Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are important regulators of Programmed Cell
Death (PCD) during limb development of amniotes vertebrates. Expression patterns and
function experiments have involved three type I receptors that mediate signaling of BMPs
during chick limb morphogenesis. BMPRIA/ALK3 promotes the interdigital cell death while
BMPRIB/ALK6 and ALK2 promotes chondrogenesis from appendicular skeleton. Although
Alk2 is expressed in undifferentiated mesenchyme during chick wing development, its
function has not been evaluated during PCD. The proteins SMAD1, SMAD5 and SMAD8
are transducers of canonical pathway of BMPs. Smad1 and Smad8 are expressed in the
interdigital tissue of chick limb and the phosphorilation of SMAD1 is increasing during
interdigital regression, However, has been not demonstrated its participation in regulation
of the cell death. In this work was evaluated, by Hybridization in situ, the expression of
Alk2, Smad1, Smad5 and Smad8 during development of chick limbs and the possible
function of ALK2 in interdigital cell death by electroporating of the receptor defective in
kinase domain. The endogenous expression of Alk2 was detected in the interdigital
mesenchyme before and during interdigital regression of the posterior chick limb, however,
overexpression of the receptor defective in kinase domain didn´t alters the cell death
pattern. Smad1 was expressed in the undifferentiated mesenchyme and developing
tendons. The transcript of Smad5 was visualized in the Apical Ectodermal Ridge (AER)
and in posterior region of limb bud. Smad8 was expressed specifically in the vascular
anterior mesenchyme, underlying to Anterior Necrotic Zone (ANZ) and in interdigital tissue.
Implantation of beads soaked in BMP7 and in Retionic Acid, which act as promoters
factors of PCD, showed increased in the expression area of Smad8 in the anterior
mesenchyme, while implantation of beads soaked in SHH, that acts as a survivor factor in
this region, resulted in expression of Smad8 restricted to the proximal anterior
mesenchyme. However, the phosporylated SMAD1/5/8 were not localized with apoptotic
cells in ANZ neither in the interdigital mesenchyme, and a pulse of just four hours of BMP7
release was enough to promote cell death. These results suggest that BMP signaling
triggers a molecular cascade that culminates in PCD.
11
INTRODUCCIÓN.
La muerte celular programada contribuye a la formación de la extremidad.
Las extremidades de los vertebrados están adaptadas al tipo de hábitat y comportamiento
de los individuos que las poseen, resultando en una amplia diversidad en formas,
tamaños y orientaciones. Aunque la mayoría de las extremidades derivan de un ancestro
pentadactílico, cada una se ha modificado a lo largo de la evolución adquiriendo ciertos
rasgos específicos. La palma robusta y los dedos largos del orangután arbóreo
contribuyen a generar el impulso requerido para su desplazamiento entre las ramas, el ala
del murciélago tiene dedos largos y delgados para soportar al patagio (tejido tegumentario
que constituye al ala) y un pulgar corto para aferrarse, la pezuña de la cebra está reducida
a un solo dedo, confiriéndole un desplazamiento veloz y el delfín posee aletas óseas cuya
forma permiten un movimiento equilibrado y con dirección a través del agua (Gore et al,
2003).
El plan anatómico de las extremidades que es compartido por todos los tetrápodos y
que refleja su origen común está constituido por el estilópodo, el zeugópodo y el
autópodo. El estilópodo es la región anatómica más proximal a la pared del cuerpo y
está representado por el húmero en la extremidad anterior y el fémur en la extremidad
posterior, el zeugópodo es la región media de la extremidad y se reconoce principalmente
por dos elementos esqueléticos; el radio y la ulna en la extremidad anterior y la tibia y la
fíbula en la extremidad posterior. Finalmente, el autópodo es la región que constituye a
todos los elementos esqueléticos mas distales y comprenden a los metacarpos, los
carpos y las falanges de las extremidades anteriores y a los tarsos, metatarsos y dedos
de las extremidades posteriores (Fig. 1) (Gilbert, 2003).
El desarrollo de la extremidad inicia con el surgimiento de un par de pequeñas
protuberancias a los costados del embrión cuyo crecimiento y alargamiento genera a las
extremidades anteriores y posteriores (Fig. 1). En el caso del pollo, que es un organismo
modelo ampliamente utilizado para estudiar la morfogénesis de la extremidad, las
protuberancias ó primordios surgen a nivel de las somitas 15 a 20 y 26 a 30 en donde se
establecerán respectivamente las alas y las patas (Gilbert, 2003). En el ratón, los
primordios de las extremidades anteriores protruyen a nivel de las somitas 7 a 12 y los
12
FIGURA 1. Las extremidades de los tetrápodos están conformadas por tres estructuras anatómicas.
El recuadro de la derecha muestra una fotografía del primordio de la extremidad del pollo en etapa 22-23.
La forma de este primordio es muy similar al de los otros vertebrados cuando pasan por una etapa
equivalente del desarrollo. Conforme avanza el desarrollo, las extremidades de cada especie adquieren sus
características distintivas. Las extremidades de todos los vertebrados pueden dividirse en tres regiones
anatómicas distintas: el estilópodo, el zeugópodo y el autópodo. Las extremidades pueden ubicarse en tres
planos espaciales diferentes; el eje anterior-posterior, el eje proximal-distal y el eje ventral-dorsal.
13
primordios de las extremidades posteriores surgen a nivel de las somitas 23-28
(Fernandez-Teran et al., 2006). Estas protuberancias empiezan a observarse a partir de la
etapa 19 durante el desarrollo del pollo y a los 9.5 a 10 días post coito (dpc) en el ratón y
van elongándose durante las subsiguientes etapas del desarrollo hasta adquirir su
morfología definitiva en etapa 33 en el pollo (Hamburger and Hamilton, 1992) y a los 16.5
dpc en el ratón.
Inicialmente, los primordios de las extremidades pueden considerarse histológicamente
como un grupo de células de origen mesodérmico cubiertas por ectodermo. La interacción
existente entre el mesodermo y el ectodermo distal permite el crecimiento de la
extremidad en una dirección proximal a distal (Saunders, 1948). El ectodermo distal es un
epitelio pseudoestratificado y por lo tanto engrosado al que se le ha denominado Cresta
Ectodérmica Apical (AER). La AER limita la región dorsal de la ventral del primordio de la
extremidad (Fig. 2).
Las moléculas emanadas de la AER, responsables de la
sobrevivencia del mesodermo y del crecimiento del primordio, pertenecen a los miembros
de la familia del Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), en los que se destaca el FGF8
y el FGF4. El Fgf8 se expresa a todo lo largo de la AER (Fig. 2) y los transcritos de Fgf4
son expresados en su región posterior. La evidencia de que la AER permite y establece el
patrón y el crecimiento próximo distal de la extremidad proviene del retiro experimental de
esta estructura en diferentes etapas del desarrollo. Cuando la AER es eliminada en las
fases iniciales de la formación del primordio, la extremidad se trunca completamente, pero
si es eliminada en las etapas subsiguientes genera solo la formación de estructuras
proximales. Así, el nivel de truncamiento próximo distal de la extremidad se ve afectada
dependiendo en qué etapa del desarrollo es eliminada la AER; entre más tardíamente es
eliminada, la extremidad formada presentará elementos más distales. Estos resultados
revelan que el estilópodo, que es la región más proximal es formado primero, seguido del
zeugópodo y finalmente del autópodo, que es la región anatómica más distal de la
extremidad (Fig. 1). El autópodo es la región que más diversificación y segmentación
morfológica presenta entre las clases de vertebrados e inclusive entre los miembros de
estas mismas clases. Muchas de estas diferencias se reflejan en el número, la forma, la
distribución y el tamaño de los dedos de cada especie, así como en la presencia de otras
características morfológicas tal como la presencia de una membrana interdigital (Fig. 3 D).
En los mamíferos terrestres la membrana interdigital está presente casi exclusivamente
en el murciélago, mientras que en los cetáceos su persistencia contribuye al
establecimiento y estructura anatómica de las aletas (Richardson and Oelschlager, 2002;
14
Weatherbee et al., 2006). Varias especies de aves nadadoras presentan una membrana
interdigital que les permite aumentar la superficie de contacto de sus patas con el agua
(Cassan, 2006). La ausencia de la membrana interdigital es resultado, en gran parte, de la
muerte celular programada (PCD) durante las etapas finales del desarrollo de la
extremidad de los reptiles, las aves y los mamíferos (Fallon and Cameron, 1977).
FIGURA 2. Centros organizadores del eje próximo-distal y antero-posterior. En la fotografía de la
izquierda se muestra la expresión de fgf8 en la AER. Esta molécula dirige el eje próximo distal de la
extremidad. En la fotografía de la derecha se observa la expresión de Shh, un marcador de la ZPA, que
dirige el establecimiento de la polaridad anterior-posterior de la extremidad. Ambos primordios corresponden
a la extremidad posterior del pollo en desarrollo en etapa 23-24.
Durante estas etapas finales del desarrollo de las extremidades de los vertebrados
amniotas se presenta una membrana interdigital que une a los dedos en formación y
crecimiento. Sin embargo y dependiendo de la especie, esta membrana es eliminada por
PCD o bien sobrevive y crece para permanecer durante toda la vida del animal. Así, en
especies con dedos separados como el lagarto, el pollo, el ratón y el humano, la muerte
celular ocurre en el interdígito, mientras que en especies con extremidades palmeadas tal
como el pato y algunas especies de tortugas, la PCD sólo se limita a la región distal del
interdígito. Autópodos con morfología particular tal como la extremidad del somorgujo
(Podiceps sp) o la focha (Fulica sp) que presentan lobulaciones interdigitales, o la
prolongada hendidura del camaleón entre los dedos tres y cuatro correlaciona con el
patrón de muerte o sobrevivencia celular que presenta el mesodermo interdigital (ZuzarteLuis and Hurle, 2005). La eliminación de la zona interdigital en el pollo se detecta a partir
de la etapa 30 y prosigue hasta la etapa 34 del desarrollo embrionario de este animal (Fig.
3 D), mientras que en el ratón esta muerte interdigital es evidenciada de los 13 a los 14.5
días de desarrollo (Hamburger and Hamilton, 1992).
Particularmente en las aves, la muerte celular programada no solo contribuye a la
morfogénesis final del autópodo sino a la de toda la extremidad. Además de la membrana
15
interdigital, otras áreas de PCD pueden reconocerse durante el desarrollo temprano de la
extremidad de las aves. Estas áreas se localizan en el mesénquima central, anterior y
posterior de la extremidad en desarrollo y se denominan Parche Opaco, Zona Necrótica
Anterior (ANZ) y Zona Necrótica Posterior (PNZ), respectivamente (Fig. 3). El Parche
FIGURA 3. Áreas de muerte celular durante el desarrollo de la extremidad del pollo. A; Corte
histológico longitudinal de la extremidad posterior del pollo en etapa 24 en el que se muestra la ANZ (flecha)
y el OP (cabeza de flecha). B; Primordio del ala del pollo en etapa 25 teñida con Rojo Neutro. La flecha
señala a la PNZ (flecha). El patrón de muerte se observa por el patrón puntuado de color rojo. C; Primordio
del ala del pollo en etapa 25 teñida con Rojo Neutro en la que señala a la ZNA (flecha). D; Patrón de muerte
celular interdigital de la extremidad posterior del pollo evidenciado por la tinción con Rojo Neutro (flecha).
Opaco se ha asociado a la separación existente entre los elementos esqueléticos del
zeugópodo, ya sea la separación entre el radio y la ulna ó entre la tibia y la fíbula,
contribuyendo a la identificación de estos elementos como unidades individuales. Esta
área de muerte aparece en la etapa 24 y persiste hasta la etapa 25 durante el desarrollo
de la extremidad del pollo (Fig. 3 A) y a los 11 y 12.5 dpc en el ratón. Algunos estudios
sobre la morfogénesis de la extremidad indican que las células de la región media de la
condensación pre-cartilaginosa que forma al futuro zeugópodo de la extremidad, son
eliminadas por PCD. Este proceso resulta en la separación de dos agregaciones que
inician su diferenciación hacia elementos cartilaginosos que finalmente establecerán los
16
dos elementos óseos independientes (Zuzarte-Luis y Hurle, 2005; Fernandez-Teran et al.,
2006). La zona necrótica anterior (ANZ) se logra evidenciar a partir de la etapa 21 en el
ala y en la 22 en la pata. Esta área se observa por la tinción del mesodermo superficial
anterior de la extremidad con colorantes vitales tales como el Rojo Neutro o el Azul Nilo
(Fig. 3 A, C). La ANZ persiste y va eliminando al mesodermo en una dirección proximal a
distal hasta la etapa 30 en el ala y hasta la etapa 28 en la pata. El patrón de muerte
celular del mesodermo anterior correlaciona estrechamente con el contorno anterior
esculpido en ambas extremidades. En etapa 31, se evidencian los rayos digitales que son
las condensaciones cartilaginosas alargadas correspondientes a los dedos, intercalados
por la membrana interdigital. Finalmente, la ANZ reaparece esculpiendo el borde del dedo
anterior de la extremidad anterior y posterior (Saunders and Gasseling, 1962; FernandezTeran et al., 2006). La zona necrótica posterior (PNZ) se observa a partir de la etapa 23
en ambas extremidades y al igual que la ANZ su patrón tiende a eliminar primero a la
región proximal del mesodermo superficial posterior y conforme la extremidad se elonga
va esculpiendo a la zona distal posterior hasta la etapa 29 (Fig. 3 B). Durante la formación
del autópodo en etapa 31, la PNZ esculpe el contorno del dedo posterior por la
eliminación del mesodermo posterior adyacente (Saunders y Gasseling, 1962, FernándezTerán et al., 2006).
Debido a que los vertebrados provienen de un ancestro pentadactílico se ha sugerido
que durante la evolución de las aves el número de los dedos se ha reducido de cinco a
tres en el ala y a cuatro en la pata. Observaciones realizadas durante el desarrollo de
aves mutantes que presentan polidactilia tal como talpid2 o diplopodia-5 han permitido la
asociación de la ANZ y de la PNZ con la reducción en el número de dedos en aves,
debido a que durante su desarrollo, las extremidades mutantes carecen de estas áreas de
muerte celular lo que permite que el tejido mesenquimal sobreviva y logre diferenciarse a
cartílago para formar dedos adicionales (Hinchliffe and Thorogood, 1974; Dvorak and
Fallon, 1991; Coelho et al., 1993). Contrariamente a la ANZ y a la PNZ en el pollo, en el
ratón solo se detecta un área de muerte celular en el mesodermo anterior que aparece
justo cuando inicia el establecimiento del autópodo. Esta área denominada foyer préaxiale
primaire (fpp) es evidente a los 12 dpc para la extremidad anterior y a los 11.5 dpc para la
posterior (Fig. 4) (Milaire, 1971). Se ha sugerido que esta área disminuye su densidad a
solo una línea marginal subyacente al ectodermo anterior que es evidente a los 13 y 13.5
dpc para la extremidad anterior y posterior respectivamente. A esta área se le ha
denominado, en esta etapa del desarrollo, como Zona Necrótica Marginal Anterior (AMNZ)
17
(Milaire, 1992) (Fig. 4). Concomitantemente, aparece un área muy estrecha en el
mesodermo superficial que se extiende junto con la AMNZ hacia todo el margen distal
que bordea al autópodo subyacente a la AER. Al área de muerte celular localizada
posteriormente se le denomina Zona Necrótica Marginal Posterior (PMNZ) y a toda la
banda periférica de células muertas que rodea distalmente al autópodo se le ha
denominado Zona Marginal Subyacente a la Cresta Ectodérmica Apical (SAMZ) (Fig. 4)
(Milaire, 1992; Fernández-Terán et al., 2006). Se ha sugerido que a partir de la SAMZ se
extiende el área de muerte hacia el mesodermo interdigital para su eliminación. Debido a
que la ANZ y la PNZ del pollo se evidencian mucho antes que la AMNZ y la PMNZ del
ratón y se ha asociado a estas últimas solo con la morfogénesis del autópodo del ratón y
no de toda la extremidad. Se ha considerado que las áreas necróticas del ratón y del pollo
no son similares con respecto a su función moldeadora del zeugópodo. Sin embargo, la
persistencia de estas áreas durante la formación del autópodo del pollo adyacentes a los
dedos axiales, de manera similar a la AMNZ y a la PMNZ así como la ausencia de la fpp
en mutantes polidactílicos en el ratón y la ausencia de la ANZ y la PNZ en mutantes
polidactílicos del pollo, sugieren una función de estas áreas, relacionada a la
morfogénesis del autópodo, esculpiendo su borde anterior y posterior, y controlando el
número de dedos en ambas especies durante esta etapa del desarrollo.
EXTREMIDAD
ANTERIOR
EXTREMIDAD
POSTERIOR
FIGURA 4. Esquemas que indican las áreas de muerte celular programada durante el desarrollo de la
extremidad del ratón (color negro). Las flechas indican las diferentes áreas de muerte que aparecen
progresivamente durante el desarrollo de la extremidad anterior y posterior del ratón. Fpp = foyer préaxiale
primaire, AMNZ=Zona Necrótica Marginal Anterior, PMNZ=Zona Necrótica Marginal Posterior, SAMZ=Zona
Marginal Subyacente a la Cresta Ectodérmica Apical, I=Interdígito, E=Etapa del desarrollo (dpc). Tomado de
Fernández-Terán et al., 2006.
18
Las áreas de muerte celular programada durante el desarrollo de la extremidad
presentan rasgos característicos de la apoptosis.
Estudios morfológicos por microscopia de luz, microscopia electrónica de transmisión y
microscopia electrónica de barrido han mostrado que los cambios morfológicos de las
células que están siendo eliminadas en las áreas de muerte celular durante el desarrollo
de la extremidad del pollo presentan características propias de la apoptosis (Hurle and
Hinchcliffe, 1978; Garcia-Martinez et al., 1993). Además, durante la regresión del tejido
interdigital, tanto en el pollo como en el ratón, se ha detectado la fragmentación del DNA
nuclear en fragmentos oligonucleosomales por electroforesis y por TUNEL, que es una
técnica en la que se evidencia la fragmentación del DNA nuclear in situ por el marcaje de
los extremos hidroxilo libres por nucleótidos modificados. Estas observaciones apoyan
que la muerte celular interdigital es de tipo apoptótico (Garcia-Martinez et al., 1993; Mori
et al., 1995). Análisis ultraestructurales realizados en la PNZ han revelado varios grupos
de células que están en diferentes etapas de degeneración. Algunas células vivas
muestran una alta actividad de fosfatasa ácida en el aparato de Golgi y en las vesículas
que se encuentran separándose de este organelo. Células presuntamente más
deterioradas muestran vacuolas más grandes con alta actividad de fosfatasa ácida. En
otras células se observa la vacuolización de la mayoría de los organelos citoplasmáticos
con una aparente disminución en la actividad de esta enzima. Finalmente, otras células
muestran condensación de la cromatina y fragmentación del núcleo y del citoplasma. Los
fragmentos celulares liberados hacia el espacio extracelular son rodeados y engullidos por
células mesenquimales vecinas y por macrófagos. La alta actividad de fosfatasa ácida
indica que las células de la PNZ son eliminadas por otro tipo de muerte celular además de
la apoptosis (Hurle e Hinchliffe, 1978).
La PCD por apoptosis se caracteriza por la contracción en el volumen celular debido a
la pérdida de líquido intracelular, condensación de la cromatina, fragmentación del DNA
que forma multímeros de nucleosomas y finalmente la fragmentación nuclear y
citoplasmática de la célula que forma vesículas denominadas cuerpos apoptóticos (Danial
and Korsmeyer, 2004; Conradt, 2009).
Estos cuerpos apoptóticos son engullidos por
células fagocíticas que eliminan todo rastro de restos celulares y evitan de esta manera
reacciones inflamatorias (Alberts et al, 2000; Karp, 2005). A nivel molecular, la apoptosis
se caracteriza por la activación de las Caspasas. Las Caspasas son proteasas con un
núcleo de cisteínas que forman el sitio catalítico de las enzimas y que reconocen al ácido
19
apartico en la secuencia de las proteínas blanco para degradarlas ó procesarlas. Las
Caspasas por su posición en la cascada molecular en la que participan se dividen en
Caspasas iniciadoras y ejecutoras. Las Caspasas son producidas como zimógenos
inactivos constituidas por una subunidad grande seguida de una subunidad pequeña
precedidas por un prodominio amino terminal que es más largo en las Caspasas
iniciadoras que en las ejecutoras. Las Caspasas se activan cuando presentan cortes
proteolíticos que generan la asociación de las subunidades grandes con las pequeñas
que resulta en la exposición del sitio activo de la enzima. Estudios cristalográficos han
revelado que la Caspasa activa es un tetrámero formado por dos heterodímeros
correspondientes a la subunidad pequeña y grande (Danial and Korsmeyer, 2004). Los
prodomidios amino terminal de las procaspasas iniciadoras poseen secuencias
conservadas. Uno de estos motivos se denomina dominio efector de muerte (DED) y lo
presenta la Caspasa 8 y Caspasa 10. Otro motivo es denominado dominio de
reclutamiento de Caspasas (CARD) y se encuentra en la Caspasa 1, 2, 4 y 9. Estos
dominios son requeridos para la interacción de estas Caspasas con otras proteínas
adaptadoras (Castro-Obregón y Covarrubias, 2003). Las Caspasas iniciadoras activan a
las Caspasas ejecutoras que activan a su vez a algunas cinasas que interrumpen la
adhesión celular y provocan el desprendimiento de las célula apoptótica de sus células
vecinas ó de su matriz extracelular, promueven la degradación de proteínas del
citoesqueleto tal como la actina, los filamentos intermedios, la tubulina, la gelsolina y la
paxilina induciendo cambios en la forma celular, eliminan los mecanismos de reparación
del DNA, desensamblan la membrana nuclear por la separación de sus láminas y activan
nucleasas y/o desactivan inhibidores de nucleasas que resulta en la degradación del DNA
de manera internucleosomal. (Castro-Obregón y Covarrubias, 2003; Karp, 2005). La
participación de las Caspasas iniciadoras se ha ubicado en dos vías moleculares que
activan a la apoptosis, la vía intrínseca y la vía extrínseca. Ambas vías convergen en la
activación de las Caspasas ejecutoras o efectoras que disparan la degradación de las
proteínas de la célula. En la vía extrínseca se requiere de la activación de ciertos
receptores por ciertas proteínas mensajeras extracelulares para inducir la muerte celular
programada, mientras que la vía intrínseca se promueve la muerte por la ausencia de
factores de sobrevivencia extracelulares, o por un daño al DNA de la célula inducida por
radiación gamma, daño genético irreparable, concentraciones muy altas de calcio
intracelular ó el estrés oxidativo grave (Lewin, 2000, Karp, 2005). Sin embargo, se ha
descrito que la vía extrínseca puede activar a la vía intrínseca ó mitocondrial dependiendo
20
de la disposición del factor denominado BID (Castro-Obregón y Covarrubias, 2003; Lewin,
2000).
La vía intrínseca es regulada por miembros de la superfamilia del BCL2 (Fig. 5). Estas
proteínas se dividen por su estructura en tres subfamilias: las proteínas anti-apoptóticas
del tipo BCL2, las proteínas pro-apoptóticas del tipo BAX y las proteínas pro-apoptóticas
con solo el dominio BH-3. Los miembros de la subfamilia BCL2 muestran cuatro dominios
conservados denominados BH1, BH2, BH3 y BH4. El dominio BH4 confiere su función
anti-apoptótica a los miembros de esta familia. Los miembros de la subfamilia del tipo
BAX carecen del dominio BH4 y la subfamilia BH3 presenta únicamente el dominio BH3
que es necesario para promover la muerte en ambas subfamilias pro-apoptóticas (CastroObregón y Covarrubias, 2003; Conradt, 2009). BAX se inserta en la membrana
mitocondrial externa en forma de multímeros oligomerizados cuando se presenta una
señal de muerte (Fig. 5). Mientras que BAK, otro miembro de la subfamilia de BAX
residente en la mitocondria presenta un cambio conformacional que provoca su
oligomerización en respuesta a las señales inductoras de muerte. Esta activación de BAX
y BAK provocan la liberación del citrocromo c del espacio intermembranal de la
mitocondria hacia el citoplasma, en donde forma un complejo con múltiples subunidades
de una molécula adaptadora denominada APAF1. La Caspasa iniciadora, Caspasa 9 es
reclutada por APAF1 en presencia de ATP. Esta interacción es mediada por los dominios
CARD presentes en APAF1 y en Caspasa 9 y se ha propuesto que la unión de ATP a
APAF1 genera un cambio conformacional en este factor que facilita el ensamblaje de un
heptámero en forma de una rueda conocido como el apoptosoma, que también incluye
varias moléculas de Caspasa 9 que procesan y activan a la Caspasas efectoras, Caspasa
3, 6 y 7 (Fig. 5). La vía intrínseca ó mitocondrial es regulada negativamente por miembros
de la subfamilia BCL2 con multidominios tal como BCL2, BCL-XL y MCL1 impidiendo la
formación del apoptosoma. BCL-XL puede interaccionar directamente con BAX e inhibir
su función apoptótica mientras que BCL2 puede estar anclado a la membrana externa de
la mitocondria impidiendo la liberación del citocromo c. Para los miembros de la subfamilia
BH-3 se han propuesto dos modelos por los que promueven la apoptosis a través de la
activación de BAX y de BAK. En el modelo directo BID y BIM que son miembros de la
subfamilia BH-3, inducen los cambios conformacionales de BAK y BAX que resultan en la
formación de los oligómeros que median la salida del citocromo c (Gavathiotis et al.,
2008). En el modelo indirecto BID y BIM neutralizan a BCL2 provocando la activación de
BAK y BAX (Willis et al., 2007). PUMA es otro miembro de la subfamilia BH3 que se
21
encuentra en la membrana mitocondrial y que activa a BAX y a BAK (Kim et al., 2009). El
triple knock-out de Bid, Bim y Puma no mostró homo-oligomerización de BAX y BAK, lo
que impidió la activación de las Caspasas mediada por la liberación del citocromo c ante
señales de muerte en neuronas y linfocitos T. Esto demuestra que Bid, Bim y Puma
promueven la activación directa de BAX y BAK en la mitocondria, resultando en la
activación de la vía intrínseca apoptótica dependiente de Caspasas (Ren et al., 2010).
FIGURA 5. La vía extrínseca de la apoptosis. Cuando se induce un daño celular interno ó algún tipo de
estrés celular, los miembros de la familia de proteínas BCL2, como BAX, se insertan en la membrana
externa mitocondrial y conducen a la liberación de moléculas del Citocromo C del espacio intermembranal
de las mitocondrias a través de poros formados por oligómeros de BAX. Las moléculas de Citocromo C
forman un complejo con varias subunidades de la proteína APAF1 y de la Procaspasa 9 en el citoplasma.
La Procaspasa 9 es activada por la interacción con APAF1 y esta a su vez activa a las Caspasas Ejecutoras
que resultan en la apoptosis (Tomado de Karp, 2008).
22
BAD es otro miembro de la subfamilia BH3 que interactúa con el complejo BCL-XL/BAX
que resulta en el desplazamiento de BAX y en la asociación con BCL-XL, permitiendo por
lo tanto que las proteínas BAX homodimerizen y permitan la liberación del citocromo c
(Yang et al., 1995). Otros factores apoptóticos liberados de la mitocondria por BAX y BAK
son el Segundo Activador Mitocondrial de las Caspasas (SMAC) y Omi, que participan en
la activación de las Caspasas inhibiendo la actividad de la proteína inhibidora de la
apoptosis (IAP) cuya función es inhibir la formación del apoptosoma y a la acción de la
Caspasa 3 (Orrenius et al., 2011). La vía intrínseca puede operar por mecanismos
independientes de Caspasas en los que se involucra la liberación de la mitocondria del
Factor Inductor de la Apoptosis (AIF) y de la Endonucleasa G (EndoG) y su subsiguiente
translocación al núcleo. Estas proteínas participan en la condensación de la cromatina y
en la fragmentación del DNA en trozos de alto peso molecular independientemente de la
actividad de las Caspasas (Orrenius et al., 2011).
Señales extracelulares pueden activar la vía extrínseca a través de la activación de los
receptores transmembranales de la familia de los receptores del TNF, en los que se
encuentra el receptor tipo I de TNF, el receptor de Fas denominado también APO-1 así
como CD95 y los receptores de muerte DR 4 y 5 (Fig. 6). La activación de la vía inicia con
la unión de miembros de la familia del TNF como FasL a los receptores de muerte tal
como Fas, provocando la formación de complejos de proteínas adaptadoras intracelulares
que reclutan a la Caspasa iniciadora ó activadora, la Caspasa 8. Esto provoca la
activación de las Caspasas efectoras que actúan sobre sus blancos (Fig. 6). La Caspasa
8 es también un mediador ó conector entre la vía extrínseca y la intrínseca, ya que a
través de BID la Caspasa 8 puede disparar la activación de la vía mitocondrial. La vía
extrínseca puede ser inhibida a través de la Proteína Inhibidora Semejante a FLICE (FLIP;
FLICE-like Inhibitory Protein) que se une intracelularmente a los receptores de muerte a
través de sus dominios de muerte impidiendo la formación de los complejos adaptadores
promotores de la apoptosis. Proteínas transmembranales llamadas Decoy Receptors
(DcR) funcionan como receptores señuelo capaces de interactuar con los ligandos
extracelulares e impidiendo la unión de estos a los receptores de muerte.
Hay evidencias que señalan que ambas vías pueden interconectarse, Bid es un factor
que al ser procesado proteolíticamente por la Caspasa 8, activada por el complejo unido
al receptor del TNF/Fas, induce la liberación del citocromo c de la mitocondria (Lewin,
23
2000) para disparar la cascada íntrinseca, de tal manera que señales extracelulares
pueden activar esta ruta alternativamente.
FIGURA 6. La vía extrínseca de la apoptosis. Miembros de la familia del TNF se unen a sus receptores
provocando la interacción del receptor con TRADD y FADD que son dos proteínas adaptadoras que sirven
de puente para unir a la procaspasa 8. Los dominios de muerte son los responsables de la interacción entre
las proteínas adaptadoras TRADD, FADD y el receptor de TNF (TNFR1), mientras que los dominios
efectores de muerte (DED) (cuadros cafés) sirven como mediadores de interacción entre FADD y la
Procaspasa 8. Dos moléculas de Procaspasa 8, que forman parte del complejo citoplásmico promovido por
el TNF, se activan por el procesamiento proteolítico que sucede entre ellas, resultando en la activación de
las Caspasas Ejecutoras (Tomado de Karp, 2008).
Además de las características ultraestructurales y morfológicas, se ha revelado la
participación de diferentes componentes moleculares que regulan la apoptosis durante la
muerte celular del interdígito de la extremidad del pollo y del ratón. Se ha mostrado la
presencia de la Caspasa 3 activa y fragmentación del DNA por TUNEL en subpoblaciones
de células interdigitales en extremidades de ratón de 13 dpc (Mirkes et al., 2001).
24
Además, extremidades de ratón cultivadas y tratadas con un análogo de la ciclofosfamida,
el 4-hidroperoxiciclofosfamida (4-OOHCPA), que genera malformaciones y apoptosis en
las extremidades, indujeron la activación de la procaspasa 3 que incrementó,
dependiendo de la concentración y el tiempo de exposición de la droga, la muerte celular
en la AER y en las áreas interdigitales. Complementariamente la inhibición de la
activación de la Caspasa 3 resultó en una disminución parcial de la muerte celular
inducida por el 4-00HCPA sugiriendo que vías dependientes e independientes de las
Caspasas regulan la muerte celular manifestada durante el desarrollo de la extremidad del
ratón (Huang and Hales, 2002). Durante la regresión interdigital de la extremidad del pollo,
las células exhiben la presencia de las Caspasas efectoras 3 y 7 en sus formas activas,
además de las Caspasa iniciadora, Caspasa 2, cuya expresión a nivel transcripcional es
interrumpida bajo el tratamiento del factor de sobrevivencia FGF2. Experimentos en los
que es electroporado el RNA de interferencia para Caspasa 2 en el interdígito causaron
un retraso en el inicio de la muerte interdigital seguido de una reducción moderada en la
apoptosis detectada 48 horas después del tratamiento, lo que indica la redundancia de
funciones de las Caspasas iniciadoras (Zuzarte-Luis et al., 2006).
La participación de la vía intrínseca durante la apoptosis interdigital ha sido
demostrada. La generación de embriones de ratones deficientes en APAF1 de manera
homóciga, examinados a los 15.5 días post coito (dpc), mostraron persistencia del tejido
interdigital. Además los fibroblastos aislados a los 13.5 dpc y cultivados in vitro de estos
ratones deficientes en APAF1 no fueron eliminados ante la adición al medio de cultivo de
los factores proapoptóticos anti-Fas, Ceramida C6 y Estaurosporina (Cecconi et al., 1998).
Sin embargo, después de los 15.5 dpc el ratón mutante para Apaf1 muestra regresión
interdigital que resulta en extremidades con dedos separados (Yoshida et al., 1998). Se
ha propuesto que la muerte celular interdigital retrasada en el mutante para APAF1, es
independiente de Caspasas y de tipo necrótico, debido a que la aplicación de ZVAD-FMK,
que es un inhibidor de las Caspasas, no inhibe la muerte celular interdigital, aunque no se
encuentran células positivas a TUNEL, sólo células con un morfotipo necrótico: cromatina
abigarrada y con lesiones en la membrana celular y en la mitocondria, aunque sin una
respuesta inflamatoria local además de ausencia de fagocitosis. Resultados similares se
encontraron en las extremidades cultivadas de los mutantes deficientes a APAF1, en los
que progresa la muerte celular interdigital sin presencia de células positivas a TUNEL,
pero con fenotipo necrótico (Chautan et al., 1999). Además se ha observado que la
sobreexpresión de la proteasa lisosomal Catepsina D en el interdígito del pollo dispara la
25
liberación y la translocación al núcleo de AIF, que es un factor que induce apoptosis
independientemente de las Caspasas en células positivas a TUNEL (Zuzarte-Luis et al.,
2007). Un análisis en los ratones dobles mutantes para BAK y BAX ha revelado la
participación de estos componentes de la vía intrínseca durante la regresión interdigital
del ratón. La mayoría de estos ratones mueren perinatalmente y exhiben múltiples
defectos del desarrollo en los que se incluye la persistencia del tejido interdigital,
indicando el requerimiento de la vía intrínseca en el control de la apoptosis en este tejido y
la redundancia de funciones entre estos dos factores, ya que los ratones que carecen
exclusivamente de BAK son normales y los mutantes de BAK exhiben anormalidades
fenotípicas limitadas solo al sistema reproductivo y nervioso (Knudson et al., 1995;
Lindsten et al., 2000). Similarmente a los ratones dobles mutantes para BAK y BAX, los
ratones triples mutantes de Bim, Bid y Puma mostraron persistencia de las membranas
interdigitales después de su nacimiento (Ren et al., 2010). Otras evidencias de la
importancia de la vía intrínseca en la muerte interdigital han sido descubiertas en la
extremidad del pollo, ya que se ha observado liberación del citocromo c de la mitocondria
al citoplasma de células interdigitales del pollo a los 7 y 7.5 días de incubación durante la
regresión interdigital (Zuzarte-Luis et al., 2006).
Durante la realización de muchos de estos estudios se ha observado también la
activación de otras formas de muerte celular distintas a la apoptosis. La utilización del
LysoTracker, que evidencia la actividad lisosomal en la evaluación de la muerte celular de
las extremidades del pollo y del ratón, así como la observación de numerosos lisosomas
tanto en células positivas y negativas a TUNEL evaluadas por el inmunomarcaje de
glicoproteínas de la membrana lisosomal en las células interdigitales del pollo, indican que
existe la participación de los lisosomas en la apoptosis y sugiere la participación de otras
formas de muerte celular en este modelo (Zuzarte-Luis et al., 2007). Las Catepsinas son
las proteasas más abundantes de los lisosomas que son expresadas durante la regresión
interdigital del pollo y del ratón. La aplicación de un inhibidor especifico de las Catepsinas,
la Pepstatina A, en el interdígito de la extremidad del pollo no afecta la muerte interdigital
evaluada a las 12 y 24 horas. Sin embargo, la coadministración de este fármaco con el
inhibidor de las Caspasas Z-VAD-FMK que solo reduce moderadamente la muerte celular,
resultó en la evidente atenuación de este proceso tanto en explantes autopodiales
cultivados durante 12, 24 y 48 horas como en el tejido in vivo (Zuzarte-Luis et al., 2007).
Estos resultados sugieren que las Catepsinas y las Caspasas cooperan sinérgicamente
en la ejecución en la muerte celular programada. Se ha reportado que la apoptosis
26
dependiente de las Caspasas activan a la DNasa CAD durante las primeras fases de la
regresión interdigital, posteriormente los niveles de CAD disminuyen e incrementan los de
la DNasa acida L-DNasa II y los de la DNasa lisosomal DNasa IIB en el momento en que
el proceso degenerativo ha alcanzado niveles muy altos. Estos cambios correlacionan
además con la acidificación del tejido interdigital. Estos datos indican que existe una
activación secuencial y coordinada de la vía de las Caspasas y de la vía lisosomal en la
inducción de la muerte celular interdigital (Montero et al., 2010). Todos estos estudios
proponen la posibilidad de considerar la participación de otros tipos de muerte celular
como la necrosis, que puede ser finamente regulada, y que se caracteriza por la
activación de las Catepsinas (Kroemer et al., 2009).
Las vías descritas anteriormente inducen de manera directa ó inmediata la muerte
celular por apoptosis. Sin embargo, se ha reconocido que ciertas señales que son
importantes durante el desarrollo, promueven y regulan indirectamente a la PCD, ya que
estas señales son activadas mucho tiempo antes de que las características celulares de la
muerte celular sean evidenciadas. La integración y conexión de estas señales con las vías
apoptóticas están siendo actualmente investigadas. Así, una de las interrogantes más
recurrentes durante el estudio de la morfogénesis de los tejidos y órganos es conocer los
mecanismos moleculares que resultan en la selección de las células que sobreviven ó que
son eliminadas por apoptosis. Un modelo de estudio importante para estudiar el papel de
la muerte celular programada en la morfogénesis y la adquisición de la forma de los
tejidos es la extremidad en desarrollo del pollo y del ratón. En este modelo se ha
reconocido, como una de las señalizaciones más importantes que promueven y regulan la
muerte celular programada, a la vía de las Proteínas Morfogenéticas del Hueso (BMPs).
La señalización de los miembros de la superfamilia del Factor de Crecimiento
Transformante  (TGF) promueve distintas respuestas celulares.
Durante el desarrollo de la extremidad de las aves y los mamíferos se ha descrito que los
miembros de la familia de las BMPs están involucrados en promover la muerte celular
interdigital. Las BMPs pertenecen a la superfamilia del TGF, que son factores secretados
por
ciertas células y que difunden al medio extracelular hasta alcanzar sus células
blanco. Dependiendo del tipo y del estado celular, los miembros de la superfamilia del
TGF producen diferentes respuestas: inhiben o estimulan la proliferación celular,
promueven la diferenciación, regulan la síntesis de varios componentes de la matriz
27
extracelular y controlan la migración, la adhesión y la muerte celular durante toda la vida
de los organismos (Sporn and Roberts, 1992; Massague and Wotton, 2000).
Destacablemente, la señalización de la superfamilia del TGF controla diferentes
aspectos del desarrollo, ya que contribuye al establecimiento de los patrones anatómicos
desde etapas muy tempranas y regula la organogénesis de múltiples estructuras. Su
importancia se ve manifestada por las varias alteraciones fenotípicas y enfermedades
producidas a consecuencia de la alteración de su señalización (Attisano and Wrana,
2000). La actividad de las BMPs fue descubierta
cuando matriz de hueso
desmineralizado, implantado intramuscular ó subcutáneamente en roedores, fue capaz de
inducir la formación de hueso ectópico (Urist, 1965). Posteriormente, tres polipéptidos con
la capacidad de inducir hueso ectópico fueron purificados y se les denominó BMP1, BMP2
y BMP3. El análisis de las secuencias reveló que a excepción de BMP1, estas proteínas
son muy similares entre sí y con los miembros de la superfamilia del TGF por lo que se
agruparon como la familia de las BMPs y se incluyeron dentro de este gran grupo
(Wozney et al., 1988). Se han descrito más de 20 proteínas relacionadas a las BMPs y se
han dividido en subgrupos con base en sus estructuras y funciones. El grupo BMP2/4
incluye a la BMP2, -4 y decapentaplegico de Drosophila. El grupo OP1 se constituye de
BMP5, BMP6, BMP7; denominada también Proteína Osteogénica 1 (OP1), BMP8 ó
Proteína Osteogénica 2 (OP2) y gbb 60A de Drosophila, el subgrupo BMP9/BMP10 que
incluye a estos factores y el subgrupo GDF-5 que engloba al Factor de Crecimiento y
Diferenciación-5 (GDF5) denominado también proteína morfogenética derivada del
cartílago 1 (CDMP1), GDF6 llamado también CDMP2 o BMP13, GDF7 o BMP12, GDF8,
GDF9, GDF11 y GDF15 (Miyazono et al., 2005; Santibanez et al., 2011). Las BMPs
actúan sobre las células en forma de dímeros uniéndose a un complejo receptor formado
por un par de receptores tipo I y un par de receptores tipo II que son cinasas de residuos
de Serina/Treonina (Fig.7). A diferencia de los miembros del TGF que presentan mayor
afinidad por el receptor tipo II y promueven subsecuentemente el reclutamiento del
receptor tipo I, las BMPs, ó se unen cooperativamente a ambos tipos de receptores, ó
interaccionan inicialmente con los receptores tipo I debido a la alta afinidad que existe
entre ambas moléculas (Hogan, 1996c, 1996a, 1996b). Al interactuar el complejo receptor
con las BMPs, el receptor tipo II, que es una cinasa constitutivamente activa fosforila en
un dominio denominado GS al receptor tipo I, lo que resulta en su activación. La
activación del receptor tipo I transmite la señal por una vía dependiente de las proteínas
SMADs (Fig. 7) ó independiente de SMADs (en las que se incluye la vía de las MAP
cinasas; ERK, JNK Y P38). De esta manera, la especificidad de la señal intracelular está
28
determinada principalmente por el receptor tipo I. Existen tres receptores tipo II que
interaccionan específicamente con la familia de las BMPs; BMPRII, ActRII y ActRIIB.
Contrariamente a BMPRII que sólo une a las BMPs, ActRII y ActRIIB pueden interaccionar
también con los miembros de la familia de las Activinas.
Se han descrito cuatro
receptores tipo I para las BMPs; BMPRIA ó ALK3, BMPRIB ó ALK6, ALK2 y ALK1. ALK3 y
ALK6 son estructuralmente muy similares y se ha observado que unen preferencialmente
a BMP2 y BMP4, mientras que ALK2 y ALK6 unen a los miembros de la subfamilia OP1
(Macias-Silva et al., 1998; Miyazono et al., 2005). ALK2 también es un receptor para la
subfamilia del GDF5. ALK1, aunque se ha reconocido que puede unir al TGF, transduce
la señal inducida por BMP9 y BMP10 (Santibañez et al., 2011).
La activación de la vía dependiente de SMADs parece ser la vía principal para
transducir la señal de la superfamilia del TGF(Fig. 7). Se han identificado cinco
proteínas SMADs que son activadas por los receptores tipo I; SMAD1, SMAD5 y SMAD8
interactúan con los receptores tipo I de las BMPs, mientras que SMAD2 y SMAD3 son
activadas por los receptores tipo I que unen a los miembros de la familia del TGF y de
las Activinas. A estas SMADs se les denomina SMADs activadas por el receptor (RSMADs) y se constituyen de dos dominios conservados que forman estructuras globulares
llamadas dominio MH1 y MH2 separados por una región que los une, denominada región
Enlazadora ó Linker. El dominio MH1 se localiza en la región amino terminal de las
proteínas SMAD y es el que interacciona directamente con el DNA, mientras que el MH2
dirige la translocación de las SMADs al núcleo y recluta otros cofactores para regular la
transcripción de genes blanco. Existe también una secuencia SSxS en la región carboxilo
terminal que es fosforilada por los receptores tipo I bajo la estimulación del ligando y que
resulta en su activación. Las SMADs interaccionan con sus receptores a través de un asa
L3 localizada en el dominio MH-1 y el asa L45 que se encuentra en el dominio de
actividad cinasa del receptor (Chen and Massague, 1999). Una vez fosforiladas las RSMADs se disocian de sus receptores respectivos y forman un complejo con otro tipo de
SMAD denominada Co-SMAD que agrupa a la SMAD4 presente en mamíferos y a la
SMAD4b identificada solo en Xenopus. Las Co-SMADs presentan una estructura MH1Enlazadora-MH2 pero carecen del motivo SSxS y por lo tanto no son fosforiladas por el
receptor. La formación del complejo de las R-SMADs con algún tipo de Co-SMAD,
mediada principalmente por los contactos de los dominios MH2, resulta en la
translocación al núcleo del complejo en donde se lleva a cabo la regulación de la
transcripción de genes blanco a través de su unión directa a secuencias específicas en el
29
DNA mediante la interacción con otros factores de transcripción y el reclutamiento de Coactivadores ó Co-represores de la transcripción (Miyazono et al., 2005) (Fig. 7). La
asociación de las SMADs con una amplia variedad de factores de transcripción resulta en
la interacción selectiva de alta afinidad con los elementos de respuesta a las SMADs
(SBE) que son secuencias específicas del DNA constituidas por la secuencia CAGAC que
contacta a las SMADs a través de su dominio MH1. También, dependiendo de esta amplia
variedad de interacción con diversos tipos de factores de transcripción, es lo que confiere
la amplia gama de respuestas celulares promovidas por la señalización de la superfamilia
del TGF (Li y Cao, 2006). Runx2 y Menina son factores de transcripción indispensables
para la formación del hueso. Estos factores interaccionan con las R-SMADs de BMPs,
SMAD1 y SMAD5 induciendo la diferenciación de células mesenquimales a osteoblastos
(Lee et al., 2004; Miyazono et al., 2004; Sowa et al., 2004). El factor nuclear Yin Yang-1
(YY-1) interactúa con SMAD1 y SMAD4 y, dependiendo del tipo celular y de los genes
blanco, actúan como represores ó activadores de la señalización de las BMPs. La
interacción de YY-1 con estas SMADs inhiben su unión a los SBE y reprimen la inducción
de Id-1, gen cuyo producto inhibe la miogénesis y la neurogénesis y estimula la migración
de las células endoteliales por las BMPs (Kurisaki et al., 2003). Contrariamente, la
interacción de YY-1 con la SMAD1 y la SMAD4 estimula la expresión de Nkx2.5 jugando
un papel importante en la inducción y desarrollo del corazón (Lee et al., 2004). SMAD1 y
SMAD4 interactúan con la proteína adaptadora OAZ requerida para la transcripción del
gen Xvent-2, esencial en la ventralización del mesodermo y en la inhibición neural de
Xenopus. Hoxc-8, un miembro de la familia de los HOX actúa como represor de la
transcripción del gen de la Osteopontina (OPN). Cuando se forma el complejo SMAD1
con SMAD4 en respuesta a las BMPs interactúan con el dominio de unión del DNA de
Hoxc-8 y retiran a este factor del promotor de Opn permitiendo su transcripción y la
subsecuente diferenciación de los osteoblastos (Hata et al., 2000). Otras proteínas
nucleares que interactúan con las R-SMADs de BMPs incluyen a los factores de
transcripción MyoD, Vent-2 y Msx-1 y a los represores transcripcionales SIP-1 y FoxG-1
(Miyazono, 2005). Existe un tercer grupo de proteínas SMADs denominadas SMADs
Inhibidoras (I-SMADs), que incluyen a la SMAD6 y SMAD7 en mamíferos y cuya función
es inhibir la señalización inducida por el TGF y las BMPs. Estas SMADs generan una
regulación de retroalimentación negativa de la señalización de la superfamilia del TGF ya
que su expresión es inducida, entre otros estímulos, por el TGF y las BMPs. SMAD2 y
SMAD3, activadas por el TGF, y las SMAD1 y SMAD5 activadas por las BMPs se unen a
30
las regiones promotoras e inducen la transcripción de Smad7 y Smad6, respectivamente
(Nagarajan et al., 1999; Denissova et al., 2000; Ishida et al., 2000; Hanyu et al., 2001).
FIGURA 7. Vía canónica ó dependiente de SMADs de las BMPs. Las BMPs son ligandos comúnmente
homodiméricos que se unen a un complejo receptor transmembranal formado por dos receptores tipo II y
dos receptores tipo I que son cinasas de residuos de Serina/Treonina. El receptor tipo II es una cinasa
constitutiva activa que fosforila al receptor tipo I en el dominio GS. Esta fosforilación resulta en la activación
cinasa del receptor tipo I y en el reclutamiento transitorio de las proteínas R-SMAD. Las R-SMADs son
fosforiladas por el receptor tipo I y son translocadas al núcleo acompañadas por la CO-SMAD, SMAD4. El
complejo de SMADs regulan la transcripción de genes blanco uniéndose directamente al DNA e
interaccionando con otros factores de transcripción (no mostrados) y reclutando activadores (CBP/p300) ó
represores de la transcripción.
Las I-SMADs contienen dominios MH-2 conservados pero carecen de dominio MH-1 y la
región Linker es muy divergente de la del resto de las SMADs. Aunque SMAD6 puede
inhibir la vía del TGF se ha observado que inhibe preferencialmente la señalización de
las BMPs formando un complejo inactivo con la SMAD1 compitiendo con la SMAD4 (Fig.
7). Además, SMAD6 puede unirse a ciertos factores de transcripción que unen a las otras
31
SMADs y reprimir la transcripción en el núcleo (Hanyu et al., 2001, Santibañez, 2011).
SMAD7 impide la fosforilación de las R-SMADs al unirse con los receptores tipo I de
TGF, Activinas y BMPs (Hanyu et al., 2001). Las BMPs también son reguladas por
antagonistas que interaccionan directamente con ellas e impiden que se unan a sus
receptores específicos. Con base en su estructura molecular los antagonistas de las
BMPs se clasifican en cuatro subfamilias; la subfamilia de DAN en los que se encuentran
Gremlin, Cerberus y DAN, la subfamilia de Chordin, la subfamilia de Twisted Gastrulation
y la subfamilia de Noggin (Guha et al., 2002, Santibañez et al., 2011).
Alternativamente, las BMPs pueden activar otras vías intracelulares independientes de
las SMADs en las que se involucra la vía de las MAP cinasas. Varias vías independientes
de las SMADs se han reportado que son activadas por las BMPs para inducir apoptosis.
Tal es el caso de BMP4, que puede activar a la cinasa 1 activada por el TGF (TAK1) que
conduce a la activación de la proteína c-Jun a través de la señalización JNK (Zuzarte-Luis
and Hurle, 2005). A través de la activación de TAK1, BMP2 activa a p38 para inducir
apoptosis y en una línea celular de osteoblastos, BMP2 incrementa, por la vía de
señalización dependiente de la proteína cinasa C, los niveles de BAX, citocromo c y la
actividad de la Caspasa iniciadora Caspasa 9 y de las Caspasas efectoras 3, 6 y 7
(Yamaguchi, 1995; Kimura et al., 2000; Hay et al., 2001).
La señalización mediada por las BMPs regula la muerte celular programada durante
la morfogénesis de la extremidad.
Las primeras evidencias que sugirieron la participación de las BMPs en la morfogénesis
de la extremidad de los vertebrados provienen del patrón de expresión a nivel
transcripcional de varias isoformas de esta familia durante su desarrollo. La expresión de
las BMPs es dinámica, ya que varía su expresión espacio-temporal durante el desarrollo
de la extremidad del pollo y del ratón. Durante el desarrollo del ala y de la extremidad
posterior del
pollo, los transcritos de Bmp4 son detectables en etapa 18 en todo el
mesénquima de la extremidad y en la cresta ectodérmica apical (AER). En este epitelio
los transcritos de Bmp4 permanecen hasta la etapa 26. Contrariamente, en el
mesénquima la expresión de Bmp4 se va restringiendo progresivamente hasta la etapa 26
en el margen anterior y posterior de la extremidad. Durante la progresión de la etapa 28 a
la 30 los transcritos se mantienen en todo el borde anterior y posterior de la extremidad en
crecimiento y se logra observar su expresión en el mesénquima interdigital, en el
32
mesénquima que bordea a los dedos anteriores y posteriores, fuertemente alrededor de
los dedos en formación y en los tendones en desarrollo (Francis et al., 1994; Yokouchi et
al., 1996; Laufer et al., 1997). En contraste a Bmp4, los transcritos de Bmp2 se restringen
a la región posterior del mesénquima desde la etapa 17 a la 28 en extremidades
anteriores y posteriores. Esta expresión se mantiene distalmente conforme avanza el
desarrollo. Durante la formación del autópodo, Bmp2 se localiza en los interdígitos con
una fuerte expresión rodeando al cartílago en diferenciación correspondiente a los dedos.
Adicionalmente, Bmp2 se expresa en la AER desde la aparición del primordio hasta la
etapa 26 (Francis et al., 1994; Yokouchi et al., 1996; Laufer et al., 1997). En el ratón,
Bmp4 se expresa fuertemente en el mesodermo posterior y muy tenue en el anterior a los
10.5 dpc. A los 11.5 dpc la expresión en el mesodermo anterior se intensifica y se
mantiene en el posterior, además de expresarse en la AER. A los 12.5 dpc la transcripción
de Bmp4 es observada de manera tenue en el área proximal de los interdígitos y
mantenida fuertemente en el mesénquima subapical a la AER (Grotewold and Ruther,
2002). Bmp2 en el ratón se observa en el mesénquima posterior y distal del primordio y a
diferencia de la extremidad del pollo, la distribución antero-posterior de sus transcritos es
muy amplia, abarcando desde el borde posterior y distal hasta casi la mitad del primordio
(Bandyopadhyay et al., 2006). Esta expresión disminuye y se restringe en el área proximal
del autópodo hasta localizarse finalmente en los interdígitos siendo más intensa en los
bordes de los dedos a los 12.5 dpc (Johnson et al., 2005). Durante el desarrollo de las
extremidades del pollo Bmp7 se expresa intensamente en el mesodermo anterior y
posterior en etapa 22 y en la AER (Pizette and Niswander, 1999). En etapa 29 Bmp7 es
expresado intensamente en el tejido interdigital, además de localizarse en los tendones y
pericondrio de los dedos en desarrollo (Laufer et al., 1997; Macias et al., 1997) A
diferencia de Bmp2 y Bmp4, los transcritos de Bmp7 se mantienen en la AER hasta que
esta estructura presenta una regresión entre la etapa 31 y la 32. Inclusive, los transcritos
de Bmp7 son aún observados en el epitelio cuboidal simple remanente de la AER en la
etapa 32 de la extremidad posterior del pollo (Pizette y Niswander, 1999). En el ratón, los
transcritos de Bmp7 son encontrados en el mesénquima anterior de la extremidad
superior a los 10 dpc; posteriormente también se localizan intensamente en el mesodermo
posterior y en la AER. A los 11.5 dpc los transcritos de Bmp7 se localizan en el
mesénquima distal, posterior y anterior proximal y en las regiones en donde se condensa
el cartílago. Finalmente a los 12.5 dpc, Bmp7 es fuertemente expresado en las regiones
interdigitales (Hofmann et al., 1996). La expresión de Bmp5, un miembro del subgrupo
BMP7 se ha caracterizado durante el desarrollo de la extremidad posterior del pollo; los
33
transcritos de Bmp5 se detectaron entre los 3 y 4.5 días de incubación en el mesodermo
distal y al quinto día se expresó en las masas musculares ventrales y dorsales. A los 5.5 y
6 días de incubación la expresión de Bmp5 fue intensa en la parte proximal de los
interdígitos y fue desplazándose subsecuentemente a los dominios distales alcanzando la
punta del dedo a los 8.5 días de incubación. Adicionalmente, los transcritos de Bmp5 se
localizaron en los tendones flexores y en el pericondrio de las falanges (Zuzarte-Luis et
al., 2004). Un análisis comparativo entre el patrón de expresión de Bmp4 y Bmp2 con la
presencia de las zonas de muerte celular durante el desarrollo de la extremidad posterior
del pollo, mostró que en etapas tempranas la expresión de Bmp4 y la ANZ se sobrelapan
en el margen anterior del mesodermo y que Bmp4 precede a la detección de la PNZ en el
margen posterior. Similarmente, en etapas subsecuentes, la expresión de Bmp4 en la
región interdigital proximal en etapa 29
precedió a la apoptosis de los interdígitos
detectada en etapa 31. Durante la eliminación de los interdígitos, Bmp4 se restringió al
mesodermo adyacente a los elementos cartilaginosos de los dedos (Yokouchi et al.,
1996). Aunque la expresión de Bmp2 es más débil que la de Bmp4, su expresión en la
región interdigital también precede a la apoptosis. Bmp2 también es expresada en el
borde posterior de la extremidad en etapas tempranas pero su distribución parece ser
más distal a comparación con la de la PNZ, coincidiendo su expresión con la región de
actividad polarizante (ZPA) que es un grupo de células en el margen posterior de la
extremidad que especifica o dirige el patrón anterior-posterior de esta. La aplicación
ectópica de BMP2 en la región anterior del primordio del ala del pollo ha sugerido que
BMP2 actúa como un factor de mantenimiento de la AER, necesaria para el crecimiento
de la extremidad y como una molécula que contribuye en la especificación e identidad de
los dedos en etapas tempranas del desarrollo (Duprez et al., 1996; Drossopoulou et al.,
2000). Por lo tanto, en etapas tempranas la acción de la BMP2 no se ha involucrado en la
regulación de la muerte celular de la PNZ aunque es capaz de reducir la viabilidad celular
del mesodermo interdigital del pollo in vitro (Yokouchi et al., 1996).
Los primeros experimentos que evidenciaron la participación de las BMPs en la muerte
celular programada consistieron en la implantación de perlas de heparina, embebidas
previamente en estos factores, en el área interdigital de la extremidad del pollo (Fig. 8). La
implantación de perlas embebidas en BMP4 en el tejido interdigital de la extremidad del
pollo en etapa 29 resultó en una aceleración de la muerte celular que se observó
primeramente alrededor de la perla a las 10 horas post-implantación. La muerte
incrementó dramáticamente a las 20 horas post-implantación de la perla resultando en
34
una regresión acelerada del interdígito antes de que la muerte fisiológica empezara
(Ganan et al., 1996). Similarmente, la aplicación de perlas embebidas en BMP2 y BMP7
en el interdígito aceleró la muerte celular en los mismos tiempos observados con la
implantación de las perlas embebidas en BMP4 (Fig. 8). Además BMP2 y BMP7
extendieron el área de muerte de la ANZ y de la PNZ cuando se implantaron las perlas en
el mesodermo anterior y posterior. Estas proteínas indujeron la muerte celular en
prácticamente todo el mesodermo adyacente a la implantación de las perlas
evidenciándose a las 10 horas post-implantación y alcanzando su intensidad máxima a las
20 horas post-implantación. El análisis histológico, ultraestructural y por TUNEL,
evidenciaron que la muerte celular inducida por BMP2 y BMP7 es apoptótica (Macias et
al., 1997; Pizette and Niswander, 1999). La aplicación de perlas embebidas en BMP5, en
el margen anterior del mesodermo del primordio del ala a los 3.5 días de incubación y en
el mesodermo interdigital antes del inicio de la muerte fisiológica, resultó en la inducción
de la apoptosis (Zuzarte-Luis et al., 2004). La demostración de la participación de las
BMPs en promover la muerte celular en el tejido interdigital del pollo proviene de
experimentos en los cuales se implantaron perlas embebidas en los antagonistas de las
BMPs.
La implantación de perlas embebidas en el antagonista de las BMPs, Noggin, en el
interdígito en etapa 30, poco antes de iniciar la muerte celular fisiológica, resultó en la
inhibición de la muerte interdigital al ser evaluada a las 20 horas post implantación
(Merino et al., 1998). La muerte interdigital en el autópodo de la extremidad posterior del
pollo también fue inhibida después de aplicar perlas embebidas con otro inhibidor de las
BMPs, Gremlin, en etapa 28 a 30 y evaluada a las 20 horas post-implantación. La
liberación sostenida de Gremlin generada por la implantación inicial de perlas embebidas
en esta proteína en etapa 28 en el interdígito seguida de la aplicación de otra perla 20
horas después, generó una sindactilia similar a la de un pato en la extremidad posterior
del pollo 3 días después de la implantación de la primera perla (Merino et al., 1999b). Se
ha sugerido que la regulación endógena de las BMPs en el mesodermo interdigital es
llevada a cabo por Gremlin, ya que es expresado en los dominios interdigitales en
etapa28 mientras que está ausente en etapa 31, cuando inicia la muerte interdigital.
Contrariamente, Noggin es expresada en los rayos digitales en desarrollo y se le ha
atribuido un papel protector del cartílago contra la señal apoptótica de las BMPs (Merino
et al., 1998). Además, el análisis de la expresión de Gremlin en el autópodo del pato ha
revelado que ésta se mantiene en el tejido interdigital durante toda la morfogénesis del
35
FIGURA 8. Las BMPs promueven y aceleran la muerte celular. A; Autópodo de la extremidad posterior
del pollo en etapa 30-31 en el que se empieza a evidenciar la muerte celular interdigital (flecha). B;
Autópodo contralateral del mismo individuo tratado, 10 horas antes, con perlas embebidas en BMP7. La
flecha señala el incremento de la muerte celular en el área interdigital promovida por la implantación de la
perla embebida previamente en BMP7. C y D son amplificaciones del tercer interdígito correspondientes a A
y B respectivamente.
autópodo (Merino et al., 1999). La inyección de virus recombinantes generados por la
clonación de Noggin de pollo en vectores retrovirales RCAS, en el presunto campo de la
extremidad del pollo en etapas 12 a 14, generó sindactilias con un exceso persistente y
anormal de tejido mesodermal alrededor de los dedos resultado de una expresión
prolongada de Fgf8 en la AER. El análisis de estas extremidades en etapa 24 mostró la
ausencia de la ANZ y PNZ e inclusive se inhibió la muerte celular promovida por la
aplicación de BMP2 o BMP4 en el mesodermo anterior de las extremidades infectadas
(Pizette y Niswander, 1999). El papel de las BMPs en la muerte celular de la extremidad
del ratón se ha elucidado por la eliminación de la función de las BMPs de manera
condicional, debido a que ratones mutantes para Bmp2 y Bmp4 mueren durante las
primeras etapas de la embriogénesis haciendo imposible su análisis funcional durante el
desarrollo de la extremidad. Además, el ratón deficiente de Bmp7 presenta polidactilia
pre-axial, con un dedo extra en la región anterior tanto en extremidades anteriores y
posteriores, no mostrando algún fenotipo relacionado con la muerte celular (Hofmann et
36
al., 1996). La carencia de fenotipos que aporten otras funciones relacionadas a la BMP7
sugiere una redundancia de funciones con BMP2 y BMP4. Es por eso que además de la
generación de mutantes condicionales de BMP2 y BMP4 ha sido necesario el análisis de
ratones dobles condicionales. El ratón condicional de Bmp2 que expresa la recombinasa
Cre bajo el Enhancer de Prx1, un gen expresado tempranamente en el mesodermo de la
extremidad y que resulta en la eliminación completa de Bmp2, exhibieron sindactilias
parciales. En contraste, el ratón condicional deficiente de Bmp4 generado similarmente al
condicional de Bmp2, no presentó evidencia de sindactilia. Sin embargo, en los ratones
dobles condicionantes para Bmp2 y Bmp4 se observó sindactilia completa en
extremidades posteriores y anteriores debido a una importante reducción de la apoptosis
interdigital y una expansión y mantenimiento prolongado de la AER que expresa Fgf8
(Bandyopadhyay et al., 2006). El ratón transgénico que expresa Noggin bajo el promotor
de Keratina 14 que dirige su expresión en el ectodermo desde los 9.5 dpc, mostró una
marcada disminución de la regresión del tejido interdigital a los 14.5 dpc. En extremidades
anteriores y posteriores de estos ratones transgénicos neonatos y en extremidades
anteriores de los adultos los dedos no lograron separarse debido a la pronunciada
sindactilia que presentaron. Adicionalmente polidactilia pre y post-axial fue observada.
Ensayos por TUNEL mostraron en este ratón transgénico una reducción de la apoptosis
en el tejido interdigital, en la Zona Necrótica Marginal Anterior (AMNZ) y en la Zona
Necrótica Marginal Posterior (PMNZ), así como una reducida actividad de Caspasa 3. La
sobreexpresión de Noggin redujo claramente la fosforilación de la SMAD1 y SMAD5 en el
interdígito. Similarmente a la sobreexpresión de Noggin en el pollo y a los ratones
condicionales deficientes a Bmp2 y a Bmp4 la regresión de la AER se retrasó
considerablemente y mantuvo la expresión de Fgf8 persistentemente (Guha et al., 2002).
El análisis funcional de los diferentes receptores de las BMPs ha contribuido a elucidar
la maquinaria de transducción de la señal involucrada y los mecanismos moleculares
referentes al control de la muerte celular programada por las BMPs en la extremidad en
desarrollo. Además de truncar el crecimiento de los dedos, la sobreexpresión de la forma
dominante negativa de BMPRIB/ALK6 en la extremidad posterior del pollo por vectores
retrovirales inhibió la apoptosis interdigital resultando en sindactilia (Zou and Niswander,
1996). Estos resultados fueron confirmados por la sobreexpresión de la forma constitutiva
activa de este mismo receptor por vectores retrovirales en etapa 15 que generaron
extremidades muy delgadas con acortamiento distal y AER degenerada y, en los casos
más dramáticos, la sobreexpresión de este receptor provocó el truncamiento de la
37
extremidad. Estas extremidades, teñidas con Azul Nilo 48 horas después de la infección,
mostraron la presencia de numerosas células muertas en el mesénquima distal. Una
infección de los retrovirus con la forma constitutiva activa de BMPRIB/ALK6 en el
mesénquima anterior del primordio del ala del pollo en etapa 22 aceleró la regresión
interdigital que fue analizada en etapa 30 (Zou et al., 1997). Retrovirus recombinantes que
acarrean la forma dominante negativa de BMPRIA/ALK3 que carece del dominio cinasa,
se inyectaron en etapa 10 en el presunto campo de la extremidad posterior del pollo. Las
extremidades transfectadas presentaron un tejido interdigital persistente, así como la
presencia de mesénquima anterior y posterior en el autópodo debido posiblemente a la
inhibición de la muerte de la ANZ y de la PNZ (Yokouchi et al, 1996). Sin embargo, el
patrón de expresión de BmprIa/Alk3 y BmprIb/Alk6 ha sugerido diferentes funciones en el
desarrollo de la extremidad. BmprIb/Alk6 es expresado exclusivamente en las
condensaciones cartilaginosas en formación tanto del ala como de la extremidad posterior
(Kawakami et al., 1996; Merino et al., 1998). La participación de este receptor en la
condrogénesis fue confirmado con la sobreexpresión de la forma constitutivamente activa,
que expandió y fusionó los elementos esqueléticos de la extremidades tratadas mientras
que la forma dominante negativa del receptor truncó la formación y crecimiento de los
elementos esqueléticos (Zou y Niswander, 1996; Zou et al., 1997). Además, la expresión
de este receptor fue inducida 6 horas después de la formación de un cartílago ectópico en
el
interdígito
por
la
aplicación
del
TGF1
(Chimal-Monroy
et
al.,
2003).
Complementariamente, la expresión de ALK3/BMPRIA se localizó en el mesénquima de
la extremidad en etapa 28 pero a niveles muy bajos ya que su expresión se observa muy
tenue en hibridaciones in situ realizadas en la extremidad completa y en cortes
histológicos (Kawakami et al., 1996, Zou et al., 1997). Además, la forma dominante
negativa de BMPRIA no afectó la condrogénesis de células mesenquimales del primordio
de la extremidad in vitro (Zou et al., 1997). Estudios hechos en el ratón han revelado el
mecanismo por el cual las BMPs promueven la muerte celular interdigital y han destacado
diferencias importantes entre la regulación de este proceso en el pollo y en el ratón. El
ratón mutante de BMPRIA muere durante las primeras fases de su desarrollo debido a
que se bloquea la gastrulación y el mesodermo no se forma por lo que se ha requerido de
generar ratones mutantes condicionales que expresen a este gen mutado únicamente
durante la morfogénesis de la extremidad. Contrariamente, el ratón mutante con expresión
nula para Bmpr-1b exhibe solo fenotipos restringidos al esqueleto con ligeros defectos
confinados a las falanges indicando que existen funciones redundantes entre los
receptores tipo I de BMPs. Esta sospecha fue confirmada con la generación del doble
38
mutante condicional para BmprIa bajo el promotor de Col2 y deficiente en BmprIb en el
que se observa una severa condrodisplasia generalizada, estos datos son apoyados por
la expresión de ambos receptores y la presencia de las SMADs fosforiladas 1, 5 y 8 en las
condensaciones de cartílago del esqueleto en formación de los ratones silvestres (Yoon
et al., 2005). La participación de BmprIa durante la muerte interdigital fue descubierta por
el análisis del ratón mutante condicional de BmprIa, cuya función fue eliminada en la AER
bajo la expresión de la recombinasa Cre controlada por Msx2. Las extremidades adultas
del ratón mutante condicional exhibieron sindactilias debido a la reducción de la muerte
celular interdigital examinadas con LysoTracker de los 12.5 a los 13 dpc (PajniUnderwood et al., 2007). Debido al reconocimiento previo del requerimiento indispensable
de FGF8 y FGF4 en la sobrevivencia de la extremidad (Lewandoski et al., 2000; Moon et
al., 2000; Moon and Capecchi, 2000), el incremento y persistencia en la expresión de Fgf8
y Fgf4 en la AER en el ratón mutante condicional de BmprIa en la AER y la eliminación de
la sindactilia en este mismo mutante por la inactivación de Fgf8 y una copia de Fgf4
indican que las BMPs expresadas en el mesénquima interdigital interaccionan con
BMPRIA en la AER que resulta en la disminución en la expresión de fgf8. Al ausentarse
este factor de sobrevivencia, la apoptosis interdigital es por lo consiguiente disparada
(Pajni-Underwood et al., 2007). Cultivo de órganos de extremidades de ratón tratados con
perlas embebidas en Noggin en el mesénquima interdigital y con Dorsomorfina, un
inhibidor de la fosforilación de las R-SMADs mediadas por los receptores tipo I de las
BMPs (Yu et al., 2008), no decrementaron la muerte interdigital después de 12 horas de
cultivo. Contrariamente y de acuerdo a la sobreexpresión de Noggin bajo el promotor de la
keratina-14 expresado en el ectodermo de las extremidades del ratón, la infección en el
ectodermo de extremidades cultivadas del ratón en desarrollo por adenovirus que llevan la
secuencia codificante de Noggin redujo la muerte celular interdigital. Esta misma
respuesta fue adquirida cuando las extremidades cultivadas fueron tratadas con
Dorsomorfina, añadida directamente al medio de cultivo durante 6 a 8 horas en E 12.5. En
el caso del pollo, la implantación de perlas embebidas en Noggin en la región proximal y
distal del mesénquima interdigital del pollo resultó en la inhibición de la muerte interdigital
(Hernandez-Martinez et al., 2009). Estos resultados indican que las BMPs en la
extremidad del ratón controlan la muerte celular disminuyendo la expresión de Fgf8 en la
AER y que solo en el pollo las BMPs expresadas en el interdígito contribuyen a regular
este proceso directamente en el mesodermo. En desacuerdo con esta propuesta se ha
reportado una disminución de la muerte en el tejido interdigital y de la PMNZ en el ratón
condicional de BmprIa que es eliminado por la recombinasa Cre al expresarse bajo el
39
promotor de gdf5. La expresión de LacZ inducida por este sistema mostró que la actividad
del promotor de gdf5 se encontró en el mesénquima posterior al dedo 5 y en el tejido
interdigital localizado entre los dedos 1 y 2 lo que indica que la activación de la
señalización de las BMPs mediada por BMPRIA directamente en el mesénquima
promueve la muerte celular interdigital en el ratón (Rountree et al., 2004). El papel de
ALK2 durante la morfogénesis de la extremidad se ha estudiado en el pollo. Alk2 es
expresado en el mesénquima del primordio de la extremidad anterior del pollo y en los
condrocitos de los elementos esqueléticos en desarrollo. La sobreexpresión de la forma
constitutiva activa de Alk2 por vectores retrovirales incrementó la condrogénesis y
expandió los elementos cartilaginosos (Zhang et al., 2003). Aunque es expresado en el
mesénquima del ala en desarrollo, no se ha reportado la participación de ALK2 durante la
muerte celular de la extremidad. La función de ALK1, otro receptor que señaliza
principalmente por la unión a BMP9 y BMP10 y cuya mutación heteróciga está asociada
con la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria, es desconocida durante el desarrollo de la
extremidad de los vertebrados amniotas.
Las evidencias que involucran a las SMADs durante la muerte celular programada de
la extremidad son escasas. Durante el desarrollo del pollo se ha reportado la expresión de
las R-SMADs de BMPs sólo durante la formación del autópodo. Smad1 fue detectado a
bajos niveles en el mesodermo interdigital mientras que Smad5 no fue detectable por
hibridación in situ en la extremidad completa. En contraste, la expresión de Smad8 fue
muy intensa en los interdígitos y se mantuvo durante la regresión interdigital. Además la
expresión de Smad8 fue regulada negativamente por la implantación de perlas embebidas
en Noggin en el interdígito antes de su eliminación y su expresión se intensificó cuando se
aplicó una perla embebida en BMPs en este tejido y precedió a la apoptosis mesodermal
en primordios de etapas tempranas. Contrariamente, la expresión de Smad1 no fue
afectada por la implantación de perlas embebidas en BMPs y no se logró que la expresión
de Smad5 fuese inducida por este tratamiento (Zuzarte-Luis et al., 2004). Por
inmunohistoquímica se han encontrado las formas fosforiladas de SMAD1, 5 y 8 en las
regiones interdigitales del ratón. Esta fosforilación es inhibida en el ratón transgénico que
sobreexpresa Noggin bajo el promotor de keratina-14 y por la aplicación de Dorsomorfina
en extremidades cultivadas de ratón (Guha et al., 2002; Hernández-Martínez et al., 2009).
El ratón mutante para Smad5 exhibe varios defectos en el embrión y en las membranas
extraembrionarias que afectan el cierre ventral del embrión, el corazón, el sistema
vascular y el alantoides, mientras que el ratón deficiente de Smad1 no forma el alantoides,
40
lo que resulta en la muerte de estos embriones mutantes a los 10.5 dpc y la dificultad de
analizar alguna función posible durante el desarrollo de la extremidad (Arnold et al., 2006).
Es destacable que los mutantes homócigos de Smad8 son viables, fértiles y no presentan
alguna alteración fenotípica a pesar de ser expresado en varios tejidos y órganos debido
posiblemente a la redundancia de funciones con las otras SMADs de BMPs en etapas
más avanzadas del desarrollo (Arnold et al., 2006).
Otras señales regulan la muerte celular programada durante el desarrollo de la
extremidad.
Además de las BMPs, se han reportado otras señales que están involucradas en la
regulación de la muerte interdigital del pollo y del ratón. Una de estas es la señalización
del ácido retinoico. El ácido retinoico (AR) es un metabolito derivado de la síntesis de la
vitamina A cuya señalización esta mediada por dos tipos de receptores nucleares
denominados RAR y RXR que presentan las isoformas  ypara cada uno Se ha
mostrado el papel de la señalización del ácido retinoico en la regulación de la muerte
interdigital por los ratones dobles mutantes para el receptor RAR y RAR en los que se
observan sindactilias (Lohnes et al., 1994). Además, la implantación de perlas embebidas
en ácido RA en el interdígito de la extremidad del pollo promovió la apoptosis antes de la
muerte fisiológica y promovió el incremento de la expresión de Bmp7 y Bmp4 previo a la
regresión interdigital acelerada. Complementariamente, la aplicación de perlas embebidas
con los antagonistas de las BMPs, Noggin ó Gremlin inhibió la muerte celular promovida
por el ácido retinoico indicando que el ácido retinoico promueve la muerte celular
interdigital a través de BMPs. La demostración de la participación del RA en la inducción
de la muerte celular fue demostrada por la aplicación de perlas embebidas en un
antagonista especifico de la señalización del RA que inhibió la muerte celular interdigital
fisiológica resultando inclusive en la formación de un dedo ectópico en el interdígito
tratado (Rodriguez-Leon et al., 1999). Similarmente, la adición exógena de RA a
extremidades de ratón cultivadas indujo la expresión de Bax previo a la muerte del
mesénquima interdigital, mientras que la aplicación de un inhibidor de los receptores del
RA redujo tanto la expresión de Bax como a la muerte interdigital. La adición del RA a las
extremidades cultivadas del ratón disminuyó la expresión del receptor de FGFs, Fgfr1 en
el mesénquima interdigital pero no a Fgf8 expresado en la AER indicando que el RA
promueve la muerte interrumpiendo la señal de sobrevivencia de los FGFs secretados por
la AER en el interdígito e induciendo a Bax (Hernández-Martínez et al., 2009).
41
Contrariamente al interdígito, las células del mesodermo de la extremidad del pollo en
etapa 22 no promovieron la muerte celular cuando la aplicación de perlas embebidas en
RA se implantaron en el mesodermo central o anterior (Reijntjes et al., 2010).
Sonic Hedgehog (SHH) es una molécula a la que se le ha reconocido un papel
primordial en el establecimiento del patrón anterior-posterior de la extremidad de los
vertebrados amniotas. Shh se expresa en una región de la extremidad responsable de
establecer este patrón a la que se le ha denominado Zona de Actividad Polarizante (ZPA),
de tal manera que Shh ha servido como un marcador de la ZPA. La ZPA se localiza en el
mesodermo posterior de la extremidad y puede ser reconocida desde las primeras fases
en las que el primordio de la extremidad sobresale de la pared del cuerpo. El transplante
de la ZPA o la implantación de perlas embebidas en SHH en el mesodermo anterior de la
extremidad del pollo en etapa 20 generan la duplicación del autópodo en imagen
especular demostrando su participación en el establecimiento de este eje (Saunders and
Gasseling, 1983; Riddle et al., 1993). Notablemente, al menos en el mesodermo posterior
de la extremidad del pollo, la expresión de Shh al parecer se sobrelapa con la alta
actividad de muerte celular de la PNZ. El sobrelapamiento de imágenes de alas de pollo
en etapa 24, marcadas con Azul Nilo e hibridadas para localizar los transcritos de Shh,
mostraron que la ZPA se localiza en el mesodermo posterior distal y la PNZ en el
mesodermo posterior proximal. Además, hay una zona de colocalización entre estas dos
áreas; el área proximal de la ZPA con la parte distal del dominio de muerte de la PNZ.
Cuando es implantada una perla embebida en SHH en el mesodermo anterior de la
extremidad del pollo en etapa 20 y es evaluada de 18 a 20 horas después, la ANZ es
inhibida. Sin embargo, cuando la perla es implantada en el mesodermo posterior,
incrementando la concentración de SHH, la PNZ es extendida por el incremento de la
muerte celular. Estas observaciones llevaron a proponer que SHH regula el número de
células que comprenden a la ZPA promoviendo la muerte celular de las células que salen
del campo de esta región y que adquieren una posición proximal. Este recambio celular es
debido al reclutamiento hacia la ZPA de nuevas células provenientes del mesodermo
distal posterior que son altamente proliferativas (Sanz-Ezquerro and Tickle, 2000).
Como anteriormente se ha descrito, los FGFs emanados de la AER son factores de
sobrevivencia que permiten el crecimiento próximo-distal de la extremidad. Su papel en la
regulación negativa o inhibición de la muerte celular se ha demostrado en la extremidad
del pollo por la implantación de perlas embebidas en FGF2 o FGF4 en etapas 28-29 que
42
FIGURA 9. Señales involucradas en la regulación de la Muerte Celular Interdigital de la extremidad. El
ácido retinoico (AR) a través de su receptor (RAR) induce la expresión de Bax y por lo consiguiente la
activación de la vía intrínseca de la apoptosis. Además, el RA induce la expresión de Bmp cuyo ligando a
través de BMPRIA, que es expresado en el mesénquima interdigital, dispara la muerte celular. El ligando de
BMP puede unirse también a BMPRIA expresado en la AER resultando en la inhibición de la expresión del
factor de sobrevivencia, Fgf8, en la AER. La ausencia de FGF8 provoca la muerte de las células del
interdígito mientras que su presencia y difusión al interdígito induce la expresión de Cyp26 que inactiva al
RA. Antagonistas de BMPs, tal como Gremlin, expresados en el tejido interdigital secuestran e inhiben la
acción de las BMPs.
resulta en la inhibición de la muerte interdigital a las 12 horas post-implantación (Macias et
al., 1996). Sin embargo, cuando las extremidades del pollo son evaluadas 48 horas postimplantación de la perla, se muestra un intenso incremento de la muerte celular
interdigital. Además, la aplicación de perlas embebidas en un inhibidor específico de la
señalización de los FGFs (SU-5402) detiene la muerte interdigital 48 horas después de la
implantación. De manera similar, perlas embebidas en FGF2 implantadas en la ANZ de la
extremidad del pollo en etapas 20 a 22 inhibieron la muerte celular a las 12 horas postimplantación pero al ser evaluadas las extremidades tratadas a las 24 horas, la muerte
celular fue promovida drásticamente en la ANZ. Además la muerte celular promovida por
el FGF2 logró ser inhibida por la co-implantación de perlas embebidas en Noggin,
indicando que la muerte celular promovida por el FGF2 en el mesodermo interdigital y de
la ANZ está mediada por las BMPs (Montero et al., 2001). Al parecer los FGFs durante el
desarrollo de la extremidad del ratón contribuyen principalmente a la sobrevivencia de las
43
células mesodermales de la extremidad. La aplicación de perlas embebidas en FGF8 en
el interdígito de extremidades cultivadas de ratón de 12.5 dpc detuvo la muerte celular a
las 8 horas post-implantación junto con la sobrexpresión de Cyp26, una enzima que
metaboliza específicamente al RA a una forma inactiva. Complementariamente, la
aplicación en el medio de cultivo del inhibidor de la señal de los FGFs, el SU5402 en las
extremidades cultivadas promovió la muerte interdigital (Hernández-Martínez et al., 2009).
En la figura 9 se muestra un modelo de la integración de las diferentes señales descritas
hasta ahora que regulan la muerte celular interdigital.
44
JUSTIFICACIÓN.
La generación del ratón mutante condicional de BmprIa ha revelado que las BMPs
promueven la muerte celular programada interdigital a través de este receptor expresado
en la AER al inhibir la expresión del factor de sobrevivencia Fgf8. Sin embargo, también
se ha reconocido que las BMPs regulan la muerte celular de manera directa en el
mesénquima interdigital del pollo, aunque la maquinaria transcripcional de la señalización
de las BMPs que participa en este proceso es poco conocida. En el mesénquima de la
extremidad del pollo en desarrollo se ha observado la expresión de Alk2 y de BmprIa, este
último a bajos niveles. La formación de sindactilias y el sobrecrecimiento del mesodermo
anterior y posterior en la autópodo del pollo infectado con la forma dominante negativa de
BMPRIA han mostrado la participación de este receptor en la regulación de la muerte
celular del mesénquima interdigital de manera directa. Sin embargo, se ha observado que
aunque BmprIa es expresado en el mesénquima interdigital a partir de la etapa 28 en la
extremidad anterior, los niveles de expresión son muy bajos. Contrariamente, la expresión
de Alk2 es muy evidente en el mesénquima del ala en desarrollo pero su participación en
la regulación de la muerte celular es desconocida. Debido a su patrón de expresión, el
papel de los componentes de la vía canónica de la señalización de las BMPs durante la
muerte celular presentada durante el desarrollo de la extremidad es sugerente.
Contrariamente a los bajos niveles de Smad1 y a la ausencia de expresión de Smad5,
Smad8 es intensamente expresado en la región interdigital del pollo, además de que su
expresión es regulada por las BMPs al ser promovida la muerte interdigital lo que sugiere
un posible papel de Smad8 en la regulación de la muerte interdigital, sin embargo se ha
observado que concomitante al proceso apoptótico interdigital se incrementa la
concentración de SMAD1 fosforilada y su translocación al núcleo indicando que las BMPs
a través de SMAD1 puedan inducir genes promotores de la muerte celular. No se conoce
si la vía de señalización de las BMPs mediada por las SMADs pueda promover
directamente la expresión de los genes activadores de la apoptosis ó si sea parte de una
cascada molecular que promueve indirectamente este proceso. En este trabajo se evaluó
la participación de ALK2 en la regulación de la muerte celular interdigital y se analizó si la
inducción de la muerte celular en la ANZ por la señalización de las BMPs a través de la
vía de las SMADs es directa ó indirecta.
45
HIPÓTESIS.
Alk2 se expresará en el mesodermo interdigital de la extremidad posterior y regulará la
muerte interdigital de la extremidad del pollo. Además, la expresión, regulación y estado
de activación de algunas R-SMADs que son transductores de la vía canónica de las
BMPs, se hará presente durante la muerte celular de las distintas áreas de la extremidad
del pollo en desarrollo, indicando su participación directa ó indirecta en este proceso.
OBJETIVO GENERAL.
Evaluar la expresión y participación del receptor ALK2 en la regulación de la muerte
celular interdigital, así como analizar la posible participación de SMAD8 en la regulación
de la muerte de la Zona Necrótica Anterior, la Zona Necrótica Posterior y el mesodermo
interdigital de la extremidad posterior del pollo en desarrollo al evaluar su patrón de
expresión, estado de fosforilación y correlación con la muerte celular programada al
determinar su regulación por factores apoptóticos y antiapoptóticos.
OBJETIVOS PARTICULARES.
Determinar la expresión de Alk2 durante el desarrollo de la extremidad posterior del pollo
por hibridación in situ.
Evaluar la expresión de Alk2 durante la regresión del tejido interdigital de la extremidad
posterior del pollo por RT-PCR.
Determinar la regulación de Alk2 por los factores proapotóticos, RA y BMP7; el factor
condrogénico, TGF1, y el factor de sobrevivencia, FGF, para sugerir una posible
participación del receptor durante la morfogénesis de la extremidad.
Evaluar la participación de ALK2 en la regulación de la muerte celular transfectando la
forma deficiente en el dominio cinasa del receptor en el tejido interdigital de la extremidad
posterior del pollo.
Determinar la expresión de Smad1, Smad5 y Smad8 durante el desarrollo de la
extremidad posterior del pollo por hibridación in situ.
46
Determinar la regulación de Smad8 por los factores proapotóticos, RA y BMP7, y por el
factor de sobrevivencia, SHH, y sugerir una posible participación de SMAD8 en la
regulación de la muerte celular.
Analizar y correlacionar el estado de fosforilación de las R-SMADs de BMPs con
algunas áreas de muerte celular en la extremidad posterior del pollo.
Determinar si la participación de las BMPs en la inducción de la PCD es directa ó
indirecta en la extremidad del pollo en desarrollo.
47
MATERIALES Y MÉTODOS.
Manipulación de los embriones.
Huevos de pollo fertilizados libres de patógenos específicos (Alpes, Puebla, México) se
incubaron a 38°C y los embriones se identificaron y clasificaron en su etapa de desarrollo
de acuerdo a Hamburger y Hamilton (1992). Para manipular los embriones, se retiró la
parte anterior del cascarón con sus membranas anexas y el primordio de la extremidad
posterior en etapa 25 y 26 se expuso para implantarse una perla de heparina (SigmaAldrich, St. Louis, M.O., U.S.A.) previamente embebida en 2 mg/ml de BMP7
recombinante humana, en 1 mg/ml de Noggin recombinante humana, en 100 g/ml de
TGF1 recombinante humana (Preprotech, Ciudad de México, México) ó en 2.5 mg/ml de
SHH recombinante humana (RyD Systems, Minneapolis, M.N., U.S.A.). Perlas de
intercambio iónico (Sigma-Aldrich) se utilizaron para administrar 5 mg/ml de RA ó 10 mM
de SU-5402. Después de la implantación de la perla en el mesodermo anterior los
embriones de pollo se regresaron a la incubadora y las extremidades se analizaron a
diferentes tiempos para hibridación in situ o tinción con rojo neutro.
Sondas generadas a partir de cDNA de extremidades de pollo en desarrollo.
El RNA se extrajo de primordios de extremidad de pollo de 5, 6 y 7 días de desarrollo
embrionario usando reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). El cDNA se
sintetizó usando el kit Fist Strand cDNA synthesis para RT-PCR (AMV) (Roche Applied
Science, Indianapolis, IN, U.S.A.). La amplificación de fragmentos de 421 p.b.
correspondientes
a
Alk2
se
obtuvo
utilizando
los
siguientes
primers:
5’
CAAAACTCCGCCATCTCC 3’ and 5’ ACGGTTGCTTCCTACACACTC 3’. Para amplificar
una región especifica de 475 p.b. (región 580-1055) de Smad5 se utilizaron los primers 5’TTCGCCAAACAGTCCCTATC-3’ and 5’- AGCATAGACTTCCCCACCAA-3’, una región de
correspondiente a 664 p.b. de Smad8 (región 424-1087) se amplificó utilizando los
primers 5’-TCCTACCTCCAGTACTTGTTCC-3’ and 5’- CACATTCAGCATACACTTCTCC3’ y un fragmento de 586 p.b. específico para vegfr2 (región 3169-2754) se amplificó con
los primers 5’-GAGATGCTAGGCTACCGCTAA-3’ y 5’-CTGTCTGGTTTTCCTCCTGAAC3’. A excepción del fragmento correspondiente a vegfr2 que fue clonado en PGEM T-Easy
de Promega (Madison W.I., U.S.A.), los demás fragmentos se clonaron en el plásmido
pCRII-TOPO TA Cloning de Invitrogen (Carlsbad, C.A., U.S.A.). La autenticidad de los
48
fragmentos se confirmó por secuenciación. La sonda para Smad1 fue generosamente
donada por el Dr. Juan Hurlé (Universidad de Cantabria, España).
Hibridaciones in situ Whole Mount y en cortes histológicos.
Las sondas de RNA se generaron marcándolas con digoxigenina UTP (Roche) y se
usaron para realizar hibridación in situ whole mount de acuerdo a lo reportado
previamente (Gañan et al., 1998). Las muestras se trataron con 10 g/ml de proteinasa K
(PK) durante 28 minutos a 20°C para Smad1, Smad5 y Smad8, 70 g/ml de proteinasa K
durante 28 minutos a 20°C para Alk2 y 70 g/ml de proteinasa K durante 28 minutos a
26°C para vgfr2. La hibridación con la sonda de RNA se realizó a 65°C y los lavados
poshibridación a 70°C. Las reacciones se visualizaron con el substrato para fosfatasa
alcalina BM purple (Roche).
Para la realización de las hibridaciones in situ en cortes histológicos se fijaron las
extremidades posteriores en Paraformaldehído al 4% a 4°C toda la noche, se
deshidrataron y se incluyeron en Paraplast. Se obtuvieron cortes histológicos de 5 m que
posteriormente se rehidrataron. Los cortes histológicos se trataron con 10 g/ml de
proteinasa K preincubada a 37°C durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron
con 0.1% de Tween-20 en buffer de fosfatos
(PBT) y se incubaron con buffer de
hibridación a 65°C durante 15 minutos. La hibridación con las sondas de RNA se
realizaron a 65°C toda la noche. Se realizaron lavados post hibridación con 100 mM de
NaCl, 100 mM de Tris-HCl pH 9.5, 50 mM de MgCl2, 1% de Tween-20 y 2 mM (0.5 mg/ml)
de Levamisol (NTMT) y las reacciones se visualizaron con un substrato para la Fosfatasa
Alkalina, BM purple (Roche), por microscopia de luz.
Aislamiento de tejido interdigital.
RNA de interdígito de extremidades del pollo en etapa 28 a 32 se purifico con Trizol
(Invitrogen). Análisis por RT-PCR de las muestras se realizó usando el kit First-Strand
cDNA synthesis para RT-PCR (AMV) (Roche) con los oligonucleótidos especificos que
contribuyen a la amplificación del fragmento de 421 p.b. de Alk2 descritos anteriormente.
Se realizó una PCR para amplificar a un fragmento de 194 p.b. de -actina como control
interno. Los controles positivos se obtuvieron a partir del RNA de corazón y estomago.
49
Electroporación.
La estandarización del método de electroporación se describe detalladamente en el
Anexo 1. A los huevos de pollo fertilizados de 5, 6 y 7 días de incubación se les abrió un
orificio por la cámara de aire y se dejó expuesta la extremidad para electroporarla. El
protocolo de electroporación se basó en el método de Oberg y col. (Oberg et al., 2002). Al
tercer interdígito de la pata derecha expuesta se le inyectó de 2 a 5 g/ml de pCMV5-Dn
alk2 y de pCX-GFP. El electrodo negativo de tungsteno se cubrió con esmalte para uñas
dejando únicamente 100 m en la punta sin aislar. El electrodo negativo se colocó en el
área proximal del interdígito y el positivo tocando el ectodermo distal y se prosiguió a dar
1 pulso de 17 V y 70 milisegundos. Los huevos se taparon con cinta adhesiva y se
regresaron a la incubadora para que los embriones fueran analizados posteriormente. Las
extremidades electroporadas se procesaron con tinción de rojo neutro, TUNEL, Azul
Alciano ó para microscopía electrónica de barrido. Para la tinción con rojo neutro, las
extremidades se lavaron con rojo neutro, se fijaron en Formol Cálcico toda la noche y se
transparentaron con Xilol previo a dos pasos por Isopropanol. Para la tinción con azul
Alciano, las extremidades se fijaron en 96% de etanol, se permeabilizaron con acetona, se
tiñeron con 5% de azul Alciano-2% de rojo alizarina y se transparentaron con 1% de
hidróxido de potasio. La apoptosis se detectó por el ensayo de TUNEL utilizando el kit de
detección de muerte celular, TMR (Roche Applied Science).
Tinción para visualizar la muerte celular y expresión de transcritos por hibridación
in situ en Whole Mount.
Primordios de la extremidad posterior del pollo se incubaron durante 45 minutos en
LysoTracker DND-99 rojo (Molecular Probes) a 37°C, se fijaron en 4% de
Paraformaldehido y se proceso para hibridación in situ whole mount. Una vez que la
reacción se completó las extremidades se deshidrataron en metanol y se transparentaron
con una solución 2:1 de Benzil Benzoato : Benzil Alcohol (solución I) seguido de una
solución de partes iguales de las solución I : Metanol durante 1 hora cada una.
Tinción para visualizar la muerte celular y los vasos sanguíneos.
15 l de CellTracker Green (Molecular Probes) se inyectaron con un microinyector
(Celltram vario 5176 Eppendorf AG 22331 Hamburgo) utilizando una aguja de vidrio
50
cargando una solución 1:10 de CellTracker : Agua directamente a las cámaras del
corazón de embriones de pollo e incubados durante 35 minutos a 37°C. Las extremidades
se aislaron y se tiñeron inmediatamente con una solución de LysoTracker por otros 35
minutos. Las extremidades se fijaron toda la noche en 4% de Paraformaldehído, se
deshidrataron en metanoles decrecientes y se aclararon con alcohol Bencílico: Bencil
benzoato. Las extremidades se observaron con un microscopio estereoscópico con
fluorescencia.
Tinción con rojo neutro.
Las extremidades se aislaron, se lavaron en PBS y se tiñeron con rojo Neutro al 2% en
PBS ó en medio de cultivo celular. Las extremidades teñidas se fijaron en una solución
fría de Paraformaldehído 4%, 1 g de CaCl2 (pH 7.0) toda la noche. Se deshidrataron en
Isopropanol durante 1 hora dos veces y se aclararon en xileno para ser fotografiados
(Gañan et al., 1996).
Inmunofluorescencia
para
Caspasa
3
activa
y
doble
marcaje
con
Inmunofluorescencias para fosfo SMAD1/5/8 y TUNEL.
Para evaluar las formas fosforiladas de SMAD1/5/8 o de la Caspasa 3 activa, cortes
histológicos de extremidades posteriores del pollo en diferentes etapas de desarrollo se
obtuvieron previamente a la inclusión con Paraplast (Sigma-Aldrich). Los cortes se
rehidrataron, se bloquearon con 1% de albumina de suero bovino (BSA) diluido en 0.3%
de Tritón durante 2 horas e incubadas con anticuerpos anti-SMAD1/5/8 fosforiladas (Cell
Signaling, Canvers, M.A., U.S.A.) toda la noche a temperatura ambiente. Lavados se
realizaron con 0.3% de Tritón en PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario Cy3
(Jackson Laboratory, Sacramento, C.A., U.S.A.) 2 horas a temperatura ambiente. Los
tejidos se trataron con PK a 20 g/ml y se procesaron para el ensayo de TUNEL de
acuerdo a las instrucciones del fabricante (Roche). Finalmente el núcleo se tiño con
1mg/ml de 4’6’-Diamino-2-Phenilindole Dihidrocloruro (DAPI) (Sigma-Aldrich). Los tejidos
se analizaron por microscopía confocal y obtención de reconstrucciones tridimensionales
para evaluar la colocalización entre las SMADs fosforiladas de BMPs en el núcleo y las
células positivas a TUNEL.
51
Análisis cuantitativo de fosfo-SMAD1/5/8 y células positivas a TUNEL.
Se realizó un análisis cuantitativo para determinar el número de células positivas a
TUNEL, a fosfo-SMAD1/5/8 o a ambos en imágenes obtenidas pro microscopía confocal o
de fluorescencia de cortes histológicos de la región anterior de extremidades de pollo en
etapa 25-26 o del tejido interdigital en etapa 30-31. El conteo celular de cada área se
obtuvo con el programa Image-Pro Plus 6.0. Los conteos reportados son los promedios de
cuatro áreas tomadas de diferentes muestras.
52
RESULTADOS.
Alk2 es expresado en el mesodermo interdigital de la extremidad posterior del pollo.
ALK2 es un receptor tipo I de BMPs que promueve la condrogénesis de los elementos
esqueléticos de la extremidad y que es expresado en el mesodermo de la extremidad
anterior del pollo. Se evalúo la expresión de Alk2 por hibridación in situ Whole Mount en el
tejido interdigital de la extremidad posterior del pollo con el objetivo de que su patrón de
expresión sugiriera una posible relación de este receptor con la regulación de la muerte
interdigital, además de conocer si también es expresado en otras áreas de muerte
evidentes en etapas más tempranas del desarrollo de la extremidad posterior (Fig. 10). Se
encontró que Alk2 se expresó en la AER una vez que el primordio de la extremidad se
hace aparente en etapa 21 (Fig. 10 A). La expresión de Alk2 se mantuvo en la AER hasta
etapa 27, cuando el tejido interdigital empieza a reconocerse (Fig. 10 B-E).
Concomitantemente encontramos que Alk2 se expresó en el mesodermo de la extremidad
incluyéndose la ANZ y la PNZ (Fig. 10 A-D). En las etapas subsiguientes; de la etapa 28 a
la 30, la expresión de Alk2 se restringió al tejido interdigital (Fig. 10 E-G) y en etapa 31,
cuando inicia la muerte celular interdigital, se observó una intensidad menor de los
transcritos de Alk2 a lo largo del área central de este tejido (Fig. 10 H). Estos resultados
fueron confirmados por la hibridación in situ de Alk2 en cortes histológicos de las
extremidades posteriores del pollo en diversas etapas del desarrollo que similarmente a la
hibridación in situ Whole Mount, la expresión de Alk2 se localizó ubicuamente en las
células mesenquimales del primordio de la extremidad y en las células interdigitales (Fig.
10 I-L). Adicionalmente, los condrocitos de las falanges en crecimiento también mostraron
expresión de Alk2 (Fig. 10 K, L). La utilización de una sonda sentido de Alk2 se utilizó
como control y la hibridación en cortes histológicos con esta sonda no generó reacción
(Fig. 10 M-P).
Se confirmó la expresión interdigital de Alk2 por RT-PCR usando primers específicos
de Alk2 que amplificaron un fragmento de 421 p.b. a partir de cDNA obtenido del RNA
purificado del tercer tejido interdigital, localizado entre el cuarto y tercer dedo. El RNA se
aisló de 25 a 30 extremidades para cada una de las siguientes etapas: 28, 29, 30 y 32
(Fig. 11). Observamos una expresión constante de Alk2 en todas las etapas analizadas
que correlacionaron con la expresión observada de este receptor en el tejido interdigital
53
FIGURA 10. Expresión de Alk2 durante el desarrollo de la extremidad posterior del pollo. Hibridación
in situ de Alk2 en Whole Mount (A-H) y en cortes histológicos (I-L). Hibridación control con la sonda sentido
de Alk2 en cortes histológicos (M-P). Extremidad posterior completa en etapa 21 (A), 22 (B), 25 (C) y 26 (D).
Las flechas indican la expresión de Smad8 en la AER en A-D y en el tejido interdigital en E-K. Autópodos
completos en etapa 27 (E), 28 (F), 30(G) y 31 (H). Extremidad posterior en cortes histológicos en etapa 24
(I, M), 26 (J, N), 28 (K, O) y 30 (L, P).
por hibridación in situ Whole Mount (Fig. 11, carril del 4 al 7). Se ha reportado que Alk2 es
expresado durante el desarrollo del corazón del ratón (Kaartinen et al., 2004) y también se
ha observado en el laboratorio su expresión por hibridación in situ Whole Mount en el
corazón del pollo y en el sistema digestivo, por lo tanto se purificó el RNA del corazón del
pollo en etapa 24 y del estomago en etapa 25 y se utilizaron como controles positivos del
análisis de expresión de alk2 por RT-PCR (Fig. 11, carril 2 y 3). Como se esperó, se
observó la banda de 421 p.b. correspondiente a Alk2 del cDNA generado del corazón y
del estómago. La amplificación de un fragmento de 194 p.b. de -actina de pollo a partir
54
del RNA aislado de los interdígitos y los órganos evaluados fue realizada como control del
manejo adecuado del método empleado. La expresión de Alk2 en las regiones
interdigitales y su posterior disminución al inicio de la muerte interdigital sugiere una
posible participación de ALK2 en la regulación de la muerte celular interdigital.
FIGURA 11. Análisis de la expresión de Alk2 por RT-PCR. Los números en la parte superior indican el
número de carril. Amplificación de una banda de 421 p.b. correspondiente a un fragmento del cDNA de Alk2
obtenido del corazón (carril 2), estómago (carril 3) y mesodermo interdigital en etapa 28 (carril 4), 29 (carril
5), 30 (carril 6) y 32 (carril 7). Los carriles 8 al 13 muestran la amplificación de un fragmento de 194 p.b.
correspondientes al cDNA de -actina de pollo como control del método usado. El carril muestra las bandas
correspondientes a un marcador de peso molecular de 100 p.b.
La transfección de la forma dominante negativa de ALK2 en el interdígito de la
extremidad del pollo no modificó la muerte celular programada.
Para evaluar la participación de ALK2 en la regulación de la muerte interdigital, un vector
de expresión que acarrea la forma dominante negativa de ALK2 fue transfectada por
electroporación en el tercer interdígito del pollo en etapa 28, 29 y 30 (Fig. 12). El vector de
expresión utilizado fue el pCX-ALK2 KR que expresa a la forma dominante negativa de
ALK2 bajo el promotor de -actina de pollo y un Enhancer ó Potenciador del
Citomegalovirus. Debido a que el pCX-ALK2 KR no expresa algún gen reportero para
visualizar su expresión, este plásmido fue co-transfectado por electroporación con el pCXGFP que expresa a la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor de beta-actina y
del Citomegalovirus. Una concentración de 3 a 4 g/l de cada vector fue inyectada en la
región media del tejido interdigital e inmediatamente fue aplicada la corriente eléctrica
55
FIGURA 12. La sobrexpresión en el tejido interdigital por electroporación de una forma dominante
negativa de ALK2 que codifica al receptor con un defecto en el dominio cinasa (ALK2 KR), no alteró
el patrón de muerte celular interdigital. Extremidad posterior de pollo 24 horas después de la
electroporación en etapa 29 visualizada en campo claro (A) y en campo claro y con filtro de UV para
observar la expresión de GFP (B). Extremidades teñidas con rojo neutro transfectadas con la forma
defectuosa en el dominio cinasa de ALK2 KR evaluadas en etapa 32 (C) y en etapa 34 (E). La extremidad
contralateral sin transfectar en etapa 32 se muestra en (D) y en etapa 34 en (F). Las flechas señalan al
interdígito transfectado en C y E con un patrón de muerte celular similar a las extremidades contralaterales
no transfectadas.
correspondiente a 17V, 70 ms, 1 pulso. La expresión de GFP a las 24 horas fue
demostrada por la observación directa de la extremidad disecada en un microscopio
56
estereoscópico de fluorescencia lo que indicó el éxito de la transfección por
electroporación (Fig. 12 A, B). Sin embargo la extremidades transfectadas con estos dos
plásmidos o sólo con el pCX-ALK2 KR no mostraron alteración de la muerte interdigital
evaluada por la tinción con rojo neutro en etapa 32 (Fig. 12 C) y 34 (Fig. 12 D), ya que
presentaron el mismo patrón de muerte celular programada al de las extremidades
contralaterales ó transfectadas solamente con el pCX-GFP. Estos datos indican que
aunque Alk2 es expresado en el tejido interdigital no parece participar en la muerte celular
regulada por BMPs.
La expresión de Alk2 es regulada por la señalización FGF.
Para apoyar la observación de que Alk2 no está relacionado a las señales promotoras de
la muerte celular y a su vez conocer la regulación de expresión de este gen por algunos
factores que participan de manera importante en la morfogénesis de la extremidad,
evaluamos la respuesta de la expresión de Alk2 ante la implantación de perlas embebidas
en BMP7 y ácido retinoico, ambas moléculas involucradas en la promoción de la muerte
interdigital así como de perlas embebidas en TGF1 y en el inhibidor del receptor de
FGFs, el SU-5402, cuyas señales están involucradas en la condrogénesis del esqueleto
apendicular (Fig. 13). Como se esperó, la implantación de perlas embebidas en RA (Fig.
13 A) y en BMP7 (Fig. 13 G), en el interdígito en etapa 28 y 29 aceleraron la apoptosis
interdigital evaluada por el rojo neutro (Fig. 13 A, B, G, H), por lo tanto se prosiguió a
evaluar la expresión de Alk2 por hibridación in situ en Whole Mount a diferentes tiempos
postimplantación de la perla. La expresión de Alk2 se evaluó a las 6, 8, 16 y 20 horas post
implantación de la perla embebida en RA (Fig. 13 C-F) y a las 2, 11 y 22 horas post
implantación de la perla embebida en BMP7 (Fig. 13 I-K). No se encontró cambio en la
expresión de Alk2 en ningún tiempo analizado en ningún tratamiento (Fig. 13 C-F, I-K). La
implantación de perlas embebidas en TGF1 en el tejido interdigital en etapa 28 y 29
induce la expresión secuencial de Sox9 a los 30 minutos, Sox8 y Sox10 a la hora, L-Sox5
y Bmpr1b a las seis horas, Ventroptina a las nueve horas, Sox6, ColI y Agrecano a las
doce horas, Noggin a las dieciséis horas y Gdf5 a las veinte horas postimplantación de la
perla, lo que resulta en la inducción de una cascada molecular que genera la formación de
un dedo ectópico (Chimal-Monroy et al., 2003). Para reconocer si Alk2 es un gen regulado
por TGF1 y pueda, por lo tanto, ser considerado como parte de la cascada que regula la
57
FIGURA 13. Análisis del efecto de la aplicación exógena del ácido retinoico (RA), BMP7 y TGF1
sobre la expresión de Alk2, la muerte celular y la condrogénesis durante el desarrollo del autópodo
de la extremidad del pollo. Aplicación de una perla embebida en RA en el tejido interdigital y teñido con
rojo neutro 16 horas después de la implantación de la perla (A). La flecha indica la posición de la perla
embebida en RA que promovió la muerte en el interdígito. La extremidad contralateral se muestra en (B). La
flecha indica el patrón normal de muerte de la extremidad contralateral. Expresión de Alk2 a las 6 (C), 8 (D)
16 (E) y 20 (F) horas post implantación de la perla con RA. Las flechas señalan la perla implantada,
embebida previamente en RA, en el interdígito sin cambios en la expresión de Alk2. Extremidad teñida con
Rojo Neutro 20 horas después de la implantación de una perla embebida en BMP7 en el tejido interdigital
(G). La flecha muestra la presencia de muerte celular inducida por la perla embebida en BMP7 y que está
ausente en el interdígito de la extremidad control. Tercer interdígito de la extremidad contralateral (H).
Expresión de Alk2 en el tejido interdigital evaluada a las 2 (I), 11 (J) y 22 (K) horas post implantación de las
perlas embebidas en BMP7. Las flechas señalan las perlas embebidas en BMP7 implantadas en el
interdígito que no muestra cambios en la expresión de Alk2. Inducción de un dedo ectópico en el tercer
interdígito por la aplicación de una perla embebida en TGF1 (L). La flecha señala la formación del dedo
ectópico. Truncamiento del tercer dedo por el engrosamiento excesivo del cartílago promovido por la
aplicación de una perla embebida en TGF1 en la punta del dedo en desarrollo (flecha) en etapa 28 (M).
Expresión de Alk2 luego de 1 (N), 8 (O), 14 (P), 20 (Q) y 24 (R) horas después de la implantación de una
perla embebida en TGF1 en la punta del tercer dedo en desarrollo (N, P) ó en el tejido interdigital (O, Q, R).
Las flechas muestran las perlas implantadas en N a R.
58
condrogénesis, se aplicó una perla embebida en TGF1 en el interdígito y se evaluó la
expresión de Alk2 a diferentes tiempos postimplantación de la perla. La aplicación de la
perla embebida en TGF1 generó un dedo ectópico (Fig. 13 L), sin embargo, al igual que
con el tratamiento de BMP7 y ácido retinoico, tampoco se observó cambió en la expresión
interdigital de Alk2 evaluada a las 8, 20 y 24 horas postimplantación (Fig. 13 O, Q, R). La
aplicación del TGF1 en la punta del dedo en desarrollo puede generar un engrosamiento
del cartílago, por el incremento en el reclutamiento de células precondrogénicas alrededor
de la perla que resulta en el truncamiento del dedo (Gañan et al., 1996). Evaluamos la
expresión de Alk2 una hora (Fig. 13 N) y 14 horas (Fig. 13 P) después de que una perla
embebida en TGF1 se implantó en la punta del dedo en etapa 28. La implantación de
esta perla resultó en un engrosamiento del cartílago (Fig. 13 M), sin cambio en la
expresión de Alk2 expresado en el mesodermo de la punta del dedo (Fig. 13 N, P). El
crecimiento próximo distal del primordio de la extremidad es detenido cuando los niveles
de la señalización del FGF emanados de la AER son disminuidos lo que resulta en
extremidades truncadas debido a una reducción en la proliferación, sobrevivencia y
diferenciación del mesénquima distal de la extremidad (Yu y Ornitz, 2008). Este nivel de
truncamiento puede ser controlado dependiendo del momento del desarrollo en que l
señalización FGF es inhibida. Para evaluar la regulación de Alk2 por la señalización de los
FGFs, se implantaron perlas embebidas en el inhibidor SU-5402 en el mesénquima distal
de la extremidad posterior del pollo y éstas se fijaron 4, 6, 12 y 24 horas después de la
implantación de la perla (Fig. 14 C, D, E y F) para posteriormente procesarlas para
localizar la expresión de Alk2 por hibridación in situ Whole Mount. Se observó una
disminución en la expresión de Alk2 circundante a la perla a las 12 horas post
implantación (Fig. 14 E) y este decremento se mantuvo a las 24 horas post implantación
(Fig. 14 F). La aplicación de a perlas implantadas en la AER y evaluadas 16 horas
después mostró una reducción de la AER y por lo tanto una disminución en la expresión
de Alk2 en esta estructura (Fig. 14 A, B). La aplicación de la perla embebida en el SU5402 resultó en el truncamiento de los elementos esqueléticos distales evaluados 24
horas después de la implantación de las perlas (Fig. 14 G, H). Este truncamiento no fue
debido a un incremento en la muerte celular ya que las extremidades tratadas no
mostraron áreas positivas a rojo neutro (Fig. 14 I, J) lo que indica, como se ha reportado
en la extremidad del ratón, que la inhibición en la señal de los FGFs interrumpe el
reclutamiento de las células mesenquimales hacia el linaje condrogénico (Yu y Ornitz,
2008). Debido a que la expresión de Alk2 no fue regulada por BMP7, ácido retinoico y
59
TGF1, se sugiere que Alk2 no participa en la regulación de la muerte interdigital ni en la
formación de los dedos promovidos por la señalización del TGF. Tanto la señalización de
FGF como de las BMPs están involucradas en el reclutamiento de las células
mesenquimales de la extremidad hacia el linaje condrogénico en etapas muy tempranas
del desarrollo. Dado que el receptor tipo I de BMPs, Alk2, es expresado en el
mesénquima del primordio de la extremidad y es regulado por la señalización de los
FGFs, cabría preguntarse si ALK2 podría participar en las primeras fases de la formación
de las condensaciones condrogénicas.
FIGURA 14. Análisis del efecto de la aplicación exógena del inhibidor del receptor de FGFs, el SU5402, sobre la expresión de Alk2, la condrogénesis y la muerte celular programada durante el
desarrollo de la extremidad posterior del pollo. La implantación de una perla embebida en el SU-5402 en
la AER afecta su extensión observada por la disminución en la expresión de Alk2 a las 16 horas post
implantación (A). Extremidad contralateral con una extensión amplia de la AER observada por la expresión
de Alk2 (B). Las flechas indican la expresión de Alk2 en la AER Expresión de Alk2 a las 4 (C), 6 (D), 12 (E) y
24 (F) horas post implantación de la perla embebida en el SU-5402. Las flechas indican la posición de las
perlas y la disminución en la expresión de Alk2 en E y F. Extremidad posterior del pollo teñida con azul
Alciano en etapa 28 (G). Extremidad teñida con Azul Alciano tratada con el SU-5402 veinticuatro horas
antes de la fijación (H). La flecha indica la porción truncada de la extremidad por el efecto del SU-5402.
Autópodo de la extremidad posterior en etapa 28 teñida con rojo neutro (I). Autópodo tratado con el SU5402 y teñido con rojo neutro 24 horas después de la implantación. La flecha muestra la posición de la perla
y la ausencia de muerte celular en la región tratada.
60
La expresión de las R-SMADs de BMPs es diferencial y dinámica.
Para evaluar la expresión de las R-SMADs de BMPs en las diferentes áreas de muerte
celular programada de la extremidad del pollo y plantear una posible participación de
estas en la regulación de este proceso analizamos por hibridación in situ Whole Mount la
expresión de Smad1, Smad5 y Smad8 durante el desarrollo de la extremidad posterior del
pollo. Smad1 se expresó en el mesodermo que bordea a todo el primordio de la
extremidad en el que se incluye al mesénquima anterior, posterior y distal en etapa 22
(Fig. 15 A). La evaluación de la expresión de Smad1 en etapa 25 y 27 indicó que la
expresión de Smad1 se restringió al mesénquima distal excluyéndose de las áreas en
donde se forman las condensaciones cartilaginosas y los futuros elementos esqueléticos
(Fig. 15 B). La expresión de Smad1 fue observada en el tejido interdigital en etapa 28
(Fig. 15 C) y mantenida en este tejido en las etapas subsiguientes (Fig. 15 D-F), incluso
durante la regresión interdigital en la etapa 32 a la 34 (Fig. 15 G-I). Adicionalmente
Smad1 se expresó en los tendones extensores y flexores a partir de la etapa 27 (Fig.15 D)
y continuó esta expresión hasta que el autópodo estuvo completamente formado (Fig.15
E-I).
FIGURA 15. Patrón de expresión de Smad1 durante el desarrollo de la extremidad. Hibridación in situ
Whole Mount de la extremidad posterior del pollo en etapa 22 (A), 26 (B), 28 (C), 29 (D), 30 (E), 31 (F), 32
(G), 33(H) y 34 (I). Las flechas indican la posición de los tendones ventrales en desarrollo que expresan
Smad1 y las cabezas de flecha la expresión de Smad1 en el interdígito.
61
Los transcritos de Smad5 se localizaron en la AER en etapa 21 (Fig. 16 B) y persistió
hasta la etapa 27 (Fig. 16 C-E), cuando el tejido interdigital empieza a reconocerse. En el
mesodermo del primordio de la extremidad los transcritos de Smad5 fueron observados
específicamente en la región posterior distal a partir de la etapa 20 a la 25, coincidiendo al
parecer con la Zona de Actividad Polarizante (ZPA) y con la expresión de Shh (Fig. 16 AD). En etapa 26 y posteriores Smad5 fue detectado en el mesénquima distal con mayor
intensidad en el tejido localizado entre la AER y los dedos en desarrollo (Fig. 16 E-J). Una
tinción muy difusa en el tejido interdigital se observó durante la formación del autópodo
hasta etapa 32 (Fig. 16 G-J), sugiriendo la expresión de bajos niveles de Smad5 en esta
región ó incluso la posibilidad de un fondo que podría adquirirse al incrementar el tiempo
de revelado al finalizar la técnica.
FIGURA 16. Patrón de expresión de Smad5 durante el desarrollo de la extremidad. Hibridación in situ
Whole Mount de la extremidad posterior del pollo en etapa 20 (A), 21 (B), 22 (C), 24 (D), 26 (E), 27 (F), 28
(G), 29(H) y 30 (I) y 32 (J). Las flechas en A, B y D muestran la expresión de Smad5 en el mesénquima
posterior y en F a G la expresión de Smad5 en el mesénquima distal que bordea la punta de los dedos en
desarrollo.
Smad8 se expresó intensamente de manera específica y confinada en el mesénquima
anterior e interdigital tanto de la extremidad anterior como de la posterior del pollo en
desarrollo. En el primordio del ala, los transcritos de Smad8 se detectaron en el
mesénquima anterior a partir de la etapa 19 (Fig. 17 A), mientras que en la extremidad
posterior se observaron a partir de la etapa 20 (Fig. 17 H). A partir de estas etapas la
expresión anterior de Smad8 se mantuvo hasta el comienzo del desarrollo del autópodo
62
en etapa 28 (Fig. 17 B-G, I-N, 9 A, B, D, E). Contrariamente al mesénquima anterior, una
tinción tenue de la reacción fue persistente en el mesénquima distal y posterior durante
todo el crecimiento del primordio indicando que bajos niveles de Smad8 son expresados
FIGURA 17. La expresión de Smad8 precede y coincide con algunas áreas de muerte celular durante
el desarrollo de la extremidad anterior y posterior del pollo. Expresión de Smad8 durante el desarrollo
del ala en etapa 19 (A), 21(B), 22(C), 23(D), 24(E), 25(F), 26(G) y de la pata en etapa 20 (H), 21 (I), 22 (J),
23 (K), 24 (L), 25 (M), 26 (N). Las flechas de A a N señalan la expresión endógena de Smad8 en el
mesénquima anterior y las cabezas de flecha de B a F, J y K muestran la baja expresión de Smad8 en el
mesénquima posterior. Expresión de Smad8 en corte histológico de la extremidad posterior en etapa 24 (O).
Inmunofluorescencia de SMAD1/5/8 fosforilada en la extremidad posterior en etapa 24 (P). Patrón de
muerte celular visualizada por la tinción con rojo neutro en la extremidad posterior del pollo en etapa 22 (Q),
23 (R), 24 (S), 25 (T), 26 (U). Las flechas en R a U muestran la ANZ teñida por el Rojo Neutro. Amplificación
y comparación de la expresión de Smad8 y del patrón de muerte celular visualizado con rojo neutro en la
región anterior de la extremidad posterior del pollo en etapa 21 (V), 25 (W) y 26 (X).
en esas áreas (Fig. 17 B-G, J-N). Esta observación se confirmo por hibridación in situ en
cortes histológicos de primordios de extremidades posteriores en etapa 24 y 26 en las
cuales se visualizó la expresión de Smad8 en las células del mesénquima distal y
63
posterior con menor intensidad que en la porción anterior (Fig. 17 O). Para evaluar si las
regiones de la extremidad que expresan Smad8 también muestran actividad de las RSMADs de BMPs se realizó una inmunofluorescencia para detectar a las formas
fosforiladas de SMAD1, 5 y 8 en cortes histológicos de primordios de la extremidad
posterior del pollo en etapa 24 y 26. La inmunofluorescencia mostró que el patrón de
expresión de Smad8 y el de fosforilación de SMAD1, 5 y 8 fueron muy similares lo que
indica que la señalización de las BMPs mediada por las proteínas SMADs se encuentra
activa en las células del mesénquima que bordea al primordio de la extremidad (Fig. 17
P). Durante la formación del autópodo en etapa 28, Smad8 se expresó en el mesodermo
interdigital y en la prospectiva PNZ del autópodo que es el mesodermo subyacente al
dedo posterior en formación
y que es eliminado por apoptosis en las etapas
subsiguientes (Fig. 18 B, C, E, F). Este patrón se encontró tanto en el autópodo de la
extremidad anterior como en la posterior (Fig. 18 B, C, E, F). Estos resultados muestran
que a diferencia de Smad1 y Smad5, la expresión de Smad8 al parecer coincide
claramente con varias áreas de muerte celular durante el desarrollo de la extremidad
anterior y posterior del pollo y que la activación de las R-SMADs de BMPs en estas áreas
sugiere su posible participación en la regulación de este proceso.
El patrón de expresión de Smad8 precede al patrón de la muerte celular.
Debido a que la expresión de Smad8 pareciese sobrelaparse con la ANZ en etapas
tempranas y con la PNZ y la INZ durante la formación del autópodo, se comparó el patrón
de expresión de Smad8 con el patrón de muerte celular en extremidades posteriores
teñidas con rojo neutro, un colorante vital que detecta el patrón de las células muertas
fagocitadas (Todt y Fallon, 1987). La comparación entre estas extremidades hibridadas
para Smad8 y teñidas con rojo neutro en la misma etapa del desarrollo mostró un patrón
similar entre la etapa 23 y la 27 en el mesénquima anterior (Fig. 17 K-N, R-U, 18 D, G).
Destacablemente, la expresión de Smad8 en el mesénquima anterior presentó un patrón
punteado muy similar al observado en las extremidades teñidas con rojo neutro en las
etapas 25 y 26 (Fig. 17 W, X). Sin embargo Smad8 precedió a la ANZ debido a que la
muerte celular fue evidenciada en etapa 22 a diferencia de los transcritos de Smad8
observados en etapa 21 en el borde anterior de la extremidad (Fig. 17 V). Similarmente
durante la formación del autópodo la expresión de Smad8 se localizó en el tejido
interdigital y en el mesodermo posterior en etapa 28 mientras que la muerte interdigital y
la PNZ del autópodo fueron evidentes a partir de la etapa 30 (Fig. 18 E, F, H, I, J, K).
64
Estas observaciones sugieren que la expresión de Smad8 precede a la muerte celular de
la ANZ, la PNZ del autópodo y de la INZ.
FIGURA 18. La expresión de Smad8 precede y coincide con el mesodermo interdigital y con la PNZ
durante el desarrollo del autópodo la extremidad anterior y posterior del pollo. Expresión de Smad8
durante el desarrollo del ala en etapa 27 (A), 28 (B), 30 (C) y de la pata en etapa 27 (D), 28 (E), 30 (F). Las
flechas indican la expresión de Smad8 en el tejido interdigital y las cabezas de flecha la expresión de
Smad8 en la PNZ. Patrón de muerte celular visualizada con la tinción con rojo neutro en el autópodo de la
extremidad posterior del pollo en etapa 27 (G), 28 (H), 30 (I). Las flechas en G e I muestran el área de
muerte celular de la ANZ y la PNZ respectivamente. Amplificación y comparación de la expresión de Smad8
y del patrón de muerte celular visualizado con rojo neutro en la PNZ del autópodo posterior en etapa 28 (J).
65
La expresión de Smad8 es regulada en la ANZ por BMP7.
Debido a que al parecer existe una correlación entre la expresión de Smad8 y el
desarrollo de la muerte celular de la ANZ evaluamos la regulación de la expresión de
Smad8 por algunos factores involucrados en la regulación de la muerte celular de esta
área. La implantación de perlas embebidas en BMP2, BMP7 y BMP5 incrementan el área
de la ANZ cuando son implantadas en el mesodermo anterior del primordio de la
extremidad del pollo, por lo tanto evaluamos si la señalización de las BMPs promueven la
expresión de Smad8 para darnos indicios sobre un posible papel de SMAD8 en la
regulación de la muerte celular de la ANZ promovida por las BMPs. Para esto perlas
embebidas en BMP7 se implantaron en medio del mesénquima anterior de extremidades
posteriores en etapa 24 y 25 y se fijaron a las 3, 6, 9, 10 y 24 horas post implantación de
la perla y se procesaron para analizar tanto la expresión de Smad8 por hibridación in situ
Whole Mount como la muerte celular por tinción con rojo neutro. La expresión de Smad8
se extendió ectópicamente a las 6 horas postimplantación de la perla en el mesénquima
anterior antes de que alguna evidencia de muerte celular fuese detectada en las
extremidades teñidas con rojo neutro (2/4) (Fig. 19 A, B I, J). Esta extensión de la
expresión de Smad8 se mantuvo a las 9 horas postimplantación y se empezó a evidenciar
un aumento en el área de muerte celular en las extremidades analizadas con rojo neutro.
A las 10 horas el área de muerte celular de la ANZ se incrementó claramente (4/4) (Fig.
19 C, D) y la expresión de Smad8 persistió ectópicamente (7/9) (Fig. 19 K, L). A las 24
horas post implantación se observó un surco en el borde anterior de la extremidad
posiblemente como consecuencia del tejido eliminado por el tratamiento con BMP7, pero
sólo en un experimento de cuatro la expresión de Smad8 fue visualizada bajo la misma
circunstancia (1/4) lo que sugiere que la expresión de Smad8 es disminuida antes de que
la muerte celular culmine (Fig. 19 M, N). Para evaluar si Smad8 puede ser expresado
ectópicamente por la señalización de las BMPs en el mesodermo anterior proximal que no
es eliminado de manera fisiológica por apoptosis en etapa 25, se implantaron perlas
embebidas en BMP7 en el mesodermo anterior proximal y se evalúo la expresión de
Smad8 y la muerte celular a las 10 horas post implantación de la perla. Contrariamente al
mesodermo anterior que es muy receptivo a expresar Smad8 y a ser eliminado por la
señal de las BMPs, el mesénquima anterior proximal solo mostró un ligero incremento en
la expresión de Smad8 (Fig. 19 O, P) y en la muerte celular (Fig. 19 G, H). Estos
resultados experimentales apoyan la observación de que Smad8 precede a la muerte
66
celular y muestran que Smad8 es un gen regulado por la señalización de las BMPs
principalmente en el mesodermo anterior sensible a esta señal.
FIGURA 19. Análisis del efecto de la aplicación exógena de BMP7 y del RA sobre la expresión de
Smad8 y la muerte celular en las extremidades del pollo en desarrollo. Extremidades teñidas con rojo
Neutro (A-H, Q, R, U, V) e hibridadas con la sonda anti-Smad8 (I-P, S, T, W, X). Extremidad contralateral (A,
I) y experimental tratada con una perla embebida en BMP7 seis horas después de su implantación en el
mesénquima anterior (B, J). La flecha en B señala la perla implantada y un patrón de normal de la ANZ. La
flecha en J muestra el incremento en la extensión de la expresión de Smad8 en el mesénquima anterior.
Extremidad contralateral (C, K) y experimental tratada con una perla embebida en BMP7 diez horas
después de su implantación en el mesénquima anterior (D, L). Las flechas muestran la extensión tanto de la
muerte celular (D) como de la expresión de Smad8 (L) por la acción de BMP7 en el mesénquima anterior.
Acercamiento del mesénquima anterior de la extremidad contralateral (E, M) y experimental tratada con una
perla embebida en BMP7 veinticuatro horas después de
su implantación (F, N). Acercamiento del
mesénquima anterior y proximal de la extremidad contralateral (G, O) y experimental tratada con una perla
embebida en BMP7 diez horas después de su implantación (H, P). Extremidad contralateral (Q, S) y tratada
con una perla embebida en RA veinte horas después de su implantación en el mesénquima anterior (R, T).
La flecha en T señala la expresión ectópica de Smad8 rodeando a la perla. Extremidad contralateral (U, W)
y tratada con una perla embebida en RA veinte horas después de su implantación en el mesénquima central
(V, X). Las flechas señalan la posición de las perlas.
El ácido retinoico promueve la muerte celular y regula la expresión de Smad8 en el
mesodermo anterior de la extremidad posterior del pollo en etapas 25 y 26.
El ácido retinoico es otro regulador importante de muerte celular programada interdigital
ya que la implantación de perlas embebidas en ácido retinoico en el tejido interdigital del
67
pollo resulta en la aceleración de la muerte celular interdigital. Complementariamente la
aplicación de perlas embebidas con un inhibidor de la señalización del ácido retinoico
inhibe la muerte de este tejido (Rodriguez-Leon et al., 1999). Sin embargo, la aplicación
del ácido retinoico en el mesodermo anterior de extremidades de pollo en etapas
tempranas actúa, similarmente a SHH, como una señal polarizante promoviendo la
duplicación en imagen especular de los elementos autopodiales. Por lo tanto, evaluamos
si el RA extiende la muerte celular de la ANZ y si regula la expresión de Smad8 en dicha
zona en extremidades en etapa 25 y 26. Perlas de intercambio iónico embebidas en RA
se implantaron en el mesodermo anterior de las extremidades posteriores en esas etapas
del desarrollo. Posteriormente se aislaron y fijaron a las 8 y 20 horas postimplantación
para teñirlas con rojo neutro o para analizar la expresión de Smad8 por hibridación in situ
Whole Mount. Se observó que el RA extendió el área de muerte celular de la zona
necrótica (2/2) (Fig. 19 Q, R), además de que indujo la expresión de Smad8 alrededor de
la perla a las 20 horas después de su implantación (Fig. 19 S, T). Se ha reportado que la
implantación de perlas embebidas en RA en el mesénquima central de primordios de
extremidad de pollo en etapa 22 y analizados en etapa 25 no promueve la muerte celular
(Reijntjes et al., 2010). Analizamos si Smad8 se expresa en estas células mesenquimales
que no son susceptibles a la señal de muerte promovida por el RA implantando perlas
embebidas en RA en esta área de extremidades posteriores en etapa 22. Como
previamente se reportó (Reijntjes et al., 2010), se observo ausencia de muerte celular en
el mesénquima central a las 20 horas postimplantación (4/4) (Fig. 19 U, V).
Correlativamente y de acuerdo con un posible papel de Smad8 como regulador de la
muerte celular, no se encontró expresión de Smad8 en el mesénquima central tratado con
RA (5/5) (Fig. 19 W, X). Estos datos indican que las células del mesénquima susceptibles
a la señal apoptótica promovida por el RA responden aumentando la expresión de
Smad8.
SHH inhibe la expresión de Smad8 en el mesodermo anterior y la promueve en el
mesodermo posterior del primordio de la extremidad posterior del pollo.
SHH es el morfógeno que establece el patrón antero-posterior de la extremidad. Cuando
perlas embebidas en SHH son implantadas en el mesodermo anterior se inicia la
duplicación en imagen especular de los dedos, previo a la inhibición de la muerte celular
de la ANZ. Con el fin de continuar con la lógica de correlacionar la expresión de Smad8
con señales que regulan la muerte de la ANZ y evaluar su regulación se implantaron
68
FIGURA 20. Efecto de la aplicación exógena de SHH sobre la expresión de Smad8, Ptc y la muerte
celular en el mesénquima anterior de la extremidad del pollo en desarrollo. Extremidad contralateral
(A) y experimental tratada con una perla embebida en SHH en el mesodermo anterior (B). 20 horas después
del tratamiento las extremidades se tiñeron con rojo neutro. La flecha en S muestra la ausencia de muerte
en el mesénquima anterior. Extremidades hibridadas con la sonda anti-sentido de Smad8 (C-H). Extremidad
contralateral (C) y experimental tratada con una perla embebida en SHH 20 horas después de su
implantación en el mesénquima anterior (D). Extremidad contralateral (E) y experimental tratada con una
perla embebida en SHH 20 horas después de su implantación en el mesénquima central (F). La flecha en D
y F señala la expresión restringida de Smad8 en el mesénquima anterior por la acción de SHH. La cabeza
de flecha en F indica la expresión intensificada en el mesénquima posterior de Smad8 por la perla embebida
con SHH en el mesénquima central. Extremidad contralateral (G) y experimental tratada con una perla
embebida en SHH 18 horas de su implantación en el mesénquima anterior proximal (H). Las flechas
señalan la expresión de endógena de Smad8 sin mostrar alteración en el mesénquima anterior de la
extremidad tratada con SHH. Extremidad contralateral (I) y experimental tratada con una perla embebida en
SHH (J). 18 horas del tratamiento las extremidades se hibridaron con una sonda anti-sentido para Ptc.
69
perlas embebidas en la proteína SHH en el mesodermo anterior de extremidades en
etapa 22, 23 y 24 y se analizaron a las 18, 20 y 24 horas postimplantación ya que se ha
reportado que a estas horas se observa inhibición de la ANZ por SHH. Una completa
inhibición de la muerte celular de la ANZ se observó después del tratamiento con SHH
(7/7) (Fig. 20 A, B). Aunque la expresión de Smad8 no se abatió totalmente, se inhibió en
la porción distal anterior (11/11) restringiéndose su expresión solo a la porción proximal
del mesodermo anterior y el cual al parecer no se sobrelapa con la ANZ y por lo tanto no
es eliminada por muerte celular programada (Fig. 20 C, D). Aunque las células del
mesénquima anterior responden sobreviviendo ante la señal de SHH, las células del
mesodermo posterior proximales a la zona de actividad polarizante (ZPA) son eliminadas
por la aplicación de perlas embebidas en SHH en el mesodermo central ó posterior. Para
evaluar si hay un incremento en la expresión de Smad8 en la región posterior y una
inhibición en la anterior se implantaron perlas embebidas en SHH en el mesénquima
central del primordio de la extremidad en etapa 22, 23 y 24 y las extremidades se
hibridaron con la sonda anti Smad8 a las 18, 20 y 24 horas posimplantación de la perla.
Un incremento en la expresión de Smad8 fue observada en el mesénquima posterior,
además de que esta expresión se restringió en el mesénquima anterior proximal (Fig. 20
E, F). Para evaluar si el tratamiento directo de SHH en el mesénquima anterior proximal
podría inhibir la expresión de Smad8 las perlas fueron colocadas en esa región e
hibridadas 18 horas después. Estos experimentos no mostraron cambios en la expresión
de Smad8 en esa región (Fig. 20 G, H). La difusión y respuesta de las células ante la
señalización de SHH fue confirmada al evaluar la expresión de Ptc, un gen de respuesta
inducido por la señalización SHH. Para esto se implantó en el mesénquima anterior del
primordio de la extremidad en etapa 24 perlas embebidas en SHH y se evaluó la
expresión de Ptc a las 18 horas cuando la expansión ectópica de la expresión de este gen
es estabilizada (Drossopoulou et al., 2000). Los resultados confirmaron la expansión de
Ptc en el mesodermo anterior medio y anterior proximal (Fig. 20 I, J). Por lo tanto, aunque
las células del mesodermo proximal respondieron a la señalización de SHH, no inhibieron
la expresión de Smad8. Para conocer el destino de las células que expresan Smad8 en el
mesénquima anterior proximal y evaluar si es esta área es eventualmente eliminada
durante las subsecuentes etapas del desarrollo de la extremidad se marcó dicha zona con
CellTracker en etapa 24 y se registró a las 0, 3, 8, 22, 32 y 46 horas el destino de esta
región. Se detectó que el marcaje con CellTracker se mantuvo en la región anterior
proximal durante todos estos tiempos de evaluación (n=4) lo que muestra que esta región
70
positiva a Smad8 no es eliminada por PCD (Fig. 21). Todos estos resultados indican que
las células responsivas a la señal de muerte expresan a Smad8 y que este gen es
regulado diferencialmente por SHH dependiendo del contexto celular. Además los análisis
de regulación de Smad8 por BMPs, RA y SHH muestran que hay una correlación muy
estrecha entre las células seleccionadas por estos factores para ser eliminadas y la
inducción de la expresión de Smad8.
FIGURA 21. Análisis del destino del mesodermo anterior proximal de la extremidad del pollo en
desarrollo determinado por el seguimiento de la región teñida con el fluoróforo CellTracker.
Extremidad posterior del pollo visualizada en campo claro (A-F). Visualización de manera simultánea en
campo claro y fluorescencia (G-L). Visualización de la región marcada con el colorante CellTracker por
fluorescencia (M-R). Extremidad en etapa 25 inyectada inicialmente con CellTracker (A, B, C). La misma
extremidad examinada a las 3 (B, H, N), 8 (C, I, O), 22 (D, J, P), 32 (E, K, Q) y 46 (F, L, R) horas. Las
flechas indican las áreas marcadas con el fluoróforo.
Las células de la ANZ no expresan Smad8 ni presentan las formas fosforiladas de
las R-SMADs de BMPs.
Para evaluar si las células que expresan Smad8 son las mismas células que están siendo
eliminadas en la ANZ se realizó en una misma extremidad un doble marcaje para detectar
la muerte celular y la expresión de Smad8. Este doble marcaje consistió en la incubación
de extremidades posteriores en etapa 26 con LysoTracker e hibridadas posteriormente
71
usando una sonda anti-sentido para Smad8. El LysoTracker es una sonda fluorescente
acidotrófica que marca organelos ácidos en células vivas, tal como los lisosomas, y que
ha sido usado para detectar patrones de muerte celular. Estas extremidades revelaron
que los intensos niveles de Smad8 en el mesodermo anterior no colocalizaron con el área
FIGURA 22. Patrón de expresión de Smad8 y de muerte celular en la ANZ de la extremidad del pollo
en etapa 26 y en la PNZ en etapa 30. Expresión de Smad8 en la extremidad posterior del pollo en etapa 25
(A). La misma extremidad vista con LysoTracker (B). Sobreposición de A y B en la que se aprecia la
expresión de Smad8 y la tinción con LysoTracker en la misma extremidad (C). Acercamiento de la ANZ de A
(D), B (E) y C (F). Expresión de Smad8 en el autópodo de la extremidad posterior del pollo en etapa 30 (G).
La misma extremidad vista con LysoTracker (H). Sobreposición de G y H en la que se aprecia la expresión
de Smad8 y la tinción con LysoTracker en la misma extremidad (I). Acercamiento de la PNZ de G (J), H (K)
e I (L). Las flechas negras muestran la expresión de Smad8 y las blancas señalan a la ANZ.
72
teñida con LysoTracker, aunque ambas regiones se encontraron adyacentes (Fig. 22 AF). La región positiva a Smad8 se localizó subyacente a la ANZ con una extensión
proximal medial, mientras que la zona positiva a LysoTracker se extendió distalmente y
por encima del área positiva a Smad8 (Fig. 22 F). Adicionalmente se evaluó la expresión
de Smad8 y el patrón de muerte revelado por LysoTracker en la PNZ del autópodo de
extremidades posteriores en etapa 30. Al igual que en la ANZ, el patrón de expresión de
Smad8 y el de muerte celular no colocalizaron (Fig. 22 G-L), encontrándose el área de
muerte celular en el borde posterior del mesodermo y las células positivas a Smad8 por
encima de la PNZ (Fig. 22 L). Estos datos sugieren que las células del mesodermo
destinado a morir detienen las síntesis de SMAD8 antes de ser eliminadas, ó que otra
SMAD como por ejemplo Smad1, que se expresa en el mesodermo que bordea a toda la
extremidad, incluidas las áreas de muerte celular, está siendo activada en las células que
entran al programa apoptótico. Para evaluar esta última posibilidad cortes histológicos de
extremidades posteriores en etapa 25 y 26 se procesaron para detectar por
inmunofluorescencia las formas fosforiladas de SMAD1/5/8 y se detectó en el mismo corte
la fragmentación del DNA in situ con el ensayo de TUNEL en la ANZ. La observación por
microscopía confocal de estos cortes mostraron la ausencia de colocalización entre las
células positivas a TUNEL y las células que mostraron actividad de las R-SMADs
fosforiladas (4/4) (Fig. 23). Adicionalmente se realizó el mismo análisis en el tejido
interdigital de extremidades posteriores del pollo en etapa 30 y 31, cuando la muerte
celular empieza a ser evidente. La observación por microscopía confocal mostró
resultados similares a los de la ANZ en donde no se encontró colocalización entre las
células positivas a TUNEL y positivas a fosfo SMAD1/5/8 (Fig. 24). Un análisis cuantitativo
de un área promedio de 6,624 m2 que comprende cerca de 232 +/- 37 células totales en
la ANZ de cuatro diferentes extremidades entre la etapa 25 y 26 mostró que 133 +/- 34
células presentaron activación de fosfo SMAD1/5/8 y 20 +/- 7 células fueron positivas a
TUNEL mientras que prácticamente no se encontraron células que presentaran este doble
marcaje. Un análisis cuantitativo de un área promedio de 89,240 m2 del tercer tejido
interdigital de cuatro extremidades posteriores de pollo entre etapa 30 y 31 evidenció un
promedio de 1007 +/- 169 células totales de las cuales 392 +/- 140 fueron positivas a fosfo
SMAD1/5/8 y 138 +/- 94 fueron positivas a TUNEL sin la presencia de colocalización entre
estas dos marcas. La exclusión de los transcritos de Smad8 y de las formas fosforiladas
de las R-SMADs de BMPs sugiere que la señalización de las BMPs median
indirectamente la muerte celular programada de la ANZ y del tejido interdigital por lo que
puede considerarse que induce una cascada molecular que culmina en la muerte celular.
73
Sin embargo, el número de células positivas a fosfo-SMADs es claramente mucho mayor
a las células que están en apoptosis, lo que indica que no todas las células que presentan
activación de las SMADs entran al programa de muerte celular y que la señalización de
las BMPs regula otros procesos diferentes a la PCD.
FIGURA 23. Inmunofluorescencia de SMAD1/5/8 fosforilada y TUNEL en la ANZ de la extremidad
posterior del pollo en etapa 25. Amplificación 20X del mesodermo anterior de la extremidad (A-C).
Amplificación 100X del mesodermo anterior de la extremidad (D-I). Inmunofluorescencia de SMAD1/5/8
fosoforilada (rojo) (A, D). Células positivas a TUNEL (verde) (B, E). Doble marcaje de las células que
presentan fosforilación de las SMADs y células positivas a TUNEL (C, G). Ambas marcas son excluyentes.
Amplificación de los núcleos teñidos con DAPI del mesodermo anterior (azul) (F). Doble marcaje de la
SMAD1/5/8 fosforilada y de los núcleos teñidos con DAPI (H). La flecha indica la localización nuclear de las
P-SMADs. Triple marcaje de la SMAD1/5/8 fosforilada, células positivas a TUNEL y núcleos teñidos con
DAPI (I). La flecha señala cuerpos apoptóticos nucleares en los que se sobrelapa el DAPI con la señal
positiva a TUNEL.
74
FIGURA 24. Inmunofluorescencia de SMAD1/5/8 fosforilada y TUNEL en el mesodermo interdigital de
la extremidad posterior del pollo en etapa 30. Inmunofluorescencia de SMAD1/5/8 fosoforilada (rojo) (A).
Células positivas a TUNEL (verde) (B). Núcleos teñidos con DAPI (azul) (C). Doble marcaje de las células
que presentan fosforilación de las SMADs y células positivas a TUNEL en las que hay carencia de
colocalización (D). Doble marcaje de la SMAD1/5/8 fosforilada y de los núcleos teñidos con DAPI (E), Triple
marcaje de la SMAD1/5/8 fosforilada, células positivas a TUNEL y núcleos teñidos con DAPI (F).
Amplificación 20X.
La señalización de las BMPs promueve una cascada molecular que culmina en la
muerte celular de la ANZ.
Para evaluar si la señalización de las BMPs promueve una cascada molecular que
culmine en la muerte celular, se generaron pulsos de la señalización de las BMPs a
diferentes tiempos durante las primeras 10 horas post implantación de una perla
embebida en BMP7 debido a que en este tiempo se evidencia claramente la muerte
celular promovida por este factor. El pulso fue generado implantando una perla embebida
con BMP7 en el mesodermo anterior de la extremidad posterior del pollo en etapa 25, y la
duración del pulso se controló sustituyendo la perla embebida en BMP7 con una perla
embebida con Noggin para eliminar la señal ectópica y endógena de las BMPs. La
duración de los pulsos de la señalización de las BMPs fueron de 2, 4 y 6 horas. Todas las
extremidades se aislaron a las 10 horas postimplantación de la perla embebida en BMP7.
75
FIGURA 25. Evaluación de la dinámica temporal de la muerte celular y activación de la fosfo
SMAD1/5/8 bajo diferentes pulsos de la señalización de las BMPs. En la parte superior se muestra el
diseño del experimento; las líneas rojas designan la duración del pulso de BMP7 y las líneas azules
designan la duración de la inhibición de la señalización ectópica y endógena de las BMPs por el reemplazo
de la perla embebida en BMP7 por una perla embebida en Noggin. Extremidades teñidas con LysoTracker,
la extremidad de la derecha se trato con un pulso de BMP7 durante 2 (A), 4 (B) y 6 (C) horas. Las flechas
indican la posición de la perla. Inmunofluorescencia de la Caspasa 3 activa 10 horas después de un pulso
de 2 (D, G), 4 (E, H) y 6 (F, I) horas de la señal de BMPs. Se muestran cortes histológicos de las
extremidades tratadas amplificadas a 10X (D, E, F) y acercamiento en el mesénquima anterior a 40X (G, H,
I). Inmunofluorescencia de SMAD1/5/8 fosforilada 10 horas después de un pulso de 2 (J), 4 (K) y 6 (L) horas
amplificadas a 40x.
Algunas extremidades se tiñeron con LysoTracker y otras se fijaron para detectar la
actividad de la SMAD1/5/8 y de la Caspasa 3, ya que se considera un marcador temprano
de la apoptosis. Estos ensayos mostraron que un pulso de 2 horas de BMP7 no fue
suficiente para disparar la muerte celular, ya que se mostró una disminución en la muerte
celular visualizada con LysoTracker, con bajos niveles de Caspasa 3 activa y ausencia de
la activación de la fosfo SMAD1/5/8, indicando que la señal de las BMPs se mantuvo
regulada negativamente (Fig. 25 A-J). Sin embargo, un pulso de cuatro horas fue el
76
requerido para detectar el aumento de la muerte celular de la ANZ, a pesar de la
presencia de Noggin. Esta misma condición fue observada con el pulso de 6 horas de
duración. Bajo estas condiciones aumentó la intensidad y el número de células que
presentaron actividad de la Caspasa 3, mientras que no fue posible detectar la activación
de las SMAD1/5/8 durante estos tiempos. Estos resultados indican que la acción de las
BMPs es requerida durante 4 horas para disparar una cascada molecular que culmina en
la muerte celular 6 horas después y sugieren un efecto indirecto debido a la poca
actividad de la señalización mediada por las R-SMADs de BMPs posteriormente a la
aplicación de estos pulsos.
Las células de la ANZ se localizaron en el tejido avascular de la extremidad.
Las extremidades teñidas con LysoTracker e hibridadas con una sonda antisentido del
transcrito de Smad8 sugirió que las células de la ANZ localizadas por encima del área de
expresión de Smad8 parecen corresponder a la zona avascular del mesodermo anterior
(Fig. 26 E). Para comprobar esta observación la vasculatura del primordio de la
extremidad posterior del pollo en etapa 25 se coloreo con el fluoróforo CellTracker, que se
inyectó directamente al corazón del embrión y que se distribuyó a todos los vasos
sanguíneos del cuerpo. Una vez distribuido el CellTracker, las extremidades se aislaron y
se incubaron en LysoTracker para visualizar la muerte celular de la ANZ. Las
extremidades marcadas con ambos fluorocromos se observaron en el microscopio
estereoscópico con fluorescencia y confirmaron que precisamente las células positivas a
LysoTracker se localizaron en el mesénquima avascular de la ANZ (23/23) (Fig. 26 A-D).
Esta observación fue confirmada con extremidades teñidas con LysoTracker e hibridadas
con el receptor de vegfr2, un receptor de VEGF que se expresa en las células endoteliales
de los vasos sanguíneos. Estas extremidades mostraron la exclusión de la expresión de
vgfr2 en la ANZ (Fig. 26 F, G). Además cortes histológicos transversales de la extremidad
en etapa 25 a nivel de la ANZ procesados para observar la fragmentación nuclear con el
ensayo de TUNEL, mostraron que las células apoptótica se localizaron encima de los
vasos sanguíneos que invaden al mesodermo anterior y que pocas son las células
mesenquimales positivas a TUNEL encontradas en la zona vascular (Fig. 26 H).
Adicionalmente no se observaron células endoteliales positivas a TUNEL. Estos análisis
muestran que las células mesenquimales que expresan Smad8 se encuentran
mayormente en la región vascular que no es eliminada por apoptosis en la etapa 25 de la
extremidad en desarrollo.
77
FIGURA 26. El mesénquima anterior que muestra expresión endógena de Smad8, se localiza en la
región vascular anterior de la extremidad, mientras que la ANZ se localiza en el mesénquima anterior
avascular. Extremidad posterior del pollo en etapa 25-26 teñida con LysoTracker (A), CellTracker (B) y
visualizada con ambos fluoróforos (C). La flecha muestra el área de muerte celular que no se sobrelapa con
el mesénquima vascular. Acercamiento del mesodermo anterior en donde se visualiza el LysoTracker y el
CellTracker en la misma extremidad (D). La flecha indica la presencia de algunas células en proceso de
muerte presentes en la región vascular. Acercamiento del mesodermo anterior en donde se observa la
expresión de Smad8 subyacente a la ANZ (E). La flecha indica una región muy estrecha en donde se
sobrelapan ambas tinciones. Acercamiento del mesodermo anterior de una extremidad en donde se observa
el patrón de muerte celular por LysoTracker (F) hibridada posteriormente con la sonda antisentido de Vegfr2
para visualizar los vasos sanguíneos (G). Corte histológico transversal a nivel de la ANZ en el que se
señalan a las células apoptóticas por las flechas rojas y a las células endoteliales por las flechas azules (H).
78
DISCUSIÓN.
Durante el desarrollo de la extremidad del pollo la muerte celular de la ANZ, la PNZ y del
mesénquima
interdigital
se localiza dentro de los dominios de expresión de varios
miembros de la familia de las BMPs; Bmp4 es expresado en la región anterior y posterior
sobrelapándose con la ANZ y la PNZ respectivamente, Bmp2 es expresado en la región
posterior que coincide con la PNZ, y Bmp2, Bmp4, Bmp5 y Bmp7 son expresados en las
regiones interdigitales (Hogan, 1996c, 1996a, 1996b; Yokouchi et al., 1996; Macias et al.,
1997; Chen and Zhao, 1998; Salas-Vidal et al., 2001; Zuzarte-Luis et al., 2004). Varios
reportes han demostrado la participación de la muerte celular de las BMPs durante el
desarrollo y morfogénesis de la extremidad. En la extremidad del ratón, las BMPs inducen
la muerte celular del interdigito inhibiendo la señal de sobrevivencia promovida por FGF8
a través de su receptor BMPRIA, expresado en la AER, mientras que las BMPs
expresadas en el mesénquima interdigital de la extremidad del pollo promueven la muerte
directamente en ese tejido. Al parecer esta respuesta está mediada por BMPRIA debido a
que la sobreepresión de su forma dominante negativa resulta en sindactilias, sin embargo,
los niveles de expresión de este receptor son muy bajos en el mesénquima del tejido
interdigital. Contrariamente los niveles de Alk2 son intensos en el mesénquima de la
extremidad anterior del pollo pero no se ha evaluado su papel en la regulación de la
muerte celular inducida por la señalización BMP. En este trabajo evaluamos la expresión
de Alk2 durante el desarrollo posterior de la extremidad del pollo y se observó una intensa
expresión en el tejido interdigital. Para evaluar la participación de ALK2 en la regulación
de la PCD, se transfectó la forma dominante negativa de este receptor en el tejido
interdigital del pollo. Esta construcción presenta la sustitución del aminoácido lisina (K) por
arginina (R) en la posición 235 del dominio cinasa, lo que impide la fosforilación de las RSMADs por el receptor. Los receptores tipo I de la superfamilia del TGF que presentan
esta sustitución pueden ser transfosforilados por el receptor tipo II en el dominio GS lo
que provoca la interacción con las proteínas SMADs, sin embargo, debido a que la
actividad cinasa del receptor está alterada, las proteínas SMADs no son fosforiladas y
tampoco liberadas del complejo receptor para transducir la señal (Macias-Silva et al.,
1996). Por lo tanto, ALK2 KR actúa secuestrando a las SMADs e inhibiendo la
transducción de la señal mediada por estas. Otro mecanismo por el cual ALK2 KR puede
inhibir la señal de las BMPs es la interacción no transitoria con los receptores tipo II. Se
ha evidenciado la prescencia de oligómeros heteroméricos entre los receptores tipo I y
tipo II y homoméricos de los receptores tipo I de BMPs en la superficie celular en la
79
ausencia del ligando en un 30% (Gilboa et al., 2000; Bragdon et al., 2011). Se ha descrito
que la interacción de BMP2 en complejos de receptores preformados activan
preferentemente la vía de las SMADs, mientras que la vía mediada por p38 es activada
cuando BMP2 promueve la homodimerización de los receptores tipo I y el reclutamiento
subsecuente de los receptores tipo II (Nohe et al., 2002). Por lo tanto un mecanismo
alterno al secuestro de las SMADs es la interacción de ALK2 KR con los receptores tipo II
endógenos que generarían la formación de complejos de receptores preformados ó
inducidos por el ligando inhibiendo la vía dependiente como independiente de las SMADs.
Sin embargo, independientemente del mecanismo de acción, la transfección de Alk2 KR
en el tejido interdigital no produjo efecto alguno, lo que indica que este receptor no está
involucrado en promover la PCD interdigital. Una posible falta de fenotipo en el tejido
interdigital podría explicarse por la afinidad que tiene ALK2 por solo dos de los receptores
tipo II de BMPs. Se ha reconocido que ALK2 forma el complejo receptor heteromérico con
ActRII y ActRIIB y no con BMPRII (Shi and Massague, 2003). Estos receptores afines a
ALK2 no se expresan en el interdigito; actRII es expresado en los músculos del autópodo
en desarrollo, en el mesénquima indiferenciado que rodea a los rayos digitales, en las
diáfisis de los elementos esqueléticos, en el mesénquima periférico de las articulaciones y
en la unión miotendinosa de los tendones autopodiales. ActrIIb similarmente a ActrII, se
expresa en los músculos en desarrollo y en las articulaciones en desarrollo.
Especificamente, actRIIb se expresa en el mesénquima que rodea la punta distal del dedo
en desarrollo, en el cartilago hipertrófico y en los bordes de los tendones autopodiales
(Merino et al., 1999a). La transfección de la forma deficiente en la actividad cinasa de
ALK2 en células interdigitales que carecen de la expresión endógena de ActrII y ActrIIb,
no resultaría en la inhibición de la señalización intracelular de las BMPs debido a que
ALK2KR no podría interaccionar con el receptor tipo II y por lo tanto no habría
reclutamiento y secuestro de las SMADs por ALK2 KR. Esta suposición apoya que ALK2
no participa endógenamente en la regulación de la muerte celular interdigital.
Adicionalmente, Alk2 no fue regulado por factores apoptóticos tal como las propias BMPs
y el ácido retinoico lo que apoya tal suposición. Contrariamente, los niveles de Alk2
disminuyeron al truncar la señalización de los FGFs en el mesénquima distal. Este
experimento podría sugerir una posible participación de Alk2 en la compleja regulación de
la muerte celular mediada por los FGFs. Sin embargo, también se ha propuesto que la
señalización de los FGFs es muy importante en el reclutamiento de las céluas
mesenquimales hacia el linaje condrogénico. Si la señal de los FGFs está ausente, los
elementos esqueléticos no se forman. Similarmente a los FGFs, las BMPs han sido
80
involucradas en el reclutamiento de las células mesenquimales para formar a los
elementos esqueléticos por osificación endocondral. El engrosamiento dramático de los
elementos esqueleticos por la sobreexpresión de la forma constituiva activa de Alk2
(Zhang et al., 2003) con la inhibición de los transcritos de Alk2 endógenos por el inhibidor
de las señal de las proteínas FGF, el SU-5402, mostrado en este trabajo, apoya la
hipótesis de que FGF participa en el reclutamiento de las células precondrogenicas a
través de las BMPs vía ALK2. (Fig. 27).
FIGURA 27. Modelo que sugiere la participación de ALK2 en la morfogénesis de la extremidad. El
esquema representa el primordio de la extremidad en etapa 25-26. Los FGFs expresados y emanados de la
AER inducen la expresion de alk2 tanto en las células mesenquimales precondrogénicas como en la AER.
Debido a la participación de los FGFs y de las BMPs en el reclutamiento de las células mesenquimales
hacia el linaje condrogénico, se propone que las BMPs expresadas en el mesénquima anterior y posterior
de la extremidad del pollo en desarrollo interaccionan con ALK2 (flechas punteadas) que resultaría en el
reclutamiento de las celulas mesenquimales al linaje condrogénico. cuya expresión se mantiene por los
FGFs e induscan este reclutamiento. Adicionalmente la expresión de alk2 promovida por los FGFs
suguieren la participación de este receptor en la regulación y tamaño de la AER.
Contrariamente no se observó regulación de Alk2, como se ha encontrado para
BmprIb, cuando una perla embebida en TGF es implantada en el tejido interdigital para
inducir la cascada molecular que resulta en la condrogénesis. Esto indica que Alk2 no
estaría involucrado en las etapas posteriores de diferenciación del cartílago una vez que
éste ha iniciado. Sin embargo, en las fases finales de la osificación endocondral este
receptor se expresa en los condrocitos en proliferación y maduros, como también se ha
observado en este trabajo, y regula la diferenciación de los condrocitos induciendo la
81
expresión de Ihh y de Pthrp. La AER es una estructura fundamental que permite le
crecimiento proximo-distal de la extremidad via FGFs. Ha sido demostrado que la
señalización de las BMPs induce la formación de la AER a través de BMPRIA durante las
primeras fases del desarrollo de la extremidad, cuando apenas se forma la protuberancia
de la extremidad. Posteriormente cuando se ha completado la morfogénesis de la
extremidad la AER es eliminada por la acción de las BMPs posiblemente involucrando
también a BMPRIA. Observamos que Alk2 y Smad5 se expresaron en la AER y
mantuvieron su expresión hasta la etapa 27, al iniciarse la formación del autópodo. Estas
observaciones abren la posibilidad de considerar a Alk2 y a Smad5 como moleculas
candidatas responsables de controlar el tamaño y la extensión de la AER por apoptosis.
Sin embargo, paradojicamente, la expresión de Alk2 se inhibió en la AER al aplicar el SU5402, lo que indica que FGFs estimula la expresión de Alk2 al menos durante las primeras
etapas del desarrollo de la extremidad (Fig. 14 A). Debido al papel dual de los FGFs como
factores de sobrevivencia y como factores apoptóticos cabria suponer la posibilidad de
que los FGFs pudieran mantener la sobrevivencia y a su vez controlar el tamaño de la
AER por apotósis. Por lo consiguiente, es recomendable realizar experimentos
funcionales para evaluar si ALK2, SMAD5 y los FGFs controlan el tamaño de la AER.
Las BMPs han sido involucradas en regular la polaridad antero-posterior de la
extremidad, sin embargo esta hipótesis ha sido cuestionada por una serie de
combinaciones de mutantes dobles condicionales para Bmp2, Bmp4 y Bmp7 que no
muestran alteraciones en la polaridad antero-posterior. En este trabajo hemos encontrado
que Smad5 es expresado en el mesenquima posterior de la extremidad, en un área que al
parecer se sobrelapa con la expresión de Shh en la denominada Zona de Actividad
Polarizante (ZPA), involucrada en el control de este patrón. La expresión de Smad5 apoya
la participación de las BMPs en regular la polaridad antero-posterior de la extremidad. Sin
embargo, no debe descartarse que pueden existir mecanismos diferentes involucrados en
el establecimiento de la polaridad anterior-posterior que sean propios en el pollo
diferentes a los del ratón. Se recomienda que estudios funcionales, tal como la
sobreexpresión de Smad5 en el mesodermo anterior y de su forma dominante negativa en
la ZPA, deben realizarse para aclarar si SMAD5 está involucrado en regular este proceso.
Encontramos que Smad1 es expresado intensamente en el tejido interdigital. Este patrón
de expresión coincide con los niveles de las SMAD1/5/8 tanto activos como inactivos.
Aunque la intensidad es menor, Smad1 persiste durante la regresión del tejido interdigital
coincidente con la fosforilación de SMAD1 y su translocación al núcleo (Zuzarte-Luis et
82
al., 2004). Estos resultados suguieren que Smad1 podría dirigir la transducción de la señal
de las BMPs en el tejido interdigital para dirigir su eliminación. Sin embargo, a diferencia
de la expresión de Smad1 que también se localizó en amplias extensiones del
mesodermo de la extremidad en etapas tempranas, la expresión de Smad8 se observó
de forma aparente en algunas áreas relacionadas a la muerte celular de manera
específica. El patrón de expresión de Smad8 se evidenció en el mesénquima anterior y en
el mesénquima interdigital de la extremidad posterior del pollo, muy similar al observado
para el patrón de expresión de Bmp2, Bmp4, Bmp5 y Bmp7. Además fue también
comparable al patrón de muerte celular de las extremidades teñidas con rojo neutro,
sugiriendo que Smad8 podría estar involucrada en el control de la muerte celular durante
el desarrollo de la extremidad. Esto es apoyado por la aplicación de perlas embebidas en
algunos factores que regulan la muerte celular durante el desarrollo de la extremidad que
regularon, también, la expresión de Smad8. Perlas embebidas en BMPs implantadas en el
mesodermo de varias regiones de la extremidad promueven ó incrementan el área de
muerte celular (Ganan et al., 1996; Macias et al., 1997; Zuzarte-Luis et al., 2004).
Además, el tratamiento del mesénquima posterior con perlas embebidas en SHH y la
aplicación en el mesénquima anterior con perlas embebidas en RA resultó en la muerte
celular (Sanz-Ezquerro and Tickle, 2000). Notablemente, todos estos tratamientos pro
apoptóticos son capaces de inducir la expresión de Smad8. Complementariamente,
cuando es aplicada una perla con RA en el mesodermo central donde no promueve la
muerte, no se observó cambio en la expresión de Smad8 y la aplicación de SHH que
inhibe la muerte en el mesodermo anterior también disminuyó la expresión de Smad8. De
tal manera que Smad8 es regulado al parecer solo en las células que responden a las
señales que regulan la muerte celular. Estos resultados, sugieren que las BMPs podrían
regular de manera endógena la PCD de la ANZ a través de Smad8. Sin embargo, el ratón
mutante homócigo de Smad8 no muestra fenotipos de ninguna clase. A diferencia de la
extremidad del pollo, la extremidad del ratón presenta un área de muerte celular en la
región anterior que es detectada en etapas comparativamente más tardías y en una
ubicación más distal que la ANZ del pollo (Fernandez-Terán et al, 2006). De hecho se ha
propuesto el nombre de foyer préaxiale primaire (fpp) en el ratón debido a las marcadas
diferencias espaciotemporales con la ANZ del pollo (Milaire, 1971). Si estas regiones son
diferentes entonces es complicado observar un fenotipo relacionado con la muerte celular
anterior mediada por Smad8 en la extremidad del ratón. Por lo tanto, Smad8 podría tener
una función específica en la ANZ durante el desarrollo de las extremidades de las aves.
Sin embargo, tampoco se descarta una posible redundancia de funciones con Smad1 y
83
con Smad5. Como se ha mostrado en este trabajo, Smad1 es expresado en el
mesénquima excluyente de las condensaciones cartilaginosas de la extremidad del pollo
en desarrollo, además también se describió que la localización de las fosfo-SMADs1/5/8
coincide con el patrón de expresión de Smad1 y Smad8, por lo tanto la falta de fenotipos
en el ratón nulo para Smad8 podría explicarse por la redundancia de funciones de al
menos Smad1 durante el desarrollo de la extremidad. La creación de ratones
condicionales de las R-SMADs de BMPs es necesaria para elucidar tal cuestión, ya que
los embriones nulos para Smad1 y Smad5 mueren antes de que se complete el desarrollo
de sus extremidades.
Diferentes funciones de la señal de la BMPs se han reconocido durante el desarrollo
de la extremidad, principalmente se ha atribuido que la señalización de las BMPs en el
mesénquima indiferenciado de la extremidad promueve la PCD y la diferenciación del
cartílago. Sin embargo se les ha atribuido otras funciones tal como el establecimiento del
patrón antero-posterior de la extremidad, la regulación de la proliferación y el
establecimiento de la identidad de los dedos. La intensa expresión de Smad8 en la región
anterior proximal no coincidente con la ANZ, responde limitadamente a la señal promotora
de la muerte celular de las BMPs. La persistencia de esta expresión cuando se inhibe a la
ANZ por la aplicación de perlas con SHH, su permanencia durante el desarrollo de la
extremidad revelada por su marcaje con CellTracker y la presencia de las R-SMADs de
BMPs activas en esta región indican que la señal de las BMPs mediada por las SMADs
está involucrada en otros procesos distintos al de promover la PCD en la región anterior
proximal de la extremidad. Sin embargo, no conocemos evidencias que relacionen a las
BMPs con otras funciones distintas a las de la PCD en la región anterior de la extremidad.
Además, es de notarse que el tratamiento del mesodermo anterior proximal con perlas
embebidas en BMP7 aunque no promovieron la muerte celular si aumentaron el área de
expresión de Smad8 lo que relaciona a esta SMAD a estas funciones alternativas. Sin
embargo, una posibilidad es que esta región anterior proximal responda limitadamente a
la señal apoptótica de las BMPs debido a que esta señal está siendo inhibida en esa
región. Recientemente se ha reportado el patrón de expresión de las SMADs inhibidoras
de la señalización de las BMPs. Interesantemente Smad6 y Smad7 se expresan en la
región anterior del ala del pollo coincidente a la expresión de Bmp4 y de Smad8. El
promotor de Smad6 del ratón presenta la secuencia de unión de las R-SMADs de BMPs y
se ha establecido un asa de regulación negativa de la señalización de las BMPs (Ishida et
al., 2000). El incremento de la señal de las BMPs durante el desarrollo de la extremidad
84
anterior del pollo incrementó también la expresión de Smad6 y Smad7a mientras que la
disminución en la expresión de estos genes resultó por la sobrexpresión de Noggin, un
antagonista de las BMPs. Estos resultados indican que en la extremidad en desarrollo, las
BMPs regulan negativamente su propia señalización. Las células de la región anterior
proximal que expresan intensamente a Smad8 y que incluso extienden esta expresión
ante la señal de las BMPs, también presentan activación de las R-SMADs de BMPs de
manera endógena lo que resultaría en la inducción en la expresión directa de la Smad6 y
Smad7 que resultaría en un efecto protector de estas células a la muerte celular
promovida por las propias BMPs ó por otras señales apoptóticas.
Como se ha demostrado en este trabajo y como se ha reportado previamente, las
células de la región anterior responden diferente a las de la región posterior ante el
aumento de la señalización de SHH. Mientras que el mesénquima anterior sobrevive
cuando son aplicadas perlas embebidas en SHH en esa región, las células del
mesénquima posterior son eliminadas por apoptósis. Se ha reportado que la ausencia de
SHH incrementa los niveles de la proteína GLI3 represor. Estas formas represoras son
mas abundantes en la región anterior de la extremidad donde los niveles de shh están
casi ausentes. Cuando la señalización de SHH es bloqueada en la región posterior de la
extremidad ocurre un incremento en los niveles de GLI3 represor en el mesodermo
anterior (Bastida et al., 2004). Este evento está asociado con un incremento en la
expresión de Bmp4 y en la muerte celular del mesodermo anterior, la cual es prevenida
por la aplicación exógena de Noggin, lo que indica que la señalización de las BMPs media
esta muerte celular. Una posible explicación de la sobrevivencia de las células del
mesodermo anterior ante la presencia de SHH sería que, cuando las perlas embebidas en
SHH son implantadas en esa región, los niveles de GLI represor disminuyen y las células
sobreviven inhibiendo a BMP4 y por lo tanto a la muerte celular. Sin embargo, estos
resultados contrastan con las observaciones reportados por Sanz-Ezquerro y Tickle
quienes encontraron que el tratamiento con SHH en la región posterior de la extremidad
induce muerte celular (Sanz-Ezquerro y Tickle, 2000). Por lo tanto, los mecanismos por
los cuales las células responden de manera diferente ante esta misma señal pudieran ser
diferentes. Una posibilidad es que el incremento de SHH en la región posterior por la
aplicación de perlas embebidas en este factor adicionalmente a los niveles de SHH
endógeno lleven a cabo una autoregulación negativa de la señal de SHH.
Independientemente del mecansimo que causa la muerte celular en la ANZ, la expresión
de Smad8 fue regulada correlativamente al tipo de respuesta celular; incrementando sus
85
niveles por la respuesta apoptótica en el mesodermo posterior ó inhibiéndose su
expresión por la sobrevivencia en el mesodermo anterior.
La vía canónica de la transducción de la señal de las BMPs hacia el nucleo está
mediada por las proteínas SMAD1, SMAD5 y SMAD8, y durante la regresión interdigital,
la actividad de las BMPs se ha asociado con la señalización mediada por las SMADs
(Zuzarte-Luis et al., 2004). En este estudio, no se observó colocalización entre las
SMAD1, 5 y 8 activadas y las células positivas a TUNEL ni en la ANZ ni en el interdigito
en regresión. Una interpretación de esos resultados es que la señal de las BMPs mediada
por estas SMADs dispara una cascada molecular que resulta en el inicio de la muerte
celular. En apoyo a esta suposición se encontró que la expresión de Smad8 fue inducida
por las BMPs antes de evidenciar a la muerte celular por la tinción de rojo neutro, e
incluso la expresión de Smad8 es cesada poco antes de la culminación de la muerte
celular. Además, un pulso de 4 horas de la señalización de las BMPs fue suficiente para
promover la activación de la Caspasa 3 resultando en la eliminación de las células de la
ANZ de 5 a 6 horas después con una notable ausencia de las R-SMADs fosforiladas de
BMPs. De acuerdo con estos resultados se ha demostrado que el tratamiento con BMPs
en el tejido interdigital del pollo dispara una cascada molecular que involucra la regulación
de genes relacionados con el control de la muerte celular tal como Msx2, Bambi, Dkk,
Snail y Fgfr3 durante las primeras 10 horas antes de que la muerte celular sea evidente
(Zuzarte-Luis et al., 2004). En este estudio la distribución de las células positivas a
TUNEL y las células que presentaron activación de SMAD1, 5 y 8 en el interdígito fue
comparable con el encontrado en la ANZ y previamente se observó el aumento en la
expresión de Smad8 por BMP5 antes de la inducción de la apoptosis interdigital. Estos
resultados sugieren que la muerte celular de la INZ y de la ANZ podrían seguir un
mecanismo similar una vez que la señal de las BMPs en el mesénquima de la extremidad
del pollo es activada.
MSX1 y MSX2 son factores de transcripción que promueven la muerte celular en el
mesénquima de la extremidad (Lallemand et al., 2005; Lallemand et al., 2009). Se ha
observado que la expresión ectópica de Msx2 en el mesodermo posterior distal de la
extremidad del pollo reduce la proliferación celular y promueve la apoptosis induciendo la
expresión ectópica de Bmp4 (Ferrari et al., 1998). Esto sugiere que la inhibición de la
proliferación celular y la promoción de la apoptósis está mediada por las BMPs. En apoyo
a esto el promotor de Msx1 tiene tres sitios de unión para las SMADs de BMPs y Smad8
86
es parte de un complejo proteico necesario para activar la transcripción de Msx1 (Binato
et al., 2006). Esos resultados suguieren que una asa de regulación positiva entre BMPs y
msx, en la cual SMAD8 podría estar involucrada, promueve la muerte celular en la
extremidad en desarrollo y apoyan la sugerencia de que la señal de las BMPs puden
inducir una cascada molecular que culmina en la muerte celular.
La inhibición de la proliferación por Msx y la expresión ectópica de Bmp4 sugiere que
las BMPs participan también en la regulación de la proliferación celular en el mesodermo
de la extremidad del pollo. Esto ha sido demostrado por la eliminación de la acción de
BMP2 y BMP4 en la AER de la extremidad del ratón en desarrollo ya que resulta en un
incremento de la proliferación del mesénquima distal (Maatouk et al., 2009). En otros
sistemas también se ha destacado que la inhibición de la proliferación esta promovida por
la señalización de las BMPs; se ha reportado que BMP2 es un regulador negativo de la
proliferación de los hepatocitos (Xu et al., 2006) y que las BMPs contrarrestan la acción
proliferativa promovida por las señalización Wnt en las células neuroepiteliales de la
espina dorsal del ratón en etapa 10.5 (Ille et al., 2007). Interesantemente, en humanos
existe una hipermetilación de Smad8 en ciertos cánceres sugiriendo que la señal de las
BMPs mediada por las SMAD8 regula de forma negativa el crecimiento y la proliferación
celular. Durante el desarrollo de la extremidad se ha observado una relación inversa entre
la inhibición de la proliferación y la inducción de la muerte celular. Las células del
mesodermo interdigital del ratón detienen su proliferación y la síntesis de DNA antes de
iniciar el programa de muerte celular (Mori et al., 1995). Además, la aplicación de perlas
embebidas con FGF en el interdígito inhibe a la muerte celular a las 12 horas después de
su aplicación, pero si se deja actuar al factor durante 24 horas post aplicación de la perla
se observa una aceleración de la muerte celular y una inhibición de la proliferación en el
interdígito (Montero et al., 2001). La señal de muerte retrasada e indirecta mediada por las
BMPs y su participación en regular negativamente la proliferación en células destinadas a
morir nos sugiere que las BMPs podrían promover la muerte celular indirectamente vía
inhibición de la proliferación. Otras observaciones indirectas sugieren la participación de la
BMPs en la regulación de la proliferación celular alternativamente o adicionalmente a la
de la muerte celular. Los ratones knock out condicionales de BMP2, y dobles
condicionales de BMP2 y BMP4 muestran sindactilia en sus extremidades debido a la
disminución de la muerte celular interdigital. El fenotipo final sugiere también que hay un
incremento en la proliferación del interdigito ya que la membrana interdigital permanece
en la parte mas distal de los dedos del ratón una vez nacido (Bandyopadhyay et al.,
87
2006). Esto es de notarse, ya que durante el desarrollo normal de la extremidad del ratón
se presenta en el autópodo un crecimiento diferencial entre el tejido interdigital y el
desarrollo de los dedos. A los 12.5 dpc el tejido interdigital no crece, a diferencia de los
dedos que continúan elongándose hasta alcanzar su tamaño definitivo (Salas-Vidal et al.,
2001). Esto indica que la muerte celular interdigital junto con el arresto del crecimiento del
interdígito contribuye a la separación de los dedos en los murinos. Así, si las BMPs sólo
promueven la muerte celular, los ratones mutantes para BMP2 y BMP4 presentarían un
tejido interdigital limitado solo a la región proximal de las falanges y no una sindactilia total
como la presentan. La atenuación de la vía de las BMPs en la AER mediada por BMPrIa
produce un incremento y mantenimiento de la expresión de AER-FGFs resultando en la
sobrevivencia de las células interdigitales y en la inhibición de la muerte celular interdital.
Al igual que los “Knock outs” condicionales de las BMPs, el mutante condicional de
BMPRIA en la AER genera sindactilias completas en los ratones neonatos indicando una
activación de la proliferación en el tejido interdigital de estos ratones (Pajni-Underwood et
al., 2007).
Se ha sugerido que durante la regresión interdigital, la señalización BMP además de
ser transducida por las SMADs podría estar involucrada un componente de la vía de las
MAPK, p38, debido a que la regulación de la expresión de algunos genes en el tejido
interdigital y que al parecer están involucrados en la regulación de la muerte celular tal
como Dkk, Snail y Fgfr3 dependen de la señalización mediada por p38 activada por las
BMPs (Zuzarte-Luis et al., 2004). Con base en esos reportes, es necesario evaluar si la
señalización dependiente e independiente de las SMADs pueden actuar para controlar la
muerte celular que esculpe a la extremidad en desarrollo. Se ha caracterizado que
durante la muerte interdigital y bajo el tratamiento de las BMPs, las proteínas SMADs de
BMPs y la MAPK p38 muestran un incremento en el inmuno-marcaje de las células del
mesodermo interdigital. Estos resultados sugieren que ambas vías actúan sinérgicamente
para controlar la muerte celular del interdígito (Zuzarte-Luis et al., 2004). En este trabajo
sugerimos que al menos la señalización dependiente de SMADs en la ANZ podría mediar
el efecto apoptótico de las BMPs de manera indirecta. Sin embargo estudios correlativos y
demostrativos de la posible participación de la vía de MAPK en la ANZ darán indicios
sobre una posible participación de ambas vías durante la muerte celular de la ANZ.
88
FIGURA 28. Modelo que sugiere la participación de la señalización de las BMPs, el RA y SHH en la
regulación de la PCD de la ANZ y la PNZ a través de SMAD8. Smad8 es inducido por los factores proapoptóticos de la familia de las BMPs y por el RA en el mesénquima anterior mientras que es inhibido por el
factor de sobrevivencia SHH. SHH promueve la muerte celular e induce la expresión de Smad8 en el
mesénquima posterior. Las BMPs a través de las SMADs dispararían una cascada molecular, induciendo la
expresión de Msx1, Msx2, Bambi, Dkk, Snail y Fgfr3, que resultaría en la PCD del mesénquima anterior.
Concomitantemente las células que expresan Smad8 pasan a la región avascular que potencialmente
contribuye a la muerte de estas células por la carencia de factores tróficos. La región anterior proximal que
expresa Smad8 es poco sensible a los factores promotores de la muerte.
Aunque se ha observado que durante la muerte del tejido interdigital hay una regresión
de los vasos sanguíneos en la extremidad del pollo, no se han explorado los mecanismos
moleculares involucrados durante este proceso. Estudios de monitoreo han revelado que
la actividad transcripcional de las R-SMADs de BMPs se lleva a cabo en los vasos
sanguíneos del interdígito del ratón en etapa 12.5 poco antes de que este sea eliminado
(Monteiro et al., 2008). Interesantemente, observamos que la expresión de Smad8 es
observada principalmente en la zona vascular del mesodermo anterior subyacente a la
ANZ aunque no fue posible determinar si los transcritos de Smad8 se expresaron en los
vasos sanguineos. Estas observaciones suguieren que las R-SMADs de BMPs podrían
regular la regresión de los vasos sanguineos durante la muerte celular de la zona
interdigital y de la ANZ, por lo tanto la evaluación de la participación de las R-SMADs de
BMPs durante este proceso sería relevante. Aunque la mayoría de las células positivas a
Smad8 se encuentra en la región vascular y las células en proceso apotótico en la
avascular observamos una región muy estrecha en la que concidieron células que
89
expresan Smad8 y células marcadas con LysoTracker. Aunado a que Smad8 precede a la
muerte celular y a que su expresión es regulada por factores reguladores de la muerte
cabría preguntarse si las células positivas a Smad8 migran o son redistribuídas del
mesodermo vascular hacia el avascular. Esta distribución podría contribuír en la ejecución
de la muerte celular por la falta de factores tróficos transmitidos por la circulación
sanguinea. Tomando en cuenta los resultados obtenidos en este trabajo en la figura 28
ilustra un modelo que propone la regulación de la PCD en la ANZ y la PNZ por la señal de
las BMPs, del RA y de SHH a través de SMAD8.
90
CONCLUSIONES.
Aunque Alk2 es expresado en el tejido interdigital de la extremidad posterior del pollo, no
está relacionado con la eliminación por apoptosis de este tejido.
La expresión de las R-SMADs de BMPs (Smad1, Smad5 y Smad8) es consistente con
las múltiples funciones que se le ha atribuido a la señalización de las BMPs durante la
morfogénesis y desarrollo de la extremidad de los vertebrados.
La expresión de Smad8 está fuertemente correlacionada con una la subsecuente
detección de la muerte celular de la ANZ.
La expresión de Smad8 se indujo por los factores inductores de la muerte celular;
BMP7 y RA, y se inhibió con el factor de sobrevivencia SHH. Este efecto se observó en el
mesénquima anterior medial, pero no en el mesénquima anterior proximal.
La señalización de las BMPs induce una cascada molecular que culmina en la muerte
celular de las células mesenquimales de la ANZ.
La ZNA se localiza en el mesénquima avascular anterior, mientras que las células
positivas a Smad8 subyacen inmediatamente a esta área en el mesénquima vascular. No
obstante, se detectó una región en donde células que expresan Smad8 y células
apoptóticas coinciden.
91
PERSPECTIVAS.
Evaluar la expresión de BmprII, ActrIIa y ActrIIb en el tejido interdigital con el fin de
confirmar que la falta de fenotipo, cuando la forma deficiente en el dominio cinasa de
ALK2 (ALK2KR) es tansfectada en el tejido interdigital, se debe a la ausencia del receptor
tipo II, necesario para la activación de ALK2KR y por el consiguiente secuestro de las
SMADs.
Evaluar, por experimentos de función, la participación de SMAD8 en la regulación de la
muerte celular programada de la ANZ y del tejido interdigital.
Evaluar la participación de SMAD5 en el mesodermo posterior de la extremidad y
aportar evidencias sobre la participación de la señalización de las BMPs en el
establecimiento de patrón antero-posterior en la extremidad del pollo.
Reconocer a los posibles componentes moleculares involucrados en la regulación de
la muerte celular mediada por las BMPs y establecer la posible cascada molecular que
resultaría en la eliminación de las células del mesodermo anterior y el establecimiento de
la ANZ.
Evaluar la participación de las BMPs en la regulación de la proliferación celular de las
áreas sensibles a la muerte.
92
REFERENCIAS.
Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. Differentiated cells and the
maintenance of tissues. 1994. Molecular Biology of the cell. Garland Publishing,
Inc. New York & London. Third Edition. 1139-1193.
Arnold SJ, Maretto S, Islam A, Bikoff EK, Robertson EJ. 2006. Dose-dependent Smad1,
Smad5 and Smad8 signaling in the early mouse embryo. Dev Biol 296:104-118.
Attisano L, Wrana JL. 2000. Smads as transcriptional co-modulators. Curr Opin Cell Biol
12:235-243.
Bandyopadhyay A, Tsuji K, Cox K, Harfe BD, Rosen V, Tabin CJ. 2006. Genetic analysis
of the roles of BMP2, BMP4, and BMP7 in limb patterning and skeletogenesis.
PLoS Genet 2:e216.
Bastida MF, Delgado MD, Wang B, Fallon JF, Fernandez-Teran M, Ros MA. 2004. Levels
of Gli3 repressor correlate with Bmp4 expression and apoptosis during limb
development. Dev Dyn 231:148-160.
Binato R, Alvarez Martinez CE, Pizzatti L, Robert B, Abdelhay E. 2006. SMAD 8 binding to
mice Msx1 basal promoter is required for transcriptional activation. Biochem J
393:141-150.
Bragdon B, Moseychuk O, Saldanha S, King D, Julian J, Nohe A. 2011. Bone
morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal 23:609-620.
Cassan F. Patas al descubierto. 2006. Atlas Visual de la Ciencia. Aves. Editorial Sol 90.
20-21.
Castro-Obregón S, Covarrubias Luis. Muerte celular programada. 2003. Biología Celular y
Molecular. Pearson Education de México. 617-657.
Cecconi F, Alvarez-Bolado G, Meyer BI, Roth KA, Gruss P. 1998. Apaf1 (CED-4 homolog)
regulates programmed cell death in mammalian development. Cell 94:727-737.
Coelho CN, Upholt WB, Kosher RA. 1993. The expression pattern of the chicken
homeobox-containing gene GHox-7 in developing polydactylous limb buds suggests
its involvement in apical ectodermal ridge-directed outgrowth of limb mesoderm and
in programmed cell death. Differentiation 52:129-137.
Conradt B. 2009. Genetic control of programmed cell death during animal development.
Annu Rev Genet 43:493-523.
Chautan M, Chazal G, Cecconi F, Gruss P, Golstein P. 1999. Interdigital cell death can
occur through a necrotic and caspase-independent pathway. Curr Biol 9:967-970.
Chen Y, Zhao X. 1998. Shaping limbs by apoptosis. J Exp Zool 282:691-702.
Chen YG, Massague J. 1999. Smad1 recognition and activation by the ALK1 group of
transforming growth factor-beta family receptors. J Biol Chem 274:3672-3677.
93
Chimal-Monroy J, Rodriguez-Leon J, Montero JA, Ganan Y, Macias D, Merino R, Hurle
JM. 2003. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb
chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Dev Biol 257:292-301.
Danial NN, Korsmeyer SJ. 2004. Cell death: critical control points. Cell 116:205-219.
Denissova NG, Pouponnot C, Long J, He D, Liu F. 2000. Transforming growth factor beta inducible independent binding of SMAD to the Smad7 promoter. Proc Natl Acad Sci
U S A 97:6397-6402.
Drossopoulou G, Lewis KE, Sanz-Ezquerro JJ, Nikbakht N, McMahon AP, Hofmann C,
Tickle C. 2000. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based
on sequential long- and short-range Shh signalling and Bmp signalling.
Development 127:1337-1348.
Duprez DM, Kostakopoulou K, Francis-West PH, Tickle C, Brickell PM. 1996. Activation of
Fgf-4 and HoxD gene expression by BMP-2 expressing cells in the developing chick
limb. Development 122:1821-1828.
Dvorak L, Fallon JF. 1991. Talpid2 mutant chick limb has anteroposterior polarity and
altered patterns of programmed cell death. Anat Rec 231:251-260.
Fallon JF, Cameron J. 1977. Interdigital cell death during limb development of the turtle
and lizard with an interpretation of evolutionary significance. J Embryol Exp Morphol
40:285-289.
Fernandez-Teran MA, Hinchliffe JR, Ros MA. 2006. Birth and death of cells in limb
development: a mapping study. Dev Dyn 235:2521-2537.
Ferrari D, Lichtler AC, Pan ZZ, Dealy CN, Upholt WB, Kosher RA. 1998. Ectopic
expression of Msx-2 in posterior limb bud mesoderm impairs limb morphogenesis
while inducing BMP-4 expression, inhibiting cell proliferation, and promoting
apoptosis. Dev Biol 197:12-24.
Francis PH, Richardson MK, Brickell PM, Tickle C. 1994. Bone morphogenetic proteins
and a signalling pathway that controls patterning in the developing chick limb.
Development 120:209-218.
Ganan Y, Macias D, Duterque-Coquillaud M, Ros MA, Hurle JM. 1996. Role of TGF beta s
and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of
interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development 122:23492357.
Garcia-Martinez V, Macias D, Ganan Y, Garcia-Lobo JM, Francia MV, Fernandez-Teran
MA, Hurle JM. 1993. Internucleosomal DNA fragmentation and programmed cell
death (apoptosis) in the interdigital tissue of the embryonic chick leg bud. J Cell Sci
106 ( Pt 1):201-208.
Gavathiotis E, Suzuki M, Davis ML, Pitter K, Bird GH, Katz SG, Tu HC, Kim H, Cheng EH,
Tjandra N, Walensky LD. 2008. BAX activation is initiated at a novel interaction site.
Nature 455:1076-1081.
94
Gilbert SF. Development of the tetrapod limb. 2003. Developmental Biology. Sinauer
Associates Inc., Publishers, Sunderland, Massachusetts. Seventh Edition. 523-546.
Gilboa L, Nohe A, Geissendorfer T, Sebald W, Henis YI, Knaus P. 2000. Bone
morphogenetic protein receptor complexes on the surface of live cells: a new
oligomerization mode for serine/threonine kinase receptors. Mol Biol Cell 11:10231035.
Golstein P, Kroemer G. 2007. Cell death by necrosis: towards a molecular definition.
Trends Biochem Sci 32:37-43.
Gore R, Clark R, Kennis A, Kennis A. 2003. El origen de los mamíferos. National
Geographic. 12:2-37.
Grotewold L, Ruther U. 2002. Bmp, Fgf and Wnt signalling in programmed cell death and
chondrogenesis during vertebrate limb development: the role of Dickkopf-1. Int J
Dev Biol 46:943-947.
Guha U, Gomes WA, Kobayashi T, Pestell RG, Kessler JA. 2002. In vivo evidence that
BMP signaling is necessary for apoptosis in the mouse limb. Dev Biol 249:108-120.
Hamburger V, Hamilton HL. 1992. A series of normal stages in the development of the
chick embryo. 1951. Dev Dyn 195:231-272.
Hanyu A, Ishidou Y, Ebisawa T, Shimanuki T, Imamura T, Miyazono K. 2001. The N
domain of Smad7 is essential for specific inhibition of transforming growth factorbeta signaling. J Cell Biol 155:1017-1027.
Hata A, Seoane J, Lagna G, Montalvo E, Hemmati-Brivanlou A, Massague J. 2000. OAZ
uses distinct DNA- and protein-binding zinc fingers in separate BMP-Smad and Olf
signaling pathways. Cell 100:229-240.
Hay E, Lemonnier J, Fromigue O, Marie PJ. 2001. Bone morphogenetic protein-2
promotes osteoblast apoptosis through a Smad-independent, protein kinase Cdependent signaling pathway. J Biol Chem 276:29028-29036.
Hernandez-Martinez R, Castro-Obregon S, Covarrubias L. 2009. Progressive interdigital
cell death: regulation by the antagonistic interaction between fibroblast growth
factor 8 and retinoic acid. Development 136:3669-3678.
Hinchliffe JR, Thorogood PV. 1974. Genetic inhibition of mesenchymal cell death and the
development of form and skeletal pattern in the limbs of talpid3 (ta3) mutant chick
embryos. J Embryol Exp Morphol 31:747-760.
Hofmann C, Luo G, Balling R, Karsenty G. 1996. Analysis of limb patterning in BMP-7deficient mice. Dev Genet 19:43-50.
Hogan BL. 1996a. Bmps: multifunctional regulators of mammalian embryonic
development. Harvey Lect 92:83-98.
Hogan BL. 1996b. Bone morphogenetic proteins in development. Curr Opin Genet Dev
6:432-438.
95
Hogan BL. 1996c. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate
development. Genes Dev 10:1580-1594.
Huang C, Hales BF. 2002. Role of caspases in murine limb bud cell death induced by 4hydroperoxycyclophosphamide, an activated analog of cyclophosphamide.
Teratology 66:288-299.
Hurle J, Hinchcliffe JR. 1978. Cell death in the posterior necrotic zone (PNZ) of the chick
wing-bud: a stereoscan and ultrastructural survey of autolysis and cell
fragmentation. J Embryol Exp Morphol 43:123-136.
Ille F, Atanasoski S, Falk S, Ittner LM, Marki D, Buchmann-Moller S, Wurdak H, Suter U,
Taketo MM, Sommer L. 2007. Wnt/BMP signal integration regulates the balance
between proliferation and differentiation of neuroepithelial cells in the dorsal spinal
cord. Dev Biol 304:394-408.
Ishida W, Hamamoto T, Kusanagi K, Yagi K, Kawabata M, Takehara K, Sampath TK, Kato
M, Miyazono K. 2000. Smad6 is a Smad1/5-induced smad inhibitor.
Characterization of bone morphogenetic protein-responsive element in the mouse
Smad6 promoter. J Biol Chem 275:6075-6079.
Johnson EB, Hammer RE, Herz J. 2005. Abnormal development of the apical ectodermal
ridge and polysyndactyly in Megf7-deficient mice. Hum Mol Genet 14:3523-3538.
Kawakami Y, Ishikawa T, Shimabara M, Tanda N, Enomoto-Iwamoto M, Iwamoto M,
Kuwana T, Ueki A, Noji S, Nohno T. 1996. BMP signaling during bone pattern
determination in the developing limb. Development 122:3557-3566.
Karp G. Señalización celular y transducción de señales: comunicación entre las células.
2005. Biología Celular y Molecular. McGraw-Hill Interamericana. 671-719.
Kim H, Tu HC, Ren D, Takeuchi O, Jeffers JR, Zambetti GP, Hsieh JJ, Cheng EH. 2009.
Stepwise activation of BAX and BAK by tBID, BIM, and PUMA initiates
mitochondrial apoptosis. Mol Cell 36:487-499.
Kimura N, Matsuo R, Shibuya H, Nakashima K, Taga T. 2000. BMP2-induced apoptosis is
mediated by activation of the TAK1-p38 kinase pathway that is negatively regulated
by Smad6. J Biol Chem 275:17647-17652.
Knudson CM, Tung KS, Tourtellotte WG, Brown GA, Korsmeyer SJ. 1995. Bax-deficient
mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science 270:96-99.
Kroemer G, Galluzzi L, Vandenabeele P, Abrams J, Alnemri ES, Baehrecke EH,
Blagosklonny MV, El-Deiry WS, Golstein P, Green DR, Hengartner M, Knight RA,
Kumar S, Lipton SA, Malorni W, Nunez G, Peter ME, Tschopp J, Yuan J, Piacentini
M, Zhivotovsky B, Melino G. 2009. Classification of cell death: recommendations of
the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ 16:3-11.
Kurisaki K, Kurisaki A, Valcourt U, Terentiev AA, Pardali K, Ten Dijke P, Heldin CH,
Ericsson J, Moustakas A. 2003. Nuclear factor YY1 inhibits transforming growth
96
factor beta- and bone morphogenetic protein-induced cell differentiation. Mol Cell
Biol 23:4494-4510.
Lallemand Y, Bensoussan V, Cloment CS, Robert B. 2009. Msx genes are important
apoptosis effectors downstream of the Shh/Gli3 pathway in the limb. Dev Biol
331:189-198.
Lallemand Y, Nicola MA, Ramos C, Bach A, Cloment CS, Robert B. 2005. Analysis of
Msx1; Msx2 double mutants reveals multiple roles for Msx genes in limb
development. Development 132:3003-3014.
Laufer E, Pizette S, Zou H, Orozco OE, Niswander L. 1997. BMP expression in duck
interdigital webbing: a reanalysis. Science 278:305.
Lee KH, Evans S, Ruan TY, Lassar AB. 2004. SMAD-mediated modulation of YY1 activity
regulates the BMP response and cardiac-specific expression of a GATA4/5/6dependent chick Nkx2.5 enhancer. Development 131:4709-4723.
Lewandoski M, Sun X, Martin GR. 2000. Fgf8 signalling from the AER is essential for
normal limb development. Nat Genet 26:460-463.
Lewin Benjamin. Cell cycle and growth regulation. 2000. Genes VII. Oxford University
Press. 866-871.
Lindsten T, Ross AJ, King A, Zong WX, Rathmell JC, Shiels HA, Ulrich E, Waymire KG,
Mahar P, Frauwirth K, Chen Y, Wei M, Eng VM, Adelman DM, Simon MC, Ma A,
Golden JA, Evan G, Korsmeyer SJ, MacGregor GR, Thompson CB. 2000. The
combined functions of proapoptotic Bcl-2 family members bak and bax are essential
for normal development of multiple tissues. Mol Cell 6:1389-1399.
Li X, Cao X. 2006. BMP signaling and skeletogenesis. Ann NY Acad Sci 1068: 26-40.
Lohnes D, Mark M, Mendelsohn C, Dolle P, Dierich A, Gorry P, Gansmuller A, Chambon
P. 1994. Function of the retinoic acid receptors (RARs) during development (I).
Craniofacial and skeletal abnormalities in RAR double mutants. Development
120:2723-2748.
Maatouk DM, Choi KS, Bouldin CM, Harfe BD. 2009. In the limb AER Bmp2 and Bmp4 are
required for dorsal-ventral patterning and interdigital cell death but not limb
outgrowth. Dev Biol 327:516-523.
Macias-Silva M, Abdollah S, Hoodless PA, Pirone R, Attisano L, Wrana JL. 1996. MADR2
is a substrate of the TGFbeta receptor and its phosphorylation is required for
nuclear accumulation and signaling. Cell 87:1215-1224.
Macias-Silva M, Hoodless PA, Tang SJ, Buchwald M, Wrana JL. 1998. Specific activation
of Smad1 signaling pathways by the BMP7 type I receptor, ALK2. J Biol Chem
273:25628-25636.
Macias D, Ganan Y, Ros MA, Hurle JM. 1996. In vivo inhibition of programmed cell death
by local administration of FGF-2 and FGF-4 in the interdigital areas of the
embryonic chick leg bud. Anat Embryol (Berl) 193:533-541.
97
Macias D, Ganan Y, Sampath TK, Piedra ME, Ros MA, Hurle JM. 1997. Role of BMP-2
and OP-1 (BMP-7) in programmed cell death and skeletogenesis during chick limb
development. Development 124:1109-1117.
Massague J, Wotton D. 2000. Transcriptional control by the TGF-beta/Smad signaling
system. EMBO J 19:1745-1754.
Merino R, Ganan Y, Macias D, Economides AN, Sampath KT, Hurle JM. 1998.
Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and
noggin through BMP signaling. Dev Biol 200:35-45.
Merino R, Macias D, Ganan Y, Rodriguez-Leon J, Economides AN, Rodriguez-Esteban C,
Izpisua-Belmonte JC, Hurle JM. 1999a. Control of digit formation by activin
signalling. Development 126:2161-2170.
Merino R, Rodriguez-Leon J, Macias D, Ganan Y, Economides AN, Hurle JM. 1999b. The
BMP antagonist Gremlin regulates outgrowth, chondrogenesis and programmed
cell death in the developing limb. Development 126:5515-5522.
Milaire J. 1971. [A morphogenic study of postaxial synactyly induced in the rat by
hadacidin. II. The limb buds in 12- to 14 day embryos]. Arch Biol (Liege) 82:253322.
Milaire J. 1992. A new interpretation of the necrotic changes occurring in the developing
limb bud paddle of mouse embryos based upon recent observations in four different
phenotypes. Int J Dev Biol 36:169-178.
Mirkes PE, Little SA, Umpierre CC. 2001. Co-localization of active caspase-3 and DNA
fragmentation (TUNEL) in normal and hyperthermia-induced abnormal mouse
development. Teratology 63:134-143.
Miyazono K, Maeda S, Imamura T. 2004. Coordinate regulation of cell growth and
differentiation by TGF-beta superfamily and Runx proteins. Oncogene 23:42324237.
Miyazono K, Maeda S, Imamura T. 2005. BMP receptor signaling: transcriptional targets,
regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev 16:251263.
Monteiro RM, de Sousa Lopes SM, Bialecka M, de Boer S, Zwijsen A, Mummery CL.
2008. Real time monitoring of BMP Smads transcriptional activity during mouse
development. Genesis 46:335-346.
Montero JA, Ganan Y, Macias D, Rodriguez-Leon J, Sanz-Ezquerro JJ, Merino R, ChimalMonroy J, Nieto MA, Hurle JM. 2001. Role of FGFs in the control of programmed
cell death during limb development. Development 128:2075-2084.
Montero JA, Lorda-Diez CI, Certal AC, Moreno N, Rodriguez-Leon J, Torriglia A, Hurle JM.
2010. Coordinated and sequential activation of neutral and acidic DNases during
interdigital cell death in the embryonic limb. Apoptosis 15:1197-1210.
98
Moon AM, Boulet AM, Capecchi MR. 2000. Normal limb development in conditional
mutants of Fgf4. Development 127:989-996.
Moon AM, Capecchi MR. 2000. Fgf8 is required for outgrowth and patterning of the limbs.
Nat Genet 26:455-459.
Mori C, Nakamura N, Kimura S, Irie H, Takigawa T, Shiota K. 1995. Programmed cell
death in the interdigital tissue of the fetal mouse limb is apoptosis with DNA
fragmentation. Anat Rec 242:103-110.
Nagarajan RP, Zhang J, Li W, Chen Y. 1999. Regulation of Smad7 promoter by direct
association with Smad3 and Smad4. J Biol Chem 274:33412-33418.
Nohe A, Hassel S, Ehrlich M, Neubauer F, Sebald W, Henis YI, Knaus P. 2002. The mode
of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different
BMP-2 signaling pathways. J Biol Chem 277:5330-5338.
Oberg KC, Pira CU, Revelli JP, Ratz B, Aguilar-Cordova E, Eichele G. 2002. Efficient
ectopic gene expression targeting chick mesoderm. Dev Dyn 224:291-302.
Orrenius S, Nicotera P, Zhivotovsky B. 2011. Cell death mechanisms and their
implications in toxicology. Toxicol Sci 119:3-19.
Pajni-Underwood S, Wilson CP, Elder C, Mishina Y, Lewandoski M. 2007. BMP signals
control limb bud interdigital programmed cell death by regulating FGF signaling.
Development 134:2359-2368.
Pizette S, Niswander L. 1999. BMPs negatively regulate structure and function of the limb
apical ectodermal ridge. Development 126:883-894.
Reijntjes S, Francis-West P, Mankoo BS. 2010. Retinoic acid is both necessary for and
inhibits myogenic commitment and differentiation in the chick limb. Int J Dev Biol
54:125-134.
Ren D, Tu HC, Kim H, Wang GX, Bean GR, Takeuchi O, Jeffers JR, Zambetti GP, Hsieh
JJ, Cheng EH. 2010. BID, BIM, and PUMA are essential for activation of the BAXand BAK-dependent cell death program. Science 330:1390-1393.
Richardson MK, Oelschlager HH. 2002. Time, pattern, and heterochrony: a study of
hyperphalangy in the dolphin embryo flipper. Evol Dev 4:435-444.
Riddle RD, Johnson RL, Laufer E, Tabin C. 1993. Sonic hedgehog mediates the polarizing
activity of the ZPA. Cell 75:1401-1416.
Rodriguez-Leon J, Merino R, Macias D, Ganan Y, Santesteban E, Hurle JM. 1999.
Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nat Cell
Biol 1:125-126.
Rountree RB, Schoor M, Chen H, Marks ME, Harley V, Mishina Y, Kingsley DM. 2004.
BMP receptor signaling is required for postnatal maintenance of articular cartilage.
PLoS Biol 2:e355.
99
Salas-Vidal E, Valencia C, Covarrubias L. 2001. Differential tissue growth and patterns of
cell death in mouse limb autopod morphogenesis. Dev Dyn 220:295-306.
Santibanez JF, Quintanilla M, Bernabeu C. 2011. TGF-beta/TGF-beta receptor system
and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond) 121:233251.
Sanz-Ezquerro JJ, Tickle C. 2000. Autoregulation of Shh expression and Shh induction of
cell death suggest a mechanism for modulating polarising activity during chick limb
development. Development 127:4811-4823.
Saunders JW, Gasseling MT. 1983. New insights into the problem of pattern regulation in
the limb bud of the chick embryo. Prog Clin Biol Res 110 Pt A:67-76.
Saunders JW, Jr. 1948. The proximo-distal sequence of origin of the parts of the chick
wing and the role of the ectoderm. J Exp Zool 108:363-403.
Saunders JW, Jr., Gasseling MT. 1962. Cellular death in morphogenesis of the avian wing.
Dev Biol 5:147-178.
Shi Y, Massague J. 2003. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the
nucleus. Cell 113:685-700.
Sowa H, Kaji H, Hendy GN, Canaff L, Komori T, Sugimoto T, Chihara K. 2004. Menin is
required for bone morphogenetic protein 2- and transforming growth factor betaregulated osteoblastic differentiation through interaction with Smads and Runx2. J
Biol Chem 279:40267-40275.
Sporn MB, Roberts AB. 1992. Transforming growth factor-beta: recent progress and new
challenges. J Cell Biol 119:1017-1021.
Urist MR. 1965. Bone: formation by autoinduction. Science 150:893-899.
Weatherbee SD, Behringer RR, Rasweiler JJt, Niswander LA. 2006. Interdigital webbing
retention in bat wings illustrates genetic changes underlying amniote limb
diversification. Proc Natl Acad Sci U S A 103:15103-15107.
Willis SN, Fletcher JI, Kaufmann T, van Delft MF, Chen L, Czabotar PE, Ierino H, Lee EF,
Fairlie WD, Bouillet P, Strasser A, Kluck RM, Adams JM, Huang DC. 2007.
Apoptosis initiated when BH3 ligands engage multiple Bcl-2 homologs, not Bax or
Bak. Science 315:856-859.
Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang
EA. 1988. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.
Science 242:1528-1534.
Xu CP, Ji WM, van den Brink GR, Peppelenbosch MP. 2006. Bone morphogenetic protein2 is a negative regulator of hepatocyte proliferation downregulated in the
regenerating liver. World J Gastroenterol 12:7621-7625.
Yamaguchi A. 1995. Regulation of differentiation pathway of skeletal mesenchymal cells in
cell lines by transforming growth factor-beta superfamily. Semin Cell Biol 6:165-173.
100
Yang E, Zha J, Jockel J, Boise LH, Thompson CB, Korsmeyer SJ. 1995. Bad, a
heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death.
Cell 80:285-291.
Yokouchi Y, Sakiyama J, Kameda T, Iba H, Suzuki A, Ueno N, Kuroiwa A. 1996. BMP-2/-4
mediate programmed cell death in chicken limb buds. Development 122:3725-3734.
Yoon BS, Ovchinnikov DA, Yoshii I, Mishina Y, Behringer RR, Lyons KM. 2005. Bmpr1a
and Bmpr1b have overlapping functions and are essential for chondrogenesis in
vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102:5062-5067.
Yoshida H, Kong YY, Yoshida R, Elia AJ, Hakem A, Hakem R, Penninger JM, Mak TW.
1998. Apaf1 is required for mitochondrial pathways of apoptosis and brain
development. Cell 94:739-750.
Yu PB, Hong CC, Sachidanandan C, Babitt JL, Deng DY, Hoyng SA, Lin HY, Bloch KD,
Peterson RT. 2008. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis
and iron metabolism. Nat Chem Biol 4:33-41.
Yu K, Ornitz DM. 2008. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal
patterning along the limb bud proximodistal axis. Development 135:483-91.
Zhang D, Schwarz EM, Rosier RN, Zuscik MJ, Puzas JE, O'Keefe RJ. 2003. ALK2
functions as a BMP type I receptor and induces Indian hedgehog in chondrocytes
during skeletal development. J Bone Miner Res 18:1593-1604.
Zou H, Niswander L. 1996. Requirement for BMP signaling in interdigital apoptosis and
scale formation. Science 272:738-741.
Zou H, Wieser R, Massague J, Niswander L. 1997. Distinct roles of type I bone
morphogenetic protein receptors in the formation and differentiation of cartilage.
Genes Dev 11:2191-2203.
Zuzarte-Luis V, Berciano MT, Lafarga M, Hurle JM. 2006. Caspase redundancy and
release of mitochondrial apoptotic factors characterize interdigital apoptosis.
Apoptosis 11:701-715.
Zuzarte-Luis V, Hurle JM. 2005. Programmed cell death in the embryonic vertebrate limb.
Semin Cell Dev Biol 16:261-269.
Zuzarte-Luis V, Montero JA, Kawakami Y, Izpisua-Belmonte JC, Hurle JM. 2007.
Lysosomal cathepsins in embryonic programmed cell death. Dev Biol 301:205-217.
Zuzarte-Luis V, Montero JA, Rodriguez-Leon J, Merino R, Rodriguez-Rey JC, Hurle JM.
2004. A new role for BMP5 during limb development acting through the synergic
activation of Smad and MAPK pathways. Dev Biol 272:39-52.
101
GLOSARIO.
Ácido Retinoico: Metabolito derivado de la vitamina A necesario en múltiples funciones
durante el desarrollo. En la extremidad está involucrado en el establecimiento del patrón
anterior-posterior y regulación de la muerte celular.
Apoptosis: Es un tipo de muerte celular caracterizada por la compactación de la célula y
su núcleo, fragmentación del DNA por acción de endonucleasas, fragmentación del
núcleo y del citoplasma de la célula para formar cuerpos apoptóticos y la fagocitosis de
estos cuerpos apoptóticos por células vecinas ó macrófagos sin inducir una respuesta
inflamatoria.
Autópodo: Región anatómica distal de la extremidad de los vertebrados. Se compone de
carpos, metacarpos y falanges de los miembros anteriores en las extremidades anteriores
y de tarsos, metatarsos y falanges de los miembros posteriores en las extremidades
posteriores.
Células precondrogénicas: Células precursoras de los condrocitos.
Condrocitos: Tipo celular del cartílago que expresa y sintetiza exclusivamente colágena
tipo II.
Condrodisplasia: Desorden genético que resulta en el acortamiento y deformidad de las
extremidades.
Cresta Ectodérmica Apical: Engrosamiento del ectodermo en el extremo distal de la
extremidad en desarrollo del pollo y de los mamíferos cuya función es dirigir el crecimiento
próximo-distal de la extremidad.
Dedo ectópico: Formación de un dedo en un lugar ó tejido en el que no es formado
comúnmente; fuera de sitio.
Ectodermo: Capa germinal externa del embrión en etapa de gástrula que forma a la
epidermis y al sistema nervioso.
102
Endodermo: Capa germinal interna del embrión en etapa de gástrula que genera al
epitelio del tubo digestivo y sus órganos asociados tales como los pulmones y el hígado
en vertebrados.
Epitelio: Tejido que recubre a una gran cantidad de órganos internos así como la
superficie del organismo animal. Está formado por células de origen ectodermal muy
adyacentes entre sí. El epitelio pseudoestratificado de la Cresta Ectodérmica Apical
emana señales que son responsables del crecimiento y establecimiento próximo distal de
la extremidad.
Estilópodo: Región anatómica proximal de la extremidad de los vertebrados adyacente al
tronco del cuerpo. Se compone de húmero en la región anterior y fémur en la región
posterior.
Falanges: Elementos esqueléticos que constituyen a los dedos de los vertebrados.
Fíbula: Elemento óseo largo localizado en la región posterior del zeugópodo de la
extremidad posterior, paralelo y más delgado que la tibia.
Foyer préaxiale primaire: Área de muerte celular programada localizada en el
mesénquima anterior del primordio de la extremidad del ratón. Su presencia se evidencia
a los 11 y 12 dpc y se ha asociado con la adquisición del borde anterior de la extremidad y
con el control en el número de dedos en el ratón.
LysoTracker: Sonda fluorescente acidotrópica usada para marcar y rastrear organelos
ácidos en las células vivas.
Mesénquima: Tipo de organización celular frecuente en el embrión que se caracteriza por
ser un tejido laxo cuyas células no están conectadas entre ellas. Usualmente, el
mesénquima es de origen mesodermal aunque algunas células epiteliales ó de origen
ectodermal pueden presentar transición epitelial a mesénquima.
Mesénquima anterior de la extremidad: Células de mesénquima localizadas en la
región anterior del primordio de la extremidad que pueden ser sensibles a las señales de
muerte celular.
103
Mesénquima distal de la extremidad: Área de células mesenquimales que se localizan
en el primordio de la extremidad de aves y mamíferos subyacentes a la Cresta
Ectodérmica Apical que pueden formar parte de los tejidos que constituyen a los dedos ó
al tejido interdigital.
Mesénquima posterior de la extremidad: Células de mesénquima localizadas en la
región posterior del primordio de la extremidad que pueden formar parte de la Zona de
Actividad Polarizante ó de la Zona Necrótica Posterior.
Mesodermo: Capa germinal intermedia del embrión en la etapa de gástrula, localizada
entre el ectodermo y el endodermo que origina a la sangre, al riñón, al corazón, a los
huesos, a los músculos y diversos tipos de tejido conjuntivo.
Muerte Celular Programada: Eliminación de células durante el desarrollo normal de los
animales o durante la vida adulta de los animales. Durante el desarrollo, la Muerte Celular
Programada contribuye a la morfogénesis de los órganos y tejidos, mientras que es
importante en la homeostasis de los órganos adultos.
Parche Opaco: Región central del mesénquima del primordio de la extremidades del
pollo cuya eliminación, por muerte celular programada, se asocia con la separación de los
dos elementos esqueléticos del zeugópodo.
Pericondrio: Capa de células que rodea a los elementos esqueléticos en formación por
osificación endocondral. Las células del pericondrio secretan importantes moléculas de
señalización necesarias para el control de la diferenciación y crecimiento de los huesos.
Una vez establecidos los elementos esqueléticos, el pericondrio rodea al cartílago.
Polidactilia: Autópodo que presenta un mayor número de dedos con respecto al
autópodo que se desarrolla de manera normal en una especie.
Radio: Elemento óseo largo localizado en la región anterior del zeugópodo de la
extremidad anterior, paralelo a la Ulna.
Regresión Interdigital: Proceso de eliminación del tejido interdigital por muerte celular
programada.
104
Sindactilia: Autópodos caracterizados por la presencia de tejido interdigital que mantiene
a los dedos unidos.
Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria: Alteración autosómica dominante en la que se
desarrollan vasos sanguíneos anormales de color rojo ó rojo púrpura propensos a
romperse fácilmente, lo que provoca hemorragias.
Tendón: Es un tipo de tejido conjuntivo fibroso en forma de banda que conecta al
musculo y al hueso capaz de soportar tensión. Está compuesto principalmente de fibras
de colágena tipo I.
Tendón extensor: Son los tendones localizados en el dorso del autópodo.
Tendones flexores: Son los tendones ubicados en región ventral de la extremidad.
Tibia: Elemento óseo largo localizado en la región anterior del zeugópodo de la
extremidad posterior, paralelo y más grueso que la Fíbula.
TUNEL: Método para detectar la fragmentación del DNA resultante de la activación de la
apoptosis. La prueba consiste en el reconocimiento del DNA fragmentado por una enzima
llamada desoxinucleotidil transferasa terminal que cataliza, en los hidroxilos 3’ de los
extremos cortados del DNA, la adición de un desoxiuridin trifosfato (dUTP) marcado.
Ulna: Elemento óseo largo localizado en la región anterior del zeugópodo de la
extremidad anterior, paralelo al Radio.
Zeugópodo: Región anatómica media de la extremidad de los vertebrados compuesta de
radio y ulna en la extremidad anterior y tibia y fíbula en la extremidad posterior.
Zona Avascular del mesénquima de la extremidad: mesénquima del primordio de la
extremidad que carece de vasos sanguíneos.
Zona de Actividad Polarizante: Región posterior del primordio de la extremidad de aves
y mamíferos que emana señales que establecen el patrón antero-posterior de la
extremidad.
105
Zona Marginal Subyacente a la Cresta Ectodérmica Apical: Área de muerte celular
que subyace a la Cresta Ectodérmica Apical que rodea distalmente a todo el autópodo. Se
conecta con la Zona Necrótica Marginal Anterior y Posterior. Se ha sugerido que esta área
se extiende hacia la región interdigital para su posterior eliminación.
Zona Necrótica Anterior: Área de muerte celular programada localizada en el
mesénquima anterior de las extremidades del pollo en desarrollo y que es evidente desde
la aparición del primordio hasta la adquisición final de la forma de la extremidad. Su
eliminación esculpe el borde anterior de la extremidad y se le ha asociado con la
reducción en el número de dedos anteriores en aves.
Zona Necrótica Marginal Anterior: Área de muerte celular, delgada y alargada, que
bordea al mesénquima anterior del autópodo del ratón.
Zona Necrótica Marginal Posterior: Área de muerte celular delgada y alargada que
bordea al mesénquima posterior del autópodo del ratón.
Zona Necrótica Posterior: Área de muerte celular programada localizada, durante la
formación de la extremidad del pollo, en el mesénquima posterior. Su eliminación moldea
el borde posterior de la extremidad y se le ha asociado con la reducción en el número de
dedos posteriores en las alas de las aves.
106
ANEXO.
TRANSFECCIÓN DEL TEJIDO INTERDIGITAL DEL POLLO POR
MICROELECTROPORACIÓN CONFINADA DE BAJO COSTO.
RESUMEN.
El tejido interdigital de la extremidad en desarrollo del pollo es un centro de señalización
que establece la identidad de los dedos y es un modelo recurrente para estudiar la muerte
celular programada. Sin embargo, debido a la falta de técnicas apropiadas, hay muy
pocos estudios sobre los mecanismos intracelulares que regulan la muerte celular
interdigital y sobre las señales del interdígito que podrían estar involucradas en la
identidad de los dedos. En este reporte, evaluamos la microelectroporación confinada
como una posible técnica de transfección en el interdígito de la extremidad del pollo.
Construimos un electroporador de bajo costo y transfectamos el vector pCX-GFP bajo
distintas condiciones de electroporación; variando el voltaje (V), la duración de los pulsos
(ms) y el número de pulsos (p). Observamos que el nivel de transfección incrementó
cuando las tres condiciones se incrementaron siempre y cuando estas no causaran daño
excesivo. A pesar de que los niveles más altos de transfección son generados con
voltajes de 18V en adelante y más de 2p, las extremidades mostraron alteraciones
fenotípicas como sindactilia y formación de cartílago ectópico en el interdígito.
Encontramos que a 17V, 70 ms, 1p es la condición de electroporación óptima debido a
que la expresión de GFP es muy aceptable y la frecuencia de alteraciones fenotípicas es
muy baja.
INTRODUCCIÓN.
La extremidad en desarrollo del pollo se ha convertido en un modelo clásico para el
estudio de diferentes procesos del desarrollo, tales como el establecimiento de patrones,
la morfogénesis, la diferenciación celular y la muerte celular programada (PCD). Durante
las últimas etapas de la formación del autópodo del pollo (la región de la extremidad
correspondiente a las alas y a las patas), las células indiferenciadas toman dos destinos:
forman a los dedos ó al tejido interdigital (1). El interdígito es un tejido mesodérmico
107
indiferenciado cuya eliminación por Muerte celular programada (PCD) contribuye a la
separación de los dedos en la pata del pollo (2, 3). Antes de que el interdígito sea
eliminado, este, actúa como un importante centro de señalamiento que regula la identidad
de los dedos (4). A pesar del amplio reconocimiento de las principales señales
extracelulares involucradas en la regulación de la PCD interdigital y en su función como
centro de señalización, los mecanismos moleculares intracelulares que podrían mediar
estas señales son prácticamente desconocidos. Esto es debido a la falta de técnicas
adecuadas que permitan la sobreexpresión de genes de interés de manera local en el
interdígito.
La electroporación es un método eficiente de transfección que consiste en la aplicación
de pulsos eléctricos controlados que provocan la apertura de poros en la membrana
plasmática por los cuales, polinucleótidos y otras macromoléculas suministradas pasan
hacia el interior de la célula por un gradiente de concentración (5). Hasta hace unos años
se ha venido utilizando una variante de la electroporación; la microelectroporación in ovo,
que resulta en la expresión espacial y temporal de manera restringida de un transgen en
un determinado tejido embrionario del pollo (6). Con el objetivo de obtener una alta
eficiencia de transfección en el mesodermo del primordio de la extremidad del pollo,
Oberg y col desarrollaron la microelectroporación confinada que consiste en la inserción
de microelectrodos aislados en el mesodermo para evitar que la corriente eléctrica fluya
por el epitelio (7). Aunque la microelectroporación in ovo, es una técnica rápida, eficiente y
segura de transfección, puede ser cara debido a los altos costos de los electroporadores
disponibles comercialmente.
En este trabajo, describimos brevemente el método de construcción de un
electroporador de bajo costo y su uso para evaluar la posibilidad de transfectar interdígitos
de pollo con un vector de expresión que contiene una secuencia codificante para Gfp,
regulada por un promotor de de -actina de pollo y un Enhancer del Citomegalovirus
(CMV). Este vector es denominado pCX-GFP (7, 8). Utilizamos la microelectroporación
confinada con ligeras modificaciones adaptadas para la transfección del tejido interdigital
del pollo en etapa 29-30 HH de desarrollo (9). Con el objeto de proponer las condiciones
óptimas de la electroporación interdigital variamos el voltaje (V), la duración (ms) y el
número de pulsos (p) durante la aplicación del campo eléctrico en este tejido.
108
MATERIALES Y MÉTODOS.
Construcción de un electroporador de bajo costo.
El electroporador construido es un instrumento que genera pulsos eléctricos con la
capacidad de controlar la duración y periodo de los pulsos, así como la amplitud de los
mismos. El sistema fue desarrollado con tecnología estándar de bajo costo y de fácil
implementación. Las condiciones generales de diseño fueron las siguientes: Generación
de pulsos con duración variable desde 20ms hasta 250ms, tren de pulsos con 2 periodos
distintos; uno de 50 ms y otro de 100 ms, variación en la amplitud de los pulsos desde
1.2V hasta 50V, indicadores visuales; uno para el número de pulsos y otro para la
amplitud del pulso, y que la Interacción hombre-máquina fuese sencilla.
Para lograr estas características, el sistema se conformó básicamente por 4 etapas:
generador de pulsos, contador de pulsos, potencia y fuente de alimentación.
El generador de pulsos tiene la función de generar y controlar tanto el ancho de los
pulsos como su periodo, esto se logró acoplando un circuito monoestable y un circuito
estable. El contador de pulsos muestra el número real de pulsos aplicados al embrión,
para esto, se implementó un circuito con 2 display de 7 segmentos.
La etapa de potencia se encarga de suministrar la corriente requerida por el embrión,
para esto se implementó un circuito amplificador de corriente utilizando 2 transistores TBJ.
La fuente de alimentación está conformada por 3 partes: una fuente fija regulada de baja
potencia que se utiliza para energizar las etapas de generación y contador de pulsos, una
fuente fija regulada de media potencia que se encarga de energizar el circuito de
acoplamiento de la etapa de potencia y una fuente variable regulada que se encarga de
proporcionar la energía programada al embrión. La figura 1 muestra el diagrama de
bloques y el aparato resultante.
Electroporación.
La microelectroporación confinada (Oberg et al. 2002) fue usada in este estudio con
ligeras modificaciones que consistieron en (1) aislar solo el microelectrodo negativo ya
109
que fue el único electrodo que se introdujo en el mesénquima interdigital, y (2) la omisión
de la microinyección con aceite mineral sustituida por la rápida aplicación del pulso
después de que el plásmido fue inyectado (Película 1). Esto debido a que la interfase
aceite-plásmido-aceite requerida en la microaguja para cada embrión puede ser laboriosa.
Se emplearon para este estudio embriones de pollos libres de patógenos específicos
(SPF) (ALPES, S.A. de C.V. Puebla, México). Se realizaron ventanas en el cascarón del
huevo de embriones en etapa 28-29 según las etapas de Hamburger y Hamilton
(Hamburger and Hamilton, 1951) y se expuso la extremidad derecha rompiendo la
membrana amniótica en esta área. Todas las manipulaciones se realizaron en el tercer
interdígito de la extremidad derecha y se uso el plásmido pCX-GFP, donado amablemente
por Kerby Oberg (7)
Se utilizaron microelectrodos de tungsteno (LS269026, Goodrellow Cambridge Limited,
Huntingdon, England) cuyos diámetro fue de 0.25 mm para el electrodo positivo y de
0.025 mm para la punta del electrodo negativo. El diámetro de la punta del electrodo
negativo se obtuvo sumergiendo el electrodo en una solución 1N de NaOH y aplicando
una corriente eléctrica de 20 a 25V. El electrodo negativo se aisló con barniz de uñas
exceptuando la punta, dejando 0.015 mm sin aislar. Se usaron capilares de vidrio de 1.0
mm de diámetro (TW100F-5, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA) para la
fabricación de microagujas usando un puller Narishige (PP-83, Narishige).
El microelectrodo positivo se contactó con el ectodermo apical del tercer interdígito y el
electrodo negativo se introdujo en el área proximal del interdígito tratando de que el área
aislada del microelectrodo contactara con el ectodermo dorsal y la punta no aislada en el
mesénquima. Una solución de 3 a 4 g/l del vector con tinta china en una proporción 6:1
se inyectó con la microaguja de vidrio entre los microelectrodos hasta ver el interdígito
teñido usando una bomba de pistón manual (Eppendorf CellTram vario, 5176, Hamburg,
Germany). Inmediatamente, se aplicó la corriente eléctrica, observando la generación de
burbujas discretas en el área electroporada (Película 1). La ventana realizada en el
cascarón fue sellada con cinta adhesiva y los embriones se incubaron durante 24 horas a
38 °C con 70% de humedad.
En base a reportes previos aplicamos diferentes condiciones de electroporación: los
voltajes fueron de 7V a 32V manteniendo la duración y el número de pulsos constante, la
110
duración de los pulsos fue de 50 a 120ms con el voltaje y el número de pulsos constante y
el número de pulsos fue de 1 a 5p con el voltaje y la duración del pulso constante.
Análisis de Transfección.
Después de 24 horas, las extremidades electroporadas se aislaron, se lavaron en PBS y
se observaron en el microscopio de fluorescencia para evaluar el nivel relativo de
transfección de acuerdo a que tanta área del interdígito expresó GFP. Basados en los
resultados, consideramos, cualitativamente cinco niveles de transfección relativa que son
ilustradas en la figura 2. El nivel 0 no mostró transfección, el nivel 1 considera sólo unas
cuantas células que expresaron GFP, el nivel 2 muestra que al menos la cuarta parte del
interdígito está transfectado, el nivel 3 considera a la mitad del interdígito transfectado, el
nivel 4 las tres cuartas partes y el nivel 5 a casi toda el área interdigital.
Análisis fenotípico.
Para evaluar la muerte celular interdigital, las extremidades se aislaron 24, 48, 72 y 96
horas después de la electroporación, se lavaron en PBS y se tiñeron con Rojo Neutro 2%
para evaluar la muerte celular programada interdigital. Las extremidades teñidas se fijaron
en formol Cálcico frío 4% in PBS toda la noche, se deshidrataron en Isopropanol dos
veces durante una hora cada vez y se transparentaron en Xilol para fotografiarlas (1).
Para evaluar posibles alteraciones en el patrón, las extremidades tratadas fueron
aisladas, lavadas en PBS y fijadas en etanol 96°. Posteriormente se permeabilizaron en
acetona, se tiñeron con azul Alciano y se trataron con KOH 1N para visualizar el cartílago.
Una vez transparentadas, las extremidades se colocaron en glicerol para fotografiarlas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Variación de los Voltajes.
La Tabla 1 describe los resultados de las comparaciones entre distintas condiciones de
electroporación de las cuales el voltaje fue cambiado, manteniendo la duración (ms,
milisegundos) y el número de pulsos (p, pulsos) constante. La tabla muestra que cuando
el voltaje se incrementó, el nivel de transfección también se incrementó. Sin embargo,
notamos que con la aplicación de voltajes altos (de 17V en adelante) se produjo
111
alteraciones fenotípicas indeseables, relacionadas principalmente al proceso de muerte
celular
programada
(PCD).
La
permanencia
del
tejido
interdigital
(sindactilia),
acompañada algunas veces de cartílago ectópico, fue el fenotipo que con más frecuencia
encontramos. Otras alteraciones consistieron en la desorganización del establecimiento
del esqueleto (figura 3) y ausencia de articulaciones en las falanges adyacentes al
interdígito electroporado. La frecuencia de las alteraciones fenotípicas disminuyó cuando
se aplicaron voltajes bajos, pero el nivel de transfección también fue bajo ó nulo. Por
ejemplo, observamos nivel 1 de transfección basados en la presencia de la expresión de
GFP en el 11.1% (1/9) de los interdígitos electroporados cuando 7V, 60 ms y 5 pulsos se
aplicaron, el resto (88.8%; 8/9) no mostró expresión de GFP. Incrementando el voltaje a
10V, el 28.6% (2/7) mostró nivel 2 de transfección, 14.3% (1/7) mostró nivel 1 y el 57.1%
no mostró expresión de GFP. En ambas condiciones de electroporación no se
presentaron alteraciones fenotípicas (Tabla 1). En otro caso, cuando se aplicó 18V, 120
ms, 1p, el 85.7% (6/7) de los interdígitos transfectados mostraron nivel 2 de transfección y
14.3% (1/7) no mostró expresión de GFP, incrementando a 20V, 7.7% (1/13) mostró nivel
4 de transfección, 30.8% (4/13) nivel 3, 46.1% (6/13) nivel 2, 7.7% (1/13) nivel 1 y el 7.7%
(1/13) restante no mostró expresión de GFP. Sin embargo, 57.1% (4/7) de interdígitos
electroporados a 20V mostraron sindactilia, mientras que el 20% (2/10) a 18V mostraron
el mismo fenotipo (Tabla 1, figura 2, 3).
Variación en la duración de los Pulsos.
Aplicamos duración de pulsos desde 50ms a120ms. El incremento a partir de 50ms hasta
80ms resultó en la elevación del nivel de transfección que disminuyó cuando 100ms y
120ms se aplicaron (Tabla 2). Interesantemente, la aplicación de voltajes que producen
cambios fenotípicos (a partir de 18V) con 50 y 60ms resultó en una frecuencia más alta de
alteraciones que cuando se aplicó 70ms. Sin embargo, la frecuencia de estos cambios
fenotípicos se elevó nuevamente cuando la duración del pulso fue mayor a 70 ms. Por
ejemplo en la tabla 2 se muestra que cuando 18V, 60 ms, 1p se aplicó, 51.6% (16/31) de
los interdígitos transfectados mostraron nivel 2 de transfección, 45.2% (14/31) nivel 3 y
solo el 3.2% (1/31) nivel 4. De los interdígitos evaluados para detectar alteraciones
fenotípicas, el 40% (10/25) presentó PCD alterada. A 70 ms el nivel de transfección fue
muy alto; EL 3.4% (1/29) mostró nivel 1, el 27.6% (8/29) nivel 2, el 34.5% (10/29) nivel 3,
el 24.1% (7/29) nivel 4 y el 10.3% (3/29) nivel 5, con baja frecuencia de alteraciones
fenotípicas; 14.3% (3/21). Incrementando la duración del pulso a 120 ms, 85.7% (6/7)
112
mostró nivel 2 de transfección, 14.3% (1/7) no expresó GFP y 20% mostró alteraciones
(2/10) (Tabla 2, figura 2, 3). En base a estos resultados elegimos 70 ms como la duración
óptima del pulso para electroporar el interdígito.
Variación del número de Pulsos.
Evaluamos la aplicación del número de pulsos que van de 1 a 5 pulsos con distintas
condiciones en donde el voltaje y la duración del pulso fueran constantes (Tabla 3).
Observamos que el nivel de transfección incrementa cuando el número de pulsos también
incrementa. Sin embargo, la aplicación de más de 2 pulsos resultó en frecuencias más
grandes de alteraciones fenotípicas. Por ejemplo, cuando se aplico 15V, 120 ms, 2p
obtuvimos 66.6% con nivel 1 de transfección (4/6) y 33.3% con nivel 3 (2/6) sin
alteraciones fenotípicas aparentes. Bajo las mismas condiciones exceptuando la
aplicación de 5p, el 72.2 % (13/18) mostró nivel de transfección 2, el 22.2% (4/18) nivel 3
y un caso (5.5%) nivel 4, pero el 50% presentó alteraciones fenotípicas. De los interdígitos
tratados con 31V, 60 ms, 1p, el 11.1% (1/9) mostró nivel 1 y 4 de transfección, el 22.2%
(2/9) mostró nivel 2 y 3 de transfección y el resto no expresó GFP. El 28.6% (2/7)
presentó alteraciones fenotípicas. Cuando se aplicaron 3 pulsos; 9.1% (1/11), 36.4%
(4/11) y 54.5% (6/11) mostraron nivel 1, 2 y 3 de transfección respectivamente con 100%
de alteraciones fenotípicas (3/3) (Tabla 3, figura 2, 3).
En general, observamos que hasta cierto punto, al incrementar las condiciones de
electroporación también se incrementó el nivel de transfección, sin embargo la frecuencia
de fenotipos no deseables o artificios provocados por estas condiciones fue mayor (figura
3). Esto puede explicarse por varias razones. La aplicación de voltajes, duración y número
de pulsos altos puede generar un campo que podría romper la membrana plasmática
irreversiblemente, provocando la expulsión de materiales citoplasmáticos y daño celular
(5). Se ha reportado que la generación de una herida en el interdígito resulta en la
divergencia de la muerte celular y la formación de cartílago ectópico en este tejido (10).
Así, el daño de las células posiblemente provocado por la aplicación de altas condiciones
de electroporación en el interdígito podría causar sindactilia y otros fenotipos relacionados
a las alteraciones interdigitales. El incremento de las tres condiciones de electroporación
también incrementó el nivel de transfección pero cuando estas condiciones fueron
mayores a 30V con duración del pulso mayor a 100ms, el nivel de transfección disminuyó.
Esto podría generar un mayor daño de las células interdigitales debido a la presencia de
113
poros permanentes en la membrana, impidiendo la permanencia del plásmido dentro de la
célula y su consecuente expresión. Contrariamente, al menos con el número de pulsos
que manejamos (hasta 5 pulsos), observamos un incremento de la transfección cuando el
número de pulsos se incrementó, pero esto resulto en mayores alteraciones fenotípicas.
Esto podría deberse, además de un ligero daño celular cuando se aplicaron los pulsos
(permitiendo que la membrana se selle nuevamente) a un cambio en las respuesta celular
que afecte la morfogénesis y la función del interdígito, por ejemplo, produciendo
gradientes químicos (11-12), secretando factores involucrados en la reparación del daño
tisular (13-15) o generando respuestas relacionadas a algunos procesos del desarrollo
provocados por la aplicación de campos eléctricos (16-18). La aplicación de tiempos bajos
de duración del pulso (50, 60 ms) resultó en una frecuencia de alteración fenotípica mayor
que cuando se aplicó 70 ms. La aplicación de 50 a 60 ms podría generar en un campo
eléctrico característico que provoque algunas repuestas celulares reflejadas en la
aparición de alteraciones fenotípicas interdigitales.
Establecimiento de las condiciones óptimas de electroporación interdigital.
Manejando empíricamente distintos voltajes, duración y número de pulsos, encontramos
que 17V, 70 ms, 1p es la condición óptima de electroporación para tratar el tejido
interdigital. La aplicación de voltajes mayores a 17V con más de 70 ms de duración del
pulso y número de pulsos mayores a uno podría resultar, dependiendo de qué tan altas
sean las condiciones, en la inhibición de la PCD interdigital, sindactilia, estrechamiento
interdigital, formación de cartílago ectópico y patrón alterado de los dedos. La condición
de electroporación de 17V, 70ms 1p no solo evita altas frecuencias de alteraciones
fenotípicas (7.3% (3/41), también produce niveles aceptables de transfección; 20% (4/20)
mostró nivel 2 de transfección, 45% (9/20) nivel 3 y 35% (7/20) nivel 4 (Tabla 1, figura 2).
La aplicación de voltajes menores a 17V, 70ms y 1p redujo las frecuencias de
alteraciones fenotípicas pero también a los niveles de transfección.
Además de transfectar etapas del desarrollo tempranas y medias del desarrollo de la
extremidad en desarrollo del pollo, la microelectroporación in vivo podría ser útil para
estudiar los mecanismos intracelulares durante las etapas tardías y en tejidos particulares
como el interdígito.
114
Bajo condiciones óptimas, el método de electroporación interdigital será de gran
utilidad para la introducción de genes relacionados o sospechosos que controlen la PCD
interdigital o su posible función en el interdígito como centro de señalización. El uso de la
microelectroporación in ovo es un método eficiente, fácil, seguro y podría ser de bajo
costo, pero primero se debe estandarizar la condición de electroporación en un tejido
particular
con
el
objetivo
de
descartar
artificios
provocados
por
la
propia
microelectroporación que podría alterar o enmascarar nuestros datos experimentales
sobre la función de un gen.
REFERENCIAS.
1.
Ganan, Y., D. Macias, M. Duterque-Coquillaud, M.A. Ros and J.M. Hurle. 1996.
Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and
the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod.
Development 122:2349-2357.
2.
Ganan, Y., D. Macias, R.D. Basco, R. Merino and J.M. Hurle. 1998.
Morphological diversity of the avian foot is related with the pattern of msx gene
expression in the developing autopod. Dev Biol 196:33-41.
3.
Chen, Y. and X. Zhao. 1998. Shaping limbs by apoptosis. J Exp Zool 282:691-702.
4.
Dahn, R.D. and J.F. Fallon. 2000. Interdigital regulation of digit identity and
homeotic transformation by modulated BMP signaling. Science 289:438-441.
5.
Somiari, S., J. Glasspool-Malone, J.J. Drabick, R.A. Gilbert, R. Heller, M.J.
Jaroszeski and R.W. Malone. 2000. Theory and in vivo application of
electroporative gene delivery. Mol Ther 2:178-187.
6.
Yasuda,
K.,
T.
Momose
and
Y.
Takahashi.
2000.
Applications
of
microelectroporation for studies of chick embryogenesis. Dev Growth Differ 42:203206.
115
7.
Oberg, K.C., C.U. Pira, J.P. Revelli, B. Ratz, E. Aguilar-Cordova and G. Eichele.
2002. Efficient ectopic gene expression targeting chick mesoderm. Dev Dyn
224:291-302.
8.
Ikawa, M., K. Kominami, Y. Yoshimura, K. Tanaka, Y. Nishimune and M.
Okabe. 1995. A rapid and non-invasive selection of transgenic embryos before
implantation using green fluorescent protein (GFP). FEBS Lett 375:125-128.
9.
Hamburger, V. and H.L. Hamilton. 1951. A series of normal stages in the
development of the chick embryo. J Morph 88:49-92.
10.
Talamillo, A., M.F. Bastida, M. Fernandez-Teran and M.A. Ros. 2005. The
developing limb and the control of the number of digits. Clin Genet 67:143-153.
11.
Borgens, R.B., J.W. Vanable, Jr. and L.F. Jaffe. 1979. Reduction of sodium
dependent stump currents disturbs urodele limb regeneration. J Exp Zool 209:377386.
12.
Song, B., Y. Gu, J. Pu, B. Reid, Z. Zhao and M. Zhao. 2007. Application of direct
current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric
field in vivo. Nat Protoc 2:1479-1489.
13.
Nuccitelli, R. 2003. A role for endogenous electric fields in wound healing. Curr
Top Dev Biol 58:1-26.
14.
Stewart, S., A. Rojas-Munoz and J.C. Belmonte. 2007. Bioelectricity and
epimorphic regeneration. Bioessays 29:1133-1137.
15.
Brown, S.B. and I. Dransfield. 2008. Electric fields and inflammation: may the
force be with you. ScientificWorldJournal 8:1280-1294.
16.
Zhao, M., H. Bai, E. Wang, J.V. Forrester and C.D. McCaig. 2004. Electrical
stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells
by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci 117:397-405.
116
17.
Ishibashi, T., K.A. Dakin, B. Stevens, P.R. Lee, S.V. Kozlov, C.L. Stewart and
R.D. Fields. 2006. Astrocytes promote myelination in response to electrical
impulses. Neuron 49:823-832.
18.
Hotary, K.B. and K.R. Robinson. 1992. Evidence of a role for endogenous
electrical fields in chick embryo development. Development 114:985-996.
117
TABLAS.
Tabla 1. Comparación del porcentaje de transfección relativa y presencia de alteraciones
fenotípicas entre diferentes condiciones de electroporación de las cuales el voltaje fue
cambiado.
Condiciones
7V, 60ms, 5p
10V, 60ms, 5p
0
*
**
***
Presencia de
alteraciones
alteraciones
fenotípicas
fenotípicas
100%
0%
(8/9)
(1/9)
(3/3)
(0/3)
57.1%
14.3%
28.6%
100%
0%
(4/7)
(1/7)
(2/9)
(5/5)
(0/5)
17V, 60ms, 1p
66.6%
33.3%
100%
0%
(4/6)
(2/6)
(4/4)
(0/4)
100%
0%
100%
(4/4)
(0/3)
(3/3)
10%
40%
50%
73.7%
26.3%
(1/10)
(4/10)
(5/10)
(14/19)
(5/19)
51.6%
45.7%
3.2%
60%
40%
(16/31)
(14/31)
(1/31)
(15/25)
(10/25)
18V, 60ms, 1p
33.3%
11.1%
22.2%
22.2%
11.1%
71.4%
28.6%
(3/9)
(1/9)
(2/9)
(2/9)
(1/9)
(5/7)
(2/7)
20%
45%
35%
92.7%
7.3%
(4/20)
(9/20)
(7/20)
(38/41)
(3/41)
3.4%
27.6%
34.5%
24.1%
10.3%
85.7%
14.3%
(1/29)
(8/29)
(10/29)
(7/29)
(3/29)
(18/21)
(3/21)
17V, 70ms, 1p
18V, 70ms, 1p
20V, 120ms, 1p
Ausencia de
11.1%
20V, 120ms, 2p
18V, 120ms, 1p
*****
88.1%
15V, 120ms, 2p
31V, 60ms, 1p
****
14.3%
85.7%
80%
20%
(1/7)
(6/7)
(8/10)
(2/10)
7.7%
7.7%
46.1%
30.8%
7.7%
42.9%
57.1%
(1/13)
(1/13)
(6/13)
(4/13)
(1/13)
(3/7)
(4/7)
118
0 = Sin expression de GFP.
* = Nivel 1 de transfección relativa; pocas células expresaron GFP.
** = Nivel 2 de transfección relativa; Una cuarta parte del interdígito expresó GFP.
*** = Nivel 3 de transfección relativa; La mitad del área interdigital expresó GFP.
**** = Nivel 4 de transfección relativa; tres cuartas partes del interdígito expresó GFP.
***** = Nivel 5 de transfección relativa; Toda el área interdigital fue transfectada.
119
Tabla 2. Comparación del porcentaje de transfección relativa y presencia de alteraciones
fenotípicas entre diferentes condiciones de electroporación de las cuales la duración del
pulso fue cambiada.
Condiciones
0
*
**
***
****
*****
Ausencia
Presencia de
de
alteraciones
alteraciones
fenotípicas.
fenotípicas.
17V, 60ms, 1p
10%
40%
50%
73.7%
26.3%
(1/10)
(4/10)
(5/10)
(14/19)
(5/19)
20%
45%
35%
92.7%
7.3%
(4/20)
(9/20)
(7/20)
(38/41)
(3/41)
51.6%
45.7%
3.2%
60%
40%
(16/31)
(14/31)
(1/31)
(15/25)
(10/25)
3.4%
27.6%
34.5%
24.1%
10.3%
85.7%
14.3%
(1/29)
(8/29)
(10/29)
(7/29)
(3/29)
(18/21)
(3/21)
17V, 70ms, 1p
18V, 60ms, 1p
18V, 70ms, 1p
18V, 120ms, 1p
31V, 50ms, 1p
31V, 60ms,1p
14.3%
85.7%
80%
20%
(1/7)
(6/7)
(8/10)
(2/10)
16.6%
33.3%
33.3%
16.6%
66.6% (2/3)
33.3%
(1/6)
(2/6)
(2/6)
(1/6)
71.4%
(1/3)
33.3%
11.1%
22.2%
22.2%
11.1%
(5/7)
28.6%
(3/9)
(1/9)
(2/9)
(2/9)
(1/9)
(2/7)
0 = Sin expression de GFP.
* = Nivel 1 de transfección relativa; pocas células expresaron GFP.
** = Nivel 2 de transfección relativa; Una cuarta parte del interdígito expresó GFP.
*** = Nivel 3 de transfección relativa; La mitad del área interdigital expresó GFP.
**** = Nivel 4 de transfección relativa; tres cuartas partes del interdígito expresó GFP.
***** = Nivel 5 de transfección relativa; casi toda el área interdigital fue transfectada.
120
Tabla 3. Comparación del porcentaje de transfección relativa y presencia de alteraciones
fenotípicas entre diferentes condiciones de electroporación de las cuales el número del
pulso fue cambiado.
Condiciones
0
*
**
***
****
*****
Ausencia
Presencia de
de
alteraciones
alteraciones
fenotípicas
fenotípicas
15V, 120ms, 2p
66.6%
33.3%
100%
0%
(4/6)
(2/6)
(4/4)
(0/4)
15V, 120ms, 5p
18V, 120ms, 1p
72.2%
22.2%
5.5%
50%
50%
(13/18)
(4/18)
(1/18)
(3/3)
(3/3)
14.3%
85.7%
80%
20%
(1/7)
(6/7)
(8/10)
(2/10)
100%
14.3%
85.7%
(3/3)
(1/7)
(6/7)
18V, 120ms, 3p
20V, 120ms, 1p
7.7%
7.7%
46.1%
30.8%
7.7%
42.9%
57.1%
(1/13)
(1/13
(6/13)
(4/13)
(1/13)
(3/7)
(4/7)
100%
0%
100%
(4/4)
(0/3)
(3/3)
20V, 120ms, 2p
31V, 60ms,1p
31V, 60m, 3p
33.3%
11.1%
22.2%
22.2%
11.1%
71.4%
28.6%
(3/9)
(1/9)
(2/9)
(2/9)
(1/9)
(5/7)
(2/7)
9.1%
36.4%
54.5%
0%
100%
(1/11)
(4/11)
(6/11)
(0/3)
(3/3)
0 = Sin expresión de GFP.
* = Nivel 1 de transfección relativa; pocas células expresaron GFP.
** = Nivel 2 de transfección relativa; Una cuarta parte del interdígito expresó GFP.
*** = Nivel 3 de transfección relativa; La mitad del área interdigital expresó GFP.
**** = Nivel 4 de transfección relativa; tres cuartas partes del interdígito expresó GFP.
***** = Nivel 5 de transfección relativa; casi toda el área interdigital fue transfectada.
121
FIGURAS.
Figura 1. En la parte de arriba se muestra una fotografía del electroporador construido
con materiales de bajo costo. El Display exhibe el número de pulsos aplicados, las perillas
de la izquierda controlan el voltaje y las perillas de la derecha controlan la duración del
pulso. En la parte de abajo se muestra el diagrama de bloques que constituye el
electroporador.
122
Figura 2. Nivel de transfección relativa del tercer interdígito de la pata de pollo usando la
microelectroporación confinada. Los arreglos verticales muestran la misma muestra bajo
diferentes condiciones de iluminación. (A-E) Campo claro de autópodos de patas de pollo
electroporadas en el tercer interdígito. (F-G) Campo claro combinado con iluminación de
excitación para localizar el GFP fluorescente. (K-L) Expresión de GFP sólo bajo
iluminación de excitación. (A, F y K) muestran nivel 1 de transfección relativa usando 17V,
60ms, 1p. (B, G y L) y (C, H y M) muestran nivel 2 y 3 de transfección relativa
respectivamente usando 17V, 70ms, 1p. (D, I y N) y (E, J y O) muestran nivel 4 y 5 de
transfección relativa respectivamente usando 18V, 70ms, 1p.
123
Figura 3. Alteraciones fenotípicas comunes cuando los voltajes, la duración del pulso y el
número de pulsos son mayores a 17V, 70ms, 1p respectivamente. (A) Muestra la
inhibición de la muerte celular programada en la extremidad tratada (derecha) cuando se
aplicaron 17V, 60ms, 2p. La flecha indica el área positiva a Rojo Neutro en el interdígito
de la extremidad contralateral que experimenta muerte celular interdigital. (B) Sindactilia y
formación de cartílago ectópico en el tejido interdigital (flecha) de la extremidad derecha
electroporada usando 31V, 80ms, 4p. (C) Patrón esquelético alterado en la extremidad
derecha por la aplicación de 20V, 60ms, 2p. (D) Sindactilia de la extremidad electroporada
usando 18V, 70ms, 1p. La flecha señala el interdígito permanente de la extremidad
tratada.
124