Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.

Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.
OBJETIVOS
Aplicar adecuadamente la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para la
detección del género Salmonella.
Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Salmonella
en alimentos.
GENERALIDADES
Al inicio del siglo XIX, patólogos clínicos en Francia documentaron la asociación de la
ulceración intestinal humana con un agente contagioso; la enfermedad fue denominada
como fiebre tifoidea y posteriormente investigadores Europeos aislaron y caracterizaron
al bacilo tifoideo responsable de ésta, mientras que en los Estados Unidos, Salmon y
Smith en 1885, aislaron de carne de puerco a Bacillus cholerae-suis, ahora conocido
como Salmonella enterica serovar Cholaraesius.
Salmonella spp. es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la
familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este género son capaces de
moverse por medio de flagelos perítricos, existen variantes no móviles, S. enterica
serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, así como cepas no móviles debido a
la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de
Salmonella son
quimioorganótrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vías fermentativa
y respiratoria. Las bacterias crecen óptimamente a 37°C y pueden catabolizar la Dglucosa y otros carbohidratos con producción de ácido y gas. Estos microorganismos
son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única fuente de
carbono, generalmente producen ácido sulfhídrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y
no hidrolizan la urea. La mayoría de estas características se utilizan para la
identificación bioquímica de cepas aisladas de Salmonella.
De acuerdo con la definición contemporánea, una cepa de Salmonella típica produce
ácido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azúcares, pero no es capaz de
utilizar lactosa y sacarosa en éste medio, o en medios sólidos selectivos tales como
verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entérico de Hektöen. Las especies típicas
de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rápida reacción alcalina por la
descarboxilación de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad genética observada
en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenérico de
plásmidos lo cual ha reducido los biotipos típicos de Salmonella. En muestras clínicas y
de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la
lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rápidamente en
KCN. Esta situación ha llevado a reevaluar el esquema de identificación del género, e
incluso a utilizar tecnologías moleculares para establecer loci genéticos y/o productos
únicos para el género Salmonella.
La identificación bioquímica de Salmonella se realiza generalmente junto con una
confirmación serológica. Esta técnica laboriosa implica la aglutinación de los antígenos
superficiales bacterianos con anticuerpos específicos para el género. Estos incluyen los
lipopolisacáridos (LPS) somáticos (O) en la superficie externa de la membrana externa,
los antígenos asociados con los flagelos perítricos (H) y el antígeno capsular (Vi), este
último presente solamente en Salmonella serovar Typhi, Paratyphi C y Dublín.
La amplia distribución de Salmonella spp. en el medio ambiente, aunada a las prácticas
agrícolas utilizadas en la industria cárnica, pesquera, de moluscos, láctea y el reciclaje
de la materia prima como alimento para ganado, ha favorecido la continua permanencia
de este patógeno humano en la cadena alimenticia. El sector avícola se sitúa como la
principal fuente de Salmonella spp. y enmascara la importancia como vehículos de
infección de las carnes de puerco, de res, de cordero, leche y sus derivados.
Las frutas y verduras han ganado notoriedad en años recientes como fuentes de
salmonelosis humana. Esto se presenta como una consecuencia de diversos factores
como: la fertilización de sembradíos con lodos sin tratamiento o efluentes de drenajes
potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a antibióticos, la irrigación
de los campos y el lavado de frutas y verduras con aguas contaminadas, la
manipulación excesiva por los trabajadores, la exposición a la contaminación ambiental
de especies y condimentos durante el secado y la resistencia del microorganismo a
valores de pH bajos.
El desarrollo incompleto del sistema inmune en recién nacidos e infantes, el abatimiento
en la respuesta inmunológica en individuos de la tercera edad, y la baja producción de
ácidos gástricos en estos sectores de la población facilita la colonización intestinal y
distribución sistémica del microorganismo. Se ha demostrado que la ingesta de
solamente algunas células de Salmonella pueden ser infecciosas. La dosis infectiva en
humanos fluctúa entre 1 a 10 células.
La composición química del alimento es otro factor determinante en la salmonelosis
además de la heterogeneidad inmunológica en la población humana y la virulencia de
las cepas infectivas. Un denominador común de los alimentos involucrados, es la
presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la
carne. Se ha sugerido que las células de Salmonella englobadas en las micelas
lipídicas pueden resistir el efecto lítico de los ácidos gástricos.
Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones
clínicas, incluyendo fiebre entérica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistémicas por
microorganismos no tifoides. La fiebre entérica es una infección grave asociada con las
cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales están particularmente bien adaptadas para
invadir y sobrevivir en los tejidos del huésped. Las manifestaciones clínicas de la fiebre
entérica aparecen después de un periodo de incubación de 7 a 28 días y pueden incluir
diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de
cabeza, y debilitamiento. El diagnóstico de la enfermedad radica en la detección del
agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la
sintomatología clínica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o
trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infección sistémica. En países
subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibióticos ha
originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad
cuando se presenta un brote de este tipo.
La infección en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, ésta
aparece de 8 a 72 h después de tener contacto con el patógeno invasivo. La condición
clínica es auto limitante y la evacuación de heces típicas diarreicas no sanguinolentas y
dolor abdominal se presentan a los 5 días. El tratamiento solo implica reemplazo de
fluidos o electrolitos. El uso de antibióticos está contraindicado ya que prolonga la
sobrevivencia y la excreción intermitente del microorganismo.
Este microorganismo se identificó originalmente en hospitales y laboratorios clínicos y
los métodos empleados para su detección, se adaptaron posteriormente al análisis de
alimentos. Las modificaciones a los métodos, consideraron dos aspectos principales, el
primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes, debido al
proceso al que se somete el alimento (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y
segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.
Para diferentes tipos de alimentos, existen distintos protocolos para el aislamiento de
Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas
de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos
selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica de los
microorganismos.
FUNDAMENTO
La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un
esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio
nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas,
logrando de esta manera una condición fisiológica estable.
Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte
dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por
otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.
Selección en medios sólidos, este punto se deriva directamente del anterior y se
utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes
a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico de colonias
sospechosas.
Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los
cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.
Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la
identificación específica de un microorganismo.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
NOTA
Los medios de cultivo que a continuación se presentan son los utilizados en el
procedimiento general. Para los medios de cultivo utilizados durante
preenriquecimientos específicos consultar las modificaciones en el inciso 1.0.
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad, conteniendo 225.0 mL de caldo
lactosado a.
1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo selenito-cistina b.
1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo tetrationato b.
1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo VassiliadisRappaport b.
1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) c.
1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar bilis verde brillante (VB) c.
1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar entérico de Hektöen (HE) c.
1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar sulfito de bismuto (SB) c.
1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar para Salmonella y Shigella (SS) c.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm conteniendo 3.0 mL de agar hierro-triple azúcar
(TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e inclinado d.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar hierro-lisina (LIA) inclinado
d
.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea o caldo Surraco e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea rápido (puede
utilizarse en sustitución del caldo urea o Surraco) e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de medio sulfuro-indol-manitol (SIM)
e
.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar citrato de Simmons inclinado
e
.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo manitol e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo malonato e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo rojo de metilo-Voges
Proskauer (RM-VP) e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 5.0 mL de caldo soya tripticaseína e.
2 cajas de Petri con 20.0 mL de agar infusión cerebro corazón e.
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
1 frasco gotero con solución salina isotónica estéril d.
1 frasco gotero con solución de verde brillante al 0.1% b
1 frasco gotero con solución yodo yoduro de potasio b
1 frasco gotero con solución salina formalizada e.
1 frasco gotero con reactivo de Kovac’s f.
1 frasco gotero con solución de rojo de metilo r.
1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer N° 1 (VP1; solución
etanólica de alfa-naftol al 5% P/V) f.
1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer N° 2 (VP2; hidróxido de
potasio al 40% P/V) f.
Juego de colorantes para la tinción de Gram d.
BIOLÓGICOS
Suero anti Salmonella “O” (somático) polivalente d.
Suero anti Salmonella “H” (flagelar) polivalente d.
Suero anti Salmonella “Vi” d.
MATERIAL Y EQUIPO
Balanza granataria a.
1 caja de Petri de vidrio estéril a.
1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estéril a.
Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas, cuchillos,
tenedores, estériles a.
Stomacher o motor para licuadora a.
Pipetas de vidrio de 1 mL, estériles con filtro de algodón b.
Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d, e, f
Asa microbiológica c, d, e.
Mecheros de Bunsen a, b, c, d, e.
Portaobjetos d.
Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón d, e.
Microscopio óptico d, e.
Incubadora a 35°C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1°C
a, b, c, d, e
.
Incubadora a 42°C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1°C
b
.
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
f
Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
DETERMINACIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS
Incubar 18- 24
h a 37°C
Pesar 25 g de muestra en
condiciones de asepsia
Siembra
con
asa
bacteriológica en caldo
tetrationato o Vassiliadis
y Caldo Selenito cistina
Homogeneizar con 225 mL
de solución diluyente
según el tipo de muestra
Incubar 18- 24
h a 37°C
Incubar 18- 24
h a 37°C
Aislamiento en medios selectivos y
diferenciales (XLD, SS. Hecktoen, VB,
Sulfito bismuto)
Incubar 18- 24
h a 37°C
Búsqueda de colonias
típicas.
Consultar
cuadro 1
Resultados característicos
Realizar
bioquímicas
presuntivas Kligler y
LIA
Confirmación
serológica
Resultados
positivos para
Salmonella
Incubar 18- 24
h a 37°C
Siembra
de
bioquímicas
complementarias: malonato
citrato, RM-VP, urea, SIM,
manitol
PROCEDIMIENTO
El siguiente método se basa en el análisis de 25.0 g de la muestra, que se
considera como una unidad analítica, en una proporción de 1:9 de muestra/caldo.
Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción de
1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mínima muestra recomendada es de
25.0 g, es decir, una unidad analítica. Para algunos casos donde el riesgo es
mayor, se utilizan dos unidades analíticas (50.0 g) o más.
1. Preenriquecimiento.
1.1. Procedimiento general para la preparación de muestras
NOTA IMPORTANTE
El presente procedimiento se basa en la técnica general para la detección de
Salmonella en alimentos. Sin embargo, deben consultarse los siguientes
incisos para realizar las modificaciones pertinentes al preenriquecimiento
dependiendo del alimento a analizar, los cuales se presentan en el
complemento de la presente práctica.
1. Pesar en una bolsa de Stomacher estéril, en área aséptica 25.0 g de muestra a
analizar.
2. Verter 225.0 mL de caldo lactosado estéril en la bolsa.
3. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a velocidad media
en el Stomacher.
4. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de
boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura
ambiente con la tapa perfectamente cerrada.
5. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH.
6. Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles.
7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz
8. Incubar la muestra homogénea a 35 2 C durante 24 h.
2. Enriquecimiento selectivo.
1. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de
preenriquecimiento y agitar suavemente.
2. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de
1 mL, estéril) a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de
enriquecimiento:
Caldo tetrationato (antes de su uso, deberá activarse añadiendo al medio
base 0.2 mL de solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solución de
verde brillante al 0.1 %)
Caldo selenito cistina
Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitución del caldo tetrationato)
3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o
caldo Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente
contaminados deberán incubarse los medios de enriquecimiento a 42°C por el
mismo periodo
3. Aislamiento diferencial.
NOTA
La metodología descrita en esta sección deberá realizarse para cada uno de los
caldos de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los cultivos
desarrollados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo VassiliadisRappaport.
1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado.
2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiológica estéril y sembrar
en estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los
siguientes medios selectivos:
a) Agar XLD
b) Agar VB
c) Agar HK
d) Agar SB
e) Agar SS
f) Agar Mac Conkey
3. Incubar las cajas ya sembradas en posición invertida a 35 2 C durante 24 2 h.
4. Observar las características macroscópicas de las colonias en los medios
sólidos selectivos.
5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de
acuerdo con las características específicas de desarrollo en cada uno de los
medios (Consultar el Cuadro 1).
6. Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C, las placas con medios selectivos por si
es necesario tomar más colonias.
7. Realizar una tinción de Gram a las colonias sospechosas.
8. Registrar las características morfológicas tanto macroscópicas como
microscópicas; anotando la forma de la colonia, su color, color del medio
circundante, morfología al Gram, etc.
9. Realizar una purificación de las colonias seleccionadas, sembrando
nuevamente en estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri
conteniendo un medio idéntico del que se tomó la colonia.
4.
Pruebas bioquímicas preliminares
NOTA
Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analítica (25.0 g).
Seleccionar colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
4.1. Agar triple azúcar hierro o agar Kligler hierro
1. Registrar las características del medio TSI o KIA antes de la inoculación (color
del medio).
2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa
bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con
agar triple azúcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA) inclinado.
3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h.
4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretación de los resultados.
4.2. Agar lisina hierro.
1. Hacer la misma operación que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la
asada de la misma colonia con la que se sembró en estos medios, pero
sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA).
2. La interpretación de resultados puede ser consultada en el Cuadro 2.
3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de
Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para realizar las pruebas
bioquímicas complementarias.
4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de Salmonella pero
que presentan reacciones en LIA típicos deben trabajarse como cultivos
presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S.
arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa.
Descartar solamente los cultivos que muestre reacciones atípicas en ambos
medios.
5. Pruebas bioquímicas complementarias
5.1. Caldo urea (convencional)
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o
LIA e inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos
que den la prueba negativa.
5.2. Caldo urea (rápida)
1. Con asa bacteriológica estéril, tomar dos asadas de crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular
tubos de caldo urea (rápida).
2. Incubar a 37 0.5 C durante 2 h en baño de agua.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos
que den la prueba negativa.
5.3. Agar citrato de Simmons
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o
LIA e inocular por estría en el tubo con agar citrato de Simmons.
2. Incubar a 35 2 C durante 96 2 h.
3. Interpretar los resultados (Consultar Cuadro 2).
5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular por punción vertical en el tubo con medio de SIM.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 h.
3. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que
presente crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovac’s.
4. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular el tubo con caldo RM-VP.
5.5.1. Prueba de Voges-Proskauer (VP)
1. Para la prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 2 C durante 48 2 h.
2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estéril un mililitro de cultivo.
3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanólico al 5
%), agitar y agregar 0.2 mL del reactivo VP2 (hidróxido de potasio al 40%).
4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).
5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto que
la reacción se lleve a cabo en presencia de oxígeno.
6. Interpretar los resultados después de 2 h. de incubación a temperatura
ambiente (Consultar Cuadro 2).
5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo
1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del medio
RMVP durante 48 h más (96 h. de incubación en total a partir de la inoculación
del medio RMVP).
2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de rojo de
metilo.
3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar Cuadro 2).
5.6. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S. arizonae)
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA
e inocularlo en el tubo que contiene caldo malonato.
2. Incubar a 35 2 C durante 40 2 h.
3. Interpretar los resultados después de incubar (Consultar Cuadro 2).
5.7. Caldo manitol
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular en el tubo que contiene caldo manitol.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
NOTA
Las pruebas bioquímicas se pueden interpretar en el Cuadro 2, sin embargo se
sugiere que se consulten otras referencias, además de las ya expresadas aquí,
con el fin de determinar la especie del género en cuestión, esto quiere decir que
no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero sí
puede encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar.
En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioquímicas más generales
de Salmonella.
6. Identificación serológica.
6.1. Investigación de los antígenos somáticos de Salmonella (suero anti
Salmonella “O” polivalente).
1. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina
estéril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa
para aglutinación.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en
TSI/KIA o LIA.
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella “O” polivalente y
mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un
minuto.
5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.
6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretación de los resultados.
NOTAS
La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Salmonella “O”
polivalente se considerará como el control negativo para poder interpretar el
resultado.
Cuando la aglutinación es positiva con el suero anti Salmonella “O” polivalente,
puede determinarse el subgrupo empleando sueros inmunes para los
diferentes subgrupos (los mas frecuentes son B, C, D y E).
Si la aglutinación con el suero anti Salmonella “O” polivalente es negativa,
utilizar el suero anti Salmonella “Vi” polivalente y efectuar la prueba en las
mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinación con “Vi” calentar a
ebullición y repetir nuevamente la prueba con el suero anti Salmonella “O”
polivalente.
6.2. Investigación de los antígenos flagelares de Salmonella (suero anti
Salmonella “H” polivalente) .
1. Para ensayo el antígeno flagelar en el mismo día, inocular el crecimiento del
cultivo de TSI/KIA o LIA en agar infusión cerebro corazón (BHI).
2. Incubar a 35°C durante 4 a 6 h.
3. Para ensayo del antígeno flagelar al día siguiente inocular una asada del
cultivo desarrollado en el tubo de TSI o KIA, en un tubo de 13 x 100 mm
conteniendo 5.0 mL de caldo soya tripticaseína.
4. Incubar a 35 2 C durante 24 h.
5. Adicionar al cultivo (ya sea de agar infusión cerebro corazón o caldo soya
tripticaseína), 2.5 mL de solución salina formalizada.
6. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar “H” polivalente en un tubo de ensayo para
serología (12 x 75 mm).
7. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 5 de este
inciso).
8. Preparar un control de solución salina mezclando 0.5 mL de solución salina
formalizada con 0.5 mL del antígeno formalizado.
9. Incubar las mezclas en baño de agua a una temperatura entre 48 y 50 C.
10. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora.
11. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la muestra de
prueba pero no en el control.
12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las
mezclas muestre aglutinación.
13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
14. La interpretación de los resultados se puede observar en el Cuadro 3.
CUADRO 1. Colonias típicas de Salmonella spp. en medios sólidos
selectivos.
MEDIO SELECTIVO
Color antes de la
Características
inoculación
coloniales de
Salmonella spp.
Agar Verde Brillante
Oscuro, color marrón
Rosas o rojas pueden ser
(VB)
transparentes, rodeadas
de medio enrojecido. Las
bacterias fermentadoras
de lactosa son amarillas
Agar Sulfito Bismuto
Opaco, verde pálido
Café, grises o negras; con
(SB)
o sin brillo metálico.
Algunas veces presencia
de halo café o negro.
Agar Xilosa Lisina
Claro, color rojo brillante
Rosas o rojas pueden ser
Desoxicolato (XLD)
transparentes, con o sin
centro negro. En algunos
casos
completamente
negras
Agar para Salmonella y Claro, color rosa
Translúcidas en ocasiones
Shigella (SS)
opacas. Algunas con
centro negro. Las colonias
fermentadoras de lactosa
son rojas
Agar entérico Hektöen
Oscuro, color verde
Verdes o azul verdes con
o sin centro negro. En
algunos casos
completamente negras
CUADRO 2. Reacciones bioquímicas de Salmonella.
Medio
Kligler:
Fermentación
Glucosa
Kligler:
Fermentación
Lactosa
Kligler: Producción
de H2S
Agar LIA: Lisin
descarboxilasa
Agar LIA: H2S
Agar LIA:
Fermentación
Glucosa
Caldo Surraco:
Ureasa
Caldo Surraco:
Fermentación
sacarosa
Medio SIM:
Movilidad
Color después de
inocular/incubar
Fondo tubo amarillo
Crecimiento
c
Naranja
Pico de flauta naranja.
Crecimiento
+
Naranja
+
Púrpura tenue
+
Púrpura tenue
+
Púrpura tenue
Ennegrecimiento
Crecimiento
Púrpura intenso
Crecimiento
Ennegrecimiento
Crecimiento
Fondo tubo amarillo
Crecimiento
-
Rosa
mexicano
Rosa
Rosa-violeta
Crecimiento
Amarillo
Crecimiento
Amarillo tenue.
Semisólido,
translúcido
Crecimiento en
superficie y picadura,
turbiedad/difusión
fuera de picadura
Con reactivo Kovac’s:
Formación de anillo
rojo en superficie
Ennegrecimiento
Crecimiento
+
-
-
+
d
Medio SIM: Indol
-
Medio SIM: H2S
+
Caldo RMVP: Prueba
de rojo de metilo
Caldo RMVP: Prueba
Voges-Proskauer
Agar Citrato
Simmons
Caldo malonato
Caldo manitol rojo
fenol
Caldo dulcitol rojo
fenol
Caldo KCN
Caldo manitol rojo
fenol
Observación
microscópica
+
a
a
Color antes de
inocular/incubar
Naranja
Resultado
c
Verde
Rojo
Con indicador rojo de
metilo: Rojo
Con reactivos VP1 y
VP2: Anillo rojizo
Azul
Crecimiento
Azul
Amarillo
b
Rojo
Amarillo
Sin desarrollo
Rojo
Desarrollo
Amarillo
V
a+
+
+
Amarillo tenue.
Semisólido,
translúcido
Amarillo tenue.
Semisólido,
translúcido
Amarillo tenue,
translúcido
Amarillo tenue,
translúcido
Verde
+
Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados
+,90% o más positivos en 1 ó 2 días;- 90% o más negativos en 1 ó 2 días; v,
variable.
b
La mayoría de los cultivos de S. arizonae son negativos.
c
La mayoría de los cultivos de S. arizonae son positivos.
d
Excepto S. entérica serovar Pullorum y S. entérica serovar Gallinarum y cepas
con flagelos disfuncionales
CUADRO 3. Reacciones serológicas de Salmonella.
Reacciones bioquímicas Reacciones serológicas
Interpretación
Típica
Antígeno O, Vi o H
Cepas consideradas como
Salmonella
Positivo
Típica
Todas las reacciones
positivas
Puede ser Salmonella
Típica
No probada
Reacciones atípicas
Antígeno O, Vi o H
Positivo
Reacciones atípicas
Todas las reacciones
No debe ser considerada
Salmonella
negativas
RESULTADOS
1. Interpretación de resultados.
Consultar los resultados obtenidos en los cuadros para la identificación de los
géneros y especies de las bacterias investigadas.
2. Informe de resultados.
Reportar presencia o ausencia de Salmonella spp. o la especie identificada en
25.0 g o mL de alimento, o en la cantidad de muestra inicialmente pesada (mayor
a 25.0 g o mL).
COMPLEMENTO
Preenriquecimientos específicos en diversos grupos de
alimentos para la detección de Salmonella spp. (continúa de
inciso 1)
1.2. Preenriquecimiento para huevo en polvo, claras de huevo en polvo,
huevos líquidos pasteurizados y congelados, fórmulas infantiles y
mezclas preparadas en polvo como harinas para hot cakes, galletas,
donas, biquets y pan.
Si el alimento está congelado, no descongelar sino hasta el momento del
análisis.
Descongelar en un baño de agua a 45°C agitando continuamente en un lapso
de 15.0 min. aproximadamente, o bien se somete a una temperatura entre 2 y
5°C durante 18.0 h.
1.2.1. Productos líquidos
Realizar el preenriquecimiento como se indica en el procedimiento general
(inciso 1.1.)
1.2.2. Productos en polvo
1. Pesar 25.0 g de muestra y transferirla a una porción del caldo lactosado
(aproximadamente 15.0 mL), para permitir la humectación lenta del alimento.
2. Homogeneizar poco a poco con una varilla de vidrio estéril y agregar más caldo
lactosado hasta completar 225.0 mL
3. Continuar igual que el procedimiento general (inciso 1.1.)
1.3. Preenriquecimiento para productos no pasteurizados congelados de
huevo
1. Descongelar la muestra como se indica en 1.2.
2. Pesar asépticamente y por duplicado 25.0 g de muestra.
3. Colocar una de las muestras en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo
selenito cistina
4. Colocar la segunda muestra en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo
tetrationato, sin verde brillante.
5. Ajustar si es necesario el pH a 6.8 0.2 con hidróxido de sodio 1N o ácido
clorhídrico 1N.
6. Al matraz que contiene el caldo tetrationato, adicionarle 2.25 mL de verde
brillante al 0.1% y 4.5 mL de solución yodo-yoduro. Mezclar bien.
7. Incubar a 35°C durante 18 a 24 h, o en caso de tratarse de alimentos
fuertemente contaminados incubar a 42°C por el mismo periodo.
1.4. Productos que contienen huevo en su formulación: (pastas para sopa,
rollos chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamón, huevos, pollo, atún, pavo);
frutas frescas, congeladas o secas; crustáceos (camarones, cangrejos, jaibas,
langostinos, langostas) y pescado
1. Preferentemente no descongelar la muestra antes de su análisis, si esto es
necesario, proceder igual que en el inciso 1.2.
2. Pesar 25.0 g de muestra y adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estéril.
3. Licuar el alimento durante 2.0 min.
4. Transferir la mezcla homogeneizada en el matraz que contenía el medio de
preenriquecimiento.
5. Continuar con la incubación como se indica en el procedimiento general (inciso
1.1.)
1.5. Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada.
1. Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla
lentamente a un matraz Erlenmayer con 225.0 mL de solución verde brillante al
0.1%, procurando que el polvo quede en la superficie del líquido y se hidrate
suavemente.
2. Dejar la mezcla en reposo por 60 min.
3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)
1.6. Queso
1. Preenriquecer como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.),
utilizando solución amortiguadora de peptona como medio de cultivo.
1.7. Caseína
1. Seguir la metodología señalada en el procedimiento general (inciso 1.1.).
2. Licuar durante 2 min.
3. Ajustar cuidadosamente el pH a 6.8 0.2
1.8. Coco
1. Proceder como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), ajustar el pH
a 6.8 0.2.
2. Adicionar hasta un máximo de 2.25 mL de tergitol aniónico 7 estéril
(121 1°C/15 min.) y mezclar bien. También puede utilizarse tritón X-100 estéril.
Usar la cantidad necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mínimo
para que se inicie la formación de espuma. Puede ser para el tritón X-100 de
dos a tres gotas.
3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)
Levadura seca
1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando como medio de
preenriquecimiento caldo soya tripticaseína estéril.
2. Mezclar para formar una suspensión homogénea
3. Ajustar el pH a 6.8 0.2
4. Terminar el procedimiento como se indica en el inciso 1.1.
1.9.1. Levadura seca inactiva.
1. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2
1.9.2. Levadura seca activa
1. Mezclar la muestra incubada (inciso 1.9.)
2. Transferir 1.0 mL a cada tubo de 10.0 mL de caldo tetrationato (con 0.2 mL de
solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solución de verde brillante al
0.1%) y 10.0 mL de caldo lauril-triptosa.
3. Incubar los medios de enriquecimiento a 35°C por 24 h 2 h
1.10. Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos, sustancias de origen
animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso)
1.10.1. Productos procesados térmicamente y productos secos.
1.
2.
3.
4.
Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta la homogeneización.
Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse.
Después de reposar, mezclar bien y ajustar el pH a 6.8 0.2.
Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las similares
proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco (inciso 1.8.)
La cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del
alimento. Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en
polvo.
5. Incubar las muestras como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)
1.10.2. Productos crudos o altamente contaminados.
1. Pesar porciones de 25.0 g de producto por duplicado en dos vasos para
licuadora o en dos bolsas de Stomacher.
2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y pesar
directamente el producto en matraces Erlenmayer estériles de 500 mL.
3. Adicionar 225.0 mL de caldo selenito-cistina o 225.o mL de caldo tetrationato
(sin verde brillante) a cada muestra pesada.
4. Licuar por dos min. y pasar asépticamente a matraces Erlenmayer de 500 mL.
5. Dejar reposar y ajustar el pH a 6.8 0.2
6. Adicionar al caldo tetrationato, 2.25 mL de solución de verde brillante 0.1% y
4.5 mL de solución yodo-yoduro de potasio
7. Mezclar el matraz con los reactivos añadidos.
8. Incubar como se describe en el procedimiento general (inciso 1.1.).
9. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2. para
muestras en general.
1.11. Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate)
1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra en un vaso de licuadora o bolsa de
Stomacher, y agregar 225.0 mL de leche descremada reconstituida estéril.
2. Licuar por dos min.
3. Continuar igual que en el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta después de
ajustar el pH.
4. Adicionar 0.45 mL de la solución de verde brillante al 0.1% y mezclar bien.
5. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)
1.12. Especias
1.12.1. Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco,
romero, tomillo, chile en polvo, páprika o pimentón, ajonjolí, hojuelas de
vegetales (vegetales secos)
1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra y verter en un matraz Erlenmeyer con
tapón de rosca de 500 mL con 225.0 mL de caldo soya tripticaseína estéril y
mezclar bien.
2. Continuar con el procedimiento como en el inciso 1.1.
1.12.2. Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas
1. Pesar asépticamente 25.0 g de la muestra y verter en un recipiente de tapón
de rosca de 500 mL con 225.o mL de caldo soya tripticaseína estéril
adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien.
2. Continuar con el procedimiento general (inciso 1.1.)
1.12.3. Pimienta de Jamaica (Pimienta Inglesa), clavo de especia, canela y
orégano
1. No se conoce un método para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias.
Diluir por lo tanto más allá de su poder de toxicidad.
2. Examinar la pimienta, canela y orégano en una proporción 1:100
muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo.
3. Continuar con el procedimiento descrito en el inciso 1.12.1.
1.13. Gelatina
1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra en un recipiente de boca ancha y
tapón de rosca de 500 mL.
2. Adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estéril con 5.0 mL de solución acuosa
de gelatinasa al 5.0% y mezclar bien.
3. Dejar reposar 60 min.
4. Continuar como en el procedimiento general (inciso 1.1.)
BIBLIOGRAFÍA
Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios. “Método para
la determinación de Salmonella en alimentos”.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy
Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.
D’Aoust J., Maurer J. & Bailey J.S. (2001). Salmonella Species. In: Food
Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Doyle M., Beuchat L.R. & Montville
T.J. (Eds.) 2d. ed. ASM Press USA: 141-157.
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th
ed. Arlington, VA: AOAC.
Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001) “Salmonella”. In:
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 th ed.
Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington: 357-380.
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