Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE
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Instrucciones de utilización del ® SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE® MCE System Lea atentamente estas Instrucciones de utilización antes de utilizar este producto. Guarde estas instrucciones de utilización para consultarlas en el futuro. Esta página se ha dejado en blanco a propósito ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Tabla de contenido Fabricante ........................................................................................................................................... 2 ® ® SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System ...... 2 Uso previsto .................................................................................................................................... 2 Indicaciones de uso ........................................................................................................................ 2 Principios del ensayo para detección de mutaciones SURVEYOR Scan KRAS ............................... 2 KRAS .............................................................................................................................................. 2 SURVEYOR Nuclease ................................................................................................................... 3 Trazabilidad de los controles del kit ................................................................................................... 5 Componentes...................................................................................................................................... 5 Número de muestras que se pueden ensayar con un kit............................................................... 6 Secuenciación del DNA .................................................................................................................. 6 Equipo y reactivos adicionales necesarios ......................................................................................... 6 Preparación del reactivo ..................................................................................................................... 7 Almacenamiento y duración ............................................................................................................... 7 Advertencias y precauciones .............................................................................................................. 7 Obtención, manejo y almacenamiento de muestras primarias .......................................................... 7 Procedimiento del ensayo .................................................................................................................. 8 Detección de mutaciones somáticas con kits SURVEYOR Scan - Introducción ........................... 8 Configuración/calibración INICIAL del WAVE MCE System .......................................................... 8 Consideraciones previas al análisis de muestras de KRAS .......................................................... 9 Consideraciones sobre las plantillas .............................................................................................. 9 Consideraciones sobre los cebadores ........................................................................................... 9 Consideraciones sobre el flujo de trabajo .................................................................................... 10 Protocolo de amplificación ........................................................................................................... 12 Programa del termociclador para el protocolo de amplificación .................................................. 14 Control de Calidad de los productos de la PCR ........................................................................... 14 Digestión con SURVEYOR Nuclease .......................................................................................... 14 Procedimientos de control ................................................................................................................ 16 Control de calidad del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD ........... 16 Utilización de DNA de plásmidos de control de KRAS ................................................................ 16 Interpretación de los resultados........................................................................................................ 17 Análisis del Exon 2 del KRAS mediante SURVEYOR Nuclease ................................................. 17 Ejemplos de resultados ................................................................................................................ 18 Procedimiento de llamadas de SURVEYOR Scan ...................................................................... 19 Revisión manual de las imágenes de gel y electroferogramas de WAVE MCE .............................. 29 Revisión manual de los resultados MCE Score = 1 ..................................................................... 30 Revisión manual del Error Code W-01 ......................................................................................... 32 Características de rendimiento ......................................................................................................... 33 Nivel de detección de SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD ............ 33 Serie de dilución del nivel de detección de la mutación Exon 2 G12S del KRAS ....................... 33 Serie de dilución del nivel de detección de la mutación Exon 2 G13D del KRAS ....................... 35 Confirmación de la secuencia ...................................................................................................... 35 Limitaciones del Procedimiento de ensayo .................................................................................. 36 Bibliografía ........................................................................................................................................ 37 Apéndice ........................................................................................................................................... 38 Guía de solución de problemas.................................................................................................... 38 Datos de pedido ................................................................................................................................ 45 Datos de contacto ............................................................................................................................. 46 Licencias, marcas registradas y derechos de autor ......................................................................... 46 Nota: En este documento, todos los títulos de capítulo y sección de la Tabla de contenido y mencionados en el texto son accesibles rápidamente manteniendo pulsada la tecla Ctrl y pulsando sobre el título con el botón izquierdo del ratón. Página 1 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Fabricante Fabricante Representante en la UE M P Transgenomic Inc 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA. Tel. 1-402-452-5400. Transgenomic Limited, 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK. Tel. +44-141-892-8800. SURVEYOR® Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE® MCE System Uso previsto Exclusivamente para uso profesional. El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System de Transgenomic es un ensayo para diagnóstico in vitro que detecta las mutaciones somáticas del exón 2 del gen KRAS. Estas mutaciones están indicadas por los picos de división de la SURVEYOR Nuclease e incluyen las mutaciones con potencial conocido de importancia química. Este kit se ha diseñado para ser usado en laboratorios de diagnóstico clínico por personal adecuadamente preparado que ensaye el DNA extraído de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Este kit, con número de catálogo 710105-CEIVD, se suministra en una sola caja que contiene los componentes indicados a continuación. Estas Instrucciones de utilización están disponibles para descargarlas en http://www.Transgenomic.com/pd/surveyor/SURVEYORKRAS_MCE_CEIVD.asp. Indicaciones de uso Los investigadores clínicos pueden utilizar el SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System como ayuda para decidir si los tumores cancerosos colorrectales de los pacientes pueden no responder a terapias anti-EGFR (epidermal growth factor receptor, ® ® receptor del factor de crecimiento epidérmico) como Vectibix o Erbitux . El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System no debe usarse para el diagnóstico de cánceres colorrectales ni de ningún otro tipo. El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System es un ensayo que detecta la presencia de posibles mutaciones somáticas del exón 2 del gen KRAS, pero no confirma la identidad de secuencia de la mutación. Para confirmar la mutación precisa detectada se necesitarán análisis adicionales, como la secuenciación del DNA. Aunque los resultados de este análisis indican el estado de mutación del paciente, deben tenerse en cuenta otros factores clínicos y los resultados del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System no deben usarse como único método empleado para la toma de decisiones sobre cualquier tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal. Más específicamente, la utilización del software WAVE MCE para identificar muestras que den positivo para una mutación de KRAS con este kit sólo deben usarse como orientación y todas las mutaciones deben confirmarse mediante análisis adicionales, como la secuenciación del DNA. Principios del ensayo para detección de mutaciones SURVEYOR Scan KRAS KRAS Los agentes terapéuticos de reciente desarrollo orientados al epidermal growth factor receptor ® ® (EGFR), como cetuximab (Erbitux ) o panitumumab (Vectibix ), se han demostrado eficaces contra el Página 2 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System cáncer colorrectal. Los investigadores indican que alrededor del 40% de los tumores colorrectales incorporan mutaciones del gen KRAS, mutaciones que se han asociado con una respuesta deficiente a los antagonistas del EGFR. Por tanto, el estado de mutación del KRAS puede usarse para determinar si un tumor responderá a una terapia anti-EGFR. Este kit se ha diseñado para utilizarlo en el análisis diagnóstico de mutaciones somáticas del exón 2 del KRAS que tienen un efecto en la eficacia de la medicación. El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System de Transgenomic es un ensayo para la detección de todas las alteraciones de secuencia y las pequeñas inserciones/supresiones del exón 2 del gen KRAS. Se proporcionan controles positivos para las mutaciones en los codones 12 y 13 que se han asociado con la falta de eficacia de los agentes anti-EGFR. Este kit utiliza la tecnología SURVEYOR Nuclease patentada por Transgenomic y, combinada con la tecnología WAVE MCE System, ofrece una detección sencilla y sensible de posibles mutaciones. Puede detectar una mezcla de mutante al 2-5% sobre una base de DNA no mutante. Los estudios de validación han demostrado una concordancia extremadamente alta con la secuenciación en muestras de cáncer colorrectal bien caracterizadas. La utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD reducirá por una parte el trabajo de secuenciación del usuario y por otro ayudará a la recuperación de la secuencia cuando el software de secuenciación automática no consiga resolver la presencia de una mutación de bajo nivel. SURVEYOR Nuclease La SURVEYOR Nuclease de Transgenomic es una endonucleasa de DNA vegetal específica para discordancias que puede escanear mutaciones y polimorfismos, conocidos o desconocidos, en DNA heterodúplex. La encima divide el DNA con gran especificidad en puntos con discordancia de sustitución de bases u otras distorsiones. Esta endonucleasa de DNA corta ambas cadenas de un DNA heterodúplex en el lado 3’ del punto de discordancia. Se reconocen las discordancias de inserción/supresión y todas las discordancias de sustitución de base, pero la eficacia de la división varía según la secuencia de la discordancia. Posición de la discordancia. SURVEYOR® Nuclease. Fragmentos resultantes. Figura A. Modo de actuación de la SURVEYOR Nuclease. La endonucleasa reconoce una discordancia y divide en el lado 3’ de cada base de la discordancia. Esto divide la doble cadena de ADN y deja una base simple 3’ suelta. La SURVEYOR Nuclease se ha utilizado en una amplia variedad de contextos para detectar con precisión distintas mutaciones y polimorfismos de genes. En concreto, SURVEYOR Nuclease se ha utilizado para comprobar la presencia de mutaciones conocidas en varios genes asociados con cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, leucemia y cáncer de endometrio, y en la predicción de resultados de radioterapia. El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD se ha diseñado para dividir discordancias del Exon 2 del KRAS para su posterior análisis mediante electroforesis capilar por microchips mediante el WAVE MCE System. Nota: Para este ensayo sólo debe utilizarse la DNA Polymerase incluida en este kit. Nota: Sigas las instrucciones concretas del Manual de consulta rápida del WAVE MCE System y el Manual de Instrucciones del WAVE MCE System. Para utilizar satisfactoriamente este kit, recomendamos encarecidamente que lea atentamente este manual y siga estrictamente las instrucciones y orientaciones del mismo. Quienes lo Página 3 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System utilicen por primera vez deberán realizar los experimentos de control descritos en la sección Utilización de DNA de plásmidos de control de KRAS. Si tiene alguna duda o necesita ayuda, llame al (888) 233-9283 (sólo América del Norte), +1 (402) 452-5400 o +44 (0) 141 892 8800 (Europa) y pida por "Asistencia sobre KRAS". O, si lo prefiere, puede enviarnos un correo electrónico a: [email protected] Página 4 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Trazabilidad de los controles del kit Los controles incluidos en este kit son clones plásmidos de secuencias del Exon 2 del KRAS. Todos los clones se han secuenciado para comprobar la fidelidad de la secuencia por comparación con la NCBI Reference Sequence (secuencia de referencia del NCBI): NG_007524.1. El "KRAS Control: Wild-Type Exon 2" se obtuvo mediante PCR del exón 2 del KRAS a partir de una preparación y clonación de DNA genómico de tipo natural. El “KRAS Positive Control Codon 12” se obtuvo mediante una mutagénesis dirigida al sitio del KRAS Control: Clon del Exon 2 Wild-Type. La secuenciación de DNA confirmó que el único cambio en la secuencia se produce en el codón 12 con una alteración GGT>AGT. Este se mezcla entonces al 50:50 con el DNA de KRAS Control:Wild-Type Exon 2 para crear una mezcla heterocigótica El “KRAS Positive Control Codon 13” se obtuvo mediante una mutagénesis dirigida al sitio del KRAS Control: clon de Wild-Type Exon 2. La secuenciación de DNA confirmó que el único cambio en la secuencia se produce en el codón 13 con una alteración GGC>GAC. Este se mezcla entonces al 50:50 con el DNA de KRAS Control:Wild-Type Exon 2 para crear una mezcla heterocigótica Consulte Utilización de DNA de plásmidos de control de KRAS si precisa más detalles sobre las secuencias de DNA de los controles. Componentes El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System está formado por una caja con 18 tubos de reactivo suministrados con el kit y 7 posiciones vacías en cada caja. Catalog NumberNúmero de catálogo 703310 703315 703065 710155F 710155F 710153F 710153F 710160 710161 708049 708027 708030 710141 710143 710144 482356 ComponentComponente DNA Polymerase (2.5 U/µL) DNA Polymerase 10X PCR Buffer dNTPs (10 mM) KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µM) Universal Seq Primer 1 (10 µM) Universal Seq Primer 2 (10 µM) SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 SURVEYOR Enhancer Cofactor 0.15 M MgCl2 Solution Solución de interrupción KRAS Control: Wild-Type Exon 2 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 12 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 13 Instrucciones de utilización Rojo Blanco Transparente Volumen incluido en el kit para 100 reacciones 100 µl 1000 µl 500 µl Azul 2 x 125 µl Azul 2 x 125 µl Naranja Naranja Púrpura Negro Rosa Marrón Rojo Amarillo 125 µl 125 µl 2 x 105 µl 105 µl 105 µl 105 µl 250 µl 40 µl Verde 40 µl Verde 40 µl Color del tapón del tubo Descargar del sitio web* http://www.Transgenomic.com/pd/surveyor/SURVEYORKRAS_MCE_CEIVD.asp Página 5 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Número de muestras que se pueden ensayar con un kit El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System se ha diseñado para permitir el ensayo de 100 reacciones. El número total de muestras que se pueden ensayar depende del tamaño de lote medio de las muestras ensayadas cada vez, dado que en cada lote de muestras debe ensayarse un juego de controles. La tabla siguiente indica el número de muestras que se pueden analizar con el kit KRAS en función del tamaño medio de lote. En la misma se tiene en cuenta (a) los 4 controles necesarios para cada determinación y (b) el límite de 100 reacciones por kit. Cuando aumenta el tamaño de los lotes, el número de muestras que se pueden ensayar también aumenta, reduciendo el coste medio de reactivo por muestra. Tamaño de lote Número de controles + Amplicones de muestra Ensayos por determin ación Total de determinacio nes por kit Muestras ensayadas por kit 1 4+1 5 20 20 2 4+2 6 16 32 3 4+3 7 14 42 4 4+4 8 12 48 5 4+5 9 11 55 6 4+6 10 10 60 11 4 + 11 15 6 66 21 4 + 21 25 4 84 29 4 + 29 33 3 87 46 4 + 46 50 2 92 96 4 + 96 100 1 96 Secuenciación del DNA Si se desea se suministran cebadores de secuenciación (PNs 710153F y 710153R) para utilizarlos para la secuenciación del DNA de todas las muestras ensayadas. Para la secuenciación deben utilizarse los amplicones de PCR creados antes de la digestión con SURVEYOR Nuclease. Equipo y reactivos adicionales necesarios Los componentes adicionales y equipos necesarios para utilizar el SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System son los siguientes: WAVE MCE System (PN MCE-99-2020B) WAVE MCE Optimized Microchip, (PN MCE-99-3600) WAVE MCE Optimized Separation Buffer Kit (PN MCE-99-5000) WAVE MCE Optimized Marker Kit (PN MCE-99-5500) Agua de clase de biología molecular Tubos de 0.2 mL-PCR, tiras o placa de 96 pocillos Micropipeteadores Puntas de pipeta Baño de hielo Mezclador de vórtice Microcentrífuga Termociclador Geles de agarosa y equipo para electroforesis con gel de agarosa. Lejía al 10% o agente limpiador similar Página 6 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Preparación del reactivo Todos los reactivos incluidos en este kit están listos para usarse. Algunos componentes tendrán que descongelarse, agitarse vorticialmente o centrifugarse en una microcentrifugadora antes de utilizarse. Los detalles se explican a continuación en Procedimiento de ensayo. No es necesario combinar reactivos para elaborar mezclas maestras ni mezclas de reacción. Los detalles completos se explican a continuación en Procedimiento de ensayo. Almacenamiento y duración El kit debe guardarse entre -18 ºC y -25 °C en un congelador de temperatura constante hasta que se utilice. Téngase en cuenta la fecha de caducidad de cada kit recibido. No utilizar el kit con posterioridad a la fecha de caducidad. La mezcla de SURVEYOR Nuclease preparada en el paso 7 de Digestión con SURVEYOR Nuclease debe usarse inmediatamente ya que la SURVEYOR Nuclease W se desactiva con el tiempo en presencia de los demás componentes de la mezcla de reacción de la SURVEYOR Nuclease. Advertencias y precauciones Ninguno de los reactivos de este kit supone un riesgo para la salud en las cantidades suministradas. La hoja de datos de seguridad Transgenomic MSD-710105 puede descargarse en http://www.transgenomic.com/lib/msds/WAVEMCEMSD.asp En este kit no hay ninguna sustancia de origen animal o humano que suponga riesgo de infección. Este kit sólo deben usarlo personas formadas en las técnicas de laboratorio adecuadas. Al trabajar con los componentes de este kit, lleve siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y protección ocular. Después de usarlos, los componentes del kit deben eliminarse como residuos clínicos y de acuerdo con las reglas y normativas locales. Las porciones de reactivo pipeteadas de los tubos de este kit están previstas para un solo uso. Se ha comprobado que los componentes de este kit mantienen su estabilidad después de 25 ciclos de congelación-descongelación. No utilice este kit si se supera este número de ciclos de congelacióndescongelación. Obtención, manejo y almacenamiento de muestras primarias El SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System ha sido validado para utilizarlo con DNA extraído de muestras de tumores de cáncer colorrectal fijadas con formol y sumergidas en parafina (FFPE). Para la extracción de DNA óptima, el tejido debe fijarse con formol durante 14–24 horas antes de sumergirlo en parafina. Las biopsias de tumores son una mezcla heterogénea de células tumorales y no tumorales. Además, el propio tumor es una mezcla heterogénea de células tumorales con mutaciones y células tumorales sin mutaciones. Dado que estas mutaciones somáticas pueden no estar distribuidas homogéneamente en el tumor, el análisis mutacional resultante de distintas secciones del mismo tumor puede ser distinto. Para aumentar la probabilidad de detectar una mutación, debe aislarse DNA de la región de tumo del tejido rascando sólo la zona del tumor del portaobjetos utilizando un escalpelo estéril nuevo con cada portaobjetos. Para la utilización satisfactoria de este kit el DNA extraído debe cumplir los criterios indicados en las Consideraciones sobre las plantillas. NOTA: Las muestras de DNA extraídas y no destinadas a un análisis inmediato deben guardarse congeladas entre -20 ºC y -80 ºC. Página 7 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Procedimiento del ensayo Detección de mutaciones somáticas con kits SURVEYOR Scan - Introducción La detección y confirmación de mutaciones con SURVEYOR Nuclease comporta tres pasos: Precribado SURVEYOR Scan en tres simples pasos Paso 1. Amplificar por PCR la muestra de DNA y calentar/enfriar para formar heterodúplex. Paso 2. División de la SURVEYOR Nuclease Paso 3. Análisis de fragmentos basado en el tamaño en el WAVE MCE System FIGURE B Paso 1 - Prepare amplicones de PCR a partir de DNA mutante (ensayo) y normal (referencia), como continuación del ciclo final de amplificación por PCR para mezclar todas las dobles cadenas y luego enfriarlas lentamente para la formación óptima de homo y heterodúplex (los heterodúplex se producen cuando una cadena de una secuencia de tipo natural se enlaza con una cadena de una secuencia mutante). Paso 2 - Trate una porción de la mezcla de heterodúplex/homodúplex enlazados con SURVEYOR Nuclease. La SURVEYOR Nuclease cortará el DNA heteroduplexado, haciendo aparecer fragmentos de DNA. El DNA de referencia de tipo natural, tratado de forma análoga, sirve como control de base. Paso 3 - Analice los fragmentos de DNA con el WAVE MCE System. La formación de nuevos productos de división, debida a la presencia de una o más discordancias, se indica mediante la presencia de picos de electroferograma adicionales. Los tiempos de migración de los productos de división indican el tamaño de los fragmentos y, por tanto, la ubicación de las discordancias. Instrucciones paso a paso Configuración/calibración INICIAL del WAVE MCE System Al configurar la placa de SURVEYOR Nuclease para analizarla en el WAVE MCE System, consulte el Manual de instrucciones del WAVE MCE System. NOTA: Para la utilización del software para el análisis es necesaria la configuración de la placa con los controles. Página 8 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Consideraciones previas al análisis de muestras de KRAS Antes de procesar las muestras en el WAVE MCE System, debe ejecutarse el WAVE MCE Optimized DNA Size Standard utilizando todos los microchips cargados en el sistema para comprobar que el WAVE MCE System funciona correctamente. El personal de laboratorio usuario del instrumento debe comprobar la calidad del WAVE MCE Optimized DNA Size Standard (consulte el Manual de instrucciones del WAVE MCE System). Consideraciones sobre las plantillas 1. Con DNA de plantillas aisladas de FFPE utilice los procedimientos habituales del laboratorio para evaluar la calidad y cantidad del DNA extraído y comprobar que hay suficiente plantilla para la PCR. 2. La relación de absorbancia 260/280 debe ser mayor que 1.80. 3. Para acelerar la configuración de la PCR ajuste la concentración de plantilla para que sea aproximadamente de 12.5 ng/µL. Diluya el DNA de la plantilla en agua de calidad de biología molecular cuando sea necesario. Consideraciones sobre los cebadores 1. Las secuencias de los cebadores de este kit son: Amplicón KRAS Primer: Exon 2 Secuencia Directo aggaaacagctatgaccatTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA Inverso tgtaaaacgacggccagtTGCATATTAAAACAAGATTTACCTCTATTG Universal Seq Primer 1 aggaaacagctatgaccat Universal Seq Primer 2 tgtaaaacgacggccagt NOTA: Los cebadores del Exon 2 del KRAS tienen las colas de Universal Sequencing indicadas en minúsculas. 2. La secuencia de los amplicones es la siguiente: a. El lugar de unión del Forward Primer está resaltado en Verde. El complemento inverso del lugar de unión del Reverse Primer está resaltado en Rojo. Las regiones de codificación están en mayúsculas y subrayadas. Las regiones de mutación más comunes están resaltadas en Púrpura. Las letras mayúsculas que no están subrayadas corresponden a regiones de DNA exónico no codificadoras. KRAS Control: Wild-Type Exon 2 NCBI Reference Sequence: Posiciones del Exon 2 NG_007524: 10.428–10,706 Tamaño de amplicón: 190 bp (con colas), 153 bp (sin colas) cgggtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaa tatagtcacattttcattatttttattataagGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT TGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATA TGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgataca gataaacccg Página 9 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Consideraciones sobre el flujo de trabajo El kit se ha diseñado para permitir el análisis de 100 reacciones. Pueden utilizarse lotes de muestras de menor tamaño, pero con cada lote de muestras deben incluirse los controles del kit y un "control sin plantilla". En el kit hay suficientes materiales de control para realizar 100 reacciones de todas las combinaciones de tamaños de lote de muestras. En general, el procesamiento de muestras debe llevarse a cabo de principio a fin tal como se explica en estas Instrucciones de utilización. Si debe detenerse el procesamiento de una muestra antes de completar todos los pasos, el DNA debe guardarse a -20 °C en los puntos indicados. No obstante, debe evitarse la exposición de cualquier muestra congelada a ciclos repetidos de congelación y descongelación, así como el almacenamiento congelado ( -18 a -25 °C) de DNA amplificado por PCR o de productos de digestión con SURVEYOR Nuclease durante períodos prolongados (>1 semana). El análisis de las muestras debe seguir el flujo de trabajo mostrado a continuación: Tejido de raspado 2 PCR 1 Electroforesis con gel 3 9b 9a Proporción de Robusta/Débil 4 Fallo de SURVEYOR Scan Análisis de SURVEYOR Nuclease &WAVE MCE Positivo de SURVEYOR Scan Negativo de SURVEYOR Scan 6 5 Calificación de MCE = 1 Proporción ≤ 5% Ánálisis manual Calificación como positivo de KRAS Exon 2 No se indica ninguna calificación ni proporción de MCE 7 Confirmación de la secuencia 9 8 Falla la calidad de la secuencia NVD Pasa la calidad de la secuencia Mutante: G12X o G13X Figura 1: Flujo de trabajo del análisis con el kit de KRAS Kit de SURVEYOR Scan. Notas sobre la Figura 1 1. Aísle el DNA del FFPE utilizando procedimientos estándar de laboratorio. 2. Lleve a cabo la PCR y compruebe la calidad del DNA mediante una electroforesis con gel. Página 10 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 3. Registre si la banda de PCR es Robusta (≥20 ng/µL) o Débil (<20 ng/µL). Si hay varias bandas de PCR prepare DNA genómico nuevo a partir del FFPE. 4. Con las muestras clasificadas como PCR Robustas o PCR Débiles después de la amplificación por PCR, siga con el tratamiento con SURVEYOR Nuclease y el análisis WAVE MCE System. Tenga en cuenta que con una señal de PCR débil el DNA puede ser insuficiente para la generación de resultados significativos en la plataforma WAVE MCE, pero puede haber suficiente DNA para la secuenciación. 5. Todas las muestras con resultado Positivo de SURVEYOR Scan deben ser: a. Establecidas como Positivas del Exon 2 del KRAS, o b. Enviadas a una confirmación de la secuencia del DNA si se necesita una identificación de la mutación precisa. 6. Para un resultado negativo de SURVEYOR Scan hay dos categorías de muestras: a. Muestras sin MCE Score ni proporción indicada se calificarán como NVD ("Sin variante detectada"). b. Las muestras con MCE Score = 1 y una proporción de picos ≤ 5% son casos dudosos. Estos resultados deben analizarse manualmente. En Revisión manual de resultados de MCE Score = 1 encontrará algunos ejemplos. 7. Después del análisis manual de las muestras con un MCE Score =1, proporción ≤ 5%, cualquier muestra que muestre productos de división con SURVEYOR Nuclease deben enviarse a una confirmación de la secuencia. Las muestras sin bandas visibles deben calificarse como NVD ("Sin variante detectada"). 8. Si el análisis de confirmación de la secuencia es aceptable, los resultados indicarán: a. Secuencia de tipo natural, es decir Sin variante detectada (NVD), o b. Variante detectada. Si la confirmación de la secuencia indica un cambio de base en las posiciones 1 o 2 de los codones 12 o 13, puede clasificarse una mutación (cambio de aminoácido), es decir, una activación del KRAS. c. Si la confirmación de la secuencia indica un cambio en la posición 3 de los codones 12 o 13, hay una mutación silenciosa. Por definición, una mutación silenciosa no cambia el aminoácido de la proteína del KRAS y, por tanto, actúa como una proteína de "tipo natural". 9. Si el análisis de confirmación de la secuencia falla y no es posible obtener un resultado plausible: a. Repetir la PCR si queda suficiente DNA genómico b. Volver a extraer DNA del FFPE; esta debe ser la segunda opción, ya que normalmente es poco deseable cortar otro bloque de FFPE. Nota: Se puede obtener una tipificación Positiva de SURVEYOR Scan que también ofrezca un resultado "Sin variante detectada" en el ensayo de confirmación. El nivel de detección (LOD) de la SURVEYOR Nuclease en el WAVE MCE es tan bajo como el 2% de mutantes en un 98% de DNA de tipo natural para algunas mutaciones, mientras que el LOD de la secuenciación es de alrededor de 10-25% de mutantes en 90-75% de DNA de tipo natural. Nota: Los resultados Positivos de SURVEYOR Scan pueden deberse a cambios de base distintos de los que son activadores del KRAS, por ejemplo: (a) las mutaciones ocultas del codón 12 [GGT (tipo natural) a GGC, GGA o GGG] o del codón 13 [GGC (tipo natural) a GGA, GGT o GGG] o (b) una mutación en un codón distinto de los 12 o 13. Dado que estas mutaciones son raras, si el usuario del kit precisa la identidad de la secuencia de las mutaciones del Exon 2, entonces se precisará la confirmación mediante otro método, como la secuenciación de DNA, antes de registrar un resultado Positivo de SURVEYOR Scan como mutación activadora del KRAS. Página 11 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Nota: El proceso de fijación con formol utilizado al preparar las muestras de la biopsia del tumor FFPE pueden provocar la desaminación de las citosinas. Esta desaminación convierte la citosina en uracil. La polimerasa "leerá" este uracilo como timina e incorporará una adenina a las cadenas copiadas. Esto parecerá entonces una mutación en la que la G es sustituida por una A provocando una mutación de GC a AT, que es una falsa mutación provocada del proceso de fijación, y no una verdadera mutación somática. Se trata de sucesos raros pero si se copian pronto en los ciclos de la PCR "parecerán" mutaciones. No se repiten al realizar un reanálisis. Las mutaciones del KRAS que pueden surgir de la desaminación de la citosina son: - Codón 12: AGT (G12S) y GAT (G12D) - Codón 13: AGC (G13S), GAC (G13D) y GGT (G13G, una mutación silenciosa) Por tanto, se recomienda confirmar cualquier mutación de este tipo mediante el análisis duplicado del mismo DNA genómico o someter a todas las muestras a análisis duplicados desde el inicio del análisis. Protocolo de amplificación 1. La solución dNTP premezclada de Transgenomic (PN 703065) se suministra a una concentración de trabajo de 10 mM de deoxinucleótido total (2.5 mM de cada uno de los cuatro deoxinucleótidos). 2. Los cebadores de PCR forward y reverse del Exon 2 (PN 710155F y 710155R) se suministran a 10 µM. 3. Retire los cebadores a 10 µM, la solución premezclada de dNTP a 10 mM y el DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) del congelador y descongélelos en hielo. 4. Una vez descongelados, agite vorticialmente los componentes del kit (~10 segundos) para mezclarlos a fondo, centrifúguelos brevemente (~10 segundos) para asegurarse que no queda líquido en las tapas de los tubos y colóquelos en hielo. 5. Prepare la mezcla maestra en hielo. 6. Use la tabla siguiente como guía para preparar la mezcla maestra para el Exon 2 del KRAS: Número de reacciones: Cálculo de volumen: Volumen de agua (µL) DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µL) dNTPs (µL) KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 2 Reverse (µL) DNA Polymerase (µL) Volumen total de mezcla maestra: Volumen de DNA extraído que se debe añadir (µL a 12.5 ng/µL) Volumen total de la reacción de PCR: 1.00 33.0** 5.0 4.0 2.5 2.5 1.0 48.0 2.0** 50.0 **Nota: El usuario debe procurar disponer de un mínimo de 25 ng de DNA por cada 50 µL de reacción. Cuando las concentraciones de DNA extraído son inferiores a 12.5 ng/µL, aumente proporcionalmente el volumen de DNA extraído para garantizar 25 ng por reacción. Reduzca también el volumen de agua de la mezcla maestra en la misma cantidad para obtener 50 µL por reacción. En todas las muestras preparadas con esta mezcla maestra deberá diluirse el DNA extraído a aproximadamente el mismo nivel de concentración más bajo. No se recomienda la utilización de concentraciones de DNA extraído inferiores a 5 ng/µL. 7. Calcule los volúmenes necesarios para la mezcla maestra multiplicando los volúmenes mostrados en la tabla anterior por el número total de muestras que se han de analizar, más 4 Página 12 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System reacciones adicionales para los controles. Tenga en cuenta que se necesitará un volumen de mezcla maestra ligeramente mayor que este cálculo para prever pérdidas durante el pipeteado. 8. Etiquete tubos de PCR de 0.2 mL, o pocillos de una placa de 96 pocillos, con la información de muestra adecuada. 9. Etiquete un tubo de centrífuga de 2.0 mL para la preparación de la mezcla maestra. 10. Añada el volumen necesario de agua de calidad de biología molecular al tubo de centrífuga de 2.0 mL etiquetado "Mezcla maestra". 11. Añada la cantidad necesaria de DNA Polymerase 10X PCR Buffer al tubo de mezcla maestra. 12. Añada el volumen necesario de dNTPs premezclados a 10.0 mM al tubo de mezcla maestra. 13. Añada el volumen necesario de KRAS Primer: Exon 2 Forward al tubo de mezcla maestra. 14. Añada el volumen necesario de KRAS Primer: Exon 2 Reverse al tubo de mezcla maestra. 15. Saque la DNA Polymerase (PN 703310) del congelador. 16. Centrifugue la DNA Polymerase durante ~10 segundos. 17. Agite vorticialmente la DNA Polymerase durante ~10 segundos. 18. Añada el volumen necesario de DNA Polymerase al tubo de mezcla maestra. 19. Tape el tubo de mezcla maestra. 20. Antes de usarla, agite vorticialmente el tubo de mezcla maestra durante ~30 segundos y luego centrifugüelo brevemente durante ~10 segundos. 21. Guarde en hielo hasta que la utilice. 22. Pipetee 48.0 µL (consulte la nota del paso 6) de mezcla maestra en los pocillos adecuados, cambiando las puntas de pipeta entre uno y otro si utiliza un pipeteador de un solo canal. Si utiliza un pipeteador de repetición, asegúrese de no verter ni salpicar de un pocillo a otro. Mantenga la placa en hielo. 23. En los pocillos correspondientes, añada 2.0 µL (consulte la nota del paso 6) de cada DNA de plantilla de muestra o agua (control sin plantilla, NTC). Utilice puntas de pipeta distintas para cada muestra y evite la contaminación cruzada de las muestras por salpicadura. Tape los pocillos con los DNA de muestra y el NTC con cintas de 8 tapones (si utiliza una placa de 96 pocillos) o tape los tubos de PCR de 0.2 mL. Compruebe que los tapones están bien cerrados. 24. Sólo entonces abra el DNA de la plantilla de control del kit (PNs 710141, 710143, 710144). Pipetee estas plantillas de control en último lugar para reducir el riesgo de contaminar cualquier muestra de DNA. Vuelva a tapar los pocillos con cintas de 8 tapones (si utiliza una placa de 96 pocillos) o tape los tubos de PCR de 0.2 mL. Compruebe que los tapones están bien cerrados. NOTA: Cuando utilice la plantilla de la placa de WAVE MCE predeterminada, los controles del kit van en los pocillos A1, B1 y C1. Coloque el control sin plantilla (NTC) en el pocillo H12. 25. Agite vorticialmente (a ~1/2 de la velocidad) durante 10 segundos. 26. Centrifugue durante 1-2 minutos para asegurarse que todas las soluciones se acumulan en el fondo de los pocillos o tubos. Compruebe que las soluciones se encuentran en el fondo de cada pocillo o tubo. En caso negativo, repita la centrifugación. Página 13 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Programa del termociclador para el protocolo de amplificación 1. Utilice el siguiente protocolo del termociclador para el protocolo de amplificación por PCR y formación de heterodúplex: Desnaturalización inicial Fase previa de 15 ciclos Amplificación de 30 ciclos Extensión final Formación de heterodúplex 95 C 5 minutos 95 C 62 C, -0.5 C/ciclo 72 C 95 C 55 C 72 C 72 C 95 C menor o igual a 12 C 30 segundos 30 segundos 25 segundos 30 segundos 30 segundos 25 segundos 2 minutos 2 minutos Retención Control de Calidad de los productos de la PCR 1. Es recomendable comprobar la calidad y cantidad de amplicones mediante electroforesis con gel (o un método equivalente) antes de pasar a la digestión con SURVEYOR Nuclease. 2. Analice una parte del producto de la PCR y varias cantidades distintas de una ladder de masa de DNA de 100-bp. 3. Utilice la ladder para estimar la concentración del DNA amplificado. 4. Sólo debe observarse una banda superior a 20 ng/µL correspondiente al producto principal de la PCR. 5. Si hay varias bandas, compruebe si era suficiente la calidad del DNA de plantilla introducido (consulte el Apéndice – Guía de solución de problemas). 6. Si no se observa ningún producto, compruebe si era suficiente la calidad del DNA de plantilla introducido (consulte el Apéndice – Guía de solución de problemas). Si la calidad cumple las especificaciones, aumente el volumen de plantilla a 4.0 µL por 50 µL de reacción (reduzca el agua por reacción a 31.0 µL). 7. No debe haber productos de la PCR visibles en la muestra de control sin plantilla. Si hay productos de DNA visibles en este control, es probable una contaminación, consulte el Apéndice - Guía de solución de problemas. 8. Califique la PCR como PCR robusta o PCR débil. a. La PCR robusta debe tener una sola banda de mayor o igual a 20 ng/µL. b. La PCR débil debe tener una sola banda de menor de 20 ng/µL. c. Continúe con la digestión con SURVEYOR Nuclease con ambos resultados robusto y débil de la PCR. SUGERENCIA: En esta etapa, los productos de la PCR pueden guardarse a una temperatura igual o inferior a -20 ºC hasta una semana. Digestión con SURVEYOR Nuclease 1. Cuando se considere que la PCR de la muestra tiene suficiente calidad y cantidad, proceda a la reacción de digestión con SURVEYOR Nuclease tal como se explica a continuación. 2. Descongele en hielo los tubos que contienen la 0.15 M MgCl 2 Solution y el SURVEYOR Enhancer Cofactor. 3. Añada 10.0 µL de cada muestra amplificada por PCR obtenida anteriormente a un tubo de 0.2 mL-PCR nuevo o un pocillo de una placa de 96 pocillos. Página 14 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 4. Prepare una mezcla nueva de 0.15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 y SURVEYOR Nuclease W (mezcla de SURVEYOR Nuclease). Utilice la tabla siguiente como orientación para preparar la mezcla maestra de digestión con SURVEYOR Nuclease para el análisis de varias muestras. El ejemplo siguiente tiene los volúmenes para mezcla maestra para 10 muestras. Tenga en cuenta que se necesitará un volumen de mezcla maestra ligeramente mayor que este cálculo para prever pérdidas durante el pipeteado. Número de reacciones de digestión con SURVEYOR Nuclease: Cálculo de volumen: 0.15 M MgCl2 Solution (µL) SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL) SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL) SURVEYOR Nuclease W (µL) Volumen total de mezcla maestra: Añada 5 µL de mezcla maestra de SURVEYOR Nuclease a cada uno con PCR (µL) muestra amplificada Volumen total de reacción de digestión con SURVEYOR Nuclease: 10 10.0 10.0 10.0 20.0 50.0 10.0 15.0 a. Centrifugue cada reactivo antes de usarlo. b. Agite vorticialmente con suavidad cada reactivo antes de pipetearlo, centrifúguelo brevemente durante ~10 segundos después de cada paso de la agitación vorticial. c. Para cada digestión, añada los componentes a un tubo de microcentrífuga para PCR de 0.2 mL (o mayor). 1.0 µL 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027) 1.0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1.0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 710161) 2.0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 710160) O añada 5 µL de mezcla maestra preparada de acuerdo con la tabla anterior. 5. Agite vorticialmente con suavidad la mezcla maestra de SURVEYOR Nuclease durante 10 segundos a baja velocidad 6. Centrifugue la mezcla maestra de SURVEYOR Nuclease durante 10 segundos a baja velocidad 7. Coloque la mezcla maestra de SURVEYOR Nuclease en hielo hasta que vaya a usarla. Nota: La mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease preparada en el paso 7 debe usarse inmediatamente ya que la SURVEYOR Nuclease W se desactiva con el tiempo en presencia de los demás componentes de la mezcla de reacción de la SURVEYOR Nuclease. 8. Pipetee una porción de 5.0 µL de la mezcla maestra de SURVEYOR Nuclease en cada tubo o pocillo conteniendo una porción de 10.0 µL de producto de PCR amplificado (consulte el paso 3 anterior). 9. Al terminar el pipeteado, centrifugue los tubos de PCR de 0.2 mL o la placa de 96 pocillos durante 10 segundos. 10. Agite vorticialmente con suavidad los tubos de PCR de 0.2 mL o la placa de 96 pocillos durante 10 segundos. 11. Centrifugue durante 10 segundos a baja velocidad (este paso es especialmente importante si se realiza la digestión en un instrumento sin tapa calefactada). 12. Incube a 42 °C durante 30 minutos. Página 15 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 13. Añada 1.0 µL Stop Solution (PN 708030) a cada tubo o pocillo y agite vorticialmente con suavidad (el volumen total de reacción con SURVEYOR Nuclease es de 16.0 µL). SUGERENCIA: Los productos de la digestión con SURVEYOR pueden guardarse a ≤ -20 ºC hasta una semana. 14. Cargue los digeridos de muestra en el WAVE MCE System. Procedimientos de control Control de calidad del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD El kit incluye DNA de plásmidos de control para realizar comprobaciones de control de calidad de unos pasos concretos del procedimiento de ensayo. Para el Protocolo de amplificación, estos controles ofrecen un medio de garantizar que las mezclas maestras se han preparado correctamente y que la amplificación funciona tal como debe. También se precisan controles sin plantilla (donde se añade agua en lugar del DNA de plantilla) para comprobar la posible contaminación de los componentes del kit con cualquier plantilla de DNA extraña. En la fase de digestión con SURVEYOR Nuclease, los amplicones de estos tres DNA de plásmidos de control ofrecen una comprobación eficaz de que las condiciones de reacción de división (condiciones de preparación e incubación de la mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease) fueron satisfactorias. En la fase de análisis, los electroferogramas del WAVE MCE System de los amplicones de control digeridos con SURVEYOR Nuclease ofrecen una orientación sobre donde se extraerán los picos de productos de división correspondientes a las mutaciones de los codones 12 y 13, incluso a bajos niveles (véase la Figura 2). Si los amplicones de PCR no concuerdan con los resultados descritos en Control de calidad de los productos de la PCR, consulte el Apéndice - Guía de solución de problemas o póngase en contacto con Asistencia Técnica de Transgenomic antes de continuar con los pasos siguientes del análisis de muestras. Si el análisis del SURVEYOR Scan KRAS del software WAVE MCE Viewer no identifica correctamente los resultados de digestión con SURVEYOR Nuclease de los plásmidos de control del KRAS, devolverá un código de error. Consulte las secciones correspondientes del Apéndice - Guía de solución de problemas o póngase en contacto con Asistencia Técnica de Transgenomic antes de continuar con los pasos siguientes del análisis de muestras. Utilización de DNA de plásmidos de control de KRAS El kit incorpora tres DNA de control: KRAS Control: Wild-Type Exon 2; PN 710141 KRAS Positive Control Codon 12; PN 710143 KRAS Positive Control Codon 13; PN 710144 Estos DNA de control son plásmidos con inserciones. Los controles positivos contienen dos plásmidos cada uno: una mezcla al 50:50 del control de KRAS: Exon 2 de tipo natural y un clon de mutación que varía respecto al tipo natural e un solo par de bases. Los controles se encuentran en viales separados, ambos con una concentración de 2.5 ng/µL. Los cebadores de PCR directo e inverso para KRAS Exon 2 necesarios para la amplificación por PCR se suministran por separado en el kit. A continuación se muestra la secuencia del tipo natural y los controles positivos. El lugar de unión del Forward Primer está resaltado en Verde. El complemento inverso del lugar de unión del Reverse Primer está resaltado en Rojo. Las regiones de codificación están en mayúsculas y subrayadas. Las regiones de mutación más comunes están resaltadas en Púrpura. Las letras mayúsculas que no están subrayadas corresponden a regiones de DNA exónico no codificadoras. La secuencia de los amplicones es la siguiente: KRAS Control: Wild-Type Exon 2 Página 16 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System NCBI Reference Sequence: Posiciones del Exon 2 NG_007524: 10.428–10,706 Tamaño de amplicón: 190 bp (con colas), 153 bp (sin colas) cgggtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaa tatagtcacattttcattatttttattataagGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT TGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATA TGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgataca gataaacccg KRAS Positive Control Codon 12 NCBI Reference Sequence: Posiciones del Exon 2 NG_007524: 10.428–10,706 Tamaño de amplicón: 190 bp (con colas), 153 bp (sin colas) cgggtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaa tatagtcacattttcattatttttattataagGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT TGGAGCT[G/A]GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACG AATATGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttga tacagataaacccg KRAS Positive Control Codon 13 NCBI Reference Sequence: Posiciones del Exon 2 NG_007524: 10.428–10,706 Tamaño de amplicón: 190 bp (con colas), 153 bp (sin colas) cgggtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaa tatagtcacattttcattatttttattataagGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT TGGAGCT[G/A]GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACG AATATGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttga tacagataaacccg Siga las instrucciones del Protocolo de amplificación, Digestión por SURVEYOR Nuclease y análisis de KRAS Exon 2 CE IVD utilizando SURVEYOR Nuclease para la utilización de estos controles. RECOMENDAMOS ENCARECIDAMENTE QUE QUIENES UTILICEN EL KIT POR PRIMERA VEZ EXPERIMENTEN CON LOS CONTROLES ANTES DE ENSAYAR MUESTRAS GENÓMICAS Interpretación de los resultados Análisis del Exon 2 del KRAS mediante SURVEYOR Nuclease - A efectos de comparación y control, realice SIEMPRE la digestión con SURVEYOR Nuclease en todos los controles (controles de tipo natural y positivos), un control sin plantilla y los DNA de muestra, y ejecútelos en la misma placa de muestras del WAVE MCE System. - En la fase de digestión con SURVEYOR Nuclease, los amplicones de estos DNA de plásmidos de control ofrecen una comprobación eficaz de que las condiciones de reacción de división (condiciones de preparación e incubación de la mezcla para la SURVEYOR Nuclease) fueron satisfactorias. En la fase de análisis, los trazos del WAVE MCE System de estos amplicones de control digeridos con SURVEYOR Nuclease ofrecen una orientación sobre dónde se extraerán los picos de productos de división correspondientes a las mutaciones de los codones 12 y 13, incluso a bajos niveles (véanse las Figuras 19-20). - Si los amplicones de PCR o los fragmentos de división de la SURVEYOR Nuclease derivados de los DNA de plásmidos de control no concuerdan con los resultados descritos, consulte el Apéndice - Guía de solución de problemas o póngase en contacto con Asistencia Técnica de Transgenomic antes de continuar con los pasos siguientes del análisis de muestras. Página 17 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System - Los ejemplos proporcionados a continuación sólo tienen efectos ilustrativos y NO deben usarse para determinar la identidad de una mutación dada. La confirmación de la identidad de una mutación es necesaria para determinar inequívocamente la presencia de un cambio de base concreto de los codones 12 o 13 del gen KRAS. - La SURVEYOR Nuclease corta en todas las discordancias resultantes de la formación de heterodúplex entre DNA de tipo natural y mutante, no sólo en las mutaciones de los codones 12 y 13. La SURVEYOR Nuclease confirma que hay un error. Si es necesario conocer la identidad del cambio de base concreto de la mutación a efectos de la realización de informes, debe confirmarse mediante otro método, como la secuenciación. Ejemplos de resultados En la Figura 2 se muestran ejemplos de resultados obtenidos mediante el SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System. En estos ejemplos se siguió con precisión el proceso explicado en la sección Introducción. Amplicón de 190-bp no dividido Marcador bajo G13D libera fragmentos de 77 y 113-bp Marcador alto 1 50% KRAS G13D mutación 2 50% KRAS G12S mutación 3 G12S libera fragmentos de 73 y 117-bp Control: Wild–Type Exon 2 Tiempos de Migración (seg.) Figura 2: Productos de digestión con SURVEYOR Nuclease de los heterodúplex de los amplicones de los codones 12 y 13 del Exon 2 de 190-bp analizados en el WAVE MCE System. Las plantillas utilizadas en estos análisis fueron (1) una mezcla del Control de KRAS: Exon 2 de tipo natural y KRAS Exon 2 Positive Control Codon 12, (2) una mezcla del Control de KRAS: Exon 2 de tipo natural y KRAS Exon 2 Positive Control Codon 13, y (3) una mezcla del KRAS Control: Wild– Type Exon 2. La mutación G12S genera heterodúplex G-T y A-C que liberan fragmentos de 73 y 117bp después de la digestión con SURVEYOR Nuclease. La mutación G13D genera heterodúplex G-T y A-C que liberan fragmentos de 77 y 113-bp después de la digestión con SURVEYOR Nuclease. Los picos resultantes de estos fragmentos concretos están bien separados. Utilización de WAVE MCE Viewer para llamadas de SURVEYOR Scan El WAVE MCE System se suministra con el software de control WAVE MCE y el software WAVE MCE Viewer. El Control Software se utiliza para preparar y procesar las muestras en el WAVE MCE System. El Viewer Software se utiliza para revisar datos, procesar electroferogramas y generar informes. En el Viewer Software se utiliza una función de análisis de KRAS para ayudar al analista a identificar la presencia de una mutación. Esta información está incluida en los informes de SURVEYOR Scan para análisis de KRAS junto con el estado de revisión de datos. Tenga en cuenta que un resultado positivo de SURVEYOR SCAN a partir de la herramienta WAVE MCE Viewer Software NO confirma la identidad de las mutaciones. La calidad de la muestra, unas condiciones de procesamiento no estándar y el estado de los chips pueden afectar a la precisión del resultado. Además, algunas mutaciones muy raras de codones Página 18 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System distintos de los 12 y 13, por ejemplo los codones 11 y 14, pueden clasificarse como si fueran positivos de SURVEYOR SCAN. Si se necesita la secuencia de cualquier mutación del KRAS Exon 2, será necesaria la confirmación de todos los resultados positivos mediante secuenciación del DNA o un método análogo. Procedimiento de llamadas de SURVEYOR Scan 1. Procese el juego de muestras de KRAS del WAVE MCE System con la bandeja de 96 pocillos explicada a continuación. a. En el software de control, seleccione Introducción de muestras -> Nueva b. En la ventana Introducción de muestras - Nueva, seleccione el proyecto de SURVEYOR_Scan y pulse el botón OK. c. De forma predeterminada, en la ventana Introducción de Muestras estará cargada la disposición de la bandeja de muestras del Exon 2 del KRAS. Se rellenará automáticamente una ladder para cada uno de los cuatro chips y los controles del Exon 2. Si no se utilizan todos los chips, elimine las ladders asociadas. Introduzca las muestras deseadas en los pocillos abiertos restantes. d. Una vez rellenado el formulario de Introducción de muestras, pulse el botón Intro para crear la bandeja. Procese las muestras en el instrumento. En el Manual de instrucciones del WAVE MCE System encontrará la información sobre el funcionamiento del instrumento. Figura 3: Configuración de la bandeja de entrada Página 19 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 2. Cuando todas las muestran hayan sido procesadas en el WAVE MCE System, abra la aplicación de WAVE MCE Viewer con uno de los métodos siguientes. a. Pulse en el icono de WAVE MCE Viewer situado en el escritorio. b. Seleccione Inicio -> WAVE MCE -> WAVE MCE Viewer [También puede accederse al software WAVE MCE Viewer Software desde el WAVE MCE Control Software durante la adquisición de datos pulsando en el icono Ver Archivo datos]. Figura 4: Acceso al WAVE MCE Viewer Software La aplicación WAVE MCE Viewer se abrirá tal como se muestra en la Figura 5. Figura 5: WAVE MCE Viewer Página 20 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 3 Abra el archivo de inyección (MLT) de WAVE MCE Viewer. Seleccione Archivo -> Abrir … y seleccione el archivo deseado y pulse el botón Abrir. Figura 6: Diálogo Abrir archivo MLT Figura 7: Ejemplo de archivo de datos MLT cargado Página 21 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 4 Las muestras se cargarán en el Viewer Software. Si es la primera vez que se han cargado muestras, aparecerá un aviso indicando al usuario que ejecute el análisis. Consulte la Figura 8. Figura 8: Ejecutar el análisis 5 Seleccione Reanálisis → Automático… para ejecutar el análisis de pico. Ejecute el análisis estándar (Figura 9) seleccionando la opción [Estándar]. Pulse [Reanálisis] y [Automático]. De este modo se identifican los picos de cada electroferograma con respecto a la ladder usada (WAVE MCE Optimized DNA Size Standard) en la preparación del ensayo de SURVEYOR Scan KRAS. Figura 9: Análisis de picos 6. Ejecute el análisis específico del KRAS seleccionando SURVEYOR Scan → Análisis KRAS. a. En el cuadro de diálogo Análisis del KRAS, las posiciones predeterminadas de los pocillos de los controles son: A1 = KRAS Control: Wild-Type Exon 2 B1 = KRAS Exon 2 Positive Control Codon 12 C1 = KRAS Exon 2 Positive Control Codon 13 Página 22 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System b. Si el usuario coloca estos controles en pocillos distintos de los indicados, seleccione las nuevas posiciones en la selección desplegable. c. Indique el nombre del Revisor. Este nombre se incluirá en todos los informes junto con los informes de Llamadas de SURVEYOR. Finalmente, pulse el botón [Ejecutar análisis]. Figura 10: Análisis del KRAS 7 Los resultados aparecerán en la pestaña Llamadas de SURVEYOR (en la Figura 11 encontrará un ejemplo). Los campos posibles se indican en la tabla siguiente: Campo Índice de materias Pocillo Posición del pocillo de la muestra Nombre muestra El nombre de la muestra Llamada SURVEYOR de La llamada derivada del software a partir de la comparación de las muestras desconocidas con los controles. Los resultados posibles de llamada de SURVEYOR incluyen: Positivo de SURVEYOR Scan – Detectada una variación genética Negativo de SURVEYOR Scan - No detectada una variación genética Desconocido – Hay demasiados picos en la zona de interés y el software es incapaz de determinar un resultado del SURVEYOR Scan. Las llamadas de muestra también están codificadas mediante colores sobre la base del resultado de SURVEYOR Scan. Rojo indica que se ha detectado una variación genética y verde indica que no se ha detectado ninguna variación genética (respecto al tipo natural). Puntuación MCE La MCE Score se obtiene a partir de las características de pico de cada resultado de SURVEYOR Scan. Esta Puntuación se basa en la intensidad de la señal y el nivel de fondo. La puntuación va de 0 a 100. Cuanto más alta sea la puntuación, más se parece la muestra desconocida al patrón de una variación mutante. Proporción Proporción del pico del fragmento cortado de la variante genética frente a la altura de pico del fragmento de tipo natural (sin cortar). Página 23 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Figura 11: Resultados de la Llamada de SURVEYOR 8 Revisión de datos: Resultados de la Llamada de SURVEYOR del KRAS a Examine todos los resultados de la tabla de muestra correlacionando el nombre de muestra con la Llamada de SURVEYOR. Para cada resultado de SURVEYOR Scan se calcula una MCE Score y una Proporción de la muestra. b Primero seleccione el pocillo en la tabla de muestras de la pestaña Llamadas de SURVEYOR, tal como se muestra en la Figura 11 anterior. Aparecerán el electroferograma y la imagen de gel de la muestra. Inspeccione el electroferograma utilizando las funciones gráficas incluidas en el software. Si es necesario, amplíe la región de interés y superponga el electroferograma de la muestra con el Exon 2 Wild-Type Control. c Observe cualquier diferencia entre el control de tipo natural y la muestra analizada. d A continuación superponga el Exon 2 Codon 12 Positive Control y el Exon 2 Codon 13 Positive Control con la muestra. Fíjese en cualquier diferencia observada. e Con estas herramientas, el revisor de los datos puede valorar la presencia o ausencia de una variación comparando la Puntuación MCE y su Proporción asociada de cada muestra con las de los controles del Exon 2. La Proporción se define como la suma de las alturas de los picos mutantes dividida por la altura del pico de tipo natural del Exon 2 sin cortar. La Proporción sólo se calcula e indica para las muestras que tienen una Llamada de SURVEYOR. Las muestras llamadas como "Desconocida" nunca tendrán una MCE Score ni una Proporción. Página 24 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Figura 12: Ejemplos de resultados de llamadas de SURVEYOR f Importante: En Revisión manual de Resultados de MCE Score = 1 encontrará ejemplos de la revisión manual de muestras con una MCE Score =1 y proporción ≤ 5%. g Importante: Tras una concienzuda revisión de cada muestra el revisor de los datos debe examinar si las muestras adyacentes de la placa de análisis tienen unos resultados de SURVEYOR Scan positivos idénticos. En caso de resultados positivos idénticos, puede ser resultado de una contaminación cruzada de la muestra o el control y deberá repetirse el análisis. h Importante: Después de una revisión concienzuda de cada muestra el revisor de datos puede cambiar el resultado de SURVEYOR Scan utilizando el menú desplegable de Llamadas de SURVEYOR. Cualquier cambio manual de la Llamada de SURVEYOR en el software de análisis se indica en los informes de la muestra. La MCE Score se actualizará a "Manual" para indicar que el revisor introdujo un cambio manualmente (consulte el ejemplo siguiente de la muestra 4553-452 del pocillo C2) Página 25 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Figura 13: El revisor realiza un cambio en la Llamada de SURVEYOR Figura 14: Cambio realizado en la llamada de SURVEYOR Página 26 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 9 La Llamada de SURVEYOR y la MCE Score aparecerán en los informes siguientes. a 120 muestras/página Planilla de muestras b 24 muestras/página Planilla de muestras c 12 muestra/página Electroferograma, imagen de gel d 12 muestra/página Tabla de resultados, imagen de gel e 1 muestra/página Electroferograma, Tabla de resultados f Electroferograma Superposición Para generar un informe, seleccione Archivo → Imprimir… Aparecerá la ventana de diálogo Imprimir (Figura 15). Seleccione el informe deseado y pulse [Vista previa] para ver el informe antes de imprimirlo. Pulse el botón [Imprimir...] para enviar el informe a la impresora. Figura 15: Diálogo Imprimir La Figure 16 es un ejemplo del informe de Electroferograma Superpuesto que incluye un resumen de los resultados del análisis con SURVEYOR Scan. Figura 16: Informe de electroferograma superpuesto Página 27 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Página 28 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Revisión manual de las imágenes de gel y electroferogramas de WAVE MCE Muestra desconocida #4 Muestra desconocida #3 Muestra desconocida #2 Muestra desconocida #1 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 13 KRAS Ex2 Positive Control Codon 12 KRAS Control: Wild-Type Exon 2 [bp] WAVE MCE Size Standard El revisor debe inspeccionar visualmente las imágenes de gel y los electroferogramas de todas las muestras como verificación adicional después de utilizar el análisis de KRAS del software. Esto es especialmente importante cuando: un resultado Negativo de SURVEYOR Scan tiene una MCE Score =1 y una proporción ≤ 5%. Dichas puntuaciones pueden indicar un nivel de mutación muy bajo que, debido al ruido de la línea de base, el software es incapaz de tipificar como Positivo de SURVEYOR Scan. se decide cambiar manualmente un resultado de SURVEYOR Scan. Comparar los digeridos de SURVEYOR Nuclease de las muestras desconocidas con los digeridos de los controles positivos y de tipo natural añadirá una verificación adicional de las muestras que deben secuenciarse. Si las muestras tienen picos de digestión de bajo nivel, deberán confirmarse mediante la secuencia del DNA. Marcador Alto Fragmento de PCR sin cortar fragmentos de digestión con SURVEYOR Nuclease en la región de los codones 12 y 13 del KRAS Marcador Bajo Figura 17: Una imagen de gel de WAVE MCE de fragmentos de digestión con SURVEYOR Nuclease después de una amplificación por PCR del Exon 2 del KRAS. La inspección visual muestra dos bandas de división en las muestras desconocidas #3 y #4 que corresponden a los patrones de banda vistos para los controles positivos. La muestra desconocida #1 sólo muestra bandas no específicas débiles. La muestra desconocida #2 puede tener dos bandas de baja Página 29 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System concentración correspondientes a los controles positivos. Por tanto, las muestras desconocidas #2, #3 y #4 deben enviarse a una confirmación de la secuencia del DNA. Junto con la inspección visual de las imágenes de gel, puede resultar útil comparar los electroferogramas de las muestras con los controles positivo y de tipo natural incluidos en el kit. En los electroferogramas es mejor utilizar la función del "superposición". Como parámetro del eje X pueden utilizarse tanto "Índice de migración" como "Tamaño". La Figura 18 siguiente muestra los electroferogramas de las mismas muestras vistas antes (Figura 17) en el modo de imagen de gel. picos de Marcador digestión Bajo SURVEYOR Producto de PCR sin cortar Marcador picos de digestión Bajo SURVEYOR muestra desconocida #4 muestra desconocida #3 muestra desconocida.#2 muestra desconocida.#1 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 13 KRAS Ex 2 Positive Control Codon 12 KRAS Control: Wild-Type Exon 2 Indice Migración (%) tamaño (bp) Figura 18: Los electroferogramas del mismo juego de muestras visualizados en la imagen de gel de la Figura 17 se muestran utilizando tanto el Índice de migración como el Etiquetado por tamaño en el eje X. En este caso queda claro que los patrones de picos de las muestras desconocidas #3 y #4 corresponden a los patrones de pico observados para los controles positivos incluidos en el kit. Para la identificación del cambio de base concreto se necesita una confirmación de la secuencia del DNA. La inspección visual de los electroferogramas de la muestra desconocida #1 muestra una línea de base relativamente baja y no será necesaria una confirmación de la secuencia de DNA. La inspección visual del electroferograma de la muestra desconocida #2 muestra dos regiones en las que hay posibles señales de pico de división y, dado que estas regiones corresponden a la posición de picos de digestión de Control Positivo, esta muestra debe enviarse a una confirmación de la secuencia de DNA. Revisión manual de los resultados MCE Score = 1 Las muestras con un resultado Negativo de SURVEYOR Scan pero una MCE Score =1 (y proporción ≤ 5%) deben analizarse manualmente ya que estos resultados dudosos podrías ser interpretados por el usuario como falsos negativos. El ejemplo de la Muestra #7 de la Figura 19 (a continuación) ilustra un escenario de este tipo. En el análisis manual, la muestra tiene dos picos, justo por encima del ruido de la línea de base en posiciones similares a los controles. Es importante observar que las muestras #3-6 y #8-9 no tienen dos picos de amplitud similar en las mismas posiciones que los controles. La Figura 20 muestra el mismo juego de muestras analizado en modo de gel virtual y de modo similar sugiere que hay una mutación en la muestra #7. Si dichas muestras han sido tipificadas por el análisis de KRAS como Negativos de SURVEYOR Scan, pero el análisis manual sugiere la presencia Página 30 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System de picos como los de las mutaciones, la secuencia debe analizarse adicionalmente a efectos de confirmación de la secuencia. Nota: El análisis de la secuencia de la muestra #7 confirmó que contenía una mutación G13D (los resultados de la secuenciación se muestran en la Figura 21). . Figura 19: Análisis manual de muestras con Negativo de SURVEYOR Scan, MCE Score = 1, proporción ≤ 5%. La muestra 7 muestra posibles productos de división de la SURVEYOR Nuclease por encima del ruido de la línea de base. G12S G13D Figura 20: Análisis de gel virtual de las muestras de la figura 19. La muestra #7 muestra bandas débiles en una posición similar a los controles, muestras #2 y #3, sugiriendo que hay una mutación de bajo nivel en la muestra. Página 31 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System T05-10656 T05-14328 Figura 21: Análisis de la secuencia de las muestras #6 y #7 de la figura 19. Las muestras #6 y #7 de la figura 19 se analizaron adicionalmente mediante secuenciación del DNA. Como sugieren el análisis manual de los trazos de WAVE MCE y los geles virtuales,#6 es una muestra plenamente de tipo natural mientras que la muestra #7 contiene una mutación del G13D del KRAS. Revisión manual del Error Code W-01 Si una SURVEYOR Scan Calling indica un Error Code W-01, el usuario debe revisar el electroferograma WAVE MCE y la imagen de gel de la muestra para determinar si los picos/bandas de los marcadores bajo y alto y los picos/bandas de PCR de los homodúplex no cortados en los controles positivos y las muestras están alineados. Si estos picos/bandas están correctamente alineados y las imágenes de gel y electroferogramas de los controles positivos indican que los picos tienen una señal de como mínimo 0.6 mV por encima del nivel de fondo de los picos circundantes, entonces el usuario puede comparar visualmente los patrones de digestión con SURVEYOR Nuclease de las muestras con los de los controles positivos. Las muestras con unos patrones de digestión similares a los patrones positivos (véase la Figura 18) deben considerarse "Positivos" y enviarse a una confirmación de la secuencia. Si el usuario considera que una muestra "puede" tener un patrón de digestión similar a los controles positivos, esa muestra debe considerarse "Desconocida" y enviarse también a una confirmación de la secuencia. Si necesita ayuda con cualquier aspecto de la Revisión manual, póngase en contacto con Asistencia de Transgenomic. Consulte los Datos de contacto. Página 32 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Características de rendimiento Nivel de detección de SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD La validación del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System utilizando clones de plásmidos de todas las mutaciones habituales del Exon 2 del KRAS ha demostrado que los picos de SURVEYOR Nuclease pueden detectarse en una mezcla de 2-5% de mutantes en un fondo de tipo natural. Los resultados siguientes indican los trazados de las series de dilución de WAVE MCE System para mutaciones de ejemplo en los codones 12 y 13 y los electroferogramas de secuenciación de las diluciones seleccionadas. Téngase en cuenta que los perfiles de pico de mutaciones concretas pueden variar en función del número de muestras procesadas en un chip determinado. Serie de dilución del nivel de detección de la mutación Exon 2 G12S del KRAS Amplicón de 190 bp de longitud completa no dividido Productos de división con SURVEYOR Nuclease de 73 y 117-bp Marcador alto 50% Mutant Marcador bajo 25% Mutant Control positivo de 50% G12S 10% Mutant Control positivo de 25% G12S Control positivo de 10% G12S 5% Mutant Control positivo de 5% G12S Control positivo de 2% G12S 2% Mutant Control positivo de 1% G12S Exon 2 Wild-Type Control 100% WT Indice Migración (%) Figura 22: Titulación con SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD de la mutación Exon 2 G12S del KRAS Se prepararon distintos niveles de mutante mezclando KRAS Control: Wild-Type Exon 2 (PN 710141) y KRAS Positive Control Codon 12 (PN 710143), y calentando y enfriando la mezcla para formar heterodúplex. Estas mezclas se dividieron después con SURVEYOR Nuclease y se analizaron en el WAVE MCE System. NOTA: Para conseguir un 90% de tipo natural y un 10% de mutante se preparó una mezcla con un 80% de PN 710141 y un 20% de PN 710143. Téngase también en cuenta que la mayor parte de la mezcla de amplicones está formada por homodúplex de tipo natural no divididos por la SURVEYOR Nuclease. El límite de detección del amplicón con la mutación G12S es del 2% con SURVEYOR Nuclease+ WAVE MCE System. Resultados de secuenciación del límite de detección de la mutación Exon 2 G12S del KRAS Los electroferogramas muestran los resultados de secuenciación del DNA de los productos de PCR analizados por SURVEYOR Nuclease. A menudo la llamada de secuenciación automática de las Página 33 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System cadenas directa e inversa no consigue detectar mutaciones G12S a niveles inferiores al 10% en mezclas con DNA tipo natural. Junto con los resultados de la SURVEYOR Nuclease, resulta posible interpretar con mayor confianza los electroferogramas de secuenciación de 5-10% de mutante para el codón 12. Si el análisis de una muestra ofrece un resultado positivo de SURVEYOR Scan pero no hay ninguna mutación detectable del KRAS con la secuenciación del DNA, recomendamos registrar el resultado como un "Sin variante detectada". Si desea más detalles consulte "Consideraciones sobre el flujo de trabajo". Página 34 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Serie de dilución del nivel de detección de la mutación Exon 2 G13D del KRAS Amplicón de 190 bp de longitud completa no dividido Productos de división con SURVEYOR Nuclease Marcador alto 50% Mutant Marcador bajo 25% Mutant Control positivo de 50% G13D 10% Mutant Control positivo de 25% G13D Control positivo de 10% G13D 5% Mutant Control positivo de 5% G13D Control positivo de 2% G13D Control positivo de 1% G13D Exon 2 Wild-Type Control 2% Mutant 100% WT Indice Migración (%) Figura 23: Titulación con SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD de la mutación Exon 2 G13D del KRAS Se prepararon distintos niveles de mutante mezclando KRAS Control: Wild-Type Exon 2 (PN 710141) y KRAS Positive Control Codon 13 (PN 710144), y calentando y enfriando la mezcla para formar heterodúplex. Estas mezclas se dividieron después con SURVEYOR Nuclease y se analizaron en el WAVE MCE System. NOTA: Para conseguir un 90% de tipo natural y un 10% de mutante se preparó una mezcla con un 80% de PN 710141 y un 20% de PN 710144. Téngase también en cuenta que la mayor parte de la mezcla de amplicones está formada por homodúplex de tipo natural no divididos por la SURVEYOR Nuclease. El límite de detección del amplicón con la mutación G13D es del 5% con SURVEYOR Nuclease+ WAVE MCE System. Resultados de secuenciación del límite de detección de la mutación KRAS Exon 2 G13D del KRAS A efectos de comparación se muestran los electroferogramas con los resultados de la secuenciación de Sanger para productos de PCR a los distintos niveles de mutación. A menudo la llamada de secuenciación automática del las cadenas directa e inversa no consigue detectar la mutación G13D a niveles inferiores al 10% en mezclas con tipo natural. Junto con los resultados de la SURVEYOR Nuclease, resulta posible interpretar con mayor confianza los electroferogramas de secuenciación 90:10 (10% de mutación) del codón 13 como conteniendo una mutación. Si el análisis de una muestra ofrece un resultado positivo de SURVEYOR Scan pero no hay ninguna mutación detectable con la secuenciación del DNA, recomendamos registrar el resultado como un "Sin variante detectada". Si desea más detalles consulte "Consideraciones sobre el flujo de trabajo". Confirmación de la secuencia Proceda a la confirmación de la secuencia si: 1. Se necesita la identidad de la secuencia de la mutación del Exon 2 del KRAS. 2. La muestra tiene una tipificación Negativa de SURVEYOR Scan con una MCE Score = 1 y el análisis manual sugiere que hay productos de división de SURVEYOR Nuclease. Página 35 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System 3. La muestra tiene un resultado Error Code W-01 y el análisis manual sugiere que hay productos de división de SURVEYOR Nuclease. No proceda a la confirmación de la secuencia si: 1. No es necesaria la identidad de la secuencia de la mutación y basta con un resultado "Mutación del Exon 2 del KRAS". 2. La muestra se ha tipificado como Negativo de SURVEYOR Scan con un resultado de MCE Score = 0, Ratio = 0. Los cebadores de secuenciación universal incluidos en este kit están destinados a utilizarse para la confirmación de la secuencia. El cebador directo es el PN 710153F (Universal Seq Primer 1) y el cebador inverso es el PN 710153R (Universal Seq Primer 2). Limitaciones del Procedimiento de ensayo Las sustancias contaminantes, arrastradas en la extracción de las muestras fijadas con formol y empapadas de parafina, pueden interferir con los procedimientos de amplificación por PCR y digestión con SURVEYOR Nuclease. Los procedimientos de control de calidad explicados en Control de calidad de los productos de la PCR garantizarán que el DNA extraído es adecuado para usarlo en este kit. Este kit ha sido validado para el análisis de muestras de tumores de cáncer colorrectal fijadas con formol y empapadas en parafina. No ha sido validado para aplicaciones diagnósticas de otros tipos de cáncer ni con muestras de biopsia frescas o congeladas. Para solucionar los problemas de resultados no estándar y obtener detalles y de los factores que pueden afectar este ensayo, consulte el Apéndice - Guía de solución de problemas. Con este kit debe prestarse atención al transporte de contaminantes y a la contaminación cruzada. La extrema sensibilidad del método de ensayo exige tomar precauciones en los puntos siguientes: Garantizar que todas las muestras se manipulan de forma que no se pueda producir una contaminación cruzada entre muestras. Trabajar en una estación de trabajo de PCR u otro espacio adecuado donde la zona de trabajo pueda someterse a luz UV antes de prepararse para las reacciones de amplificación por PCR. Utilizar una estación de trabajo de PCR o sala independiente para abrir las muestras después de la amplificación por PCR para el control de calidad mediante electroforesis con gel. La preparación de la digestión con SURVEYOR Nuclease debe realizarse en una sala diferente o una estación de trabajo de PCR distinta de donde se preparó la PCR inicial. Comprobar que los controles de plásmidos del kit se manejan por separado de las muestras en todas las etapas del ensayo. o Comprobar que todos los pocillos de soluciones, controles sin plantilla y DNA de muestra están tapados antes de abrir los tubos con el DNA de plásmidos de control. o MANIPULAR LOS CONTROLES EN ÚLTIMO LUGAR. Añadir el DNA de plásmidos de control a los tubos adecuados sólo DESPUÉS de tapar TODOS los pocillos de controles sin plantilla y de muestras. o Después de tapar los tubos del DNA de control, limpie TODOS los tubos y tapones con un agente destructor del DNA (como lejía al 10%) antes de transferirlos a otra área. Al pipetear las muestras en las placas de 96 pocillos, asegurarse que no es posible la contaminación de las muestras de los pocillos adyacentes, sea debido a salpicaduras durante la mezcla como por no cambiar las puntas de pipeta. Página 36 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Bibliografía En http://www.Transgenomic.com/lib/PL/482146.pdf encontrará referencias sobre la SURVEYOR Nuclease y sus aplicaciones. Página 37 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Apéndice Guía de solución de problemas La utilización eficaz del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System depende de la finalización satisfactoria de una serie de etapas. Una de las más críticas es la amplificación por PCR, que debe concluir con la obtención de DNA específico y de tamaño uniforme en cantidad suficiente para ser detectado después de la hibridación y división. Lo cual depende a su vez de la calidad de la muestra inicial. No se recomienda realizar el ensayo con un DNA que no cumpla los criterios de calidad y cantidad. Nota: Si es la primera vez que utiliza SURVEYOR Nuclease, realice los experimentos de la sección Utilización de DNA de plásmidos de control de KRAS después de leer y comprender la sección Instrucciones paso a paso. Obtenga los resultados de los DNA de los plásmidos de control del KRAS antes de ponerse en contacto con la Asistencia Técnica de Transgenomic. Esta Guía de solución de problemas abarca una lista de problemas con los que se puede encontrar al utilizar el SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con el WAVE MCE System y sugerencias sobre cómo resolverlos. Consulte el Manual de instrucciones del WAVE MCE System si precisa información detallada sobre el funcionamiento y mantenimiento del instrumento. El manual incluye procedimientos concretos de comprobación y mantenimiento de las prestaciones de los microchips así como información sobre solución de problemas. Problema 1 – Baja liberación de la PCR o ausencia de productos de la PCR al analizarlos con gel de agarosa Baja liberación de la PCR Cantid ad de PCR buena Cantid ad de PCR buena POSIBLE CAUSA SOLUCIÓN Baja calidad de la plantilla de DNA Repetir la purificación del DNA. Revisar el método de purificación utilizado. Si el DNA extraído de FFPE está demasiado fragmentado, pueden ser necesarios otros bloques de FFPE. Repetir el tratamiento con RNase de la muestra de DNA y volver a purificar el DNA Demasiado RNA en una muestra provocará una sobreestimación de la concentración de DNA Termociclador no calibrado No hay suficiente plantilla Calibrar el termociclador. Aumentar la cantidad de plantilla Banda de RNA Nota: Debe utilizarse un DNA de alta calidad procedente de FFPE. El DNA debe tener una concentración de 25 ng/µL, determinada por la absorbancia a 260 nm, tener una relación de absorbancia a 260/280 nm de más de 1.8 y tener más del 90% de DNA (es decir, sin la mayoría de la contaminación por tRNA y rRNA, evaluado por el aspecto en un gel de agarosa). Guarde las muestras de DNA a entre -20 °C y -80 °C. El análisis de la plantilla de DNA extraído del tejido empapado de parafina exige tomar varias precauciones. El DNA extraído puede ser tratado con uracil DNA glycosylase para impedir la amplificación de fragmentos de DNA que contengan residuos C desaminados. A menudo, un porcentaje alto de material absorbente A260 extraído del tejido empapado en parafina no es bien amplificado durante la PCR. La utilización de mayor cantidad de DNA inicial ayudará a menudo a Página 38 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System conseguir un producto de amplificación adecuado. Página 39 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Problema 2 – Varios productos de PCR cuando se analiza con gel de agarosa Varios productos de PCR Cantid ad de PCR buena POSIBLE CAUSA Temperatura de enlace demasiado baja SOLUCIÓN Comprobar la calibración del termociclador. Banda múltiple de PCR Nota: La PCR debe producir una liberación suficientemente alta (mayor de 20 ng/µL) de una SOLA especie amplificada del tamaño correcto. Para la PCR deben utilizarse la DNA Polymerase y el DNA Polymerase 10X PCR Buffer incluidos en el kit. Los amplicones de los controles deben digerirse con SURVEYOR Nuclease y procesarse en paralelo para excluir ruido de fondo espurio por comparación visual de los perfiles del electroferograma (consulte Ejemplos de resultados, Figura 2). Examine todos los productos de DNA amplificado antes de la digestión mediante electroforesis con gel (o con un análisis mediante WAVE MCE System) para asegurarse que sólo hay una especie del tamaño esperado. Problema 3 – No se observan productos de división al analizar después del tratamiento con SURVEYOR Nuclease de los heterodúplex No hay productos de división Posición de los heterodúplex que faltan Marcador bajo Pico de homodúplex sin cortar Marcador alto POSIBLE CAUSA Proporción de discordancia objetivo demasiado baja Formación ineficiente de heterodúplex SURVEYOR Nuclease inactiva SOLUCIÓN Comprobar el ensayo utilizando controles. Seguir el procedimiento de PCR e hibridación correcto. Utilizar DNA recién hibridado en los digeridos de SURVEYOR Nuclease. Realizar la reacción de control para comprobar el rendimiento de las enzimas. Utilizar sólo mezcla maestra de SURVEYOR Nuclease acabada de preparar. Nota: La SURVEYOR Nuclease divide preferentemente en las discordancias de los heterodúplex. La proporción de heterodúplex respecto a homodúplex en la muestra hibridada determinará el tamaño de la señal de digestión con SURVEYOR Nuclease. Si la mutación del KRAS está presente en la muestra de DNA genómico a una concentración muy baja, la señal puede ser demasiado baja para proporcionar un resultado positivo. Es importante asegurar que la fase de hibridación forme parte del programa del termociclador (consulte Protocolo de amplificación) para conseguir la máxima eficiencia en la formación de Página 40 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System heterodúplex. Los heterodúplex se forman de manera muy ineficiente en las reacciones de PCR estándar. Nota: La relación entre señal y ruido suele ser suficientemente alta para detectar mutaciones presentes con un bajo porcentaje de la plantilla de DNA total. Se puede detectar DNA mutante en proporciones tan bajas como el 2%. Las Figuras 19-20 muestran la detección de mutaciones presentes en los codones 12 y 13 del Exon 2 del KRAS (4-10% heterodúplex) con un WAVE MCE System. La Figura 2 muestra los productos de digestión generados con DNA de control positivos homodúplex y heterodúplex del KRAS (incluidos en este kit) en un WAVE MCE System. Los productos de división específicos de la mutación se ven claramente como nos nuevos picos de elusión con los tamaños esperados que puede estimarse con respecto al marcador de tamaño del DNA. Precaución: los tampones de PCR disponibles comercialmente varían mucho en contenido y las fórmulas no siempre están definidas por los proveedores. Hay varios tampones NO compatibles con la SURVEYOR Nuclease debido al pH o a la presencia de aditivos, surfactantes u otros ingredientes exclusivos. NO utilice ningún tampón de polimerasa o 10X polimerasa distinto de los incluidos en el kit. Problema 4 – Fondo alto después del tratamiento con SURVEYOR Nuclease Fondo alto Fondo alto Marcador bajo Pico de homodúplex sin cortar Marcador alto POSIBLE CAUSA SOLUCIÓN Paso de hibridación subóptimo Hacer lo siguiente: 1. Comprobar que la concentración de DNA es >25 ng/µL. 2. Repetir la fase de hibridación con cuidado de respetar el procedimiento de hibridación. Comprobar la liberación y calidad del DNA de plantilla Comprobar la liberación y alidad del DNA de plantilla Cantidad de DNA demasiado baja Productos de PCR no específicos SURVEYOR Enhancer W2 o SURVEYOR Enhancer Cofactor han perdido actividad Comprobar la fecha de caducidad del kit. Nota: En ocasiones la SURVEYOR Nuclease marca DNA de doble cadena en lugares de concordancia aleatorios. Esto provoca un fondo después de la digestión. Con SURVEYOR Enhancer W2 y su cofactor se suprime esta actividad sin por ello afectar negativamente de ningún modo en la reacción de división de discordancias. El SURVEYOR Enhancer W2 y el cofactor están incluidos en este kit y deben utilizarse siempre. Si aún así se produce este marcado, genera picos menores en el WAVE MCE System. La comparación de los digeridos de control de homodúplex con los digeridos de la muestra permitirá reconocerlos y normalizarlos con el software WAVE MCE System. Página 41 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Problema 5 – Picos de digestión con SURVEYOR Nuclease en controles negativos Picos de digestión en controles negativos Picos de digestión Marcad or bajo POSIBLE CAUSA Contaminación del contenido del kit con amplicones del KRAS o controles de plásmidos. SOLUCIÓN Tirar todos los componentes del kit y utilizar un kit nuevo. Ponerse en contacto con la Asistencia Técnica de Transgenomic para comentar las posibles causas y el origen de la contaminación. Marcad or alto Pico de homodúplex sin cortar Problema 6 - Marcador superior (UM) dividido durante el análisis de la ladder o las muestras El marcador alto (UM) empieza a resolver como segundo pico o dividido en un doble pico. Picos simples Picos dividido s POSIBLE CAUSA SOLUCIÓN Habitualmente provocado por utilizar un tampón de separación viejo (o envejecido) o reactivos caducados. Detener el procesamiento, preparar tampón de separación nuevo y reiniciar el procesamiento. Pico dividido de WAVE MCE Size Standard comparado con un patrón de tamaño normal Picos dividido s Análisis de muestras que muestra un pico dividido del Marcador alto Página 42 de 46 Preparar siempre reactivos nuevos antes del análisis. Para obtener unos resultados óptimos, utilice la mezcla de tampón de separación y reactivo colorante en las cuatro horas siguientes a su preparación. Nota: Los picos divididos pueden provocar un error en la estimación del tamaño de fragmento del patrón de tamaño y precisar un ajuste manual del Marcador alto. ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Problema 7 – Códigos de error del WAVE MCE Viewer de SURVEYOR Call Software Durante la utilización del WAVE MCE Viewer de SURVEYOR Call Software pueden aparecer códigos de error como el mostrado en la Figura 24. En la tabla siguiente encontrará una explicación de los errores y cómo solventarlos. Figura 24: Ejemplo de mensaje de código de Error Code W-01 Tabla: Mensajes de códigos de error de WAVE MCE Software Código Mensaje Explicación del mensaje Recursos de solución del problema Comprobar el WAVE MCE System ejecutando "comprobar las prestaciones de análisis" del instrumento. Consultar también la sección "Revisión manual de las imágenes de gel y electroferogramas de WAVE MCE" para evaluar manualmente los resultados y después el paso 8g de la sección "Procedimiento de llamadas de SURVEYOR Scan " para cambiar una llamada si algún marcador no cumple los criterios de llamada de SURVEYOR Scan al compararlo con los controles. Compruebe si es correcta la dilución a 10 veces del WAVE MCE Optimized Size Standard. W-01 Marcador no válido Los picos de marcados del Control <nombre> tienen un tamaño o posición inadecuados en el electroferograma. El análisis no puede continuar con esta muestra. W-02 Ladder no válida El patrón de tamaño utilizado como Ladder no satisfizo los parámetros de la operación. No se puede realizar el análisis. Página 43 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Mensaje Explicación del mensaje Recursos de solución del problema Control de tipo natural no válido Los picos del Exon 2 Wild-Type Control son inadecuados para su análisis. Tiene una altura de pico o un índice de migración atípicos. No puede realizarse el análisis del KRAS de las muestras. Compruebe el instrumento y los demás controles. Si son satisfactorios, repita la PCR y la digestión con SURVEYOR Nuclease. Control positivo no válido Los picos del Control positivo del codón 12 presentan una separación, altura de pico o índice de migración inadecuados. No puede realizarse el análisis del Exon 2 del KRAS. Compruebe el instrumento y los demás controles. Si son satisfactorios, repita la PCR y la digestión con SURVEYOR Nuclease. Control positivo no válido Los picos del Codon 13 positive control presentan una separación, altura de pico o índice de migración inadecuados. No se puede realizar el análisis del KRAS. Compruebe el instrumento y los demás controles. Si son satisfactorios, repita la PCR y la digestión con SURVEYOR Nuclease. W-08 Muestra no válida El pico sin cortar de la muestra tiene una altura de pico o un índice de migración atípicos. El análisis de KRAS no cumple todos los criterios de "Sin variación detectada". Compruebe el instrumento y los controles. Si son satisfactorios, compruebe si la plantilla de la PCR es adecuada. Preferiblemente repita la PCR y la digestión con SURVEYOR Nuclease. W-09 Falta un control Tipo natural del Exon 2 En la placa de muestras falta el Wild-Type Control Exon 2 . No se puede realizar el análisis del KRAS. Incluya un control de tipo natural del Exon 2 y repita el análisis. W-10 Falta un control Codón 12 En la placa de muestras falta el Positive Control Exon 2 Codon 12. No se puede realizar el análisis del KRAS. Incluya un control de tipo natural del codón 12 del Exon 2 y repita el análisis. W-11 Falta un control Codón 13 En la placa de muestras falta el Positive Control Exon 2 Codon 13. No se puede realizar el análisis del KRAS. Incluya un control positivo del codón 13 del Exon 2 y repita el análisis. Falta Ladder No hay procesamiento de ladder (patrón de tamaño). No se puede realizar el análisis del KRAS. Incluya un WAVE MCE Optimized DNA Size Standard adecuadamente diluido para la ladder y repita el análisis. Código W-03 W-04 W-05 W-14 Página 44 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Datos de pedido Número de producto Nombre del producto Tamaño 710105-CEIVD SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD 100 análisis MCE-99-2020B WAVE MCE MicroChip Electrophoresis System Unitario MCE-99-3600 WAVE MCE Optimized Microchip Unitario MCE-99-5000 WAVE MCE Optimized Separation Buffer Kit ~1,000 análisis MCE-99-5500 WAVE MCE Optimized Marker Kit ~1,000 análisis MCE-99-5600 WAVE MCE Optimized Cleaning Reagents Kit 1 Kit Página 45 de 46 ® Instrucciones de utilización del SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit Exon 2 CE IVD con ® el WAVE MCE System Datos de contacto Sede central corporativa M Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street Omaha, Nebraska 68164 United States of America Europa Representante Autorizado en la UE P Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park Glasgow G52 4RY United Kingdom Teléfono: +1 (402) 452-5400 Fax: +1 (402) 452-5401 Teléfono: +44 141 892 8800 Fax: +44 141 883 5967 Correo electrónico: [email protected] [email protected] Correo electrónico: Certificado ISO 9001:2008 Transgenomic, Inc. aplica un Sistema de Gestión de la Calidad que cumple con los requisitos de la norma ISO 9001:2008, tal como certificó el BSI, con el certificado # FM 538914. www.Transgenomic.com Licencias, marcas registradas y derechos de autor SURVEYOR Nuclease: Este producto se fabrica bajo licencia exclusiva de las patentes US 6,699,980, 6,391,557, 5,869,245, sus análogas extranjeras y otras solicitudes de patente. La utilización de la SURVEYOR Nuclease precisa una licencia de Transgenomic. Las organizaciones académicas, con o sin ánimo de lucro, obtienen unos derechos limitados de utilización de la SURVEYOR Nuclease en aplicaciones de investigación al adquirir este producto. La reventa u otros usos están estrictamente prohibidos. Pónganse en contacto con Transgenomic si precisan más información. DNA Polymerase: La utilización de este producto está cubierta por una o más de las siguientes patentes US y las correspondientes solicitudes de patente fuera de US:, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155, y solicitudes fuera de US correspondientes a la Patente US N.º 4,889,818. La adquisición de este producto incluye una indemnidad limitada y no transferible ante demandas bajo las solicitudes de patente en curso para utilizar sólo esta cantidad de producto para la propia investigación interna del comprador. No se concede, explícitamente, implícitamente ni por estoppel, ningún derecho bajo ninguna otra reclamación de patente (como las reclamaciones en proceso de la Nucleasa 5' patentada en las patentes US N.º 5,210,015 y 5,487,972), ningún derecho a ejecutar ningún método patentado, ni ningún derecho a realizar servicios comerciales de ningún tipo, incluidas la comunicación de los resultados de las actividades del comprador, a cambio de una tarifa u otra consideración comercial. Este producto se destina únicamente a investigación. Los diagnósticos bajo patentes de Roche necesitan una patente independiente de Roche. Puede obtenerse más información sobre la compra de licencias poniéndose en contacto con el Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. Transgenomic, SURVEYOR y WAVE son marcas comerciales registradas y el logotipo de la hélice y Advancing Personalized Medicine son marcas comerciales de Transgenomic, Inc. Todas las demás marcas comerciales pertenecen a sus respectivos propietarios. © 2012 Transgenomic, Inc. Reservados todos los derechos. Impreso en USA. Document Part No. 482356-03(ES) Página 46 de 46
