ANALISIS DE AGENTES TIREOSTATICOS EN PRODUCTOS

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Análisis de agentes tireostátiws en productos cárnicos
69
ANALISIS DE AGENTES TIREOSTATICOS
EN PRODUCTOS CARNICOS
Departamento de Bromatología, Toxicología y Análisis Químico -4plicado.
Facultad de Farmacia Universidad de Barcelona
RESUM
Es fa una revisió bibliogrAfica sobre que utilitza una CCF per a la detecció
la utilització del Metiltiouracil (MTU) final, en l'anhlisi de 36 mostres de tiroicom a finalitzador, de les seves implica- des procedents de bestiar' boví i porcí.
cions i de les diferents tkcniques per a
la seva detecció. Se n'aplica una, proParauies ciau: Metiltiouracil, an8isi.
posada per De Brabander i Verbeke,
SUMMARY
After a bibliographical review about
the employ and problems of the methyltiouracile (MTU) as meat fmalizer and
its usual analytical procedures, it has
ben applied the proposed method by
De Brabander and Verbeke, which uses
the TLC for the final detection. It has
been analyzed 36 samples of bovine
and swine thyroids.
Key words: Methyltiouracile, detection of.
A R X l U S d e I'Esc. d ' A g r i c de Barcelona
70
INTRODUCCION
Durante el año 1980, los medios de
información se hicieron eco de la problemática del empleo de finalizadores
en la alimentación del ganado vacuno
y su presencia en los derivados cámicos
Se presentaba un problema con
doble vertiente. En primer lugar, su
presencia en alimentos significaba un
peligro para la salud pública (especialmente los estrógenos de síntesis) (1 ).
Por otra parte, y para el caso concreto
de los agentes tireoestáticos, es indudable que la utilización de los mismos supone un fraude para el consumidor, ya
que la ganancia de peso obtenida en
reses y añojos no es debida a un aument o en la producción de carne sino que
tiene su origen en una retención hídnca (2). Esto se traduce, en la mayoría
de los casos, en un sobrepeso de un
10-15 % aproximadamente (1 ).
El empleo de antitiroideos en la alimentación animal es relativamente reciente. El descubrimiento de los tiouracilos sintéticos se debe a Kennedy
(1942) (3). Este autor observó en estos
compuestos propiedades bociógenas.
Posteriormente, en 1948, Venero obtuvo resultados positivos en la ganancia
de peso en cerdos alimentados con dietas que contenían tiouracilos (4). Anteriormente, ya se conocía el hecho de
que algunas plantas utilizadas en la alimentación del ganado tenían propiedades antitiroideas; este es el caso de ciertas cruciferas como el trébol blanco,
coles, nabos, algunas gramíneas, etc.(5).
Esto dio pie al uso masivo de este tipo
de sustancias para completar la última
fase del cebo, ya que según algunos au-
tores, además de los efectos positivos
sobre la ganancia de peso, se observaba
una mejora en el índice de conversión
del pienso (1).
El Metiltiouracilo (MTU) se ha hecho
muy popular en el mundo ganadero
durante la última época, dado que su
uso como finalizador ha ido reportando
amplios beneficios, es un producto relativamente barato, de fácil administración
y de resultados rápidos (40 dias) (1).
Este agente actúa a nivel glandular
inhibiendo la formación de hormonas
tiorideas (figura 3), provocando, com o consecuencia, un estado hipotiroideo en el animal, con una hipertrofia e
hiperplasia glandular o bocio. Dato
particularmente interesante, pues ya el
tamaño y el peso de la tiroides son
orientativossobre el posible tratamiento
del animal con las citadas sustancias (figuras 1 y 2).
Otros efectos paralelos se traducen
en una retención hídrica en el tramo
gastrointestinal y en el tejido conectivo.
Hay un descenso del metaboIismo basa1
y un aumento en el contenido de grasas.
Asimismo, al inicio del tratamiento se
observa una cierta acción anabolizante.
Otra ventaja aparente que ofrecía el
uso de tireostáticos era el de producir
carnes más blancas.
Frente a estas ventajas económicas
para el ganadero, ya sea a nivel cualitativo o cuantitativo, surgían una serie de
riesgos, especialmente el peligro de
sobredosificación o bien por prolongación del tratamiento. Así, por ejemplo,
se producían una serie de trastornos
relacionados con la retención hídnca,
1
Análisis de agentes tireostáticos en p r o d u c t o s cárnicos
FIGURA 1 - Muestra núm. 36. Tiroides de peso normal.
Animal no tratado.
FIGURA 2 - Muestra núm. 32. Hipertrofia tiroidea.
Animal tratado con MTU.
71
72
que originaban un encharcamiento general, localizándose edemas subcutáneos duros, principalmente en el bajo
vientre y en las extremidades. Hay pérdida de apetito, anemia, timpanizaciones, pudiendo incluso provocar la muerte del animal (6).
Estos agentes se metabolizan parcialmente formando el glucurónido correspondiente (del cual n o se conoce bien
la estructura) y se excreta junto con la
fracción de droga libre por la orina y
por la bilis. Estos procesos son muy
rápidos, y por esto, desde el punto de
vista sanitario, su utilización n o constituye un riesgo elevado para la salud del
consumidor, ya que los residuos hallados en carnes son insignificantes (7).
En cuanto al posible riesgo carcinogenético, aunque Doniach (8) y Christov (9) realizaron distintos estudios experimetales con antitiroideos, Vaderhaan y Sonie no encontraron pruebas
concluyentes que demuestren un efecto
cancerígeno directo en el hombre, aún
recibiendo los individuos tratados dosis
terapéuticas de tireostático (1 0).
Por otra parte, un problema adicional que se podría presentar es el de que
las carnes hidrohémicas (con un contenido de agua mayor de lo normal) sean
más suceptibles de una contaminación
bacteriana, con los consiguientes pe rjuicios que de ello deriven (1 1).
Así, pues, parece ser que, por el m o
mento, la utilización de los citados
tireostáticos no supone u n elevado
riesgo sanitario, sino más bien un hecho
fraudulento para el consumidor.
La legislación internacional no ha
permanecido impasible, y en sus diferentes años se ha ido prohibiendo su
A R X l U S de I ' E x . d'Agric. de Barcelona
empleo como promotor del engorde de
animales de abasto.
En España, la n ~ r m a t i v asobre finalizadores data ya del año 1963, en que se
prohibió el uso de estrógenos de síntesis en el engorde de pollos. Sin embargo
estaba permitido su uso junto con el de
los antitiroideos en otros animales (6).
En 1975, a instancias del Ministerio
de Gobernación, el Ministerio de Agricultura adoptó medidas más concretas.
con la promulgación de un Decreto, el
20 de marzo, en el que se establecía
una lista positiva de aditivos que se
podían emplear en la alimentación
animal. Ni el Dietilestilbestrol (DES)
(estrógeno de síntesis) ni los antitiroideos quedaban incluídos (1 1 y 12).
En 1977, el Ministerio de Agricultura
reforzó esta legislación con dos nuevas
resoluciones: una para estrógenos de
síntesis y otra para tireoestáticos. Sólo
quedaban autorizados aquellos productos destinados estrictamente a uso veterinario, para combatir enfermedades
y trastornos.
Todo esto quedó recopilado en la
Resolución de la Dirección General de
Producción Agraria del 3 de marzo,
publicada en el B.O.E. del 12 de marzo (1 3).
Con el objeto de unificar criterios
en el cumplimiento de la citada normativa, se publicó una Circular dependiente del Ministerio de Sanidad y Seguridad Social, Subsecretaría de la Salud,
en julio de 1979. En ella se regulan la
colocación de avisos, toma y conservación de muestras, peso límite de las
glándulas y levantamiento de actas, entre otros temas (14).
l
I
!
l
Analisis d e agentes tireonáticos en productos cárnicos
73
Como base de la legislación europea, Diario Oficial una Directiva prohibíenhemos tomado la normativa del C.E.E. do el uso de sustancias con carácter
que, en julio de 198 1, publicó en su hormonal y tiroestático ( 15).
loduro
por tiroides
Peroxidasa
lodo libre
,
Bloqueado por
N?
I
NH2
+
a entima
m i n t o
HoH~cH2~co{~+H;QcH2-;-co$
H
1
L
--
Monoiodotirosina
L- Düodotirosina
H
n6
1
NH2
, H o 0 o o H 2 - c - c o
t
1
i
'
o
E
1
I
L
Trüodotirosina (T3)
tiouracilos
1
NH2
1
I
I
[email protected]{n
1
NHz
+ H 4 3 H 2 - ; - - $
H
L -- Diiodotirosina
1
1
enzima
1
NH2
l
[email protected]@cH2--co$
H
1
L - Diiodotirosina
1
H
L - Tiroxina (Te)
FIGURA 3 - Mecanismo de acción del metil-tiouracilo.
PARTE EXPERIMENTAL
El interés práctico de este trabajo
radica, precisamente, en la necesidad de
disponer lo más rápido posible de un
resultado cualitativo. Por ello, .hasta
cierto punto, puede sacrificarse la precisión del mismo con el fin de ganar en
rapidez y sencillez del método. En el
mismo sentido, hay que sefíalar qve la
aplicación de estas determinaciones
posee interés en el control de las reses
que llegan a los mataderos, y es aquí
donde deben practicarse, por lo que en
74
A R X I U S de I'Ecc. d'Agric. de Barcelona
la actualidad no puede pensarse en la
Es, precisamente, con estos criterios
aplicación de sofisticadas técnicas ins- que se han elegido y estudiado las sitrumentales para este tipo de control.
guientes técnicas:
1 .- TECNICAS CROMATOGRAFICAS
,,
Como eluyente se emplea
l . 1.- Metodo descrito por Saldaña, Cap cagel F,
y
Alonso
(
1
6)
una
mezcla
de cloroformo/metanol
bonell
(90: 10). La placa, una vez seca, se obSe basa en la visualización de 10s di- se,a bajo luz ultravioleta a 254 nm y
ferentes tiouracilos (2-tiouraciio, 4-me- aparecen l q i manchas
til-2-tiouracil0 y el 4-propd-2-tiouraci- a los tiourac;13s. Para visualizar las manlo), previa separación por cromatografía chas de modo permanente, puede pulen capa fina, revelando con el reactivo verizarse con la placa una solución de
dicloroquinona-clorimida O bien utili- dicloroquinona-clo~mida en isopropazando luz UV a 254 nm.
no1 (0,4 % ), obteniendo una coloración
amarilla por formación de un comMétodo
plejo formado entre el reactivo y los
Se someten 25 g de tiroides tritura- tiOuracilos.
dos a un desengrasado en Soxhlet con Comentario
éter de petróleo durante unas 15 horas.
Es una técnica sencilla y asequible a
La muestra desengiasada se macera en
cualquier
laboratorio por escasos que
10 m1 de metanol, manteniéndose en
sean
sus
medios.
agitación durante 20 minutos, se filtra
Como inconvenientes principales cay se evapora la fase metazólica a sequebria
señalar, en primer lugar, la duradad en rotavapor a 4 0 C. El residuo
ción
del proceso, puesto que el desenseco se recoge en 3 0 m1 de una mezcla.
grasado
de la muestra requiere un míde cloroformo/metanol ( 1: 1).
nimo
de
15 horas. Por otra parte, en las
La purificación se realiza por cromaextracciones
se producen pérdidas notatografía en columna de óxido de alumibles,
lo
cual,
junto con la presencia de
nio (grado de actividad 1) eluyendo con
numerosas
impurezas
en el extracto
mezclas de polaridad creciente. Se desfinal,
hace
que
la
detección
cromátoprecian los 8 primeros milílitros, y los
gráfica
sea
problemática.
restantes eluatos se evaporan a sequedad y se disuelven de nuevo en 25 m1
1.2.- Método descrito por De Brabande metanol.
der y Verbeke
La separación se lleva a cabo por cromatografía en capa fina, sembrando
Se basa en la separación de varios
cantidades de 5 p1 en una placa de sili- antitiroideos (tiouracilo y sus derivados
Análisis de agentes tireostáticus en productos cárnicos
metil, propil y fenil, junto con el metilmercAptoimidazo1) por cromatografía'
en capa fina. Previamente se obtiene un
complejo formado por el tiroestático Y
el 7-C1-Nitrobenzofurazano, que, una
vez revelado con cisteína en solución
alcohólica, da fluorescencia al UV a
366 nm. La identificación se realiza por
comparación de Rf con los patrones.
75
sin indicador de fluorescencia. La placa
se activa a 1 10°C, una hora, y se siembran porciones de 50 pl. El eluyente
empleado es una mezcla de clorofomo/
metanol (95:s). El revelador empleado
se compone de cisteína en soliición alcohólica, y bajo luz UV a 366 nm se
aprecia una coloración amarillo-verdosa
que ,permite una mejor visualización
de las manchas. El exceso d e reactivo
Método
avanza con el frente del disolvente.
El tiroestático se identifica por compaEn el procedimiento de extracción ración de Rf con el patrón.
hemos introducido algunas modificacioEsta técnica permite detectar connes que nos han permitido una mayor centraciones de 20 ppb, aunque los
comodidad en el trabajo.
autores señalan el límite de detección
Se maceran 20 g de muestra trituen 10 ppb.
rada con 100 m1 de metanol durante 20
minutos. Luego se centrifuga el extrac- Comentario
t o a 2.000 g durante 3 minutos. Pasar
aproximadamente la décima parte del
Es una técnica sencilla, aunque un
sobrenadante a un tubo de extracción y tanto laboriosa, pero dada la escasa
acidificar con 1 m1 de ácido clorhídrico complejidad del material utilizado per1N. La grasa se elimina por extraccio- mite analizar distintas muestras al misnes sucesivas con éter de petróleo y éter m o tiempo.
etílico para eliminar los lípidos más poPor 'otra parte, la obtención de un
lares.
derivado con un reactivo específico permite aumentar la sensibilidad del méLa purificación se realiza por co- todo.
lumna de resinas intercambiadoras de
Hemos estudiado una variante del
aniones DOWEX 50W-X8 eluyendo con mismo, aplicando la cromatografía 1ímetanol al 75 %.El extracto percolado quida de alta presión como método de
se concentra en rotavapor hasta 1 ml.
separación y cuan tificación. Para ello,
Luego se diluye con 5 m1 de solución unavez extraído el derivado en solución
reguladora de fosfatos (pH 8).
etérea, concentramos e inyectamos diLa obtención del derivado se realiza rectamente en el cromatógrafo bajo las
en baño de agua a 40°C durante 1 hora, siguientes condiciones:
añadiendo 0,l m1 del reactivo en solución
=
ODS-18
Columna
acetónica. Al finalizar, acidificar con
Fase
móvil
=
metan01
ácido clorhídrico y extraer el derivado
=
lml/min
Flujo
con éter etílico. Se concentra hasta 0 , s
Longitud
de
onda
Ó 0,2 m1 y proceder a cromatografiar en
del detector
= 278nm
capa fina. Se utilizan placas de silicagel
76
A R X I U S de I'Esc. d'Agric. de Barcelona
Esta variante permite, además, reali- tivo y cuantitativo.
zar de forma rápida un- análisis cualita
2.- TECNICA COLORIMETIUCA
2.1.- Método descrito por Van Waes (18) ridad creciente (clorofonno/metanol
a 1: 1, metanol, metanol al 75 % y por
Se basa en la determinación de metilmetanol).
tiouracilo por colorimetría, previa for~~~~~~~i~~los 8 primeros ml y evamación de un complejo coloreado con porar el extracto a sequedad.
la dicloroq~inona-clorimida que se lee
Para dez,trrollar la coloración se redien es~ectrofotómetroa 435 nm- (Gra- suelve el extracto seco en 21 m1 de solufic 1)
ción reguladora pH 7,6, se añade un m1
Método
de solución de dicloroquinona-clorimida, se agita y se deja reposar durante
Se maceran 20 g de muestra triturada 20 minutos.
en 10 m1 de metanol, agitando mecániEl complejo coloreado se extrae con
camente durante 30 minutos.
cloroformo y se procede a la lectura
Una vez filtrado, se concentra el bajo la luz UV a 435 nm. Los resultasobrenadante hasta tener un volumen dos pueden cuantificarse estableciendo
final de 25 ml. El concentrado se tras- previamente una curva de calibrado con
lada a un embudo de decantación y se concentraciones conocidas de patrón.
añaden 25 m1 de agua y 6 0 m1 de éter
etílico. Una vez separadas las fases, se Comentario
lava la capa etérea con 12,5 m1 de agua,
se recogen junto con la fracción acuosa
Es una técnica relativamente sencilla
anterior y se evaporan a sequedad.
y posiblemente más rápida que la anteEl residuo seco se redisuelve en 30 m1 rior. Ofrece buena recuperación y su
de una mezcla de~cloroformo/metanol sensibilidad, si bien n o es tan elevada, es
(1: 1).
aceptable para este tipo de determinaLa purificación se realiza percolando ciones. Sin embargo, presenta, a nuesla solución obtenida por una columna tro juicio, el problema de la presencia
de óxido de aluminio (grado de activi- de posibles interferencias al efectuar la
dad I), utilizando disolventes de pola- lectura en el colorímetro.
Análisis de agentes tireostáticos en productos cárnicos
77
CRAFICA 1 - Espectro al visible de soluciones de MTU de concentraciones
0,02;0,04 y 0,06 mg/ml(l8)
RESULTADOS
Los resultados analíticos han sido
obtenidos segíin el método cromatográfico en capa fina descrito por Brabander
y Verbeke (17), pues, a nuestro juicio,
ofrece ventajas en relación con los otros
métodos estudiados.
Las muestras analizadas corresponden a tiroides de bóvidos procedentes
del Matadero de Mercabarna y tiroides
de cerdo suministrados por el Servei
d'Higiene Alimentaha de la Consellena
de Sanitat i Seguretat Social de la Gene-
78
A R X I U S de I'Ecc. d'Agric de Barcelona
ralitat de Catalunya
Hemos de destacar que en el caso de
tiroides de terneros (animales en los
que el fraude se hace más evidente) la
mayoría de las muestras eran escogidas
entre las que sobrepasaban los 70 g de
peso (límite establecido por la legislación española para una tiroides normal
de bóvidos) (8) (Figuras 1 y 2).
Las glándulas se recibieron y conser-
varon congeladas hasta el mismo momento del análisis, ya que, de no ser
así, se habría producido una merma
considerable en la concentración de
tireostático debido a su rápido metabolismo.
A continuación exponemos detalladamente los resultados obtenidos para
cada tipo de muestra en las Tablas 1 y II.
TIROIDES DE TERNERA
Muestra núm.
Peso (g)
Fecha
Lectura
Agente
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1O
11
12
13
24
31
32
33
34
35
36
60
67
168
175
134
119
157
214
148
177
162
190
182
3 20
179
370
258
110
146
59
3-3-81
11-3-81
16-3-81
18-3-81
18-3-81
23-3-81
26-3-81
2-4-8 1
6-4-8 1
6-4-8 1
6-4-8 1
28-4-81
28-4-81
19-5-81
16-6-8 1
16-6-81
25-6-81
18-9-81
20-9-81
25-1-82
-
---
TABLA 1
T
+
+
+
+
+
t
-
'
MTU
MTU
MTU
MTU
MTU
MTU
MTU
--
-
--
+
+
+
+
+
+
+
+
MTU
MTU
MTU
MTU
MTU
MTU
MTU
MTU
-
--
79
Análisis de agentes tireostáticos en productos carnicos
TIROIDES D E CERDO
1
Muestra núm.
15
16
17
18
19
20
21
22
23
25
26
27
28
29
3O
Fecha
peso (g)
4-5-8 1
4-5-81
4-5-8 1
12-5-81
12-5-8 1
12-5-8 1
12-5-81
19-5-8 1
19-5-81
25-5-8 1
28-5-81
3-6-8 1
3-6-81
3-6-8 1
3-6-8 1
40
46
44
41
40
38
43
39
32
41
35
43
37
60
29
Lectura
Agente
+
+
+
Dudoso
Dudoso
Dudoso
-
---
t
MTU
-
---
-
-
--
-
-----
+
MTU
-
-
--
TABLA 11'
COMENTARIOS
1.- De la revisión bibliográfica realizada, se deduce que el uso de antitiroideos como agentes finalizadores en el
engorde del ganado vacuno y porcino,
si bien no supone un elevado riesgo
para la salud -debido a los bajos niveles residuales hallados- es evidente que
representan un peligro potencial, y en
cualquier caso un fraude para el consumidor. Precisamente, por estos motivos,
está prohibida su utilización.
ventajas es la propuesta por De Brabander y Verbeke, debido a su sencillez,
buena recuperación, sensibilidad y a
que no precisa un instrumental complejo, ya que una simple cromatografía en
capa fina es capaz de detectar concentraciones del orden de 20 ppb (referidas
a tiroides).
3.- En los resultados obtenidos hemos conseguido una buena correlación
entre el peso del tiroides y la presencia
2.- Por lo que a las técnicas analíti- de agente tireostático. Si bien algunas
cas se refiere, la que presenta mayores muestras, glándulas de peso elevado,
A R X I U S de I'Esc. d'Agric. de Barcelona
80
han dado u n resultado negativo debido
al rápido metabolismo de estas sustancias.
4.- La frecuencia de positivos es
considerable, aunque, lógicamente, n o
es representativa de la situación real, ya
que se tomaron muestras sospechosas
en la mayoría de los casos.
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