Estudio en vivo de la invasión de células vivas de arroz por el
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Estudio en vivo de la invasión de células vivas de arroz por el hongo Magnaporthe oryzae, el tizón del arroz Martha C. Giraldo Z Barbara Valent Laboratorio Kansas State University CIAT – Febrero 18, 2011 Teleomorfo: Magnaporthe oryzae Anamorfo: Pyricularia grisea Sacc. Haploide Ascomiceto filamentoso 37.8 Mb genome 7 chromosomes, >11,109 genes Una amenaza emergente : Añublo de trigo es una nueva enfermedad en América del Sur “Incrementar la p producción en agricultura g es la única forma de garantizar suficientes fuentes de alimentos a precios accequibles” Adhesión de la espora Germinación Formación del apresorio i Invasión biotrófica Esporulación Los efectores son secretados y translocados dentro de la célula de arroz Penetración PAVR-Pita SP AVR-Pita CDS EGFP T SUSCEPTIBLE RESISTENTE pi-ta- en la planta no reconoce el correspondiente AVR-Pita del hongo Pi-ta en la planta reconoce el correspondiente AVR-Pita del hongo Interacción COMPATIBLE Interacción INCOMPATIBLE Sakamoto (1949) Cada proteína efectora del añublo del arroz tiene una secuencia única BIC BIC Secreción localizada de estos efectores dentro del Complejo biotrófico interfacial– BIC es la única caracteristica en común encontrada entre éstos efectores Khang et al. 2010. The Plant Cell Kankanala et al. 2007. The Plant Cell FM4-64 (Stains only endocytotic membranes) Invasive hyphae yp undergo g extreme constriction when crossing Live-Cell Imaging Suggested That Cell-to-Cell Movement Involves Plasmodesmata Kankanala P. et.al. Plant Cell 2007:19:706-724 Extrainvasive Hyphal Membrane – EIHM Biotrophic Interfacial f C Complex – BIC C Pathogen-induced in planta structure that accumulates effector proteins secreted from invasive hyphae Khang et al. 2010. The Plant Cell Hyphae in liquid medium Invasive hyphae in planta at 36 hpi Validation of microarray data by Reverse Transcriptase-PCR Identified novel in planta planta-specific specific secreted proteins Mosquera & Giraldo et al. 2009. The Plant Cell Comprobar si las proteínas candidatos-efectoras están específicamente secretadas en la planta Determinar si son secretadas y se localizan en los BIC como los efectores conocidos AVR-Pita, PWL1 y PWL2 Determinar si son translocadas dentro de las células de arroz •SECRECIÓN •TRANSLOCACIÓN ? EIHM Extrainvasive Hyphal Membrane – EIHM Secretion in planta: secreted GFP accumulates within the EIHM PRP27::EGFP Cytoplasmic GFP PRP27 ::AVR-Pita SP::EGFP Secreted GFP Secretion studies again g confirm that the EIHM encloses a compartment that traps proteins secreted by the fungus Fungal transformation expressing candidate effector proteins fused with fluorescent reporter protein to follow secretion ti i planta in l t by b live li cell ll imaging i i pBHt2 Binary vector Left e t Border o de Right g t Border o de HygR P (1kb) SP-CDS(~400bp) __FP - T Exchangeable Candidates __FP: FP: __ Fluorescent reporter protein ¾ mRFP - Monomeric Red ¾ EYFP - Enhanced Yellow ¾ EGFP - Enhanced Green Biotrophy Associated Secreted Biotrophy-Associated (BAS) Proteins Microscopic visualization of >100 individual rice sheath infection sites per gene at each time point of the invasion M Mosquera & Gi Giraldo ld ett al. l 2009. 2009 Th The Pl Plantt C Cell ll •100-fold upregulated in invasive hyphae •Secreted protein with 115 aa BAS1:EYFP 27hpi BAS1:mRFP in AVRPita:EGFP 27hpi BAS1:mRFP in Cytoplasmic:CFP •84-fold upregulated in invasive hyphae •Secreted protein with 102 aa BAS2:EYFP BIC pattern BAS2:mRFP at 37hpi 32hpi Mosquera & Giraldo et al. 2009. The Plant Cell It is localized at the points where the fungus moves to next cells EYFP EYFP Unpublished data Mosquera & Giraldo et al. 2009. The Plant Cell •71-fold upregulated in invasive hyphae •Secreted protein with 113 aa At appressorial penetration site, weak BIC pattern & at the points where the fungus moves to next cells BAS3:EYFP BAS3:mRFP in Cytoplasmic:CFP 24hpi 37hpi EYFP 37hpi EYFP •61-fold 61 fold upregulated in invasive hyphae Mosquera & Giraldo et al. 2009. The Plant Cell •Secreted protein with 102 aa •No pathogenicity phenotype for gene knock-out It is secreted and retained inside the EIHM compartment BAS4:EYFP 27hpi p 37hpi p BAS4:EGFP_PWL2:mRFP COMPATIBLE INTERACTION INCOMPATIBLE INTERACTION B k EIHM / COMPATIBLE INTERACTION Broken BAS4 is secreted and retained inside the EIHM compartment Strain Gene BAS4:YFP Extrainvasive Hyphal Membrane – EIHM BAS1:mRFP BAS2:mRFP BAS3:mRFP EIHM ? BAS1:mRFP in BAS4:YFP is translocated to the cytoplasm of living rice cells Plasmolysis BAS1 also moves beyond the invaded rice cell Estas proteínas asociadas a la fase biotrófica (BAS) exhibieron diferentes patrones de secreción: BAS1, localizada en BICs, es un candidato fuerte como un efector citoplásmico. BAS2 y BAS3 son candidatas como proteínas de movimiento del hongo de célula a célula. BAS4 marcado fluorecentemente es un buen control en estudios de traslocación de efectores, como marcador de integridad del EIHM y del éxito de la infección. La expresión de las proteínas BAS se redujo notoriamente, durante las interacciones incompatibles. Determinar si el movimiento de célula a célula del añublo del arroz se p produce a través de plasmodesmos p usando la co-localización de BAS2 y BAS3 con proteínas marcadoras de plasmodesmos. Determinar la proteína o el complejo de proteínas que interactúan con los efectores conocidos y proteínas BAS en planta. Dale Bumpers National Rice Research Center Arkansas
