FOSFATASA ALCALINA

FOSFATASA ALCALINA
USO DEL PRODUCTO
Para la determinación de la actividad fosfatasa alcalina en suero
o plasma. Método Cinético 405 nm según DGKC/SSCC
Blanco
Muestra
1 ml
1 ml
Reactivo de Trabajo
Incubar hasta que el reactivo alcance los 37°C
FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El sustrato p-nitrofenilfosfato (p-NFF) es hidrolizado por la fosfatasa alcalina de la muestra, con producción de fosfato y pnitrofenol.
El medio de reacción alcalino, el sustrato es incoloro, mientras
que el p-nitrofenol producido es amarillo, con máximo de absorción a 405 nm. La cantidad formada de éste último para un determinado tiempo, se mide fotométricamente y es proporcional
a la actividad de la Fosfatasa Alcalina de la muestra (1).
Muestra
-
100 µl
Mezclar luego de cada agregado. Incubar 30 min exactos.
NaOH 20 mmol/l
10 ml
10 ml
Muestra
100 µl
-
Mezclar. Leer en espectofotómetro a 405 nm o colorímetro(390-420 nm).
Llevar a cero con blanco de agua. Color estable 2 horas.
REACTIVOS
Buffer: Glicina 50 mmol/l, Mg++ 0,5 mmol/l pH 10,5. Listo para
Usar.
Sustrato: Viales con p-NFF para una concentración final de 6
mmol/l
Estándar: Solución acuosa de p-nitrofenol 0,5 mmol/l
Hidróxido de Sodio 5N: Solución concentrada para preparar
1000 ml de solución de 20 mmol/l (Nota 1)
Conservación y Estabilidad de los Reactivos
Conservar en refrigerador 2-8°C.
La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la
caja.
Precauciones y Advertencias sobre el Uso de los Reactivos
Los reactivos son para uso IN VITRO.
Indicios de inestabilidad y deterioro de los Reactivos
Coloración amarilla del Buffer.
CALCULOS
Previamente restar de la lectura de cada Muestra, la correspondiente lectura de su Blanco.
Se obtiene así la Lectura Corregida (Nota 2).
1.Espectofotómetro (405 nm)
Cubeta: 1cm de paso de luz.
Fosfatasa Alcalina U/l=Lectura Corregidax200
2.Colorímetro (390-420 nm)
MUESTRA
Suero fresco ó plasma heparinizado.
Las muestras dejadas a temperatura ambiente, almacenadas en
refrigerador o congeladas, experimentan variaciones en la actividad de fosfatasa alcalina (2). Esto también sucede con los reconstituidos de sueros liofilizados. Por tales razones, para poder
obtener máxima precisión en el ensayo, se recomienda trabajar
con especímenes frescos.
Sustancias Interferentes
Los anticoagulantes son inhibidores de la fosfatasa alcalina.
La hemólisis causa interferencias. Se han descrito algunas interferencias medicamentosas (3), por lo tanto, es útil conocer la
medicación del paciente.
En papel milimetrado graficar las lecturas de D.O. obtenidas
para cada tubo (ordenada), contra los valores de la Actividad de
las muestras, llevar el valor de la Lectura Corregida a la gráfica
e interpolar (Nota 2).
PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO
Agregar en el frasco se Sustrato, el volúmen de Buffer que indica
el rótulo. Agitar hasta la disolución total.
Conservación y estabilidad
Proteger de la luz directa
Refrigerados (2-8°C)...........................................estable 30 días
Temp.Amb (15-25°C)..........................................estable 4 días
Indicios de deterioro
Lecturas de Absorbancia a 405 nm superiores a 0,400 DO., indican deterioro.
ENSAYO
Procedimiento
En tubos en baño a 37°C agregar:
Tubo N°
B
1
2
3
4
5
6
Estándar
0
0.1 ml
0.2 ml
0.4 ml
0.6 ml
0.8 ml
1,0 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
NaOH 20 mmol/l
Mezclar. Leer colorímetro 390-420 nm. Llevar a cero con el Blanco.
Actividad U/l
0
18.3
36.3
71,2
105
137
168
VALORES DE REFERENCIA (Nota 3)
Adultos: 20-50 U/l
Niños: 38-140 U/l
SISTEMA ANALÍTICO
A. Linealidad: hasta 160 U/l. Valores superiores, repetir en
ensayo con muestra diluída en solución fisiológica. Corregir el
resultado por la disolución efectuada.
B. Sensibilidad: Dependiendo del espectofotómetro, alcanza
generalmente a 0,2 U/l.
C. Precisión:
Intraensayo
Nivel Medio
Rango
D.S.
C.V.%
70 U/l
67-79 U/l
± 3,0 U/l
4,2
120 U/l
94-126 U/l
± 5,o U/l
4,1
Nivel Medio
Rango
D.S.
C.V.%
117 U/l
111-124 U/l
± 6,3 U/l
5,3
Interensayo
NOTAS
1. Trasvasar el contenido del frasco de Hidróxido de sodio 5 N
a un envase de 1000 ml de capacidad. Enjuagar el frasco. Completar a 1000 ml con agua desionizada. Mezclar.
La solución obtenida es de NaOH 20 mmol/1.
2. Cuando las LECTURAS CORREGIDAS superan 0,800 D.O.,
debe repetirse la determinación con la muestra diluida adecuadamente con solución fisiológica. Corregir el resultado obtenido
por la dilución efectuada.
3. Los valores de referencia para niños varían ampliamente según la edad. Los valores más elevados se observan en la
pubertad.
PRESENTACION
Código 302005: 5 x 10 mI.
BIBLIOGRAFIA
1.Bessey, O. y cols. J. Biol. Chem., 164,231 (1946)
2.Massion, O. y cols., Clin. Chem., 18-4 :366 (1972)
3.Young, O. Clin. Chem., 21-5 : 246 (1975)
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Código y Fecha de Revisión: 30290000/13