Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas

Departamento de Microbiología
Facultad de Biología
Universidad de Barcelona
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Memoria presentada por Natalia Jiménez Blasco
para optar al grado de Doctora por la Universidad de Barcelona
Programa de Doctorado
Microbiología Ambiental y Biotecnología
Bienio: 2003-2005
VºBº del director
VºBº de la codirectora
La doctoranda
Dr. Juan Tomás Magaña
Dra. Susana Merino Montero
Natalia Jiménez Blasco
Barcelona, mayo 2008
1. INTRODUCCIÓN
Introducción
1.1 El género Aeromonas
1.1.1 Taxonomía
La familia Aeromonadaceae incluye el género Aeromonas que está constituido por
bacilos Gram negativos; oxidasa y catalasa positivos; quimiorganotrofos anaerobios
facultativos, capaces de fermentar tanto la glucosa como numerosos carbohidratos con
producción de ácidos y, frecuentemente, gas; reductores de nitratos a nitritos (aunque no
tienen actividad desnitrificante); y con una temperatura óptima de crecimiento de 22-28ºC.
La de las cepas psicrófilas se sitúa entre los 22-25ºC, aunque pueden crecer entre 5-35ºC, y
la de las cepas mesófilas es de 28ºC, pero pueden llegar a crecer entre 5-41ºC. Los
integrantes de este género son, en su mayoría, móviles por flagelación polar, a excepción
de A. salmonicida y A. media. Se diferencian de la mayoría de las especies del género
Vibrio porque son resistentes al agente vibriostático O/129 (2,4-diamino-6,7diisopropilpteridina) y son capaces de crecer sin NaCl o hasta con un 6% (Kirov, 1997). El
porcentaje de guanina-citosina del ADN del género oscila entre el 57 y el 63% (Popoff,
1984).
La taxonomía del género Aeromonas es compleja y ha experimentado cambios
continuos. En 1891, Sanarelli realizó lo que se considera la primera descripción de un
aislamiento de Aeromonas con el nombre de Bacillus hydrophilus fuscus, a partir de una
rana infectada. Posteriormente, varios autores describieron cepas similares aisladas de
diferentes animales y su nomenclatura fue cambiando progresivamente, hasta que, en 1936,
Kluyver y van Neil propusieron su asignación a un nuevo género, Aeromonas, nombre que
deriva de las palabras griegas aer, que significa aire o gas, y monas, que significa unidad,
es decir, unidades productoras de gas. Aunque durante muchos años fue clasificado dentro
de la familia Vibrionaceae, junto con los géneros Vibrio, Photobacterium y Plesiomonas,
investigaciones filogenéticas posteriores indicaron que debería formar parte de una familia
propia: Aeromonadaceae (Colwell et al., 1986). En la primera edición del Manual de
Bergey de Bacteriología Sistemática, el género se dividió en dos grupos principales: uno
constituido por las especies psicrófilas e inmóviles: A. salmonicida; y otro por las especies
mesófilas y móviles: A. hydrophila, A. caviae y A. sobria (Popoff, 1984).
Las primeras clasificaciones dentro del género se llevaron a cabo mediante
características fenotípicas, generándose las denominadas fenoespecies, en base a pruebas
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bioquímicas. No obstante, existe una gran dificultad en la identificación de las cepas de
Aeromonas a nivel de especie mediante características bioquímicas, debido a la
heterogeneidad fenotípica encontrada y al número creciente de especies reconocidas
(Abbott et al., 2003). Uno de los mayores logros en el proceso taxonómico fue la
introducción y validación de métodos genotípicos, estableciéndose grupos de hibridación
(HG) o genoespecies mediante pruebas de hibridación de ADN total. Las genoespecies se
han ido asociando a especies fenotípicas determinadas, aunque todavía quedan
genoespecies sin fenoespecie asociada y viceversa. Sin embargo, la identificación de
algunas especies seguía suponiendo un problema debido a que existían discrepancias entre
los grupos fenotípicos y genotípicos. Una herramienta útil para la clasificación de las cepas
del género Aeromonas fue el análisis de la secuencia del gen ribosomal 16S (MartínezMurcia et al., 1992). Posteriormente, se desarrolló un método, rápido y de relativo bajo
coste, basado en el análisis de los patrones RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) de los genes ADNr 16S amplificados por PCR (Figueras et al., 2000). Con
el fin de mejorar la clasificación de las especies y su identificación, se han desarrollado,
recientemente, estudios basados en el análisis de la secuencia de genes esenciales, entre los
que se encuentran el gen gyrB, que codifica la subunidad B de la ADN girasa, el gen rpoD,
que codifica el factor σ70 de la ARN polimerasa (Yáñez et al., 2003; Soler et al., 2004;
Saavedra et al., 2006), el gen rpoB, que codifica la subunidad β de la ARN polimerasa
(Küpfer et al., 2006), el gen dnaJ, que codifica la proteína de choque térmico 40 (Nhung et
al., 2007), y el gen que codifica la proteína RecA (Sepe et al., 2008). Estos genes logran
una mayor resolución interespecífica y son buenos marcadores moleculares para realizar
estudios filogenéticos en el género, ya que su tasa de sustitución nucleotídica es mayor que
la del gen ADNr 16S.
El género Aeromonas incluye en la actualidad 17 especies (entre paréntesis se indica
el grupo de hibridación del ADN), según la última edición del Manual de Bergey de
Bacteriología Sistemática (Martin-Carnahan y Joseph, 2005): A. hydrophila (HG1), A.
bestiarum (HG2), A. salmonicida (HG3), A. caviae (HG4), A. media (HG5), A.
eucrenophila (HG6), A. sobria (HG7), A. veronii (bv. sobria (HG8) y bv. veronii (HG10)),
A. jandaei (HG9), A. schubertii (HG12), A. trota (HG14), A. allosaccharophila (HG15), A.
encheleia (HG16) y A. popoffii (HG17) y los grupos de hibridación de ADN Aeromonas
sp. HG11 y Aeromonas sp. HG13 (Grupo Entérico 501) que permanecen sin tener asignado
un nombre de especie. Recientemente, se han descrito tres nuevas especies: A. culicicola
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Introducción
(Pidiyar et al., 2002), A. simiae (Harf-Monteil et al., 2004) y A. molluscorum (MiñanaGalbis et al., 2004). Otras especies, como A. ichtiosmia y A. enteropelogenes, actualmente
se consideran sinónimos de A. veronii y A. trota, respectivamente (Collins et al., 1993).
1.1.2 Hábitat
Las especies de Aeromonas ocupan una enorme diversidad de hábitats, aunque son
microorganismos considerados autóctonos del medio acuático. Se han aislado a partir de
aguas marinas, ríos, lagos, pantanos, sedimentos, aguas potables, tanto cloradas como no
cloradas, sistemas de distribución de aguas y aguas residuales, observándose un mayor
número en los meses cálidos. Algunos autores consideran que la presencia de Aeromonas
en el agua potable podría ser un indicador de la necesidad de optimizar el sistema de
tratamiento y potabilización del agua (Szewzyk et al., 2000).
Son microorganismos que también se han aislado de una gran variedad de alimentos
frescos, como carnes, pescados, mariscos o vegetales; o alimentos preparados, como
salsas, helados o productos de pastelería, cuya presencia ha sido atribuida al contacto del
alimento con agua contaminada (Merino et al., 1995). Potencialmente, podrían representar
un problema serio en alimentos, dado que muchas cepas pueden crecer a las temperaturas
de refrigeración (4-7ºC), en condiciones de pH de 4-10, bajo la mayoría de atmósferas
utilizadas para la preservación de alimentos y en presencia de una elevada concentración
de sal (Kirov, 1997).
1.1.3 Patogenia y epidemiología
El género Aeromonas comprende, predominantemente, patógenos de animales
poiquilotermos, incluyendo varias especies de peces, anfibios y reptiles, aunque también se
han asociado con infecciones en aves y mamíferos. Diversas especies del género son
consideradas agentes etiológicos de numerosas patologías en peces de interés en
acuicultura, causando infecciones que suponen significativas pérdidas económicas (Austin
et al., 1998). La especie psicrófila A. salmonicida se considera el principal agente causal de
furunculosis (formación de lesiones o forúnculos) en diferentes especies de peces, entre las
que se incluyen el salmón y la trucha, cultivadas en piscifactorías de zonas frías. La
furunculosis se caracteriza por producir letargo y múltiples hemorragias en aletas, ano y
músculo; y, a nivel interno, hemorragias en hígado y bazo, y necrosis en riñón (McCarthy,
1975). Por otro lado, A. hydrophila y A. jandaei son causantes de aeromoniasis en especies
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de peces cultivadas en zonas templadas, como la anguila, la carpa o el pez gato (Austin et
al., 1998). La aeromoniasis es una septicemia hemorrágica que se caracteriza por la
presencia de pequeñas lesiones superficiales, precedidas a menudo por la pérdida de
escamas, hemorragias en agallas y ano, úlceras, abscesos, exoftalmia (ojos saltones) y
distensión abdominal y, a nivel interno, se puede observar anemia e inflamación de hígado
y riñón (Miyazaki y Kaige, 1985).
Las Aeromonas mesófilas están emergiendo como importantes patógenos en
humanos y, cada vez con más frecuencia, aparecen como responsables de una gran
variedad de infecciones. Aproximadamente, el 85% de los aislamientos clínicos del género
Aeromonas corresponden a las especies: A. hydrophila, A. caviae y A. veronii bv. sobria
(Janda, 1991). Entre las infecciones extraintestinales producidas por Aeromonas, se
incluyen: septicemia, generalmente en individuos inmunocomprometidos; infecciones de
heridas, principalmente infecciones cutáneas superficiales pero pueden llegar a
complicarse infectando tendones, músculos y huesos; infecciones en el tracto respiratorio,
desde epiglotitis a neumonía; y con menor frecuencia, meningitis, peritonitis, infecciones
oculares y síndrome hemolítico urémico (Janda y Abbott, 1998). Una de las infecciones
causada por Aeromonas más comúnmente descrita es la gastroenteritis, que puede
manifestarse desde una forma de diarrea líquida autolimitante hasta una diarrea más severa
e invasiva. Es, especialmente, un problema en niños y, en los últimos años, se han
documentado casos de diarrea del viajero causada por Aeromonas (Vila et al., 2003). Se ha
descrito que, a nivel mundial, la tasa de aislamiento de Aeromonas a partir de muestras
diarreicas oscila entre el 0% y el 10,8% (Edberg et al., 2007). Sin embargo, a pesar de
haberse demostrado el potencial enterotoxigénico de algunas cepas, su papel etiológico en
la diarrea líquida permanece en controversia (von Graevenitz, 2007), debido a que no se
han descrito grandes brotes epidémicos y a que, a nivel experimental, no se dispone de un
modelo animal adecuado para reproducir la sintomatología diarreica observada en el ser
humano (Janda y Abbot, 1998).
1.1.4 Factores de virulencia
El estudio de la patogenicidad bacteriana ha permitido la comprensión de parte de las
complejas interacciones entre los patógenos y sus hospedadores a nivel celular y
molecular. La variedad de manifestaciones clínicas observadas en las infecciones
provocadas por Aeromonas concuerda con la idea de que la patogenicidad de este
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Introducción
microorganismo es multifactorial, de manera que múltiples factores de virulencia podrían
actuar conjuntamente. Estudios recientes refuerzan esta hipótesis, además se ha observado
que la virulencia, en este género, es dependiente de la cepa bacteriana, de la ruta de
infección y del animal utilizado como modelo (Yu et al., 2005).
En la actualidad, se está llevando a cabo la secuenciación del genoma de la cepa
A449 de A. salmonicida subsp. salmonicida y, recientemente, se ha completado la
secuenciación del de la cepa ATCC 7966T de A. hydrophila. La información obtenida
permite una mejor comprensión del potencial de virulencia de la bacteria, el cual se ha
visto que es considerable en esta última. Sin embargo, existe una gran diversidad dentro
del género y algunos de los factores de virulencia puede que no estén representados en
estas cepas, como es el caso del sistema de secreción de tipo III o del flagelo lateral en la
cepa A. hydrophila ATCC 7966T, o que presenten factores de virulencia distintos a los de
otras cepas (Seshadri et al., 2006).
Se ha propuesto, recientemente, un ensayo para evaluar la virulencia de diferentes
especies de Aeromonas mediante el uso de la ameba Dictyostelium como modelo
hospedador alternativo a los vertebrados. Este ensayo se basa en la capacidad de la ameba
de formar una calva de fagocitosis sobre un cultivo confluente de una bacteria no patógena,
mientras que cepas virulentas impiden su crecimiento. De esta manera, ha sido ensayada la
patogenicidad asociada a varios factores de virulencia, concordando los resultados con los
obtenidos en el modelo animal en los casos en los que éste había sido utilizado (Froquet et
al., 2007).
Los principales factores de virulencia descritos en Aeromonas spp. son el
lipopolisacárido, la cápsula, la lámina S, las fimbrias y otras adhesinas no filamentosas, la
flagelación polar y lateral, los sistemas de captación de hierro, el sistema de secreción de
tipo III y la secreción de otras exotoxinas y enzimas extracelulares.
1.1.4.1 El lipopolisacárido (LPS)
Este factor de virulencia, por ser el objeto de estudio de este trabajo, se describe de
forma extensa y detallada en el apartado 1.2.
1.1.4.2 Cápsula
La cápsula es una estructura polisacarídica que recubre la membrana externa de la
bacteria. Está altamente hidratada (aproximadamente, un 95% es agua) y se compone de
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Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
repeticiones de monosacáridos unidos entre sí mediante enlaces glicosídicos, dando lugar a
polisacáridos capsulares (CPS) que pueden ser homopolímeros o heteropolímeros. La
variedad de monosacáridos que pueden formarla y del tipo de uniones entre éstos, y sus
posibles modificaciones, contribuyen a una elevada diversidad y a una complejidad
estructural adicional. Frecuentemente, esta estructura constituye la capa más externa de la
célula y, como tal, participa en la interacción de la bacteria con el ambiente. Se ha descrito
como un factor de virulencia importante en diversos patógenos, ya que contribuye a la
resistencia a la actividad bactericida del complemento y a la fagocitosis, favorece la
adherencia a otras bacterias o tejidos del hospedador, y actúa como barrera frente a
moléculas hidrofóbicas tóxicas. La cápsula puede impedir el acceso de los componentes
del complemento a la superficie celular y, por otro lado, algunos CPS contienen
componentes que inactivan al factor C3b, de manera que se impide la formación del
complejo de ataque a la membrana. La cápsula, además, se ha utilizado para la
clasificación dentro de un mismo género debido a sus propiedades antigénicas (antígenos
K) (Roberts, 1996).
En A. salmonicida, se había documentado la capacidad de formar cápsula tanto in
vitro (en un medio rico en glucosa) como in vivo, y el papel de esta estructura como factor
de virulencia, ya que su presencia reducía la opsonización, impidiendo la fagocitosis
(Garrote et al., 1992¸ Garduño et al., 1993; Merino et al., 1994), y favorecía la invasión en
líneas celulares de peces (Merino et al., 1996a). Recientemente, se ha descrito su estructura
química, que consiste en unidades repetitivas de un trisacárido lineal, y es idéntica a la de
un nuevo antígeno O del lipopolisacárido que se produce en estas mismas condiciones
(Wang et al., 2004b). Este polisacárido capsular es detectado in vitro en crecimientos en
medio sólido TSA (Tryptic Soy Agar), pero no en medio líquido TSB (Tryptic Soy Broth).
Entre las Aeromonas spp. mesófilas, A. hydrophila AH-3 (serotipo O:34) y A. veronii
bv. sobria (serotipo O:11) también son capaces de producir cápsula cuando crecen en un
medio rico en glucosa (Martínez et al., 1995). En el serotipo O:34, se ha asociado con una
mayor invasión y adhesión a líneas celulares de peces (Merino et al., 1997a). Las cepas
PPD134/91 y JCM3980 de A. hydrophila (serotipo O:18) también producen polisacáridos
capsulares y es en la cepa PPD134/91 donde se ha descrito por primera vez, dentro del
género, una agrupación génica que incluye los genes de biosíntesis y exportación de la
cápsula. Su organización genética, en tres regiones, es similar al grupo II de polisacáridos
capsulares de otras bacterias como Escherichia coli (Zhang et al., 2002). En base a la
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Introducción
organización genética en diferentes cepas de A. hydrophila, se han identificado dos tipos
de cápsulas del grupo II: IIA, mayoritariamente encontradas en los serotipos O:18 y O:34,
y IIB, halladas en los serotipos O:21 y O:27. Ambos tipos muestran correlación con la
resistencia a la actividad bactericida del suero y a la fagocitosis, pero es mayor en el caso
de las cápsulas del grupo IIA (Zhang et al., 2003).
1.1.4.3 Lámina S
La lámina S es una matriz proteica de naturaleza paracristalina, producida por una
gran variedad de bacterias, que forma una envuelta externa a la pared celular. Su análisis
químico ha demostrado que está constituida por monómeros de una única proteína o
glicoproteína, que se autoensamblan constituyendo una estructura supramolecular con una
morfología ultraestructural precisa. Debido a su posición, cumple distintas funciones
biológicas: está implicada en adhesión y protección frente a la fagocitosis, presenta
propiedades antigénicas, y es el lugar de anclaje de exoenzimas hidrolíticas y receptor de
bacteriófagos, entre otras (Beveridge et al., 1997).
En 1981, se identificó, mediante microscopía electrónica de transmisión, una lámina
externa a la pared celular, inicialmente llamada lámina A, que se asoció con la virulencia
de A. salmonicida (Kay et al., 1981). Estudios posteriores, permitieron la identificación de
la proteína constituyente y la secuenciación del gen codificante de la misma, vapA (Kay et
al., 1984). Se observó, además, la pérdida de dicha lámina cuando esta especie crecía a
temperaturas superiores a 25ºC, debido a una deleción del material genético (Belland y
Trust, 1987). Seguidamente, se identificaron también las láminas S de algunas cepas de A.
hydrophila y A. veronii bv. sobria, todas pertenecientes al serotipo O:11, y el gen
codificante fue denominado ahsA (Dooley y Trust, 1988; Janda et al., 1987). Aunque estas
láminas son parecidas a nivel morfológico a la de A. salmonicida, son diferentes a nivel
genético y funcional y, consecuentemente, podrían desempeñar papeles distintos en la
patogenicidad (Noonan y Trust, 1997). Recientemente, se ha descrito la presencia de
lámina S en aislados patógenos de A. hydrophila pertenecientes a los serotipos O:14 y
O:81 (Esteve et al., 2004).
La lámina S de Aeromonas está constituida por subunidades de una única proteína
que se autoensamblan de forma tetragonal y envuelven a la célula por completo, y
constituye el antígeno superficial predominante de las células que la poseen (Chu et al.,
1991). Anticuerpos policlonales contra la lámina S han permitido desarrollar un método
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Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
para la detección de las Aeromonas pertenecientes al serotipo O:11 en alimentos mediante
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Merino et al., 1993).
Estudios de secreción de la proteína de la lámina, realizados en diferentes especies de
Aeromonas, muestran que el paso a través de la membrana plasmática implica el corte de
un péptido señal. La salida desde el periplasma hacia el exterior requiere la acción de
diferentes proteínas de secreción que muestran homología con componentes del sistema de
secreción de tipo II, aunque son específicas de las subunidades de la lámina S, habiéndose
demostrado que la mutagénesis de éstas no altera la secreción de sustratos de tipo II
(Thomas y Trust, 1995; Noonan y Trust, 1995).
En A. salmonicida, la lámina S facilita la unión a macrófagos, une porfirinas (Kay et
al., 1985) e inmunoglobulinas (Phipps y Kay, 1988), protege de la acción de las proteasas,
evita la activación del complemento y contribuye a la resistencia a la actividad bactericida
del suero (Merino et al., 1996b), y es capaz de unirse a una gran variedad de proteínas de
la matriz extracelular, como el colágeno IV y la laminina (Trust et al., 1993). La presencia
de lámina S en las Aeromonas spp. mesófilas pertenecientes al serotipo O:11 incrementa la
capacidad de adhesión de estas células, contribuyendo a la colonización de la mucosa
intestinal, pudiendo ser ésta la explicación del frecuente aislamiento de este serotipo en
pacientes con gastroenteritis. Además, parece que la lámina S proporciona una mayor
resistencia a la opsonofagocitosis, hecho que podría facilitar la diseminación sistémica
(Merino et al., 1995). Tanto en A. salmonicida como en Aeromonas mesófilas de serotipo
O:11, la pérdida de la lámina se ha asociado con la disminución de la virulencia (Noonan y
Trust, 1997).
Hasta el momento, todas las cepas de Aeromonas que poseen lámina S tienen en
común la presencia de un lipopolisacárido (LPS) que contiene polisacáridos O de longitud
de cadena homogénea en su superficie celular, y este hecho ha llevado a especular sobre la
posible implicación del LPS en la unión de la lámina a la superficie celular bacteriana
(Kokka et al., 1990; Esteve et al., 2004).
1.1.4.4 Adhesinas
La capacidad de adhesión y colonización bacteriana de las mucosas es crítica para el
desarrollo de la infección. Las Aeromonas spp. producen adhesinas que les permiten
adherirse a receptores específicos que se encuentran en la superficie de células eucariotas.
Muchos de estos receptores son carbohidratos que se expresan en eritrocitos, de manera
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Introducción
que la hemoaglutinación se ha utilizado para la detección de adhesinas, aunque no todas las
adhesinas presentan la capacidad de hemoaglutinar. Se han descrito dos clases de
adhesinas en Aeromonas, unas se han asociado con apéndices filamentosos (fimbrias o pili)
y otras con proteínas de la membrana externa (Burke et al., 1984) y otras estructuras.
1.1.4.4.1 Fimbrias o pili (adhesinas filamentosas)
Las fimbrias son proyecciones filamentosas, formadas a partir de subunidades
proteicas denominadas pilinas, que se encuentran en la superficie bacteriana. En aislados
de cepas, tanto clínicas como ambientales, de Aeromonas mesófilas, se han descrito dos
tipos de fimbrias: fimbrias cortas y rígidas (S/R, Short/Rigid), presentándose en un alto
número por célula bacteriana; y fimbrias largas y flexibles (L/W, Long/Wavy), que se
encuentran en bajo número por célula.
Las fimbrias S/R presentan una longitud de 0,6 a 2 µm, poseen epítopos comunes
entre las diferentes especies analizadas, y están altamente distribuidas entre las cepas
ambientales. Es el tipo de fimbrias predominante entre las Aeromonas spp. que presentan
una elevada cantidad de pili, como algunas cepas ambientales de A. veronii bv. sobria
(Kirov et al., 1995). Pueden causar autoagregación de las bacterias, pero no
hemoaglutinación, y no se unen a células intestinales (Honma y Nakasone, 1990). En
algunas cepas clínicas, este tipo de fimbrias se puede inducir bajo determinadas
condiciones ambientales (< 22ºC, en medio líquido).
Las fimbrias L/W se consideran hemoaglutininas (Hokama et al., 1990). Son largas,
finas (4-7 nm) y flexibles y son el tipo predominante en cepas aisladas a partir de heces,
como las de A. veronii bv. sobria que presentan un bajo número de pili (< 10 por célula).
El análisis de su secuencia aminoacídica indica que se corresponden con pili de tipo IV
(Pepe et al., 1996), reconocidos como estructuras importantes en la adhesión a células
epiteliales y en la formación de “biofilms”, y relacionadas con el movimiento celular
independiente de flagelo sobre superficies sólidas, conocido como twitching motility,
actividades importantes en la colonización de las mucosas (Béchet y Blondeau, 2003). En
especies de Aeromonas asociadas con gastroenteritis, existen dos familias de pili de tipo
IV: Bfp (Bundle-Forming Pili) y Tap (Type IV Aeromonas Pili) (Barnett et al., 1997). Se
ha demostrado la implicación de las fimbrias Bfp en la adhesión a células intestinales
(Kirov et al., 1999) y parece ser que las fimbrias Tap no presentan un papel tan
significativo en la colonización de estas células (Kirov et al., 2000). Por otra parte, se ha
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Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
observado que una de las proteínas de la familia Tap (TapD) es esencial para la secreción
de aerolisina y proteasas, contribuyendo de este modo al sistema de secreción de tipo II
(Pepe et al., 1996).
1.1.4.4.2 Adhesinas no filamentosas
Las Aeromonas spp. presentan en su superficie otras estructuras no filamentosas que
han sido consideradas adhesinas, como los monómeros constituyentes de la lámina S, el
lipopolisacárido y diferentes proteínas de membrana externa. Entre estas últimas, se ha
descrito que las porinas podrían actuar como adhesinas tipo lectina para la unión de la
bacteria a superficies ricas en carbohidratos, como los eritrocitos y, probablemente, las
células del intestino humano (Quinn et al., 1993). En A. hydrophila, ha sido descrita una
proteína de membrana externa (OMP) de 43 kDa con función adhesina (Quinn et al., 1993;
Quinn et al., 1994), denominada Aha1p, y se ha planteado la posibilidad de utilizarla como
vacuna en peces (Fang et al., 2004). Una adhesina OMP de 43 kDa ha sido también hallada
en cepas sin fimbrias de A. caviae (Rocha-De-Souza et al., 2001) y, en A. veronii, se ha
observado que una proteína parecida a la porina LamB, Omp48, está implicada en la
adhesión a células epiteliales (Vázquez-Juárez et al., 2004).
1.1.4.5 Flagelo
El flagelo bacteriano es un apéndice largo (15-20 µm de longitud) y delgado
(aproximadamente, 20 nm de diámetro), de naturaleza proteica, con capacidad de rotación
y que permite la propulsión de la célula. En esta estructura, se distinguen tres regiones: el
cuerpo basal, el gancho y el filamento. El cuerpo basal se encuentra embebido en las
envueltas bacterianas y el gancho tiene como función el anclaje del filamento al cuerpo
basal. El filamento, que se extiende desde el gancho hacia el exterior, es un cilindro rígido
y hueco constituido por la polimerización de una proteína denominada flagelina.
Las Aeromonas mesófilas expresan un único flagelo polar de manera constitutiva y,
en un 50-60% de las cepas asociadas a procesos diarreicos, el crecimiento en superficies
induce la expresión de flagelos laterales (Kirov et al., 2002). Así, las cepas AH-3 de A.
hydrophila y Sch3N de A. caviae producen un único flagelo polar sin vaina cuando crecen
en medio líquido, y múltiples flagelos laterales, además del flagelo polar, también sin
vaina, cuando crecen en medio sólido (Gavín et al., 2002). El flagelo polar permite la
movilidad por natación (swimming) en ambientes líquidos, mientras que los flagelos
laterales son responsables de la movilidad colonial observada en crecimientos en medios
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Introducción
sólidos o semisólidos, conocida como swarming (“enjambrado”). La natación y la
quimiotaxis son importantes en el contacto inicial con las superficies, mientras que el
swarming permite a las bacterias avanzar sobre las superficies y facilitar el proceso de
colonización (O'Toole y Kolter, 1998). En consecuencia, la presencia del flagelo y también
su movilidad participan en las fases iniciales del proceso de infección, entre las que cabe
destacar la adhesión a células eucariotas, la colonización del hospedador (Josenhans y
Suerbaum, 2002) y la formación de “biofilms” (Merino et al., 2006). En A. hydrophila
O:34, se ha demostrado que la movilidad es importante en el proceso de adhesión a líneas
celulares de peces, que los flagelos contribuyen al proceso de invasión (Merino et al.,
1997b), y que tanto la natación como el swarming son esenciales para la formación de
“biofilms” en la cepa AH-3 de A. hydrophila (Gavín et al., 2002).
Se han secuenciado agrupaciones génicas implicadas en el establecimiento de la
flagelación polar y lateral en las cepas AH-3 de A. hydrophila y Sch3N de A. caviae. En la
cepa AH-3, los genes del sistema de flagelación polar se agrupan, al menos, en seis
regiones cromosómicas distintas (Canals et al., 2006b). En cambio, los genes del sistema
de flagelación lateral están agrupados en una única región cromosómica (Canals et al.,
2006a). Por otro lado, la cepa AH-3 de A. hydrophila presenta dos flagelinas para la
flagelación polar (FlaA y FlaB) y una sola para la flagelación lateral (LafA), mientras que
A. caviae Sch3N presenta dos flagelinas para ambos tipos de flagelo (Gavín et al., 2002).
Las flagelinas polares y laterales de ambas cepas están glicosiladas (Gavín et al., 2002) y,
recientemente, han sido descritos varios genes implicados en su glicosilación (Canals et
al., 2007).
A. salmonicida ha sido definida como una especie no flagelada e inmóvil, aunque en
crecimientos en medios líquidos con elevada viscosidad y a temperaturas supraóptimas (30
a 37ºC), se ha observado que un 1% de la población presenta movilidad mediante
flagelación polar (McIntosh y Austin, 1991). Se han identificado algunos genes implicados
en la biosíntesis de la flagelación polar, como los que codifican las flagelinas, flaA y flaB
(Umelo y Trust, 1997). También se ha descrito una agrupación génica asociada a la
flagelación lateral, lafA-U, donde todos los genes son funcionales, excepto lafA, inactivo
debido a la presencia de una putativa transposasa (Merino et al., 2003).
19
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
1.1.4.6 Sistemas de captación de hierro
Numerosos ambientes contienen una concentración de hierro libre inferior a 1 µM,
que es la considerada indispensable para el crecimiento óptimo de los microorganismos
(Neilands, 1995). La baja disponibilidad de hierro libre dificulta, pero no impide, el
crecimiento y la patogenicidad bacteriana. Los microorganismos han desarrollado una serie
de mecanismos que les permiten extraer el hierro del hospedador y de los polímeros
insolubles del ambiente: las modificaciones reductivas del hierro, los sistemas de
transporte de iones ferrosos o los sideróforos. Debido a la presencia de las proteínas de
unión a hierro del hospedador, como por ejemplo la hemoglobina (con sus grupos hemo),
la transferrina, la lactoferrina o la ferritina, el hierro se encuentra poco accesible in vivo. En
suero, las concentraciones de hierro libre están muy lejos de los mínimos requeridos para
el crecimiento durante la infección de muchas bacterias. Por lo tanto, los mecanismos para
la captación de hierro que presentan las bacterias se consideran esenciales para su
crecimiento y para la virulencia durante una infección (Stintzi y Raymond, 2000).
Se conocen dos sistemas de captación de hierro en cepas de Aeromonas, uno
dependiente y otro independiente de sideróforo (Byers et al., 1991). Los sideróforos son
moléculas de bajo peso molecular que presentan grupos funcionales con elevada afinidad y
especificidad por el ión férrico. Algunas Aeromonas spp. también podrían adquirir el hierro
in vivo mediante la unión de receptores de la membrana bacteriana con proteínas
secuestradoras de hierro del hospedador (Stintzi y Raymond, 2000).
La mayoría de Aeromonas mesófilas producen un único tipo de sideróforo:
enterobactina o amonabactina. La enterobactina es sintetizada por diferentes bacterias
Gram negativas, mientras que la amonabactina es producida, exclusivamente, por
Aeromonas spp. (Zywno et al., 1992). Ambos sideróforos son de tipo catecolato, ya que
están formados por ácido 2,3-dihidróxidobenzoico (2,3-DHB) conjugado con aminoácidos
(Telford y Raymond, 1998). De este modo, en Aeromonas spp. la biosíntesis de 2,3-DHB
está codificada por dos agrupaciones génicas diferentes: la agrupación amo, presente en las
cepas productoras de amonabactina, y la agrupación aeb (Aeromonad Enterobactin
Biosynthesis), propia de las productoras de enterobactina (Massad et al., 1994).
Se ha demostrado la capacidad de la amonabactina en la adquisición de hierro a
partir de la transferrina y de la lactoferrina y, por lo tanto, su importante papel en la
patogénesis (Stintzi y Raymond, 2000).
20
Introducción
Los sistemas de captación de hierro mediante sideróforos se componen, también, de
un aparato asociado a la célula responsable de procesar el sideróforo unido a hierro con la
finalidad de entregarlo al metabolismo bacteriano. Este sistema incluye un receptor,
específico para el sideróforo, unido a la membrana. En A. hydrophila, se ha descrito un
único receptor y transportador de hierro en la membrana externa de la bacteria, que es
dependiente de amonabactina. El transporte implica un proceso de intercambio de ligando,
o mecanismo lanzadera, que tiene lugar en la superficie celular cuando el ferri-sideróforo
transfiere el átomo de hierro a un apo-sideróforo, libre de hierro, previamente unido al
receptor. Además, el receptor de amonabactina de A. hydrophila presenta baja
especificidad, con capacidad de transportar un amplio rango de sideróforos, con grupos
quelantes tan variados como catecolato, hidroxamato o hidroxipiridonato (Stintzi et al.,
2000).
Recientemente, ha sido descrita la agrupación génica implicada en la biosíntesis del
sideróforo tipo catecolato de A. salmonicida, cuya producción es imprescindible para el
crecimiento en condiciones limitantes de hierro, y que es capaz de obtenerlo de la
transferrina (Najimi et al., 2008).
También, se ha secuenciado el gen que codifica el receptor de sideróforos en A.
salmonicida, fstA, que muestra homología con otros genes fstA de bacterias patógenas
Gram negativas (Pemberton et al., 1997).
1.1.4.7 Secreción de exotoxinas y otras enzimas extracelulares
1.1.4.7.1 Exotoxinas
Se ha descrito que el género Aeromonas produce una gran variedad de exotoxinas.
No obstante, no todas las cepas del género producen la totalidad de toxinas descritas y,
aunque ciertas cepas posean los genes que codifican una toxina en concreto, éstos sólo se
expresan en determinadas condiciones de crecimiento.
1.1.4.7.1.1 Enterotoxinas
En Aeromonas spp., se han descrito dos tipos de enterotoxinas: citotóxicas, que
provocan importantes daños en el epitelio del intestino delgado, y citotónicas, que no
producen degeneración del epitelio.
21
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
1.1.4.7.1.1.1 Enterotoxinas citotóxicas
Las enterotoxinas citotóxicas, también conocidas como enterotoxinas citolíticas, βhemolisinas o aerolisinas, pueden llegar a producir hemólisis, citotoxicidad y
enterotoxicidad. Las cepas productoras se aíslan, frecuentemente, de enfermos diarreicos
(Chopra et al., 1993). Se sintetizan como preproproteínas que contienen una secuencia
señal que se separa al atravesar la membrana. La proproteína inactiva pierde parte de su
extremo C-terminal y, produciéndose su activación por proteólisis, es capaz de
oligomerizar y formar poros en la membrana de la célula eucariota que pueden provocar un
desequilibrio osmótico (van der Goot, 1994).
A partir de A. hydrophila, se purificó una hemolisina con actividad hemolítica,
citotóxica y enterotóxica y capaz de provocar letalidad en ratones (Asao et al., 1984). Más
tarde, dos grupos diferentes publicaron el clonaje de un gen aerolisina, aerA, a partir de A.
trota y A. bestiarum (Chakraborty et al., 1986; Howard y Buckley, 1986). Posteriormente,
a partir de la cepa SSU de A. hydrophila, aislada de una muestra diarreica, fue purificada
una nueva enterotoxina citotóxica, Act, que presentaba actividades similares a las
asociadas a las enterotoxinas descritas anteriormente (Ferguson et al., 1997). Estudios
detallados de las funciones y estructuras de la aerolisina y la Act indicaron que estaban
íntimamente relacionadas, aunque presentan heterogeneidad aminoacídica en algunas
regiones (Buckley y Howard, 1999). Se ha demostrado la importancia de estas
enterotoxinas en la patogénesis de enfermedades mediadas por Aeromonas (Chakraborty et
al., 1987; Xu et al., 1998). La aerolisina contiene dos lugares de unión a receptor, uno se
une a proteínas ancladas al glicosilfosfatidilinositol y el otro, a carbohidratos de superficies
celulares. En este sentido, la aerolisina de A. bestiarum puede unirse a la glicoforina de la
membrana de los eritrocitos, mientras que la Act no (Chopra y Houston, 1999). Se han
realizado estudios de las cascadas de señalización intracelular, inducidas por Act, que
llevan a la producción de mediadores de la inflamación en macrófagos (Galindo et al.,
2003) y en células epiteliales humanas (Galindo et al., 2005). Además, se ha investigado el
potencial papel de esta enterotoxina como inductora de la apoptosis (Galindo et al., 2006).
1.1.4.7.1.1.2 Enterotoxinas citotónicas
Las enterotoxinas citotónicas presentan un sistema de actuación similar al de la
toxina colérica, aumentando los niveles de AMPc y prostaglandinas en las células del
epitelio intestinal (Chopra et al., 1992). En el género Aeromonas, se han descrito diversas
22
Introducción
enterotoxinas que presentan diferentes pesos moleculares y una reactividad variable con la
antitoxina colérica (Chakraborty et al., 1984; Potomski et al., 1987; McCardell et al.,
1995). Estas enterotoxinas se dividieron en dos tipos: termolábiles (56ºC durante 10
minutos) sin reactividad cruzada con la toxina colérica, y termoestables (100ºC durante 30
minutos) que reaccionan con la antitoxina colérica (James et al., 1982).
La proteína Alt es una enterotoxina citotónica termolábil, que fue purificada a partir
de la cepa SSU de A. hydrophila (Chopra y Houston, 1989). Parte de su secuencia proteica
muestra similitud con el extremo C-terminal de la fosfolipasa C (PLC) de A. hydrophila y
causa un incremento de los niveles de AMPc y de prostaglandinas en la mucosa intestinal
de rata (Chopra et al., 1996). En la misma cepa, fue identificada la enterotoxina citotónica
termoestable (56ºC durante 20 minutos) conocida como Ast (Chopra et al., 1994) y se ha
demostrado, utilizando una rata como modelo animal, que provoca la secreción de fluido
en el intestino delgado y un aumento de los niveles de AMPc en las células de la mucosa
(Chopra y Houston, 1999). Por otro lado, se ha observado que la contribución de estas dos
enterotoxinas en la gastroenteritis inducida por A. hydrophila en ratón es menor que la de
la enterotoxina citotóxica Act y que puede existir algún tipo de interacción entre todas ellas
durante la infección (Sha et al., 2002).
1.1.4.7.1.2 Hemolisinas
Las Aeromonas spp. producen al menos dos clases de hemolisinas: β-hemolisinas y
α-hemolisinas. Además de la enterotoxina citotóxica con actividad β-hemolítica, las
Aeromonas producen otras β-hemolisinas. Provocan la formación de poros en las
membranas celulares produciendo una lisis osmótica y una destrucción completa de los
eritrocitos. Las β-hemolisinas son termolábiles (56ºC durante 5 minutos) y, generalmente,
se forman durante la fase de crecimiento exponencial (Thelestam y Ljungh, 1981; Kirov,
1997). Un tipo de β-hemolisina es la designada como AHH1 (Hirono y Aoki, 1991), cuya
secuencia presenta una elevada similitud con la proteína HlyA de V. cholerae y podría
funcionar formando canales de manera similar (Wong et al., 1998). Por otro lado,
recientemente, ha sido identificada una proteína con actividad hemolítica en la cepa SSU
de A. hydrophila que no presenta similitud con el resto de hemolisinas caracterizadas y ha
sido denominada HlyA (Erova et al., 2007).
23
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Las α-hemolisinas producidas durante la fase estacionaria del crecimiento causan
efectos citotóxicos reversibles y lisis incompleta de los eritrocitos, pero no se han
relacionado con propiedades enterotoxigénicas (Thelestam y Ljungh, 1981).
1.1.4.7.2 Otras enzimas extracelulares
Las cepas de Aeromonas pueden producir una gran variedad de enzimas
extracelulares como proteasas, lipasas, amilasas, quitinasas, nucleasas o gelatinasas, entre
otras. Aunque en muchos casos su papel en la patogenicidad está todavía por determinar,
representan un gran potencial en la adaptación a los cambios ambientales.
1.1.4.7.2.1 Proteasas
Las proteasas pueden contribuir a la patogenicidad causando lesiones directas del
tejido, potenciando la invasividad o mediante la activación proteolítica de toxinas (Kirov,
1997). Además, también pueden contribuir al establecimiento de la infección ayudando a
superar las defensas del hospedador, mediante inactivación del complemento, y
proporcionando nutrientes para la proliferación celular (Leung y Stevenson, 1988).
En A. hydrophila, se han identificado tres tipos de proteasas. Las dos halladas en la
mayoría de los sobrenadantes de cultivos de esta especie son una serina proteasa termolábil
de 68 kDa (Rivero et al., 1991) y una metaloproteasa de 38 kDa termoestable y sensible al
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) (Rivero et al., 1990), ambas con actividad
caseinolítica. Una Zn-metaloproteasa de 19 kDa resistente al EDTA ha sido también
descrita en una única cepa (Loewy et al., 1993). La metaloproteasa de 38 kDa, denominada
AhpB, presenta también actividad elastasa, no descrita inicialmente, y es un importante
factor de virulencia, y la serina proteasa, AhpA, podría estar implicada en su maduración
(Cascón et al., 2000). La purificación de una metaloelastasa se ha llevado a cabo en varios
grupos (Esteve y Birbeck, 2004) y, según un estudio paralelo, provocaría la activación de
la protrombina (Keller et al., 2004), actividad que también ha sido descrita para la serina
proteasa de 65 kDa (ASP) de A. sobria (Nitta et al., 2007). En A. caviae, se ha
caracterizado una metaloproteasa de 34 kDa (AP34) y una Zn/Fe-metaloproteasa
termoestable de 19 kDa (AP19), pero sus papeles en la virulencia están por determinar
(Toma et al., 1999; Nakasone et al., 2004). Y, en A. veronii bv. sobria, se ha observado
que la proteasa más importante, una metaloproteasa de 34 kDa (AVP), activa la
proaerolisina (Song et al., 2004). En el caso de A. salmonicida, la serina proteasa de 64
24
Introducción
kDa AspA (Whitby et al., 1992) es necesaria para la activación de la GCAT
(glicerofosfolípido colesterol aciltransferasa) (Vipond et al., 1998).
Por otro lado, también existen aminopeptidasas que pueden presentar diversas
actividades específicas como el catabolismo de péptidos exógenos, la activación
extracelular de la aerolisina o la eliminación de la metionina N-terminal de nuevas cadenas
peptídicas sintetizadas (metionina aminopeptidasas) (Pemberton et al., 1997).
1.1.4.7.2.2 Lipasas/Fosfolipasas
Muchas bacterias patógenas producen lipasas. En A. hydrophila, se han encontrado
diferentes lipasas, como la Ah65 lipasa/aciltransferasa y otras que muestran elevada
homología entre ellas: H3, Apl1 y Lip, la segunda de las cuales presenta actividad
fosfolipasa C (Chuang et al., 1997; Pemberton et al., 1997). En cepas de Aeromonas del
serotipo O:34, se han descrito las fosfolipasas A1 y C. La fosfolipasa C muestra actividad
lecitinasa y capacidad citotóxica, y se ha demostrado su papel como factor de virulencia
(Merino et al., 1999).
Las Aeromonas spp. también producen glicerofosfolípido colesterol aciltransferasas
(GCAT), que funcionan como lipasas y pueden provocar lisis en eritrocitos mediante la
digestión de sus membranas plasmáticas (Pemberton et al., 1997).
1.1.4.7.3 Toxinas asociadas al sistema de secreción de tipo III
El sistema de secreción de tipo III (T3SS) (ver apartado 1.1.4.8) es un sistema de
transporte de proteínas bacterianas, denominadas efectores, al citoplasma de las células
hospedadoras. Las moléculas efectoras llevan a cabo una amplia gama de actividades
bioquímicas y modulan la función de moléculas reguladoras cruciales para la célula
hospedadora, de manera que son capaces de alterar el citoesqueleto o interferir en las
cascadas de señalización intracelular (Mota y Cornelis, 2005).
Se han identificado cuatro proteínas efectoras de T3SS en A. salmonicida, AexT,
AopP, AopO y AopH (Braun et al., 2002; Dacanay et al., 2006; Fehr et al., 2006), y una en
las cepas AH-3 y SSU de A. hydrophila¸ AexT y AexT-like (o AexU), respectivamente
(Vilches et al., 2008; Sha et al., 2007; Sierra et al., 2007). La proteína AexT es una toxina
bifuncional homóloga de los efectores bifuncionales ExoT/ExoS de P. aeruginosa, que
presenta actividad ADP-ribosiltransferasa y GAP (GTPase activating protein) (Fehr et al.,
2007). AopP es miembro de la familia YopJ, un grupo de proteínas efectoras de T3SS que
25
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
interfiere con vías de señalización de proteínas quinasa activadas por mitógeno (MAPK)
y/o con el factor nuclear kappa B (NF-κB) (Fehr et al., 2006). Las funciones biológicas de
AopO y AopH se desconocen; sin embargo, son homólogos de los efectores de Yersinia
enterocolitica YopO y YopH, respectivamente.
1.1.4.8 Sistema de secreción de tipo III (T3SS)
El sistema de secreción de tipo III (T3SS) es un sistema de transporte de proteínas
bacterianas, denominadas efectores, al interior de células eucariotas (ver apartado
1.1.4.7.3) y presenta una elevada similitud con el sistema de biogénesis flagelar (Plano et
al., 2001).
El T3SS constituye una maquinaria de transporte de proteínas bacterianas,
frecuentemente implicadas en patogenicidad, al interior de células eucariotas, hecho que
implica su transporte tanto a través de las envueltas bacterianas, como a través de la
membrana plasmática y, en algunos casos, de la pared, de las células eucariotas. El T3SS
está formado por tres tipos de proteínas: componentes estructurales del sistema de
inyección, sustratos de secreción (efectores) y factores reguladores de la expresión de las
proteínas estructurales y efectoras. El aparato de inyección está formado por unas 20
proteínas diferentes que se ensamblan entre ellas formando una estructura en forma de
aguja que permite la translocación de efectores (Cornelis, 2006), generalmente tras el
contacto con la célula hospedadora (Galán y Collmer, 1999).
Se ha caracterizado un T3SS funcional en A. salmonicida (Burr et al., 2002; Burr et
al., 2003), en la cual se halla codificado en un plásmido termolábil, y en las cepas AH-1,
AH-3 y SSU de A. hydrophila (Yu et al., 2004; Vilches et al., 2004; Sha et al., 2005).
Se ha demostrado que el T3SS es esencial, en A. salmonicida, para establecer la
infección sistémica en peces (Burr et al., 2005) y que es importante en el proceso invasivo
y de colonización (Dacanay et al., 2006). En A. hydrophila AH-1, AH-3 y SSU, también se
ha observado que es un factor importante para su patogenicidad, viéndose reducida su
virulencia al inactivar algunos de los genes, tanto en modelos animales como en cultivos
celulares (Yu et al., 2004; Vilches et al., 2004; Sha et al., 2005).
Se ha estudiado la presencia del T3SS en diferentes cepas, ambientales y clínicas, de
Aeromonas spp., y se ha observado una mayor frecuencia en A. veronii y A. hydrophila
respecto a A. caviae (Chacón et al., 2004; Vilches et al., 2004).
26
Introducción
1.2 El lipopolisacárido (LPS)
El lipopolisacárido (LPS), también conocido como endotoxina, es una molécula
glucolipídica que representa la estructura mayoritaria de la cara externa de la membrana
externa de la mayoría de las bacterias Gram negativas (Funahara y Nikaido, 1980). Es una
molécula anfipática constituida por una región polisacarídica (polar) unida covalentemente
a una estructura lipídica (apolar), altamente conservada, denominada lípido A, que le
permite el anclaje a la membrana. La fracción polisacarídica suele constar de dos partes:
una oligosacarídica más interna y conservada, unida al lípido A, conocida como núcleo del
LPS, que se puede subdividir en núcleo interno y núcleo externo; y otra polisacarídica más
externa y variable, anclada al núcleo y denominada polisacárido O, cadena lateral O o
antígeno O por sus características inmunogénicas (Fig. 1.1). El antígeno O consiste en la
repetición de una subunidad oligosacarídica básica que varía en función de las diversas
especies y serotipos y que puede estar formada por un único tipo de monosacárido, o por
diferentes, constituyendo subunidades lineales o ramificadas. Estas tres regiones (lípido A,
núcleo del LPS y antígeno O), divididas en base a su estructura química, también se
diferencian en sus rutas biosintéticas, en las agrupaciones génicas implicadas en su
biosíntesis y en el grado de conservación.
Subunidad repetitiva
Antígeno O
Lipopolisacárido
Núcleo externo
Núcleo interno
Lípido A
MEMBRANA EXTERNA
Porina
PERIPLASMA
Figura 1.1. Esquema de la estructura y disposición del LPS en la membrana externa de las bacterias Gram negativas.
La variabilidad estructural del LPS disminuye gradualmente desde el antígeno O
hasta el lípido A. La elevada conservación de las características generales del lípido A y
del núcleo interno puede ser reflejo de las restricciones impuestas por su papel en el
27
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
mantenimiento de la integridad de la membrana externa, mientras que las estructuras más
superficiales están sometidas a una mayor presión evolutiva ejercida tanto por el ambiente
como por la interacción con el sistema inmune del hospedador (Heinrichs et al., 1998).
Esta variabilidad se correlaciona con la amplia diversidad de los genes implicados en su
biosíntesis.
Las moléculas de LPS extraídas a partir de un mismo cultivo celular muestran
heterogeneidad en sus tamaños. Algunas familias, como Enterobacteriaceae, producen
comúnmente moléculas de LPS que presentan el antígeno O unido al núcleo, con diversas
longitudes de cadena, conocidas como LPS de tipo S (Smooth). Sin embargo, también se
pueden encontrar algunas moléculas que sólo contienen el lípido A y el núcleo, completo o
truncado, denominadas LPS de tipo R (Rough). Estos dos términos se deben al aspecto que
presentan las colonias bacterianas, de fenotipo liso las que producen S-LPS y con bordes
rugosos, en el caso del R-LPS (Whitfield et al., 1997).
1.2.1 Importancia biológica
El LPS tiene un papel muy importante en el mantenimiento y la organización de la
membrana externa de las bacterias Gram negativas. Dicha membrana está formada por una
bicapa lipídica asimétrica, la cara interna de la cual está constituida por fosfolípidos,
mientras que la cara externa está formada, principalmente, por el LPS, cuyo componente
hidrófobo, el lípido A, forma la parte exterior de esta bicapa y queda oculto por los
componentes sacarídicos (Fig. 1.1). Su contacto directo con el medio lo convierten en un
importante antígeno de superficie y en una de las principales dianas de bacteriófagos, así
como del sistema de defensa del organismo hospedador.
El LPS también es responsable de la resistencia de las bacterias Gram negativas a
determinadas moléculas. El núcleo y el antígeno O crean una barrera hidrofílica (Snyder et
al., 1999) difícilmente penetrable por compuestos o antibióticos hidrofóbicos que, además,
también debilita la efectividad de los péptidos policatiónicos, los cuales quedan atrapados
mediante interacciones electrostáticas con las cargas negativas del LPS y pueden formar
autoagregados, evitándose su acceso a la membrana (Andrä et al., 2004; Papo y Shai,
2005).
El LPS es un importante factor de virulencia en bacterias Gram negativas patógenas.
Por un lado, el lípido A, la única región del LPS reconocida por el sistema inmune innato,
28
Introducción
es el responsable de la actividad endotóxica del LPS (Rietschel et al., 1996) y puede llegar
a provocar una importante inflamación sistémica conocida como shock séptico o
endotoxemia. Las moléculas de LPS, que se liberan durante la división o muerte
bacteriana, provocan la activación del sistema inmune para hacer frente a la infección. Sin
embargo, en algunos casos, la activación continuada e incontrolada produce una respuesta
excesiva en la secreción de citoquinas que, junto con las anafilatoxinas que se hayan
podido generar en la cascada del complemento, son responsables del proceso inflamatorio.
La respuesta sistémica que se produce se caracteriza por una elevada concentración de
citoquinas proinflamatorias en sangre, especialmente del TNF-α (Tumoral Necrosis Factor
α), principal causante de los efectos patológicos del shock séptico, tales como daños en el
endotelio, pérdida del tono vascular, coagulopatías e insuficiencia multiorgánica que,
muchas veces, lleva a la muerte (Cohen, 2002). Por otro lado, la presencia de las cadenas
polisacarídicas del antígeno O facilita el proceso inicial de adhesión (Merino et al., 1996c)
y colonización de las mucosas (Merino et al., 1996d). Además, actúa de barrera física
impidiendo la correcta activación del complemento, confiriendo resistencia a la actividad
bactericida del suero no inmune, debido a que sobre las cadenas más largas del antígeno O
del LPS, no recubiertas por el polisacárido capsular, se deposita el componente C3b del
complemento lejos de la membrana, lo que previene la formación del complejo de ataque a
la membrana (C5b-9) que provoca la lisis celular y la muerte bacteriana (Merino et al.,
1991; Merino et al., 1992a).
1.2.1.1 Receptores humorales y celulares del LPS
Se han reconocido diversos receptores humorales del LPS entre los cuales hay que
destacar la proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP), la lipoproteína de alta
densidad (HDL), la proteína de unión a LPS (LBP) y el receptor CD14 soluble (CD14s).
La PLTP, implicada en el intercambio de lípidos entre distintas partículas lipoproteicas
plasmáticas, se une al LPS y lo transfiere de la membrana bacteriana o de los agregados de
LPS a las HDL, las cuales lo neutralizan dando lugar a una función destoxificadora
(Chaby, 2004). La LBP reconoce al lípido A y entrega el LPS al receptor CD14 de la
membrana de monocitos, macrófagos y neutrófilos, facilitando la detección de pequeñas
cantidades de LPS (Rietschel et al., 1996) (Fig. 1.2). Además, la LBP también transfiere el
LPS al receptor CD14 soluble (CD14s) formando un complejo que puede transportar el
LPS a partículas lipoproteicas o a las células, de manera que las células endoteliales, las
29
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
cuales no expresan el receptor CD14 celular, pueden ser activadas y producir citoquinas
(Frey et al., 1992; Dauphinee y Karsan, 2006). Por otro lado, la LBP, a elevadas
concentraciones, inhibe la estimulación celular producida por el LPS, lo que puede ser
debido, en parte, a la neutralización por las partículas lipoproteicas a las que es capaz de
transferirlo (Wurfel et al., 1994). Debido a sus diferentes funciones, la LBP juega un
importante papel en la respuesta inmune producida por el LPS (Zweigner et al., 2006).
Figura 1.2. Esquema con algunos
de los receptores de membrana y
extracelulares del LPS. Figura
adaptada de Chaby, 2004.
Otras moléculas plasmáticas que se unen al LPS son diferentes constituyentes de las
tres vías del complemento. La región polisacarídica es reconocida por el componente C3b,
produciendo la activación de la vía alternativa; la lectina de unión a manosa (MBL)
reconoce residuos de manosa repetidos que pueden estar contenidos en el antígeno O y
activa la vía de la lectina; y la región del lípido A activa la vía clásica mediante la
interacción con los componentes C1q y C3b (Chaby, 2004).
Los péptidos antimicrobianos, defensinas y catelicidinas, secretados por células
epiteliales y fagocíticas, interaccionan también con el LPS de la superficie bacteriana
debido a sus cargas positivas y a sus residuos polares, desplazando los cationes divalentes
que neutralizan las cargas negativas de las moléculas de LPS. De esta manera, reducen la
respuesta proinflamatoria, ya que el LPS no puede ser reconocido por la LBP (Rosenfeld y
Shai, 2006).
El Factor XII es otra de las proteínas solubles que se unen al LPS y se activa dando
lugar a la vía de coagulación intrínseca de la sangre (Morrison y Cochrane, 1974), lo que,
en exceso, puede originar una coagulación intravascular diseminada.
30
Introducción
A nivel celular, CD14 concentra las moléculas de LPS para favorecer su unión al
complejo formado por el receptor Toll-like 4 (TLR4) y la proteína adaptadora extracelular
MD-2 (proteína de diferenciación mieloide 2) (Miller et al., 2005). MD-2 es el lugar de
unión del LPS al complejo y es necesaria para la transducción de señales (Nagai et al.,
2002) (Fig. 1.2). Como consecuencia, se activan vías de señalización que conducirán a la
síntesis y la secreción de mediadores de la inflamación, como el TNF-α o la interleuquina
IL1-β, y de moléculas requeridas para la activación de la respuesta inmune adaptativa
(Raetz y Whitfield, 2002). En consecuencia, se estimula la fagocitosis y se activa la
proliferación, diferenciación y secreción de anticuerpos en los linfocitos B.
Recientemente, se ha descrito que el complejo formado por RP105, parecido
estructuralmente a TLR4 pero sin el dominio de señalización citoplasmático, y la molécula
MD-1, similar a su homóloga MD-2, se expresa, no sólo en los limfocitos B, de los que se
creía exclusivo, sino también en macrófagos, neutrófilos y células dendríticas. Su papel en
la señalización producida por el LPS, en estas últimas, no es debido al reconocimiento
directo del mismo sino a la interacción con el complejo TLR4/MD-2, inhibiendo su
capacidad de unión con el ligando. En las células B, sin embargo, la interpretación fue que
RP105 facilitaba la señalización mediada por TLR4, de manera que su función se sigue
estudiando (Divanovic et al., 2007).
El receptor scavenger SR-A es otra de las moléculas de la membrana de los
macrófagos implicada en el reconocimiento del LPS, lo que induce su posterior
internalización y eliminación de la sangre (Hampton et al., 1991).
Si bien todos los efectos provocados por el LPS son necesarios para la eliminación
de infecciones localizadas, la excesiva estimulación sistémica producida en el caso de una
infección severa puede provocar un shock séptico, acompañado de daños irreversibles en
vasos sanguíneos y órganos.
1.2.2 El lípido A
1.2.2.1 Características principales del lípido A
El lípido A es el responsable de las propiedades endotóxicas del LPS y constituye
su punto de anclaje hidrofóbico en la monocapa externa de la membrana externa de la
mayoría de bacterias Gram negativas. Es la región más conservada del LPS, con pequeñas
variaciones interespecíficas. Su presencia resulta indispensable para la viabilidad de la
31
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
mayoría de bacterias Gram negativas, dado su importante papel en la integridad de la
membrana externa, siendo el responsable de su ensamblaje e interactuando con algunas
proteínas de esta membrana de forma específica, de manera que contribuye,
probablemente, a su correcto plegamiento (de Cock et al., 1999; Ferguson et al., 2000). La
interacción con cationes divalentes de las cargas negativas de los grupos fosfato del lípido
A, de los grupos carboxilo de las moléculas de ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico
(Kdo) que lleve unidas, y, posiblemente, también, de otros azúcares más distales que pueda
haber, es indispensable para la estabilización de la membrana externa. De esta manera, las
moléculas de LPS adyacentes interaccionan fuertemente, hecho que disminuye, además, la
permeabilidad de dicha membrana (Nikaido et al., 2003).
Debido a que se trata de una molécula indispensable para la mayoría de las bacterias
Gram negativas, a su elevada conservación y a su papel como componente tóxico de la
endotoxina, se ha desarrollado un gran interés en su biosíntesis, con el fin de analizar los
motivos implicados en su toxicidad y desarrollar nuevos fármacos contra el shock séptico
(Rietschel et al., 1996; Onishi et al., 1996).
1.2.2.2 Estructura química del lípido A
La mayoría de las bacterias Gram negativas sintetizan un lípido A muy similar al de
E. coli. Su estructura química básica consiste en un disacárido de glucosamina (GlcN)
ligado mediante un enlace β(1-6), fosforilado en las posiciones 1 y 4’ y acilado con
residuos de R-3-hidroximiristato en las posiciones 2, 3, 2’ y 3’ del disacárido. Los grupos
hidroxilo de los acilos de las posiciones 2’ y 3’ se encuentran esterificados con otros dos
grupos acilo de 12 átomos de carbono (laureato) ó 14 (miristato), respectivamente. La
molécula está glicosilada en la posición 6’ por los residuos del Kdo, que ya corresponden
al núcleo del LPS (Raetz y Whitfield, 2002) (Fig. 1.3).
Aunque la estructura del lípido A presenta un alto grado de conservación, puede
verse modificada como respuesta a cambios ambientales. Muchas de las enzimas
necesarias para la modificación covalente del lípido A se sitúan en el periplasma o en la
membrana externa, a diferencia de las enzimas implicadas en su biosíntesis. En E. coli y
Salmonella enterica sv. Typhimurium (S. typhimurium), se han descrito diversas
modificaciones que consisten en la adición de grupos de fosfoetanolamina (PEtN), 4amino-4-desoxi-L-arabinosa (L-Ara4N), grupos difosfato y palmitato (16 átomos de
carbono); en la sustitución del laureato por el palmitoleato (en E. coli); y en la
32
Introducción
hidroxilación o la eliminación de alguna cadena de miristato (en Salmonella) (Raetz et al.,
2007) (Fig. 1.3).
Figura 1.3. Estructura química del
Kdo2-lípido A de E. coli K-12 y sus
modificaciones covalentes más
frecuentes. En negro se indican las
moléculas de Kdo, las cadenas
aciladas y los fosfatos; en azul, el
dímero de glucosamina; en rojo, la
PEtN; y, en verde, la L-Ara4N.
Figura adaptada de Raetz et al.,
2007.
En el caso de Aeromonas hydrophila AH-3 (serotipo O:34), el lípido A está
constituido también por un disacárido de GlcN, unidas mediante un enlace β(1-6), cuyos
grupos fosfato en las posiciones 1 y 4’ presentan sustituciones con residuos de L-Ara4N
(Knirel et al., 2004). Respecto a su estructura acilada, se han descrito cambios como
consecuencia de una adaptación térmica, de forma que a elevadas temperaturas (37ºC) se
produce un incremento de los niveles de ácidos grasos hidroxilados y saturados
(principalmente, 2-hidroxilaureato, 3-hidroxilaureato, 2-hidroximiristato, laureato y
palmitato) (Merino et al., 1992c).
1.2.2.3 Biosíntesis del lípido A
La ruta biosintética del lípido A es un proceso que tiene lugar en el citoplasma y en
la cara citoplasmática de la membrana interna. La de E. coli es la mejor caracterizada pero
las nueve enzimas constitutivas implicadas están altamente conservadas en la mayoría de
las bacterias Gram negativas (Raetz y Whitfield, 2002). Sphingomonas paucimobilis
constituye una de las excepciones, debido a que su membrana externa contiene
glicoesfingolípidos en lugar de lípido A (Kawasaki et al., 1994).
Uno de los primeros precursores que se necesitan es la UDP-N-acetilglucosamina
(UDP-GlcNAc), cuya formación la lleva a cabo la enzima bifuncional GlmU que acetila la
33
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
GlcN-1-P y, posteriormente, activa la GlcNAc (Mengin-Lecreulx y Heijenoort, 1994) (Fig.
1.4). Se trata de un precursor que participa en varias rutas biosintéticas, entre ellas, la
formación del peptidoglicano y la síntesis de algunos antígenos O.
N-acetilglucosamina-6-P
nagA
Acetato
Fructosa-6-P
glmS
nagB
Glucosamina-6-P
glmM
Glucosamina-1-P
Acetil-CoA
glmU
Figura 1.4. Ruta de biosíntesis de la UDP-Nacetilglucosamina (UDP-GlcNAc). Figura adaptada
de Mengin-Lecreulx y Heijenoort, 1996.
N-acetilglucosamina-1-P
UTP
glmU
UDP-N-acetilglucosamina
La reacción inicial en la biosíntesis del lípido A está catalizada por la aciltransferasa
LpxA y consiste en la acilación de la UDP-GlcNAc en la posición 3 con R-3hidroximiristato, el cual tiene que estar unido a la proteína transportadora de grupos acilo
ACP (Acil Carrier Protein) como dadora del sustrato. Leptospira interrogans,
Acidithiobacillus ferrooxidans y Legionella pneumophila, entre otras, contienen una
deshidrogenasa (GnnA) y una transaminasa (GnnB) que, en dos reacciones sucesivas,
convierten la UDP-GlcNAc en su análogo UDP-GlcNAc3N (UDP-2-acetamido-3-amino2,3-didesoxiglucosa), sobre el que se produce la acilación con LpxA (Sweet et al., 2004).
A continuación, actúa la desacetilasa LpxC liberando el grupo acetilo de la posición
2, lo que significa la primera reacción irreversible de la vía. Seguidamente, una segunda
aciltransferasa, LpxD, transfiere un segundo grupo R-3-hidroximiristato, formando la
UDP-2,3-diacil-GlcN. Estas tres enzimas, LpxA, LpxC y LpxD, presentan una localización
citoplasmática. La pirofosfatasa LpxH genera, a continuación, el lípido X (2,3-diacil-GlcN1-P) y la disacárido sintasa LpxB cataliza el enlace glicosídico β(1’-6) entre una molécula
de UDP-2,3-diacil-GlcN y el lípido X. LpxB y LpxH son proteínas periféricas de la
membrana y las cuatro enzimas que actúan a continuación son proteínas integrales de la
34
Introducción
membrana interna. Una vez formado el disacárido, la quinasa LpxK lo fosforila en la
posición 4’ y forma la molécula conocida como lípido IVA. La transferencia del primer
residuo de Kdo (KdoI) a la segunda GlcN mediante un enlace α(2-6’), a partir del azúcar
nucleótido CMP-Kdo, es catalizada por la Kdo transferasa, proteína integral de la
membrana interna, codificada por el gen waaA. Se trata de una enzima bifuncional en E.
coli ya que añade dos residuos de Kdo, el segundo (KdoII) mediante un enlace α(2-4) con
el primero. Esta reacción constituye el primer paso para la biosíntesis del núcleo del LPS.
En E. coli, la biosíntesis del lípido A se completa con la acción de dos aciltransferasas,
LpxL y LpxM, que catalizan la transferencia de laureato y miristato, respectivamente, a los
acilos de la segunda GlcN (Raetz y Whitfield, 2002; Trent, 2004) (Fig. 1.5).
Figura 1.5. Ruta constitutiva de la biosíntesis del Kdo2-lípido A en E. coli K-12. Figura adaptada de Raetz et al., 2007.
Durante la biosíntesis
del
lípido A,
en los
miembros
de la familia
Enterobacteriaceae, se añaden dos moléculas de Kdo al lípido IVA. Muchas otras bacterias
Gram negativas también contienen un lípido A glicosilado con dos moléculas de Kdo
(Rietschel et al., 1992). Sin embargo, en Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae,
Bordetella spp., Shewanella putrefaciens y otras especies, la enzima WaaA incorpora un
35
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
único residuo de Kdo, tratándose en estos casos, de una enzima monofuncional. Además,
este único Kdo está fosforilado en la posición 4, ocupada normalmente por el segundo Kdo
en la mayoría de bacterias Gram negativas, gracias a la quinasa dependiente de ATP,
asociada a la membrana interna, KdkA (Kdo kinase A) (White et al., 1999) (Fig. 1.6).
Figura 1.6. Biosíntesis del P-Kdolípido IVA. Figura adaptada de White
et al., 1999.
En Pasteurella multocida, han sido descritos, recientemente, los dos tipos de lípido A
glicosilado, de manera que se expresan dos glicoformas simultáneas del núcleo de su
lipooligosacárido (LOS) (ver apartado 1.2.3.1). La predominante contiene un único Kdo
fosforilado y la segunda está formada por dos residuos de Kdo. Esto es debido a la
expresión simultánea de una Kdo transferasa bifuncional, una Kdo quinasa que fosforila a
una tasa elevada y dos heptosiltransferasas I diferentes (ver apartado 1.2.3.3). Otras
especies como Mannheimia haemolytica y Actinobacillus pleuropneumoniae parecen
contener también los mismos genes en su genoma, aunque sólo en el primer caso se ha
encontrado más de una glicoforma (Harper et al., 2007).
Por otro lado, aunque el LPS de Helicobacter pylori contiene un único Kdo no
fosforilado, su Kdo transferasa es bifuncional. La eliminación del KdoII tiene lugar a nivel
periplasmático mediante la acción de una enzima unida a la membrana con actividad Kdo
hidrolasa (Stead et al., 2005), actividad que también ha sido descrita en membranas de
Francisella novicida (Wang et al., 2004a).
1.2.2.4 Organización genética del lípido A
El sistema de síntesis del lípido A se encuentra altamente conservado y los genes que
codifican para las diversas enzimas de la ruta biosintética son de copia única en la mayoría
de bacterias (Raetz y Whitfield, 2002). Legionella pneumophila es la única en la que se
36
Introducción
han descrito parálogos para varios de los genes implicados en la biosíntesis de su lípido A
(Albers et al., 2007).
La mayoría de los genes necesarios para su producción se encuentran dispersos a lo
largo del genoma bacteriano debido al hecho de compartir intermediarios con otras rutas de
biosíntesis de macromoléculas. Sólo algunos de ellos (lpxA, lpxB y lpxD) se han visto
agrupados en un operón complejo que se denominó, inicialmente, Operón de Síntesis
Macromolecular II (OSMII) en el que, entre sus once genes, también se localizan genes
para la replicación del ADN y la biosíntesis de glicerofosfolípidos (Tomasiewicz, 1990)
(Fig. 1.7). Posteriormente, fueron también identificados en esta agrupación genes
necesarios para la biogénesis de la membrana externa, implicados en el transporte y
ensamblaje de proteínas de membrana externa (OMP) y en la regulación de la respuesta al
choque térmico mediada por el factor σE (Genevrois et al., 2003; Bos et al., 2007).
Los genes lpxD y lpxA, que codifican aciltransferasas, se hallan separados por el gen
fabZ que codifica una R-3-hidroximiristoil deshidratasa relacionada con la biosíntesis de
palmitato. De esta manera, tres genes que codifican enzimas que utilizan el mismo sustrato
se hallan agrupados y, presuntamente, corregulados (Schnaitman y Klena, 1993). El gen
lpxB, que codifica la disacárido sintasa, se halla localizado inmediatamente a continuación
del gen lpxA, de manera que en E. coli existe solapación entre el codón de terminación de
uno y el de inicio de la transcripción del otro, lo que sugiere que se transcriben y traducen
de forma acoplada (Crowell et al., 1987). Por otro lado, ha sido identificada una secuencia
promotora dependiente del factor σE en la región 5’ del gen hlpA (skp), que codifica una
chaperona periplasmática de OMP, y en la región 5’ del gen lpxD. Los genes transcritos a
partir de ellas formarían parte del regulón σE de E. coli que se induce por la acumulación
de proteínas no plegadas correctamente en el periplasma o alteraciones en la estructura del
lípido A, con el fin de responder a diferentes situaciones de estrés que alteren la membrana
(Dartigalongue et al., 2001; Tam y Missiakas, 2005).
cdsA
yaeL
yaeT
hlpA
lpxD
fabZ
lpxA
lpxB
rnhB
dnaE
accA
Figura 1.7. Esquema del operón OSMII en E. coli K-12. Los genes implicados en la biosíntesis del lípido A están
sombreados. Figura adaptada de Genevrois et al., 2003.
La secuenciación del genoma de H. influenzae, entre muchos otros, puso de
manifiesto el elevado grado de conservación de los genes lpx, ya que mantienen incluso el
37
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
mismo orden dentro del operón y pueden sustituir funcionalmente a los genes de E. coli
(Servos et al., 1996).
El resto de genes se localizan en diferentes regiones del cromosoma. El gen lpxC,
que codifica la desacetilasa, se encuentra en el extremo 3’ de una gran agrupación de genes
relacionados con la división celular y con la secreción de proteínas (Schnaitman y Klena,
1993). Por otro lado, el gen lpxK, que codifica la quinasa que permite la formación del
lípido IVA, está localizado en un operón junto con el gen msbA, implicado en las etapas
iniciales de la exportación del lípido A y de los fosfolípidos (Garrett et al., 1997).
Los genes implicados en la vía constitutiva de biosíntesis del lípido A son los más
conservados, mientras que los que codifican las enzimas implicadas en su modificación
covalente muestran una mayor variabilidad (Raetz y Whitfield, 2002).
1.2.2.5 Lípido A y viabilidad celular
La mínima estructura del LPS requerida para la viabilidad de la mayoría de las
bacterias Gram negativas es la constituida, normalmente, por dos moléculas de Kdo unidas
al lípido A (Kdo2-lípido A), conocida como quimiotipo Re del LPS, como en el caso de E.
coli y de S. typhimurium (Belunis et al., 1995; Goldman et al., 1988). E. coli puede
sobrevivir también con un único Kdo unido al lípido A al reemplazar su WaaA bifuncional
por la enzima monofuncional de Haemophilus junto con la coexpresión de la Kdo kinasa
KdkA de éste (Brabetz et al., 2000). La presencia de dos grupos cargados negativamente, y
por consiguiente, de la molécula de Kdo, parece ser un requisito fundamental para el
mantenimiento de la integridad de la membrana externa y la viabilidad celular. La falta de
alguno de los enzimas implicados en la biosíntesis del Kdo (ver apartado 1.2.3.3) o de la
Kdo transferasa resulta en un mutante no viable en la mayoría de los casos (Raetz y
Whitfield, 2002).
Las moléculas de Kdo estabilizan la membrana externa participando en la unión
con cationes divalentes junto con las cargas negativas de los grupos fosfato del lípido A.
Esto permite la interacción lateral entre moléculas de LPS adyacentes, de manera que se
crea una barrera impermeable a la difusión de moléculas hidrofóbicas y péptidos
catiónicos. En la creación de esta barrera y en el mantenimiento de la integridad de la
membrana externa también son importantes las interacciones hidrofóbicas entre las
cadenas aciladas saturadas del lípido A, manteniendo un bajo grado de fluidez (Nikaido et
al., 2003).
38
Introducción
En E. coli y S. typhimurium, la acción de LpxL y LpxM requiere de la presencia del
disacárido de Kdo en el lípido A para poder completar el proceso de acilación. Precursores
no acilados completamente o no glicosilados que fuesen transportados comprometerían la
estabilidad y la permeabilidad de la membrana externa. Mutantes en la síntesis de Kdo de
S. typhimurium presentan sensibilidad a la temperatura de crecimiento y acumulación del
lípido IVA tetraacilado en las condiciones no permisivas (Rick y Young, 1982), al igual que
el mutante de E. coli en la Kdo transferasa (Belunis et al., 1995).
Sin embargo, el orden de acilación no es universal. En Pseudomonas aeruginosa, la
acilación precede a la adición del Kdo (Mohan y Raetz, 1994) y en Neisseria meningitidis
parece ocurrir lo mismo, dada la descripción de un mutante en su Kdo transferasa que es
viable y expresa un lípido A completamente acilado (Tzeng et al., 2002a). Mutantes
viables sin esta enzima también han sido conseguidos en Yersinia pestis (Tan y Darby,
2005) y en Moraxella catarrhalis (Peng et al., 2005a). En todos estos casos, los mutantes
presentan tasas de crecimiento muy reducidas, pero la presencia de Kdo no es esencial para
su viabilidad. Mutantes en el gen kdsD, que codifica la D-arabinosa-5-fosfato isomerasa
implicada en la biosíntesis del Kdo, son también viables en N. meningitidis (Tzeng et al.,
2002b) y Y. pestis (Tan y Darby, 2005), a pesar de la ausencia de un lípido A glicosilado.
Por otro lado, también han sido descritas mutaciones en el gen lpxA de N. meningitidis
(Steeghs et al., 1998; Bos y Tommassen, 2005) y M. catarrhalis (Peng et al., 2005b) que
implican la falta total de lípido A pero resultan en un fenotipo viable, capaz de ensamblar
la membrana externa, aunque con alteraciones en la composición de fosfolípidos y la
ausencia de algunas lipoproteínas (Steeghs et al., 2001).
Ante todos estos datos, la mínima estructura del LPS requerida para el crecimiento y
la viabilidad de E. coli fue redefinida recientemente. Mediante la deleción de los dos genes
de E. coli que codifican una D-arabinosa-5-fosfato isomerasa (kdsD y gutQ) y la aparición
de una mutación supresora, se obtuvo una cepa mutante viable con una tasa de crecimiento
reducida y con el lípido IVA formando parte de su membrana interna y externa, de manera
que esta estructura sería suficiente para el ensamblaje de la membrana externa (Meredith et
al., 2006). Se sugirió que la supresión del fenotipo letal por la falta de Kdo podría ser
debida a una mutación que permitiera el transporte del lípido IVA desde la membrana
interna, a una tasa basal suficiente para evitar los efectos tóxicos secundarios debidos a su
acumulación, proporcionando una cantidad suficiente de precursores del LPS para que la
membrana externa se pudiera formar. Mutaciones puntuales en el transportador del LPS
39
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
MsbA (ver apartado 1.2.3.3) de la membrana interna compensan este fenotipo letal (Mamat
et al., 2008).
1.2.3 El núcleo del LPS
1.2.3.1 Características principales del núcleo del LPS
El núcleo del LPS es un oligosacárido heterogéneo unido al lípido A en la posición
6’. En bacterias que producen LPS de tipo S, se encuentra dividido en dos regiones: el
núcleo interno, próximo al lípido A, y el núcleo externo, donde normalmente se une el
antígeno O. Algunos patógenos de las mucosas, como Neisseria, Haemophilus,
Actinobacillus, Pasteurella, Moraxella o Campylobacter producen, sin embargo, una
molécula denominada lipooligosacárido (LOS) que contiene un núcleo interno desde el que
se extienden una o más ramificaciones mono u oligosacarídicas, que equivaldrían al núcleo
externo, y carecen de antígeno O.
El núcleo del LPS está implicado de forma indirecta en la virulencia al ser el lugar de
anclaje del antígeno O, aunque también se ha descrito una posible relación con la adhesión
de ciertas bacterias a células del hospedador (Jacques, 1996). Por otro lado, mediante
estudios realizados en E. coli y Vibrio, se ha descrito que la región del LPS a la que se
unen toxinas que son secretadas, y que permanecen asociadas a la superficie bacteriana, es
la constituida por las dos moléculas de Kdo del núcleo o por una sola desfosforilada
(Horstman et al., 2004). En el caso de Klebsiella pneumoniae, se ha demostrado la
implicación del núcleo del LPS en la unión de la cápsula a la superficie celular bacteriana
(Fresno et al., 2006) y, en S. enterica serovar Typhi, parece que es necesaria la presencia
de una glucosa terminal en el núcleo de su LPS para el reconocimiento de la bacteria y su
internalización en las células epiteliales (Hoare et al., 2006).
Dentro de un género o familia bacteriana, la estructura del núcleo interno tiende a
estar bien conservada. Las similitudes estructurales en bacterias lejanamente relacionadas
se atribuyen a su importante papel en la organización de la membrana externa (Heinrichs et
al., 1998). Las cargas negativas de los grupos carboxilo de las moléculas de Kdo, así como
las de los grupos fosfato que modifican las primeras heptosas que forman el núcleo interno,
en el caso de E. coli y Salmonella, constituyen un lugar de unión con cationes divalentes
permitiendo la interacción entre moléculas de LPS adyacentes (Yethon et al., 2000). La
falta de estos grupos fosfato, o de los residuos de heptosa a los que se unen, provoca
40
Introducción
grandes cambios en la composición y la estructura de la membrana, que se traducen en un
fenotipo pleiotrópico, conocido como deep-rough, que consiste, entre otros, en una
importante reducción de la cantidad de proteínas de la membrana externa y un aumento de
la de fosfolípidos; en una hipersensibilidad a antibióticos catiónicos (como la polimixina),
detergentes y otros compuestos hidrófobos; y en la liberación de enzimas periplasmáticas
al medio (Schnaitman y Klena, 1993). En P. aeruginosa, en cambio, la pérdida de estos
grupos fosfato o de las heptosas del núcleo interno impide su viabilidad (Walsh et al.,
2000). Por otro lado, K. pneumoniae no presenta grupos fosfato en el núcleo interno del
LPS y son las cargas negativas de los grupos carboxilo de los ácidos galacturónicos (GalA)
del núcleo las que contribuyen al mantenimiento de la membrana externa y a la resistencia
a compuestos hidrofóbicos (Izquierdo et al., 2003a; Frirdich et al., 2005). Además, estos
ácidos galacturónicos juegan un papel esencial en la unión de la cápsula a la superficie
bacteriana mediante una interacción iónica en cepas de K. pneumoniae (Fresno et al., 2006;
Fresno et al., 2007).
El núcleo externo muestra una mayor diversidad estructural al ser una región más
expuesta a las presiones selectivas del medio, de bacteriófagos y del sistema inmune del
hospedador. Sin embargo, esta variabilidad dentro de una especie, o incluso un género, es
limitada en comparación con la hipervariabilidad del antígeno O, lo que ofrece la
posibilidad de utilizar el núcleo del LPS como vacuna que proteja, a la vez, contra
diferentes especies de Gram negativas. Para ello, han sido estudiadas distintas estrategias
tales como la utilización del núcleo como antígeno para la vacuna (Stanislavsky et al.,
1997; Cross et al., 2004), para la preparación de vacunas basadas en anticuerpos (MüllerLoennies et al., 2007), en anticuerpos anti-idiotipo (Field y Morrison, 1994) o en
liposomas (Bennett-Guerrero et al., 2000).
1.2.3.2 Estructura química del núcleo del LPS
El núcleo del LPS es un oligosacárido sin unidades de repetición unido al lípido A
mediante un residuo de Kdo (KdoI). El núcleo interno está formado, principalmente, por
Kdo y heptosas, normalmente en su configuración L-glicero-D-mano-heptosa (L,D-Hep).
En algunos casos, como Acinetobacter haemolyticus o Y. pestis, un derivado del Kdo, el
ácido D-glicero-D-talo-2-octulosónico (Ko) está también presente, pudiendo reemplazar al
KdoI o al KdoII, respectivamente (Vinogradov et al., 1997; Vinogradov et al., 2002c),
pero todavía no se conoce su ruta biosintética ni la regulación de su expresión en el LPS.
41
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Algunas bacterias como Shewanella putrefaciens contienen heptosas sólo en forma de Dglicero-D-mano-heptosa (D,D-Hep) (Vinogradov et al., 2002a) y, en casos como el de
Rhizobium o Francisella turalensis, entre otras, carecen incluso de ellas (Forsberg y
Carlson, 1998; Vinogradov et al., 2002b).
El núcleo externo está formado, mayoritariamente, por hexosas, entre las cuales se
hallan, normalmente, la glucosa (Glc), la galactosa (Gal) y la N-acetilglucosamina
(GlcNAc). Por este motivo, núcleo interno y externo también se denominan, en ocasiones,
región de las heptosas y de las hexosas, respectivamente. Sin embargo, también es
frecuente hallar residuos de D,D-Hep y/o L,D-Hep en el núcleo externo (Caroff y Karibian,
2003).
La estructura del núcleo interno tiende a estar bastante conservada, especialmente
dentro de una misma familia (Fig. 1.8). A pesar de ello, suele presentar sustituciones no
estequiométricas con otros azúcares, grupos fosfato (P) o residuos de pirofosfoetanolamina
(PPEtN) o fosfocolina (PCho), lo que contribuye a crear heterogeneidad entre las
moléculas de LPS presentes, incluso, en un mismo cultivo bacteriano, de manera que, en
muchos casos, tan sólo se conoce la cadena oligosacarídica predominante para un
determinado núcleo. Alteraciones en el núcleo externo, quizás en función de las
condiciones de crecimiento y de los factores ambientales, podrían afectar a la eficiencia de
ligación del antígeno O al núcleo y contribuir, a su vez, a la heterogeneidad del LPS (Raetz
y Whitfield, 2002).
Se han descrito diferentes tipos de núcleos del LPS dentro de una misma especie y
las principales diferencias residen en el núcleo externo. En E. coli, existen cinco tipos de
núcleo conocidos (R1, R2, R3, R4 y K-12) que difieren, principalmente, en el núcleo
externo, así como en algunas sustituciones no estequiométricas del núcleo interno
(Heinrichs et al., 1998) (Fig. 1.8).
En el caso de S. enterica, se conocen dos tipos de núcleo, muy parecidos a los de E.
coli, que se corresponden a los encontrados en S. enterica sv. Typhimurium y S. enterica
sv. Arizonae y que se diferencian, tan sólo, en un residuo del núcleo externo (Kaniuk et al.,
2002) (Fig. 1.8).
42
Introducción
Gal-1→2-Glc-1→3-Glc-1→3-Hep2
↑
1
E. coli R1
Gal
GlcNAc**
2
↑
1
6
↑
1
GlcNAc
Gal
E. coli R1
2
↑
1
Glc
2
E. coli R2
GlcN
7
2
↑
1
Gal
Kdo-7
E. coli K-12
O-PS → Hep
PEtN
2
↓
4
núcleo externo →3-Hep-1→3-Hep-1→5-Kdo-2→ lípido A
GlcNAc**
4
↑
1
4
↑
4
↑
P*
P
PEtN
O-PS → Glc-1→2-Gal-1→3-Glc-1→3-Hep-
β-Gal ← O-PS
Glc-1→2-Glc-1→3-Glc-1→3-Hep2
↑
1
1
745
1
↓
7
Gal-1→2-Glc-1→3-Glc-1→3-HepE. coli R4
L-Rha
1
Hep
3
↑
1
E. coli K-12
Gal
1
Glc-1→2-Gal-1→3-Glc-1→3-HepE. coli R3
Kdo
1
β-Glc ← O-PS
O-PS → Glc-1→2-Glc-1→3-Glc-1→3-HepE. coli R2
E. coli R2, K-12 y
S. enterica
E. coli R3
3
↑
1
6
↑
1
Gal
2
↑
1
6
↑
1
GlcNAc
Gal
S. enterica sv. Typhimurium
O-PS → Glc-1→2-Gal-1→3-Glc-1→3-Hep-
7
1
β-GlcNAc
2
↑
1
6
↑
1
Glc
Gal
S. enterica sv. Arizonae IIIA
Figura 1.8. Estructuras de los núcleos de E. coli y Salmonella conocidos. El recuadro muestra la estructura del núcleo
interno. Las sustituciones no estequiométricas se indican con líneas de puntos. El núcleo externo se muestra unido a la
HepII del núcleo interno y, si se conoce, se indica el lugar de unión del antígeno O (O-PS). Todos los enlaces están en la
configuración α-anomérica excepto que se indique, las hexosas son D-piranosas y las heptosas presentan la
configuración L,D-Hep. (*): sustitución no estequiométrica en R3. (**): N-acetiladas parcialmente. Figura adaptada de
Raetz y Whitfield, 2002; Müller-Loennies et al., 2002 y Müller-Loennies et al., 2003.
En K. pneumoniae han sido descritos, también, dos tipos de núcleo, tipo 1 y tipo 2,
del LPS (Vinogradov y Perry, 2001; Regué et al., 2005b) que comparten el mismo núcleo
interno y los residuos del núcleo externo más proximales (Fig. 1.9).
Núcleo tipo 1
Q-(1→4)
Ag O
α-Kdo-(2→4)
K-(1→7)-α-Hep-(1→7)
α-Kdo-(2→6)-α-GlcN-(1→4)-α-GalA-(1→3)-α-Hep-(1→3)-α-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→6)-LÍPIDO A
J, K = H o β-GalA
J-(1→6)-β-Glc-(1→4)
Q = H o α-Hep
Núcleo tipo 2
K-(1→7)-α -Hep-(1→7)
Ag O
α-Kdo-(2→4)
β-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-GlcN-(1→4)-α-GalA-(1→3)-α-Hep-(1→3)-α-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→6)-LÍPIDO A
J-(1→6)-β-Glc-(1→4)
Figura 1.9. Estructuras de los núcleos de K. pneumoniae. Las hexosas son D-piranosas y las heptosas presentan la
configuración L,D-Hep. Dependiendo de la cepa, los residuos J y K pueden ser hidrógeno (H) o β-GalA y el residuo Q
puede ser H o α-Hep. La flecha discontinua indica el posible lugar de unión del antígeno O (Ag O). (Vinogradov y Perry,
2001; Regué et al., 2005b).
43
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
El análisis estructural de la región del núcleo no sólo se ha llevado a cabo en la
familia Enterobacteriaceae, en la cual se ha realizado un enorme progreso (Holst, 2007),
sino que también se ha caracterizado el núcleo del LPS o del LOS de una gran cantidad de
bacterias Gram negativas.
El núcleo del LPS de Aeromonas hydrophila AH-3 (serotipo O:34) está constituido
por un único Kdo fosforilado, L,D-Hep, D,D-Hep, D-Glc, D-GlcN y D-Gal. El grado de
sustitución con D-Gal es de un 50% y representa el lugar de unión del antígeno O (Knirel
et al., 2004). Esta estructura comparte muchas similitudes con la estructura del núcleo de
A. hydrophila A6 caracterizada anteriormente (Michon et al., 1984) y es también muy
parecida a la recientemente descrita del núcleo de varias cepas de A. salmonicida subsp.
salmonicida (Wang et al., 2006) (Fig. 1.10), la cual, por su parte, difiere bastante respecto
a la estructura que había sido previamente caracterizada de la cepa SJ-15 de esta misma
especie, tanto a nivel del núcleo interno como del externo (Shaw et al., 1992).
A. hydrophila AH-3
*
β-D-Gal-(1→4)
L-α-D-Hep-(1→6)


D-α-D-Hep-(1→6)-D-α-D-Hep-(1→6)-β-D-Glc-(1→4)-L-α-D-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→
α-D-GlcN-(1→7)-L-α-D-Hep-(1→2)-L-α-D-Hep-(1→3)
P-4
A. samonicida subsp. salmonicida
L-α-D-Hep-(1→6)

R→4)-L-α-D-Hep-(1→6)-β-D-Glc-(1→4)-L-α-D-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→
α-D-GlcN-(1→7)-L-α-D-Hep-(1→2)-L-α-D-Hep-(1→3)
P-4
R = α-D-Gal-(1→4)-β-D-GalNAc-(1→
o
α-D-Gal-(1→
Figura 1.10. Estructura química del núcleo de A. hydrophila AH-3 (serotipo O:34) y de las cepas A449, 80204-1 y de una
cepa con R-LPS de A. salmonicida subsp. salmonicida. Todos los monosacáridos están en la forma piranosa. (*): Lugar de
unión del antígeno O. (Knirel et al., 2004; Wang et al., 2006).
1.2.3.3 Biosíntesis del núcleo del LPS
El inicio de la síntesis del núcleo se intercala con el final de la biosíntesis del lípido
A en E. coli, que, en sus últimos pasos, requiere la unión de los residuos de Kdo a partir de
la molécula activada (CMP-Kdo). La ruta de biosíntesis del Kdo se inicia con la acción de
44
Introducción
la enzima D-arabinosa-5-fosfato isomerasa (API), codificada por el gen kdsD y, en algunos
miembros de la familia Enterobacteriaceae, como E. coli, también por el gen parálogo
gutQ (Meredith y Woodard, 2005). La API convierte la D-ribulosa-5-fosfato (Ru5P) en Darabinosa-5-fosfato (A5P) que, seguidamente, es condensada con fosfoenolpiruvato (PEP)
formándose Kdo-8-fosfato por la enzima KdsA (Kdo-8-P sintasa). A continuación, KdsC
(Kdo-8-P fosfatasa) hidroliza el fosfato para obtener la molécula de Kdo, función que en su
ausencia podría ser realizada a baja eficiencia por fosfatasas no específicas (Sperandeo et
al., 2006). Por último, la molécula de Kdo formada es activada, posteriormente, por KdsB
(CMP-Kdo sintetasa) (Wu y Woodard, 2003; Strohmaier et al., 1995) (Fig. 1.11).
O
CH2OH
O
O
KdsD/GutQ
HO
OH
CH2O
-
P
O
O
P
O
O
O
PEP
O
HO
-
HO
KdsA
O
-
HO
OH
-
OO
OH
HO
Pi
OH
-
Ru5P
O
A5P
HO
O
KdsB
O
O
O-
PPi
CMP-Kdo
O
OH
CTP
KdsC
O
OH
HO
CMP
HO
O-
Kdo-8-P
HO
OH
O-
P
O
O
Pi
O-
Kdo
Figura 1.11. Ruta de biosíntesis del CMP-Kdo.
La proteína que une los residuos de Kdo al lípido A es la Kdo transferasa,
codificada por el gen waaA. Es una enzima integral de la membrana interna con un
dominio transmembrana (Clementz y Raetz, 1991) que ha sido descrita como
multifuncional, capaz de transferir varios residuos de Kdo desde CMP-Kdo a diferentes
sustratos y formando diferentes enlaces. Se trata de una enzima bifuncional en E. coli
(Belunis y Raetz, 1992) y se ha sugerido que puede tener actividad trifuncional en aquellas
bacterias cuyo núcleo contenga tres residuos de Kdo, como en el caso de la familia
Chlamydiaceae (Löbau et al., 1995), o monofuncional, en el caso de contener uno solo,
como ocurre en H. influenzae (White et al., 1997), yendo acompañada, en este último caso,
de la actividad de la kinasa KdkA (White et al., 1999). Sin embargo, aún no es posible
deducir su mono-, bi- o trifuncionalidad mediante el análisis de su secuencia (Raetz y
Whitfield, 2002).
45
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Seguidamente, en la mayoría de los casos, se añaden secuencialmente varios
residuos de heptosa que han sido previamente sintetizados. La ruta de biosíntesis y
activación de la L,D-Hep se inicia mediante la isomerasa GmhA que convierte la
sedoheptulosa-7-fosfato en D,D-heptosa-7-fosfato. A continuación, la enzima bifuncional
HldE fosforila el anómero β, mediante su actividad kinasa, produciendo D,D-Hep-1,7bisfosfato, que será desfosforilada por la fosfatasa GmhB obteniendo D,D-Hep-1-fosfato.
HldE vuelve a actuar generando, con su función adenosiltransferasa específica para la
configuración β-anomérica, ADP-D,D-Hep (Kneidinger et al., 2002). Finalmente, la
epimerasa HldD (o GmhD) cataliza una reacción reversible, usando como cofactor
NADP+, que implica una oxidación y una reducción seguidas, dando lugar a la ADP-L,DHep (Morrison y Tanner, 2007). Las dos formas activadas de la heptosa se sintetizan en su
configuración β-anomérica, forma en la que son sustratos para las heptosiltransferasas
(Zamyatina et al., 2000) (Fig. 1.12).
O
P
O-
O
O
O
P
O-
P
O
OH
HO
O
OH
OH
GmhA
HO
OH
HldE
O
HO
CH2OH
OH
HO
OH
O
HO
OH
O
HO
OH
P
O
ADP
D-glicero-β-D-mano-heptosa-1,7-biP
D-glicero-α,β-D-mano-heptosa-7-P
GmhB
Pi
OH
OH
OH
HO
HO
HldD
OH
HO
O
HO
O
O
OH
sedoheptulosa-7-P
HO
-
HO
OH
ATP
HO
O-
O
HO
ADP
OH
O
HO
O
HO
ADP
PPi
ADP-L-glicero-β-D-mano-heptosa
OH
HldE
ADP-D-glicero-β-D-mano-heptosa
ATP
-
O
O
O
P
OH
O
D-glicero-β-D-mano-heptosa-1-P
Figura 1.12. Biosíntesis de la ADP-L-glicero-D-mano-heptosa en E. coli. Figura adaptada de Zamyatina et al., 2003.
El núcleo del LPS se ensambla por la acción secuencial de glicosiltransferasas
asociadas a la membrana que actúan de forma coordinada, y quizás formando un complejo,
en la cara citoplasmática de la membrana interna, donde están disponibles el aceptor y los
46
Introducción
azúcares precursores activados con nucleótidos para su transferencia (Raetz y Whitfield,
2002).
WaaQ
E. coli R1
WaaA
α-GlcN-1
7-α-Hep-(1→7)
PEtN
WaaV
WaaL
WaaG
7-α-Kdo-(2→4)
WaaF
β-Glc-(1→3)-α-Glc-(1→3)-α-Glc-(1→3)-α-Hep-(1→3)-α-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→6)- LÍPIDO A
Ag O
WaaO
WaaY PEtN
WaaT
WaaW
WaaC
P→4
α-Gal-(1→2)-α-Gal-(1→2)
P→4
WaaP
α-Kdo-2
WaaZ
S. enterica sv. Typhimurium
WaaQ
PEtN
WaaL
WaaJ
WaaG
WaaI
WaaA
4
α-Hep-(1→7)
7-α-Kdo-(2→4)
WaaF
α -Glc-(1→2)-α-Gal-(1→3)-α-Glc-(1→3)-α-Hep-(1→3)-α-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→6)- LÍPIDO A
Ag O
α-GlcNAc-(1→2)
α-Gal-(1→6)
WaaK
WaaB
WaaC
P→4
WaaY PEtN
P→4
WaaP
WabO
K. pneumoniae 52145
WaaQ
β-GalA-(1→7)-α-Hep-(1→7)
WaaL
WabM
WabK
WaaA
α-Kdo-(2→4)
WaaF
β-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-GlcN-(1→4)-α-GalA-(1→3)-α-Hep-(1→3)-α-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→6)- LÍPIDO A
Ag O
WabH
WabN
WabG
β-Glc-(1→4)
WaaC
WaaE
S. marcescens N28b
WaaL
Ag O
WaaQ
WabH
WabN
α-Hep-(1→7)
WaaF
WaaA
*
β-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-GlcN-(1→4)-α-GalA-(1→3)-α-Hep-(1→3)-α-Hep-(1→5)-α-Kdo-(2→6)-LÍPIDO A
WabM
WabK
α-Hep-(1→2)-D-α-D-Hep-(1→2)
WabG
β-Glc-(1→4)
WaaC
Orf7
WaaE
Figura 1.13. Esquema de la estructura química y de las transferasas conocidas implicadas en la biosíntesis de los núcleos
de E. coli R1 (Raetz y Whitfield, 2002), S. enterica sv. Typhimurium (Heinrichs et al., 1998; Kaniuk et al., 2002), K.
pneumoniae 52145 (Regué et al., 2005a; Regué et al., 2005b; Fresno et al., 2007) y S. marcescens N28b (Coderch et al.,
2004; Regué et al., 2005a; Regué et al., 2005b). Las enzimas que forman el núcleo interno están marcadas en azul; las del
núcleo externo, lo están en verde; las que introducen modificaciones, en naranja; la desacetilasa de GlcNAc, en lila; y la
ligasa, en rosa. Las sustituciones no estequiométricas se indican con flechas discontinuas. Las hexosas son D-piranosas y
las heptosas presentan la configuración L,D-Hep, excepto que se indique. (*): El KdoI de S. marcescens N28b lleva,
probablemente unido en la posición 4, un segundo Kdo que podría ser sustituido por un Ko, en base a la caracterización
del núcleo de otras cepas (Vinogradov et al., 2006).
47
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Aunque muchos de los genes implicados en la biosíntesis del núcleo han sido
identificados en una gran cantidad de bacterias, la gran diversidad estructural impide la
asignación de la función exacta de muchas de las tranferasas. A nivel del núcleo interno, su
conservación ha facilitado el reconocimiento de las enzimas implicadas en su biosíntesis,
de manera que, en la mayoría de los casos, las heptosiltransferasas codificadas por los
genes waaC y waaF son las que transfieren las dos primeras heptosas, la L,D-HepI y la
L,D-HepII, respectivamente (Raetz y Whitfield, 2002). Los sistemas de biosíntesis del
núcleo mejor caracterizados son el de Salmonella enterica, E. coli, Klebsiella pneumoniae
y Serratia marcescens (Fig. 1.13).
En el caso de los LOS, la síntesis del núcleo interno y la unión de los oligosacáridos
sigue el mismo mecanismo utilizado para la biosíntesis del núcleo del LPS (Raetz and
Whitfield, 2002).
El KdoI está mayoritariamente sustituido por una L,D-Hep mediante un enlace
α(1-5), reacción catalizada por la enzima WaaC. Sin embargo, en H. influenzae, la
heptosiltransferasa I difiere en la especificidad de sustrato respecto a la enzima WaaC
descrita en la mayoría de bacterias, y le fue asignado el nombre de OpsX. Mientras que la
primera muestra preferencia por la molécula de Kdo2-lípido A como aceptor, OpsX
presenta una estricta especificidad de sustrato por la molécula de Kdo fosforilada (P-KdoLípido A) (Gronow et al., 2005). En Pasteurella multocida, se han identificado dos
heptosiltransferasas I diferentes, la primera, denominada HptA, tiene como aceptor la
molécula predominante de P-Kdo-Lípido A y, la segunda, HptB, es específica para la
molécula de Kdo2-lípido A, lo que responde a la expresión de dos glicoformas simultáneas
del núcleo de su LOS (Harper et al., 2007).
Por otro lado, existen también casos, como el de Shewanella, en el que la primera
heptosa es una D,D-Hep (Vinogradov et al., 2002a; Vinogradov et al., 2003), o casos en
los que el primer azúcar unido al Kdo no es una heptosa, estando el núcleo desprovisto de
ellas, como ocurre en Rhizobium o F. tularensis, donde el primer azúcar es una manosa. En
Rhizobium leguminasorum, concretamente, se ha descrito una manosiltransferasa,
denominada LpcC, implicada en la transferencia de manosa al KdoI mediante un enlace
α(1-5) a partir de GDP-manosa, y cuyo gen es capaz de complementar a un mutante en el
gen waaC de Salmonella, debido, probablemente, a la similitud estructural entre la L,DHep y la D-manosa (Kanipes et al., 2003).
48
Introducción
El núcleo del LPS puede ser también modificado mediante la adición de otros
azúcares o grupos fosfato, por la acción de kinasas, sobre la cadena principal. El orden en
el que tienen lugar estas modificaciones o la necesidad de ellas para la correcta extensión
del núcleo sugieren complicadas especificidades de sustrato para las enzimas y complejas
interacciones entre ellas para un óptimo ensamblaje (Raetz y Whitfield, 2002).
Por otro lado, la modificación con PEtN que tiene lugar en el segundo residuo de
Kdo en E. coli y S. typhimurium es llevada a cabo, seguramente a nivel del periplasma, por
una
enzima
integral
de
membrana
interna
denominada
EptB
que
utiliza
fosfatidiletanolamina (PtdEtN) como dador del sustrato, liberando una molécula de
diacilglicerol, y que es inducida por elevadas concentraciones de Ca2+ (Reynolds et al.,
2005).
Respecto al mecanismo de incorporación de residuos de GlcN al núcleo del LPS, en
K. pneumoniae, se ha descrito la participación de dos enzimas que también están presentes
en S. marcescens. En primer lugar, la glicosiltransferasa WabH incorpora un residuo de
GlcNAc a partir del precursor activado UDP-GlcNAc (Frirdich et al., 2004) y, a
continuación, actúa la desacetilasa WabN, lo cual es necesario para la incorporación del
resto de los azúcares del núcleo externo (Regué et al., 2005a). Este mecanismo, junto con
el hecho de que la UDP-GlcNAc se halle en una concentración mucho mayor que la UDPGlcN, prácticamente inexistente en la célula bacteriana (Gabriel, 1982), indica que la
incorporación de GlcNAc y su posterior desacetilación podría ser el procedimiento general
de biosíntesis de núcleos con GlcN en la familia Enterobacteriaceae (Regué et al., 2005a).
Una vez sintetizado el núcleo, tendrá lugar la unión covalente del antígeno O en la
cara periplasmática de la membrana interna. La proteína MsbA es un transportador ABC
(ATP-Binding Cassette), por lo que presenta dominios transmembrana y actividad ATPasa,
que forma un homodímero, es esencial para la supervivencia de la bacteria y está implicada
en el transporte del núcleo-lípido A al periplasma a través de la membrana interna (Zhou et
al., 1998; Chang y Roth, 2001). MsbA también ha sido relacionada con el transporte de
fosfolípidos a través de la membrana interna en E. coli (Doerrler et al., 2004) y, por otro
lado, también se ha descrito que es capaz de reconocer y transportar una amplia gama de
moléculas tóxicas (Woebking et al., 2005).
49
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
1.2.3.4 Organización genética del núcleo del LPS
La mayoría de los genes implicados en la biosíntesis del núcleo se hallan formando
operones contenidos en una agrupación génica cromosómica denominada wa, fuera de la
cual se localizan los genes conservados relacionados con la biosíntesis y activación del
Kdo y la mayoría de los implicados en la biosíntesis y activación de las heptosas. En el
caso de E. coli, S. enterica (Heinrichs et al., 1998), S. marcescens (Coderch et al., 2004),
K. pneumoniae (Regué et al., 2001) y V. cholerae (Nesper et al., 2002), esta agrupación wa
es única. Sin embargo, en otras bacterias Gram negativas, esta organización puede ser
distinta. En el caso de Bordetella, por ejemplo, los genes implicados en la biosíntesis del
núcleo y del antígeno O se hallan en una misma agrupación génica (Allen y Maskel, 1996)
y, en otros casos, puede que los genes para la biosíntesis del núcleo del LPS no estén
agrupados en una sola, sino en varias regiones, como seguramente ocurre en Y. pestis en
base al análisis de su genoma secuenciado (Knirel et al., 2007).
En E. coli y Salmonella, la agrupación wa consiste en tres operones definidos por el
primer gen de cada unidad transcripcional: hldD-, waaQ- y waaA- (Fig. 1.14). En el primer
operón, los genes hldD, waaF y waaC codifican enzimas para el paso final de la biosíntesis
y activación de la L,D-Hep y para transferirla al núcleo interno, y el gen waaL, codifica la
ligasa que une el antígeno O al núcleo-lípido A (ver apartado 1.2.5). En E. coli K-12, la
transcripción de este primer operón está regulada por un promotor de choque térmico, lo
que indica la importancia de las heptosas para el crecimiento a elevadas temperaturas
(Schnaitman y Klena, 1993), el cual es dependiente del factor σE (Dartigalongue et al.,
2001).
El operón central waaQ contiene los genes necesarios para la biosíntesis del núcleo
externo y para la modificación del núcleo interno con otros azúcares o grupos fosfato y, en
E. coli R1 y R4, el gen waaL es el último. Este operón está precedido por una región de 39
pb no traducida (Heinrichs et al., 1998) denominada JUMPStart (Just Upstream of Many
Polysaccharide-associated gene Starts) (Hobbs y Reeves, 1994) que contiene una
secuencia conservada de 8-12 pb conocida como ops (operon polarity supressor) (Nieto et
al., 1996). Esta región también se halla en operones implicados en la biosíntesis de otras
macromoléculas extracitoplasmáticas que representan factores de virulencia dirigidos a la
superficie celular (Bailey et al., 1997). La secuencia ops enlentece a la ARN polimerasa e
induce su isomerización a un estado de pausa transcripcional (Artsimovitch y Landick,
50
Introducción
2000), favoreciendo el reclutamiento del factor facilitador de la elongación de la
transcripción o antiterminador RfaH (Artsimovitch y Landick, 2002). RfaH se une
específicamente a la cadena de ADN no codificante expuesta en la superficie del complejo
de elongación de la transcripción (Artsimovitch y Landick, 2002), lo que desencadena el
desplazamiento de sus dominios y la exposición de su lugar de unión con la subunidad β’
de la ARN polimerasa (Belogurov et al., 2007). RfaH permanece unido y modifica a la
ARN polimerasa mediante una señal alostérica que aumenta la procesividad del complejo
evitando su isomerización al estado de pausa (Svetlov et al., 2007), de esta manera,
permite extender la transcripción en operones largos, eludiendo las posibles secuencias de
pausa y de terminación, y suprimiendo, así, la polaridad transcripcional. Por otro lado, la
unión de RfaH previene la unión del factor σ a la subunidad β’ de la ARN polimerasa
durante la elongación en lugares parecidos a la secuencia promotora de –10, lo que
también evita su pausa (Sevostyanova et al., 2008). RfaH y el elemento ops funcionarían
como un sistema de antiterminación en la biosíntesis del núcleo (Bailey et al., 1997), sin
embargo, la secuencia JUMPStart no se ha hallado en otras regiones wa como la de K.
pneumoniae o la de S. marcescens (Regué et al., 2001; Coderch et al., 2004).
El último operón contiene el gen waaA, que codifica la Kdo transferasa bifuncional
que coloca los dos residuos de Kdo del núcleo interno, y el gen coaD, que no está
relacionado con la biosíntesis del núcleo del LPS, sino que está implicado en la biosíntesis
de la coenzima A (Geerlof et al., 1999). Entre ambos genes, en K. pneumoniae y S.
marcescens, se sitúa el gen waaE que codifica una glicosiltransferasa que une un residuo
de glucosa a la HepI del núcleo interno mediante un enlace β(1-4). Este gen también se
halla en otros miembros de la familia Enterobacteriaceae como Yersinia enterocolitica,
Proteus mirabilis y Enterobacter aerogenes (Izquierdo et al., 2002) (Fig. 1.14).
Los genes implicados en la biosíntesis del núcleo del LPS han sido identificados en
un elevado número de bacterias, pero la asignación de una función a las proteínas que
codifican se ha llevado a cabo en muy pocos casos. No obstante, la caracterización química
de mutantes en genes específicos del LPS y los estudios de complementación realizados en
algunas bacterias, han permitido asignar funciones específicas a algunos de los genes. Las
agrupaciones génicas de E. coli (Heinrichs et al., 1998; Yethon et al., 1998), S. enterica
(Heinrichs et al., 1998; Kaniuk et al., 2002), K. pneumoniae (Regué et al., 2001; Izquierdo
et al., 2003a; Frirdich et al., 2004; Regué et al., 2005a; Regué et al., 2005b; Fresno et al.,
51
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
2007) y S. marcescens (Coderch et al., 2004; Regué et al., 2005a; Regué et al., 2005b) son
las mejor caracterizadas (Fig. 1.14).
E. coli R1
hldD
waaF
waaC
waaL
waaQ
waaA
coaD
waaP waaG
waaQ
waaA
waaV waaW waaY
waaT
waaO
waaP waaG
waaK
waaJ
waaI
waaB
S. enterica sv. Typhimurium
hldD
waaF
waaC
waaL
waaZ
waaY
coaD
K. pneumoniae 52145
hldD
waaF
waaC
wabK waaL wabM
wabN waaQ wabG
wabH wabO
waaL wabM
orf7 wabN waaQ
wabG wabH
waaE coaD
waaA
S. marcescens N28b
hldD
waaF
waaC wabK
orf11
waaA
waaE coaD
Figura 1.14. Esquema de las agrupaciones génicas wa de E. coli R1 (Heinrichs et al., 1998), S. enterica sv. Typhimurium
(Heinrichs et al., 1998), K. pneumoniae 52145 (Regué et al., 2005a; Regué et al., 2005b; Fresno et al., 2007) y S.
marcescens N28b (Coderch et al., 2004; Regué et al., 2005a; Regué et al., 2005b). Los genes en azul codifican las
transferasas que forman el núcleo interno; los naranjas, las enzimas que modifican la estructura; los verdes, las del núcleo
externo y la ligasa está en rosa. En lila se marca el gen que codifica la desacetilasa de GlcNAc y, en blanco, se indica el
gen implicado en la biosíntesis de las heptosas (hldD) y el coaD, no relacionado con la biosíntesis del núcleo del LPS.
1.2.4 El antígeno O
1.2.4.1 Características principales del antígeno O
El antígeno O es un polisacárido expuesto en la superficie bacteriana unido,
frecuentemente, a un residuo terminal del núcleo externo que consiste en una serie de
repeticiones, entre 10 y 30 normalmente, de una subunidad oligosacarídica básica, llamada
unidad o subunidad O, que, generalmente, contiene de 2 a 6 residuos de azúcares (Reeves
et al., 1996). Existe variabilidad en el número de repeticiones de esta subunidad, de forma
que las moléculas de LPS de tipo S de un cultivo bacteriano son heterogéneas en cuanto a
su tamaño, lo que produce el característico patrón de migración en “escalera” al
visualizarlas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico
(SDS-PAGE). Cada banda o “escalón” superior representa una molécula de núcleo-lípido
A con una unidad O adicional respecto al anterior, y el espacio entre cada uno de ellos está
determinado por el tamaño de esta subunidad, manteniendo cada cepa un patrón de
distribución de longitudes de cadena específico (Whitfield et al., 1997).
52
Introducción
El antígeno O es la parte más externa, inmunogénica y variable del LPS. Es uno de
los componentes de la bacteria que está sometido a una mayor presión selectiva, ya que
actúa como receptor para bacteriófagos y es también importante en la respuesta inmune del
hospedador, quedando reflejada en la elevada variabilidad estructural que presenta tanto a
nivel de la naturaleza, como en el orden y en los enlaces de los diferentes azúcares que lo
constituyen. Esta variabilidad se puede detectar mediante métodos inmunológicos, lo que
ha permitido agrupar las cepas de una especie bacteriana en diferentes serotipos.
Se trata de un importante factor de virulencia que proporciona a la bacteria una capa
superficial hidrófila que puede enmascarar importantes epítopos antigénicos conservados
de la membrana externa y que es capaz de conferir resistencia a la actividad bactericida del
complemento, en función de la cantidad de moléculas de LPS con antígeno O, así como de
la longitud de esta cadena polisacarídica (ver apartado 1.2.1). Por otro lado, también se ha
descrito, en muchas bacterias patógenas, el papel que juega como adhesina y,
consecuentemente, su importancia en la colonización de las mucosas del organismo
hospedador (Merino et al., 1996c; Merino et al., 1996d).
En A. hydrophila AH-3 (serotipo O:34), se han observado cambios en el LPS, como
consecuencia de una adaptación térmica, que implican la presencia o ausencia de antígeno
O. Las moléculas de LPS de las bacterias crecidas a 20ºC, o a 37ºC y elevada osmolaridad,
son de tipo S, mientras que las crecidas a 37ºC en condiciones de baja osmolaridad son de
tipo R (Merino et al., 1992c; Aguilar et al., 1997). El LPS de tipo S proporciona a las
bacterias una mayor actividad hemolítica, un aumento de la virulencia en peces y ratones
(Merino et al., 1992c), un incremento de la adhesión a células epiteliales humanas y
resistencia a la actividad bactericida del suero no inmune (Aguilar et al., 1997).
1.2.4.2 Estructura química del antígeno O
Existe una amplísima diversidad estructural a nivel del antígeno O ya que las
subunidades repetitivas pueden diferir en los monómeros que las forman, en la posición y
en la estereoquímica de los enlaces O-glicosídicos, y en la presencia o la ausencia de
sustituyentes no sacarídicos. Han sido descritos más de 60 monosacáridos y unos 30
componentes no sacarídicos diferentes. Estas subunidades, lineales o ramificadas, pueden
estar formadas por un solo tipo de monosacárido (formando homopolisacáridos) o por
varios (heteropolisacáridos) (Raetz y Whitfield, 2002).
53
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Las sustituciones no estequiométricas y otras modificaciones tienen un importante
papel en la antigenicidad, de forma que adiciones de grupos acetilo o de residuos de
glucosa y modificaciones de los enlaces entre residuos pueden cambiar el serotipo de la
bacteria, definido por la estructura del antígeno O. En algunos casos, estas modificaciones
pueden ser el resultado de la presencia de bacteriófagos lisogénicos que codifican enzimas
que alteran la biosíntesis del antígeno O (Schnaitman y Klena, 1993).
El número de antígenos O diferentes puede variar considerablemente de una especie
a otra. En E. coli han sido identificados más de 180 antígenos O diferentes (Stenutz et al.,
2006) y en S. enterica, unos 54. La mayoría de los antígenos O de E. coli y S. enterica son
heteropolisacáridos. En cambio, casi todos los antígenos O de K. pneumoniae son
homopolisacáridos (Samuel y Reeves, 2003).
Dentro de las Aeromonas mesófilas, se definieron 44 serotipos O (Sakazaki y
Shimada, 1984), que fueron ampliados posteriormente a 97 (Thomas et al., 1990), entre los
cuales, O:11, O:16 y O:34 destacan por su incidencia en infecciones en humanos (Janda et
al., 1996) y, junto con el serotipo O:18, están relacionados con más del 60% de los casos
de septicemia (Janda y Abbott, 1998).
Varias estructuras químicas han sido descritas en el género Aeromonas, como la del
antígeno O:11 de A. hydrophila LL1 (Shaw et al., 1984) y la de los antígenos O de las
cepas 11212 de A. caviae (Linnerborg et al., 1996), A. trota 1354 (Knirel et al., 1996) y A.
salmonicida A449, 80204 y 80204-1 (Wang et al., 2005) (Fig 1.15). En este último caso, la
estructura resulta ser bastante diferente a la previamente descrita en la cepa SJ-15 (Shaw et
al., 1983). Curiosamente, la cepa 80204-1 de A. salmonicida, cuando es capaz de expresar
la cápsula, produce un nuevo antígeno O que presenta una estructura idéntica a la del
polisacárido capsular (Wang et al., 2004b).
El antígeno O:34 de A. hydrophila AH-3 es un heteropolisacárido cuya unidad
repetitiva consiste en un tetrasacárido que contiene D-manosa (D-Man), D-Nacetilgalactosamina (D-GalNAc) y dos residuos de 6-desoxi-L-talosa (L-6dTal). La 6dTalI
está acetilada estequiométricamente en la posición 2 y la 6dTalII contiene cero, uno o dos
grupos O-acetilo en cualquier posición (Fig 1.15) (Knirel et al., 2002).
54
Introducción
A. samonicida A449, 80204, 80204-1
A. caviae 11212
OAc (75%)
↓
2
→3)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-L-Rhap-(1→
3
↑
1
α-D-Glcp
α-L-Rhap
1
↓
3
→6)-β-D-ManpNAc-(1→4)-β-D-GlcAp-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→
4
↑
1
β-D-Galp
α-L-Rhap
1
↓
3
→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-α-L-Rhap-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→
2
4
↑
↑
1
1
α-Colp
α-Colp
A. trota 1354
OAc (21%)
↓
2
→4)-α-L-Rhap-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→
A. hydrophila LL1
A. hydrophila AH-3 (O:34)
→3)-β-D-GalpNAc-(1→4)-α-D-Manp-(1→3)-α-L-6dTalpI2Ac-(1→
3
↑
1
α-L-6dTalpIIAc0-2
Figura 1.15. Estructura química de la unidad repetitiva del antígeno O de las cepas de A. salmonicida A449, 80204 y
80204-1 (Wang et al., 2005), de A. caviae 11212 (Linnerborg et al., 1996), de A. trota 1354 (Knirel et al., 1996), de A.
hydrophila LL1 (Shaw et al., 1984) y de A. hydrophila AH-3 (O:34) (Knirel et al., 2002). Ac y OAc: grupo O-acetilo;
Col: colitosa (3,6-didesoxi-L-xilo-hexosa); Gal: galactosa; GalNAc: N-acetilgalactosamina; Glc: glucosa; GlcA: ácido
glucurónico; GlcNAc: N-acetilglucosamina; Man: manosa; ManNAc: N-acetilmanosamina; Rha: ramnosa; 6dTal: 6desoxitalosa; p: forma piranosa.
1.2.4.3 Biosíntesis del antígeno O
En la biosíntesis del antígeno O, se pueden diferenciar tres procesos. El primero
implica la biosíntesis de los precursores azúcar nucleótido del antígeno O en el citoplasma.
55
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
En el segundo, se produce la transferencia secuencial mediante glicosiltransferasas de los
diferentes azúcares a partir de sus precursores nucleotídicos para formar un oligo o
polisacárido sobre un transportador lipídico, el undecaprenil-fosfato (Und-P) (Fig. 1.16),
situado en la cara citoplasmática de la membrana interna. Y, por último, tiene lugar la
translocación a través de la membrana interna y la polimerización, dependiendo este orden
de la vía utilizada (Samuel y Reeves, 2003).
Figura 1.16. Estructura del undecaprenil-fosfato
(poliisoprenoide de 55 átomos de carbono).
Figura adaptada de Raetz et al., 2007.
1.2.4.3.1 Biosíntesis de los precursores azúcar nucleótido
Los precursores de varios de los azúcares comunes del antígeno O o del núcleo del
LPS forman parte de otras rutas metabólicas de la bacteria, como la UDP-Glc (UDPglucosa), la UDP-Gal (UDP-galactosa) y la UDP-GlcNAc (UDP-N-acetilglucosamina).
Los genes implicados en la biosíntesis de estos azúcares nucleótido no se encuentran,
normalmente, duplicados en las agrupaciones génicas wb responsables de la biosíntesis del
antígeno O. En cambio, en ellas sí que se localizan aquellos genes implicados en la
biosíntesis de los azúcares que forman parte de los antígenos O y no son esenciales para la
bacteria. Algunos de los precursores permiten la incorporación directa del azúcar y/o
sirven de intermediarios para la síntesis de otros monosacáridos activados. Se han descrito
varias de las rutas de biosíntesis de los azúcares presentes en los antígenos O que parecen
estar conservadas en un amplio rango de especies (Samuel y Reeves, 2003) (Fig 1.17).
La formación de la GDP-Man (GDP-manosa) requiere tres etapas sucesivas. La
primera consiste en la isomerización de la fructosa-6-P a manosa-6-P mediante la acción
de la fosfomanosa isomerasa codificada por el gen manA, que se halla fuera de la
agrupación wb. A continuación, la fosfomanomutasa codificada por manB forma la
manosa-1-P sobre la que actúa, por último, la GDP-manosa pirofosforilasa codificada por
manC. En algunos casos, ManC es bifuncional y presenta también actividad fosfomanosa
isomerasa (Samuel y Reeves, 2003) (Fig 1.17).
La L-6dTal (6-desoxi-L-talosa) se incorpora al antígeno O a partir de la dTDP-L6dTal, cuya biosíntesis parte de la glucosa-1-P e implica la acción secuencial de cuatro
enzimas:
56
RmlA
(glucosa-1-P
timidiltransferasa),
RmlB
(dTDP-D-glucosa-4,6-
Introducción
deshidratasa), RmlC (dTDP-4-deshidroramnosa-3,5-epimerasa) y Tll (dTDP-6-desoxi-Llixo-4-hexulosa reductasa) (Nakano et al., 2000). La proteína RmlD (dTDP-4deshidroramnosa reductasa) presenta la misma actividad reductasa que Tll y actúa sobre el
mismo producto producido por RmlC, pero da lugar al epímero dTDP-L-Rha (dTDP-Lramnosa). Los genes rmlA, rmlB, rmlC y rmlD, necesarios para la síntesis del precursor de
la L-Rha, ampliamente distribuida en los antígenos O, suelen hallarse juntos en el extremo
5’ de la agrupación wb con diferente orden según la especie (Samuel y Reeves, 2003) (Fig
1.17).
galK
galactosa
ATP
galT
galactosa-1-P
UDP-Gal
ADP
galE
pgm
glucosa-6-P
galU
glucosa-1-P
pgi
manosa-6-P
manA
manB
GTP
glmS
glucosamina-6-P
PPi
rmlA
fructosa-6-P
nagB
manosa-1-P
UTP
UDP-Glc
dTTP
nagA
PPi
H2O
manC
glmM
PPi
Acetato
AcetilCoA
rmlC
glmU
CoA
dTDP-6-desoxi-Llixo-4-hexulosa
N-acetilglucosamina-1-P
UTP
glmU
rmlD
tll
PPi
UDP-GalNAc
gne
UDP-GlcNAc
rmlB
dTDP-6-desoxi-Dxilo-4-hexulosa
glucosamina-1-P
GDP-Man
dTDP-Glucosa
N-acetilglucosamina-1-P
dTDP-L-Rha
dTDP-L-6dTal
Figura 1.17. Rutas biosintéticas de algunos precursores azúcar nucleótido.
1.2.4.3.2 Biosíntesis de la unidad O
La síntesis de la subunidad repetitiva del antígeno O tiene lugar en la cara
citoplasmática de la membrana interna en la que los precursores azúcar nucleótido del
citoplasma están disponibles. La reacción inicial implica la transferencia de un azúcarfosfato, a partir de su precursor, al transportador lipídico Und-P, formándose un enlace
fosfodiéster y liberándose NMP. Las transferasas que catalizan esta reacción inicial
presentan dominios transmembrana, no comunes en el resto de glicosiltransferasas, y
pertenecen a la familia de las transferasas poliisoprenil-fosfato N-acetilhexosamina-1fosfato (PNPT) o a la familia de las transferasas poliisoprenil-fosfato hexosa-1-fosfato
57
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
(PHPT). Las proteínas de la familia PNPT se han encontrado en eucariotas y procariotas, y
un ejemplo es WecA, proteína bacteriana que transfiere GalNAc-P o GlcNAc-P al Und-P.
En la familia Enterobacteriaceae, wecA no se localiza en la agrupación wb, sino en la de
biosíntesis del antígeno común de las enterobacterias (ECA), en la cual participa. La
familia PHPT, cuyos miembros han sido identificados sólo en bacterias, incluye a la
proteína iniciadora WbaP, identificada en S. enterica, que transfiere la galactosa-1-P inicial
a partir de UDP-Gal (Valvano, 2003).
Una vez se ha completado la reacción de iniciación, el resto de azúcares son añadidos
en el extremo no reductor de la molécula de forma secuencial por glicosiltransferasas
específicas, que se hallan en el citoplasma o asociadas a la membrana mediante
interacciones electrostáticas, hasta que se sintetiza una unidad repetitiva o todas ellas (todo
el antígeno O), dependiendo de la vía de ensamblaje y translocación utilizada. Se han
descrito una gran variedad de glicosiltransferasas, que reflejan la diversidad observada en
las estructuras del antígeno O. Las glicosiltransferasas son específicas del azúcar que
deben unir, del azúcar aceptor y del carbono aceptor del enlace glicosídico (Samuel y
Reeves, 2003).
1.2.4.3.3 Translocación y polimerización
Hasta el momento, sólo se conocen tres rutas para la polimerización y translocación
del antígeno O que se denominan: Wzy-dependiente, transportador ABC-dependiente y
sintasa-dependiente (Raetz y Whitfield, 2002).
1.2.4.3.3.1 Sistema Wzy-dependiente
El sistema Wzy-dependiente (Fig 1.18) implica la acción de, al menos, tres
proteínas: Wzx, Wzy y Wzz. Esta vía es característica de la síntesis de antígenos O que son
heteropolisacáridos, muchos de los cuales presentan ramificaciones. Mediante esta vía, las
subunidades repetitivas ligadas al Und-PP (undecaprenil-pirofosfato) sintetizadas
individualmente son translocadas a través de la membrana interna por una proteína
transmembrana con función flipasa denominada Wzx. El mecanismo exacto de transporte
de las subunidades es desconocido, sin embargo se ha propuesto que Wzx podría reconocer
y posiblemente interaccionar con el primer azúcar unido al Und-PP (Marolda et al., 2004).
La polimerización de las subunidades repetitivas tiene lugar en la cara
periplasmática de la membrana interna y es llevada a cabo por la polimerasa del antígeno
58
Introducción
O, Wzy, proteína integral de la membrana que transfiere el extremo reductor del polímero
en formación desde el transportador Und-PP al extremo no reductor de la nueva unidad de
repetición ligada a su Und-PP. Mutantes en la proteína Wzy producen un LPS conocido
como SR-LPS (Semi-Rough), con una única subunidad O unida al núcleo. En cada
reacción de polimerización se incrementa la longitud de la cadena y se libera una molécula
de Und-PP que debe ser reciclada a la forma activa monofosforilada, ya que dada su
elevada utilización en este caso, su disponibilidad se convierte en un factor limitante. Este
mecanismo de biosíntesis del antígeno O resulta inhibido por la bacitracina, que impide la
reacción de desfosforilación que recicla el Und-PP (Valvano, 2003). Esta desfosforilación
de reciclaje, a nivel de la cara periplasmática de la membrana interna, es llevada a cabo en
E. coli por las proteínas de membrana PgpB, YbjG y LpxT con actividad pirofosfatasa, la
última de las cuales cataliza la transferencia del grupo fosfato del Und-PP a la posición 1
del lípido A, que pasa a estar bifosforilada, lo que ocurre en un tercio de las moléculas
(Valvano, 2008).
Figura 1.18. Esquema de la polimerización y
translocación del antígeno O del LPS
mediante el sistema Wzy-dependiente. Figura
adaptada de Raetz y Whitfield, 2002.
Por último, otra proteína de la membrana interna, Wzz, actúa regulando la longitud
de las cadenas polisacarídicas y generando la distribución modal específica de cada cepa
(Valvano, 2003). El mecanismo de acción de Wzz no está claro, aunque se han propuesto
dos modelos: el primero considera que podría interaccionar con Wzy y modular su
actividad alternándola entre un estado que favorecería la elongación de la cadena
polisacarídica y otro que favorecería la terminación, mediante la transferencia del antígeno
O a la ligasa WaaL (Bastin et al., 1993). El segundo modelo sugiere que Wzz podría
funcionar como una chaperona para ensamblar un complejo formado por Wzy, WaaL y el
59
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
polisacárido unido a Und-PP, determinándose la modalidad por la proporción de Wzy y
WaaL asociadas (Morona et al., 1995). Sin embargo, la modalidad parece ser
independiente de WaaL (Feldman et al., 2005) y estar determinada antes de que tenga
lugar el proceso de ligación (Daniels et al., 2002). Estudios sobre el proceso de
translocación llevado a cabo por Wzx sugieren la formación de un complejo junto con Wzz
y Wzy (Marolda et al., 2006). Recientemente, además, se ha demostrado la presencia de un
dominio en la proteína WbaP de S. enterica que afecta la distribución modal, posiblemente,
mediante una interacción con Wzz (Saldías et al., 2008).
1.2.4.3.3.2 Sistema transportador ABC-dependiente
El
sistema
transportador
ABC-dependiente
(Fig
1.19)
está
implicado
mayoritariamente en la síntesis de homopolisacáridos lineales, sin ramificaciones. No
obstante, también ha sido descrito este mecanismo en algunos heteropolisacáridos
(Izquierdo et al., 2003b; Feng et al., 2004). Hasta el momento, todos los antígenos O
sintetizados por esta vía presentan homólogos de la proteína WecA como iniciadores. El
Und-PP-GlcNAc que se forma actúa como cebador para la extensión de la cadena, de
manera que, posteriormente, la GlcNAc será transferida a la estructura del núcleo-lípido A
durante el proceso de ligación, y, aunque no forma parte de la subunidad repetitiva, se
hallará un residuo por cada cadena de antígeno O. A continuación, una glicosiltransferasa
específica del antígeno O transfiere un adaptador al Und-PP-GlcNAc, el cual también se
hallará en la molécula final de LPS, necesario para la adición progresiva de los residuos
que formarán subunidades repetitivas hasta completar la cadena del antígeno O en la cara
citoplasmática de la membrana interna. Los azúcares se añaden a la cadena por el extremo
no reductor del polímero en formación ligado al Und-PP, de forma que no es necesaria una
actividad polimerasa, mediante transferasas que pueden ser monofuncionales o pueden
añadir dos o más residuos con un enlace específico. Todo el proceso requiere una única
molécula de Und-P por polímero, de manera que el reciclaje del Und-PP no es un factor
limitante y la vía es resistente a la bacitracina (Raetz y Whitfield, 2002).
Una vez finalizada la polimerización del antígeno O, la translocación a través de la
membrana interna es llevada a cabo por un transportador ABC de la subfamilia ABC-2,
que consiste en una proteína integral de membrana, Wzm, y una proteína hidrofílica, Wzt,
que contiene un dominio de unión al ATP en la región N-terminal (Raetz y Whitfield,
2002). En varios antígenos O sintetizados mediante esta vía, se han hallado residuos
60
Introducción
terminales no reductores, como, por ejemplo, grupos metilo, responsables de la
terminación de la cadena y la regulación de su longitud. En los antígenos O8 y O9a de E.
coli, se ha descrito, además, que esta modificación, producida por la proteína WbdD, es
requerida para la translocación, acoplándose la terminación de la cadena y su transporte
(Clarke et al, 2004) y que el dominio C-terminal de Wzt reconoce, concretamente, este
residuo no reductor del extremo del polímero (Cuthbertson et al, 2007).
Figura 1.19. Esquema de la polimerización
y translocación del antígeno O del LPS
mediante el sistema transportador ABCdependiente. Figura adaptada de Raetz y
Whitfield, 2002.
1.2.4.3.3.3 Sistema sintasa-dependiente
El sistema sintasa-dependiente es únicamente conocido en el antígeno O:54 de S.
enterica serovar Borreze (Fig 1.20). La síntesis de este homopolímero de Nacetilmanosamina (ManNAc) se inicia por la
acción de WecA y, seguidamente, la transferasa
específica WbbE añade el adaptador, que en este
caso es el primer residuo de ManNAc, al UndPP-GlcNAc. Una segunda transferasa específica,
WbbF, lleva a cabo la extensión de la cadena
mediante la unión de más residuos de ManNAc.
WbbF es una proteína integral de membrana que
actúa como una sintasa, catalizando de forma
procesiva la reacción de polimerización de la
cadena
polisacarídica
y
translocándola,
simultáneamente, a través de la membrana.
Figura 1.20. Esquema de la polimerización y
translocación del antígeno O del LPS mediante el
sistema sintasa-dependiente. Figura adaptada de
Raetz y Whitfield, 2002.
61
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Aunque se desconoce el mecanismo exacto de transporte del polímero, así como también el
de terminación de la cadena (Keenleyside and Whitfield, 1996).
1.2.4.4 Organización genética del antígeno O
Los genes necesarios para la biosíntesis del antígeno O se hallan generalmente
localizados en una única agrupación génica denominada wb que, mayoritariamente, es
cromosómica. El antígeno O:54 de S. enterica serovar Borreze, codificado en un plásmido,
representa una excepción. El número de genes varía en función de la composición y
complejidad del antígeno O. La mayoría de ellos presentan sus pautas de lectura solapadas
y muchas veces se transcriben como una única unidad. Estos genes contiguos codifican las
enzimas para la biosíntesis de los precursores azúcar nucleótido, las glicosiltransferasas y
las proteínas implicadas en la translocación del antígeno O a través de la membrana interna
y en su polimerización. Algunos antígenos O contienen componentes que no son azúcares
y los genes relacionados con su biosíntesis o transferencia pueden estar presentes en la
agrupación (Samuel y Reeves, 2003). Por otro lado, en algunas agrupaciones que codifican
homopolisacáridos, se ha hallado el gen que codifica la enzima implicada en la
modificación del extremo terminal del antígeno O (Clarke et al, 2004).
La mayoría de las agrupaciones wb parecen expresarse constitutivamente y suelen
estar precedidas por una secuencia JUMPStart que contiene la región ops, lo cual indica la
actuación de un mecanismo de antiterminación de la transcripción de estos largos operones
(ver apartado 1.2.3.4) (Raetz y Whitfield, 2002).
En el caso de Y. enterocolitica O:8, existe una regulación de la transcripción de la
agrupación wb por la temperatura, de manera que a 20ºC la transcripción es óptima y a
37ºC, se produce muy poca cantidad de antígeno O. Se ha identificado un operón a 3’ de la
agrupación que contiene los genes rosA y rosB, que afectan, indirectamente, a esta
regulación transcripcional. RosA y RosB constituyen una bomba de expulsión de péptidos
catiónicos y un cotransportador antiporte de K+/H+, respectivamente. Su síntesis se activa a
37ºC y el descenso en los niveles intracelulares de K+ y el aumento de H+ pueden ser la
señal que afecte a la represión de la transcripción a nivel del promotor propio del gen wzz
(Bengoechea et al., 2002).
En S. typhimurium, la expresión del gen wzz de la agrupación wb está sujeta al
control de varios sistemas reguladores de dos componentes, que inducen la transcripción
62
Introducción
bajo diferentes condiciones ambientales, como la presencia de Fe3+ o de bajas
concentraciones de Mg2+ (Delgado et al., 2006).
Varias bacterias producen una distribución bimodal de las cadenas del antígeno O,
con dos tipos de grupos de longitudes diferentes, y dos genes wzz han sido identificados
responsables de la regulación de cada una de ellas. Uno de los genes se halla en la
agrupación wb, mientras que el otro presenta una localización cromosómica distinta, como
ocurre en S. typhimurium (Murray et al., 2003) o P. aeruginosa (Daniels et al., 2002; Kintz
et al., 2007) o, en el caso de Shigella flexneri, una localización plasmídica (Stevenson et
al., 1995; Carter et al., 2007).
La gran diversidad de estructuras de antígenos O diferentes se refleja, también, a
nivel de las agrupaciones génicas wb (Fig. 1.21), las cuales muestran, en general, un bajo
contenido de guanina y citosina (G+C) respecto a la media observada en el genoma
correspondiente, lo que puede ser debido a transferencias horizontales entre especies, que
podrían explicar, en parte, dicha diversidad. Los genes implicados en las rutas de
biosíntesis de los azúcares nucleótido se encuentran, normalmente, agrupados dentro de la
región wb, constituyendo módulos de genes separados, mientras que los que codifican
glicosiltransferasas se suelen situar de forma dispersa. La asignación de una función
específica a los genes de las agrupaciones del antígeno O resulta difícil en el caso de las
glicosiltransferasas (Samuel y Reeves, 2003).
S. enterica sv. Typhimurium O4
rmlB rmlD rmlA rmlC ddhD ddhA ddhB ddhC
Biosíntesis
de ramnosa
Biosíntesis
de abecuosa
abe
wzx
wbaV wbaU wbaN manC manB wbaP
wzz
wzy
Glicosiltransferasas Biosíntesis Iniciador Sistema de transporte
de manosa
Wzy-dependiente
K . pneumoniae O5
manC manB wzm
wzt
wbdD wbdA wbdB wbdC
Biosíntesis Transportador
de manosa
ABC
Glicosiltransferasas
Metiltransferasa
Figura 1.21. Esquema de las agrupaciones génicas wb de S. enterica sv. Typhimurium O4 (Liu
pneumoniae O5 (Merino et al., 2000). Los genes que codifican las enzimas implicadas en la
precursores activados se muestran en azul; los que codifican las glicosiltransferasas, en verde;
iniciador, en amarillo; y los que están implicados en la polimerización y el transporte, en rojo.
representado el gen que codifica la modificación terminal del homopolisacárido (Clarke et al, 2004).
et al., 1995) y K.
biosíntesis de los
el que codifica el
En naranja, se ha
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Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
Hasta el momento, en Aeromonas spp., sólo se ha descrito la agrupación génica
implicada en la biosíntesis del antígeno O de las cepas PPD134/91 y JCM3980 de A.
hydrophila (serotipo O:18). Esta agrupación incluye 17 genes, entre los cuales han sido
identificados, mediante el análisis de similitud de aminoácidos, siete genes que codifican
las enzimas implicadas en las rutas de biosíntesis de los precursores azúcar nucleótido
dTDP-ramnosa y GDP-manosa; seis genes que codifican putativas transferasas; y los genes
wzx y wzz. La función de alguna de las pautas abiertas de lectura no ha podido ser asignada
al no disponer de la estructura química (Zhang et al., 2002).
1.2.5 Ligación del antígeno O al núcleo del LPS
El mecanismo de ligación del antígeno O al núcleo del LPS a nivel del periplasma no
ha sido completamente caracterizado, y el producto del gen waaL es la única enzima que se
conoce que es requerida para el proceso. Se trata de una proteína integral de membrana
interna con ocho o más dominios transmembrana. Las secuencias primarias obtenidas de
las diversas especies presentan entre ellas bajos niveles de similitud pero comparten una
estructura secundaria muy conservada con dominios hidrofóbicos de similar distribución y
longitud. Esta diversidad en su secuencia primaria se asocia a la especificidad de la ligasa
en el reconocimiento de una estructura determinada de núcleo, dado que pueden unir a este
aceptor antígenos O de otras especies bacterianas y que hay núcleos que requieren no sólo
el residuo al que se une el antígeno O, sino también la presencia de otros residuos
proximales específicos para que tenga lugar la ligación (Whitfield et al., 1997).
Se ha propuesto que la ligación del antígeno O mediada por WaaL comprende el
reconocimiento y la separación del antígeno O unido al Und-PP y la transferencia de éste
al aceptor núcleo-lípido A. No obstante, no hay evidencia experimental que corrobore este
modelo. Sin embargo, estudios más recientes, apuestan por un proceso de interacciones
más complicado en el que la proteína WaaL no sería la única implicada en el
reconocimiento del aceptor, en el que deben intervenir otros factores adicionales. Se ha
sugerido que WaaL formaría parte de un complejo que interacciona de forma específica
con intermediarios del antígeno O unidos a Und-PP y con el aceptor núcleo-lípido A
(Kaniuk et al., 2004). Anteriormente, había sido propuesto un modelo para la vía de
biosíntesis del antígeno O Wzy-dependiente en el que un complejo formado por Wzx, Wzy
y WaaL estaría implicado en reconocer los azúcares unidos al Und-PP (Feldman et al.,
1999). Wzz es otra de las proteínas de esta vía que se piensa que podría interaccionar con
64
Introducción
WaaL, Wzy y los azúcares unidos al und-PP para formar un complejo y que diferentes
proporciones de cada una de ellas podrían determinar la elongación o terminación de la
cadena del antígeno O (Daniels y Morona, 1999). De esta manera, las variaciones en las
secuencias de las ligasas podrían reflejar no sólo especificidad por la estructura del aceptor,
sino también por las proteínas que formarían parte del complejo de biosíntesis (Raetz y
Whitfield, 2002), sin embargo interacciones proteína-proteína en las que esté implicada
WaaL no han sido demostradas.
Análisis de los dominios conservados entre ligasas de diferentes especies revelaron la
existencia de dos motivos conservados a nivel periplasmático, que resultaron cruciales para
la reacción de ligación y que, por lo tanto, podrían estar implicados en la liberación del
antígeno O del Und-PP y la transferencia al núcleo, más que en el reconocimiento de un
aceptor específico. Por otro lado, también se describió que la región C-terminal de la ligasa
de V. cholerae, que contiene un gran lazo periplasmático, sería la responsable de la
discriminación entre diferentes estructuras de núcleo (Schild et al., 2005). La existencia de
un residuo de histidina conservado en este gran lazo periplasmático e indispensable para la
función de la enzima también se ha observado en P. aeruginosa. Además, se ha descrito
que la enzima WaaL de esta bacteria, la cual podría funcionar en forma de dímero, posee
actividad ATPasa a bajas concentraciones de ATP, por lo que podría utilizar esta fuente de
energía para formar el enlace glicosídico entre el antígeno O y el núcleo, y se han
identificado dos putativos motivos de unión e hidrólisis de ATP (Abeyrathne y Lam,
2007).
1.2.6 Transporte del LPS a la membrana externa
El destino final del LPS es la superficie externa de la membrana externa. Como ya se
ha comentado, los diferentes constituyentes del LPS se sintetizan en la cara citoplasmática
de la membrana interna y la estructura núcleo-lípido A y las subunidades del antígeno O se
sintetizan y se transportan a través de dicha membrana de forma separada. Mientras que la
translocación del núcleo-lípido A es mediada por el transportador ABC MsbA (ver
apartado 1.2.3.3), las subunidades del antígeno O se transfieren a través de la membrana
interna mediante la ruta Wzy-dependiente, transportador ABC-dependiente o sintasadependiente (ver apartado 1.2.4.3.3). La unión del antígeno O, después de su
polimerización previa o no a la translocación, a la estructura núcleo-lípido A tiene lugar en
65
Caracterización del lipopolisacárido de Aeromonas mesófilas
la cara periplasmática de la membrana interna mediante un proceso que, como mínimo,
implica la acción de la ligasa WaaL (ver apartado 1.2.5).
Existen dos modelos para explicar el transporte del LPS a través del periplasma sin
que ninguno de ellos haya sido probado o descartado de forma definitiva (Bos et al., 2007).
Una posibilidad es que se trate de un mecanismo semejante al sistema Lol de transporte de
lipoproteínas, de manera que, la proteína citoplasmática LptB, junto con una proteína
desconocida integral de membrana interna y, posiblemente, la proteína YrbK formarían el
transportador ABC que entrega el LPS a la chaperona periplasmática LptA (Sperandeo et
al., 2007). El LPS sería transferido al dominio periplasmático del complejo formado por la
proteína integral de membrana externa Imp y la lipoproteína RlpB, que lo transportaría a la
superficie celular mediante una función flipasa, existiendo la posibilidad de que una de las
dos fuese la aceptora del LPS y la otra la transportadora (Wu et al., 2006) (Fig. 1.22). Un
modelo alternativo postula que el transporte del LPS podría tener lugar en puntos de
contacto entre la membrana interna y la membrana externa, conocidos como uniones de
Bayer (Tefsen et al., 2005). En este modelo, LptA, LptB, YrbK y una proteína de
membrana interna podrían estar implicadas en la formación de estas zonas de adhesión
(Bos et al., 2007) (Fig. 1.22). LptA y LptB son dos proteínas implicadas en la biogénesis
de la membrana externa que forman parte, junto con Imp y otras proteínas responsables del
transporte y ensamblaje de OMP, del regulón σE de E. coli (Sperandeo et al., 2007).
Figura 1.22. Modelos para el transporte del LPS a través del periplasma e incorporación en la membrana externa. Las
vías de translocación a través de la membrana interna y de biosíntesis del antígeno O en el periplasma no están
representadas. ME: Membrana externa; MI: Membrana interna. Figura adaptada de Bos et al., 2007.
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