Criterios cuantitativos en toxicología forense

Criterios cuantitativos en toxicología forense
María Antonia Martínez González
Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses,
Departamento de Madrid, Las Rozas de Madrid, Madrid, España
Resumen
La
toxicología
forense
requiere
resultados
analíticos
científicamente indiscutibles y legalmente defendibles. Disponer de
datos analíticos fiables es indispensable para interpretar
correctamente los resultados toxicológicos. Los criterios analíticos
en toxicología forense, basados en las normativas y
recomendaciones vigentes son proporcionados por prestigiosos
organismos de ámbito internacional y local, y su cumplimiento es
fundamental para obtener resultados toxicológicos científicamente
sólidos. Este trabajo supone una continuación en la revisión y
evaluación de los criterios analíticos en toxicología forense, iniciada
con el anterior trabajo recientemente publicado en esta revista
«Criterios cualitativos en toxicología forense». Su objetivo es
contribuir a la calidad de la pericia y al avance en la unidad de
criterio científico, aspectos cruciales en toxicología forense. Este
trabajo revisa, evalúa y recopila los criterios para una correcta
cuantificación detallándose los requisitos para validar las
metodologías. Además, pretende servir a aquellos profesionales
que deban evaluar resultados toxicológicos emitidos por
laboratorios forenses.
Artículo
Introducción
La toxicología forense (TF), se define como una de las disciplinas
científico-técnicas que constituyen las denominadas Ciencias
Forenses y que sitúa a la Toxicología al servicio de la
Administración, fundamentalmente de la Justicia1.
No es posible hablar de TF sin hablar de toxicología analítica. Esta
hace uso de las herramientas que proporciona la química analítica
en la estimación cualitativa y cuantitativa de las sustancias de
interés toxicológico presentes en los distintos tipos de matrices2.
El cumplimiento en TF de los criterios analíticos, basados en las
normativas y recomendaciones vigentes, es fundamental para
lograr obtener resultados toxicológicos científicamente sólidos. En
sus aspectos más generales, estos criterios son proporcionados por
prestigiosos organismos de ámbito internacional y local en el área,
entre los que destacan:



- «Laboratory Guidelines»3, de la Asociación Internacional de
Toxicólogos Forenses (TIAFT).
- «Forensic Toxicology Laboratory Guidelines, 2006 Version»4,
de la Sociedad de Toxicólogos Forenses y la Academia
Americana de Ciencias Forenses (SOFT/AAFS).
- «Guidelines and Recommendations of the GTFCh»5, de la
Sociedad Alemana de Química y Toxicología Forense (GTFCh).
Dichos criterios referentes a la cuantificación, están basados en
varias recomendaciones y normativas entre las que destacan
citadas por orden cronológico de aparición:

- Las recomendaciones referentes al análisis cuantitativo de
drogas y/o sus metabolitos en muestras biológicas mediante
cromatografía de gases (GC) o cromatografía de líquidos de
alta presión (LC) y sus modernas combinaciones con la
espectrometría de masas (MS), tales como LC-MS, LC-MS-MS,


GC-MS, y GC-MS-MS elaboradas por la FDA, el CDER y el CVM
y que aparecen recogidas en el documento «Guidance for
Industry. Bioanalytical Method Validation»6.
- La reglamentación sobre el análisis de residuos en los
productos de origen animal. En Europa aparece recogida en el
Diario Oficial de las Comunidades Europeas «European Unión
Decision 2002/657/EC»7.
- La reglamentación analítica para el control del dopaje en las
prácticas deportivas elaborada por la WADA en el
documento «WADA Technical Document TD2003IDCR,
Identification Criteria for Qualitative Assays, Incorporating
Chromatography and Mass Spectrometry»8.
Los requisitos generales para la Competencia de los Laboratorios de
Ensayo y Calibración que están recogidos en la norma UNE-EN
ISO/EC 17025:20059, constituyen la base de la acreditación y,
también están presentes en la filosofía de las recomendaciones y
normativas anteriormente citadas.
El presente trabajo «Criterios cuantitativos en TF», tiene como
objetivo continuar con la revisión, evaluación y recopilación en un
único documento de las distintas directrices existentes sobre
criterios analíticos en TF, ya iniciada con el anterior trabajo
recientemente publicado en esta revista10, «Criterios cualitativos en
TF». Con ello, se pretende enfatizar la necesidad de su
cumplimiento en las prácticas rutinarias de los laboratorios de TF.
Además, también se pretende con ello contribuir a la calidad de la
pericia y al avance en la unidad de criterio científico, aspectos
cruciales en TF para obtener resultados analíticos basados en
fundamentos científicos sólidos, y que sean, por tanto,
comparables y legalmente defendibles ante los Tribunales de
Justicia. Asimismo, esta revisión y recopilación de criterios pretende
servir a aquellos profesionales que deban evaluar los resultados
toxicológicos emitidos por los laboratorios forenses (Tabla 1).
Tabla 1. Siglas utilizadas en el texto
Siglas
CDER
CV
CVM
GC
GC-MS/GCMS-MS
Significado
Center for Drug Evaluation and Research (Centro
para la Evaluación e Investigación de Fármacos,
dependiente de la USFDA)
Coeficiente de variación (indica la precisión de un
método analítico, se expresa en porcentaje)
Center for Veterinary Medicine (Centro de Medicina
Veterinaria, dependiente de la USFDA)
Gas Chromatography (cromatografía de gases)
Gas
Chromatography-Mass
Spectrometry (cromatografía
de
gasesespectrometría de masas)
Gesellschaft für Toxikologische und Forensische
GTFCh
Chemie (Sociedad Alemana de Química y Toxicología
Forense)
High
Performance
Liquid
HPLC
Chromatography (cromatografía de líquidos de alta
resolución o presión)
Cromatografía de gases con detector de ionización
HS-GC-FID
de llama acoplada a un autoanalizador de espacio en
cabeza
IS
Internal Standard (patrón interno)
Liquid Chromatography (cromatografía de líquidos
LC
de alta resolución o presión)
LC-MS/LC-MS- Liquid
Chromatography-Mass
MS
Spectrometry (cromatografía
espectrometría de masas)
LD
Límite de detección
Lower limit of quantitation (límite de cuantificación
bajo)
Límite de cuantificación (usualmente suele referirse
LLQ, aunque, obviamente, existe también un ULQ)
Redistribución postmortem
Standard deviation (desviación estándar)
Relación señal/ruido
Sistema Internacional
Society of Forensic Toxicologists and American
Academy of Forensic Sciences(Sociedad de
Toxicólogos Forenses y Academia Americana de
Ciencias Forenses)
Toxicología forense
The International Association of Forensic
Toxicologists (Asociación
Internacional
de
Toxicólogos Forenses)
Tiempo de retención absoluto
Tiempo de retención relativo
Upper limit of quantitation (límite de cuantificación
alto)
LLQ
LQ
RPM
SD
S/N
SI
SOFT/AAFS
TF
TIAFT
Tra
Trr
ULQ
de
líquidos-
UNE-EN
ISO/EC
17025:2005
Requisitos generales relativos a la competencia de
los laboratorios de ensayo y calibración 17025:2005
USFDA
United States Department of Health and Human
Services
Food
and
Drug
Administration (Administración
Americana
de
Alimentos y Medicamentos)
Xm
Valor de una muestra utilizada como blanco
World
Antidoping
Agency (Agencia
Mundial
WADA
Antidopaje)
El análisis toxicológico cuantitativo
Según la TIAFT3, el análisis toxicológico comprende la detección,
identificación y cuantificación de sustancias con interés toxicológico
y la interpretación de sus resultados.
El análisis cuantitativo, tiene como objetivo determinar mediante
una serie de procesos (pretratamiento de muestras, extracciónpurificación y análisis instrumental) la cantidad o concentración en
que los tóxicos se encuentran en la muestra en cuestión.
Criterios de cuantificación
Dadas las connotaciones legales y sociales derivadas de los
resultados analíticos, cualquier aspecto o procedimiento
relacionado debe ser científicamente indiscutible y legalmente
defendible. Por ello, siempre deben conocerse los parámetros de
validación del método, someterse a consideración y documentarse
en los informes analíticos con el fin de que los resultados puedan
ser interpretados correctamente.
A continuación se revisan, evalúan y recopilan los criterios
cuantitativos en TF, basados en las recomendaciones
internacionales, con relación a los aspectos analíticos clave para
acometer la cuantificación de tóxicos en muestras biológicas.
Generalidades
Con relación al análisis cuantitativo en TF conviene tener
presentes/adoptar los siguientes criterios3, 4:



- El análisis cuantitativo solamente se acometerá cuando sea
significativo desde el punto de vista toxicológico para la
interpretación del caso forense.
- Los fármacos administrados en el hospital normalmente no
se cuantifican salvo petición expresa por denuncia médica.
- Lo ideal es realizar el análisis cuantitativo en una alícuota de
muestra distinta de la que se empleó para realizar el análisis
de barrido «screening» y/o cualitativo de la muestra.
Criterios toxicológicos para la cuantificación
La sangre (o el plasma, en sujetos vivos) es la muestra más
importante objeto de cuantificación, ya que lo que en ella se
detecta, sería, en principio, indicativo del efecto, terapéutico,
tóxico o letal producido sobre el individuo11. Al evaluar estas
concentraciones, hay que tener siempre en cuenta, que en los
consumos asociados de drogas de abuso y psicofármacos (u otros
tóxicos en general) los efectos tóxicos son susceptibles de
potenciarse por fenómenos de sinergismo.
Con relación a las drogas de abuso, si bien estas siempre suelen ser
objeto de cuantificación y muy especialmente en la muestra de
sangre, cabe resaltar que de los resultados cuantitativos de las
mismas no se puede desprender el grado de afectación tóxica, no
pudiendo aquí, además, ser olvidados los fenómenos de tolerancia
en los toxicómanos. Las drogas de abuso no son fármacos, no
existiendo, por tanto, concentraciones terapéuticas («seguras») y/o
tóxicas/letales, ya que en ausencia de otra circunstancia que
justifique la causa de la muerte, su sola presencia en las muestras
biológicas puede ser compatible con la misma por reacción adversa.
Las cuantificaciones realizadas en vísceras y contenido gástrico (si
se conoce su totalidad) aportan información complementaria a la
obtenida de la muestra de sangre, siendo muy valiosas,
especialmente, en casos de ingestas masivas de tóxicos. Sin
embargo, los resultados cuantitativos en orina no aportan ninguna
información, por considerarse la orina muestra de eliminación,
estando las concentraciones afectadas por la cantidad de líquidos
ingeridos y por la actividad de la función renal12.
Para ser lo más preciso y exacto posible en la valoración
toxicológica de las concentraciones de tóxicos, es fundamental
conocer todos los detalles de la historia del caso.
Las concentraciones de tóxicos en sangre postmortem deben ser
siempre evaluadas con cautela, pues muchos tóxicos son
inestables,
por
sufrir
degradación
(bacteriana
y/o
13, 14, 15
metabólica)
,
y/o
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23
redistribución postmortem (RPM)
, desde las
etapas más tempranas de acontecer el fallecimiento. Las
concentraciones postmortem no reflejarían, pues, con exactitud las
concentraciones antemortem. Los tubos que tienen como
conservante fluoruro sódico y como anticoagulante oxalato
potásico, y que usualmente tienen tapón de color gris, son los
ideales para tomar la muestra de sangre, pues evitarán que los
tóxicos se degraden y, además, facilitarán su correcta medición. No
obstante, también es necesario tomar muestra de sangre en tubos
sin aditivos, usualmente son los de tapón rojo, pues hay tóxicos
como
los
pesticidas
organofosforados24 y
muchos
13, 14, 15
psicofármacos
susceptibles de degradarse por la acción del
ión fluoruro. Mantener las muestras biológicas congeladas hasta su
análisis al menos a −20 °C es clave para evitar la degradación de los
tóxicos. Se sabe que, especialmente, los tóxicos de carácter básico y
de alto volumen de distribución (p. ej., los antidepresivos) sufren
RPM, por ello sus concentraciones pueden estar incrementadas
hasta 20 veces en sangre de cavidad central (p. ej., cardiaca) en
comparación con la sangre periférica (p. ej., femoral)16, 23. Los
barridos toxicológicos iniciales deben por ello, realizarse en sangre
de cavidad central, pues es donde en general, los tóxicos van a
estar más concentrados. Cuando las concentraciones detectadas en
las sangre de cavidad central se encuentran en rango tóxico, se
debe proceder a realizar la cuantificación en la sangre periférica
para aclarar si se trata de un fenómeno de la RPM. Contar pues,
con ambos tipos de sangre, central y periférica, permitirá aclarar si
el tóxico objeto de interés ha estado sujeto a RPM, ello,
posteriormente, permitirá poder realizar una correcta
interpretación de los resultados toxicológicos.
De todo lo anteriormente expuesto, también se deduce que en
matrices en descomposición, obviamente, las concentraciones
obtenidas tienen un valor interpretativo altamente limitado desde
el punto de vista toxicológico.
Tipos de calibración
Para poder acometer con corrección el análisis cuantitativo de las
muestras los instrumentos de medida deben estar calibrados. El
calibrado en un método instrumental es el proceso mediante el que
se obtiene una relación matemática («función analítica») entre la
señal del analito y su concentración mediante la comparación con
uno o más patrones («calibradores»).
Los tipos de calibración que se recomienda emplear en los
laboratorios de TF son12, 25:

- Curva de calibrado multinivel. Requiere un mínimo de 3
calibradores, siendo deseables al menos 5, 2 de ellos
próximos al límite de detección. Los gráficos de calibración se
construirán a partir de los patrones añadidos al mismo tipo de
matriz que la muestra objeto del análisis y someterse a los
mismos procedimientos de extracción que las muestras
problema. El gráfico de calibración debe construirse
representando los ratios (relaciones) analito/patrón interno
(IS) de respuestas obtenidas en el detector (eje de ordenadas)
frente a las concentraciones (eje de abscisas). Es necesario
determinar si la calibración se ajusta a un modelo lineal,
cuadrático u otro. El modelo lineal de calibración es el
preferible, pero si es necesario se debe emplear un modelo
no-lineal. Los modelos lineales deben aplicarse para conjuntos
de datos con homoscedasticidad, esto quiere decir que debe
de existir una homogeneidad de las varianzas a lo largo de
todo el rango de calibración. Como regla de oro, esto debe
esperarse para rangos de calibración que no se expandan más
de un orden de magnitud. Sin embargo, la mayor parte de los
métodos de análisis toxicológico se expanden 2 o 3 órdenes
de magnitud, lo cual suele llevar implícito un grado
significante de heteroscedasticidad. Para compensar la
heteroscedasticidad debe adoptarse un modelo de calibración
basado en el ajuste ponderado mediante mínimos cuadrados
utilizando un factor de ponderación de 1/×, 1/×2, 1/×3, etc. En
el caso de adoptarse el modelo lineal, debe siempre
comprobarse que existe una relación lineal entre la respuesta
y la concentración a lo largo de todo el rango de calibración
establecido26,27, 28, 29, 30, 31. En todo caso, la concentración de
un calibrador calculada frente a la curva de calibrado con él
generada debe estar comprendida en ± 20% de su valor. La
curva de calibrado se verificará en cada tanda de análisis
mediante el uso de controles obtenidos de fuentes diferentes
de las que se han generado los calibradores y los resultados
que arrojen también deben estar comprendidos en ± 20% de
su valor nominal.
En el caso de que no se prepare una recta de calibrado
completa, por no tratarse de analitos objeto de cuantificación
frecuente en el laboratorio, los patrones para la cuantificación
deben estar en torno a la concentración del analito en la
muestra problema. En este sentido, y con relación a los
métodos analíticos basados en un punto de calibración, Peters
y Maurer32concluyeron, tras sus estudios, que la utilización de
solo un punto de calibración en GC-MS y en LC-MS puede ser
válida y constituir una alternativa a la utilización de un rango
completo de calibradores si el punto de calibración elegido se
sitúa cerca del punto medio del rango total de calibración. Tan
et al.33 más recientemente han llegado a la misma conclusión
utilizando solo 2 puntos de calibración en LC-MS.

- Método de las adiciones estándar. Se utiliza cuando existe
un efecto matriz que no es posible corregir. Consiste en medir
las respuestas de «n» alícuotas iguales de la muestra a las que
se adicionarán (a todas menos a una) cantidades crecientes
(en igual volumen) del analito que se pretende medir. La
propia muestra problema actuará como blanco del método.
Es un método laborioso que se suele utilizar
fundamentalmente en los métodos espectrofotométricos y
potenciométricos y, también, cuando el blanco de matriz no
es fácil de obtener como en el caso de las muestras
procedentes de embalsamamientos. El gráfico de calibración
debe construirse representando las respuestas detectadas
(eje de ordenadas) frente a las concentraciones (eje de
abscisas). El punto de corte de la gráfica (normalmente es
lineal, recta de regresión) con el eje de abscisas determinará
la concentración del analito en la muestra.
Cualquiera que sea el tipo de calibración utilizado, los resultados se
expresarán siempre de forma inequívoca y utilizando unidades de
medida del sistema internacional (SI).
Tipos de calibradores
Los tipos de calibradores que existen en los laboratorios forenses
son6, 12, 25:



- Disoluciones de patrones: Son útiles cuando el método no
obliga al uso de otro tipo de patrones, y cuando no existe
efecto matriz (p. ej., análisis de volátiles por GC con detector
de ionización de llama acoplada a un autoanalizador de
espacio en cabeza [HS-GC-FID]).
- Material de referencia: En este material una o más
propiedades deben estar confirmadas mediante un método
validado. Por ejemplo, la concentración certificada de un
analito en una determinada matriz, así una sangre con una
concentración certificada de alcohol etílico sería un material
de referencia certificado.
- Calibradores fabricados en el propio laboratorio: Son los de
mayor objeto de preocupación, se usan en métodos analíticos
complejos que requieren extracción, evaporación, etc. A
partir de disoluciones «madre» del principio activo de
1 mg/mL (en el disolvente adecuado) se obtienen lo que se
llaman «disoluciones de patrones de trabajo» «working
standard solutions»que se conservan a −20 °C y en tubos de
vidrio ámbar. Deben atemperarse antes de su uso y
establecer su periodo de validez. Se utilizarán para enriquecer
(«sembrar») las matrices y así generar los calibradores.
Patrón interno
Se recomienda el uso del IS en todos los métodos de análisis
cromatográficos 3, 12, 25, 31. El IS corrige la cuantificación del analito,
al minimizarse errores aleatorios y sistemáticos, bien debidos a
pérdida del analito por: adsorción a las superficies, extracción,
evaporación, derivatización; como también a la irreproducibilidad
del método durante la transferencia e inyección de la muestra en
los equipos de análisis. Lo ideal es que el IS sea un homólogo del
analito, y si no es posible, se elegirá un compuesto con propiedades
físico-químicas muy similares. Cromatográficamente debe eluir
cerca del analito, y estar resuelto (suficientemente separado) de
cualquier otra sustancia que pueda estar presente. Si el analito se
va a derivatizar, el IS que se elija debe formar un compuesto
derivatizado análogo. Los isótopos estables (p. ej., deuterados) son
los que se recomiendan para los análisis por GC-MS y LC-MS,
aunque los IS no deuterados bien elegidos pueden proporcionar en
ocasiones resultados equivalentes e incluso mejores. En el caso de
los análisis por LC-MS los IS marcados isotópicamente son los
únicos que pueden compensar la «supresión iónica» (ion
supression)34, 35, 36. Siempre que sea posible, el IS se preparará en
disolución acuosa para facilitar su miscibilidad con las muestras
biológicas, y debe añadirse a estas lo antes posible en las etapas
iniciales del método, y en cualquier caso, antes de añadir el tampón
y de proceder a la extracción. Los marcadores que se añaden
después de la extracción inicial se consideran «patrones externos»
y su uso es desaconsejable.
Validación y aspectos relacionados
Para garantizar la calidad y, por tanto, la fiabilidad de los resultados
analíticos obtenidos en los laboratorios de TF, estos deben
dimanarse de metodologías analíticas escritas, validadas y
aprobadas por el responsable del laboratorio, todo ello de acuerdo
con la norma UNE-EN ISO/EC 17025:20059, y siguiendo las
directrices de los organismos internacionales y la normativa
internacional anteriormente citados.
La validación de las metodologías junto a otras actividades
englobadas en el control del aseguramiento de la calidad, permite
demostrar a los laboratorios, en general, que sus métodos
analíticos proporcionan resultados fiables. Validar un método
consiste en verificar y documentar su validez, esto es, su
adecuación a unos determinados requisitos, previamente
establecidos por el laboratorio para poder resolver un problema
analítico particular.
Todos
los
métodos
analíticos
deben
ser
6, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47
validados
utilizando
la
misma matriz en la que de manera rutinaria se van a realizar los
análisis (p. ej., sangre, suero, tejidos), para ello las matrices se
sembrarán con cantidades conocidas de drogas/tóxicos y se
analizarán siguiendo el procedimiento analítico completo. Los
parámetros analíticos que deben ser validados son la exactitud, la
precisión y el rendimiento absoluto, todos ellos a diferentes
concentraciones, el rango de calibración, la selectividad, los límites
de detección (LD) y de cuantificación (LQ) y si es posible también la
robustez y la incertidumbre. Se recomienda que los límites bajo y
alto de cuantificación (LLQ y ULQ) coincidan, respectivamente, con
los calibradores inferior y superior de la recta de calibración31. El
rango de calibración en sangre debe ser tal, que, en principio, sirva
para abarcar concentraciones de fármacos desde terapéuticas
hasta letales22, 48, 49,50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. En la validación de
métodos por LC-MS-MS es especialmente importante conocer el
efecto matriz44, 45.
Modernamente, el rendimiento de extracción no se considera,
obviamente, un parámetro esencial de validación, pues los
calibradores se preparan en la misma matriz31. Sin embargo, sí que
es fundamental estudiar la exactitud y precisión (intra-ensayo e
inter-ensayo). Para ello, se utilizarán un mínimo de 5
determinaciones procedentes de diferentes tandas, por nivel de
concentración (excluyéndose las muestras blanco). Deben
estudiarse un mínimo de 3 concentraciones comprendidas en el
rango de medida: baja, media y alta. El valor medio de la exactitud
debe estar comprendido en ± 15% del valor teórico, excepto en el
LLQ que debe estar comprendido en ± 20%. La precisión en torno al
valor medio no debe exceder el 15% del coeficiente de variación
(CV), excepto en el LLQ, donde el CV no debe exceder el 20%6.
La SOFT/AAFS hace además especial mención a los siguientes
aspectos fundamentales a tener en cuenta con relación al diseño de
protocolos de validación de métodos analíticos4:



- Al realizar los análisis en los laboratorios las muestras deben
de agruparse en «tandas». Cada «tanda» debe de contener un
número suficiente de controles y calibradores que dependerá
del tamaño de la tanda y del tipo de prueba.
- Cuando los análisis se vayan a realizar sobre muestras no
habituales (tejidos en descomposición, humor vítreo, etc.)
deben emplearse, siempre que sea posible, calibradores
apropiados a esas matrices, que sean preparados y analizados
a la par que las que las muestras.
- En el caso de los inmunoensayos, el laboratorio puede
calcular el LD sumando al valor medio del blanco (Xm) 3
desviaciones estándar (SD), o sea, LD = Xm + 3 SD. Con
relación a las técnicas cromatográficas (p. ej., GC y
cromatografía de líquidos de alta resolución [HPLC]), si bien
existen diferentes métodos, para su cálculo, uno de ellos
consistiría en calcular el LD como la menor concentración de
una droga que proporcionara una señal con una altura de pico
de 3 veces la relación señal/ruido de fondo (S/N)
correspondiente a un blanco de muestra. El valor del LD
nunca debe de ser menor que el valor del blanco más 3 SD. El
LQ puede ser calculado añadiendo al valor del blanco 10 SD
(LQ = Xm + 10 SD). Sin embargo, es preferible determinar el
LQ experimentalmente como la concentración más baja que
puede medirse con un coeficiente de variación no superior al
20%.


- La linealidad del método debe establecerse utilizando al
menos 3 calibradores. La concentración inicialmente estimada
de la muestra problema debe estar comprendida dentro del
rango de calibración. En el caso de que la muestra problema
tenga una concentración mayor que la del calibrador más
alto, entonces la muestra debe primero diluirse con agua
desionizada, y después someterse a extracción. Si ello no se
realizara, entonces debe de reportarse la concentración como
mayor que el calibrador más alto. Si la concentración de la
muestra estuviera por debajo del calibrador más bajo se debe
de añadir un calibrador adicional que esté por debajo de la
concentración del analito en la muestra. Otra opción posible
es duplicar el volumen de la muestra y proceder a la reextracción, siempre y cuando se haya demostrado que el
análisis no sea dependiente de la matriz. Si no se requiere una
cuantificación exacta, entonces se puede reportar que la
muestra contiene al analito en una concentración menor que
el calibrador más bajo («traza»). La utilización del término
«traza» implica que la sustancia está presente en una
concentración por encima del LD, pero por debajo del LQ del
método.
- El criterio de aceptación de una calibración cromatográfica
debe de quedar establecido en el método. En el caso de una
calibración multinivel este factor es habitualmente el
coeficiente de correlación. En la mayor parte de las
aplicaciones, se considera como un factor aceptable 0,99. Sin
embargo, puede haber casos en los que un coeficiente de
correlación de 0,98 se pueda considerar como mínimamente
aceptable. Además, se considera una buena práctica evaluar
la calibración calculando el valor de cada calibrador frente a la
curva generada. Valores de ± 20% se consideran, en general,
aceptables para la mayoría de las aplicaciones, aunque en el
caso del etanol se prefieren valores de ± 10%.



- Para muestras con concentraciones significativamente
mayores que los calibradores más altos, el laboratorio debe
asegurarse y tomar precauciones para que no se produzcan
arrastres«carryover» en las siguientes muestras que se
analicen. Para asegurarse de que no existen posibilidades de
falsos positivos por arrastres se debe realizar una
comprobación de la metodología analizando muestras
similares con muy bajas concentraciones después del análisis
de una muestra con un valor positivo muy alto.
- Es un hecho conocido que en un laboratorio, debido a
diferentes causas, algunos resultados analíticos se desvían de
modo falso y significativo del valor real («outliers»). Si esto le
sucede a un blanco, a un control, o a un calibrador la
percepción del hecho por el analista es obvia. Sin embargo, si
esto le sucede a una muestra procedente de un caso, ello no
se detectaría. Por esta razón, se recomienda replicar la
extracción y el análisis cuantitativo, al menos en duplicado. El
laboratorio debe determinar el criterio de aceptabilidad para
replicados de análisis. Una desviación como máximo de ± 20%
del valor medio se suele considerar aceptable.
- El tiempo de retención en los análisis cromatográficos tiene
también su rol dentro de los criterios de aceptabilidad. Así,
para análisis mediante GC se admiten desviaciones de los
tiempos de retención (Tra) del 1-2% con relación a los
calibradores o controles. En el caso de análisis mediante HPLC
son aceptables desviaciones ligeramente superiores, y más
concretamente si se han realizado en modo programado noisocrático (Tabla 2)4, 5, 7.
Tabla 2. Rangos de aceptabilidad * de tiempos de retención
cromatográficos
Tra
Trr
GC ≤ ± 2% ≤ ± 1%
HPLC ≤ ± 5% ≤ ± 2,5%
Fuente: tomado de las referencias 4–6 .
* Con relación al material de referencia.
Finalmente, y como complemento ilustrativo y práctico de este
trabajo, de revisión, evaluación y recopilación de criterios para la
correcta cuantificación de tóxicos en los laboratorios de TF, se hace
referencia a los trabajos científicos publicados en los últimos años
por los grupos de investigadores del Dr. Maurer59, 60, 61, 62, 63, 64 y de
la Dra. Huestis65, 66, 67, 68 por describirse en ellos excelentes ejemplos
prácticos de métodos analíticos validados.
Conclusiones
El cumplimiento de los criterios cuantitativos, basados en las
normativas y recomendaciones vigentes, es fundamental para
poder obtener resultados toxicológicos científicamente sólidos y,
por tanto, indiscutibles y legalmente defendibles ante los
Tribunales de Justicia. La calidad de la pericia y el avance en la
unidad de criterio científico, aspectos fundamentales en TF, se
sustentan en su cumplimiento. La correcta cuantificación de tóxicos
requiere la aplicación de metodologías analíticas de detección
validadas basadas en los criterios establecidos. En definitiva, la
correcta cuantificación de tóxicos en las muestras biológicas, es
indispensable para poder acometer posteriormente una correcta
interpretación de los resultados toxicológicos. En base a ello, el
médico-forense, junto con el resto de la información relativa al
caso, podrá establecer finalmente la causa de la muerte. Es por
tanto fundamental, que estos profesionales estén familiarizados
con los criterios existentes.
Bibliografía
1.Society of Forensic Toxicologists «What is Forensic Toxicology» [consultado 31 Ene 2013]. Disponible en:
http://www.abft.org/files/WHAT%20IS%20FORENSIC%20TOXICOLOGY.pdf.
2.García-Rodríguez S, Gímenez MP. Recursos humanos en un laboratorio de toxicología forense. Rev Toxicol.
2005; 22:1-11.
3.The International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT), Laboratory Guidelines (fuente: TIAFTBulletin XXXI Number 4 p. 23–26) [consultado 31 Ene 2013]. Disponible en:
http://www.tiaft.org/files/bulletin/Volume%20XXXI%20Number%204.pdf.
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