preparaciòn de fases mobiles

PREPARACIÒN DE FASES MOBILES
Los
solventes acuosos, orgánicos y la mezcla entre ellos son típicamente
usados como fases móviles en cromatografía liquida (HPLC).Por su parte las
soluciones buffer son también muy usadas junto con soluciones acuosas. Sin
embargo existen entre ellas algunas restricciones en su preparación y uso.
Para algunas bibliografías la definición de buffer es vaga y a veces confusa.
Existen casos donde, debido a las diferencias entre las instrucciones dadas
en la documentación y los métodos de preparación actualmente usados se
muestra disparidad en cuanto a la preparación de las fases móviles, las cuales
afectan el resultado de los cromatogramas y por supuesto el análisis de los
resultados.
Existen múltiples aspectos en la preparación de fases móviles que pueden
convertirse en un punto ciego en el tema. Esto aplica no solo a soluciones
buffer sino también por ejemplo a los métodos de mezclado de solventes. Aquí usaremos un
buffer de fosfato como ejemplo, y observaremos el efecto que puede ocasionar el utilizar un
método de preparación diferente, en el análisis de los resultados, especialmente para la
separación de compuestos como cafeína, dihidrocodeina y acetaminofen.
1) En la preparación de la Solución Buffer.
En general ¿Cómo se describe una solución buffer de “20mM de fosfato (pH 2,5) y como
se prepara? El valor de pH de una solución acuosa de 20mM de fosfato de sodio es
aproximadamente 5.0, entonces en orden de tener un valor de pH de 2.5 indudablemente
se requiere el ajuste con algún tipo de sustancia ácida. Para esto tenemos dos posibles
alternativas. La primera se obtiene si asumimos que tomamos una solución buffer y
ajustamos el pH a 2,5 con ácido fosfórico, mas los contra iones usados no están claros, si
se incluyen en la concentración o no, de esta forma el problema es que “20 mM” se
refiere a la concentración de acido fosfórico o fosfato de sodio. Si asumimos que hay una
cierta cantidad de iones sodio, el siguiente problema es… ¿Como sabemos si en efecto
tenemos una solución buffer de 20 mM de acido fosfórico o tenemos una solución fosfato
sódico? , Podemos considerar que “ 20 mM” será la concentración del acido fosfórico?
Podríamos decir a ciencia cierta que “20mM”será la concentración de sodio simplemente,
podemos pensar que esta solución como “una solución buffer creada por el ajuste de pH
de una solución de 20 mM de fosfato dihidrogenado de sodio”. Es así que dependiendo
del ácido utilizado en el ajuste de pH, el efecto de par iónico puede ocurrir o no, y de ahí
surgen algunas discrepancias en al análisis de los resultados.
De esta manera podemos ver que existen dos posibles y muy validas interpretaciones de
solución buffer.
Fig1 Muestra el efecto en el
FIGURA 1. INFLUENCIA DEL A
análisis de los resultados de
CORMATOGRAFICO
interpretar el ejemplo anterior
en las dos diferentes maneras.
La línea superior muestra el
resultado obtenido de
interpretar “20 mM” como
concentración de acido
fosfórico y usando una solución
prepara como “20mM” de
ácido fosfórico (sódico)
ajustado a (pH 2.5) como fase
móvil.
El cromatograma de un medio e
inferior muestra el resultado
obtenido
interpretando
“20mM” como la concentración
de fosfato hidrogenado de
sodio
y
posteriormente
ajustado a pH 2,5 adicionando
el respectivo par iónico (ácido
fosfórico) y con ajuste usando
un ácido diferente como ácido
perclórico.
Como
se
muestra
la
hidrocodeina en este ejemplo,
se encuentra que en algunos
casos donde el tiempo de
retención y consecuentemente
la robustez de la técnica de
análisis son significativamente
afectadas. Indicando que el método de preparación de la solución buffer y la presión en
encontrar ayudas adecuadas previene los problemas resultante de las diferentes
interpretaciones.
2. En la mezcla de solventes orgánicos y acuosos.
Soluciones obtenidas de mezclar solventes orgánicos y acuosos son en algunos momentos
usadas como fases móviles. La forma en que esta mezcla es obtenida puede causar efectos
significativos en los resultados. Como ejemplo, consideremos una mezcla del 90% 20mM
de solución de acido fosfórico (sódico) a pH2.5 y 10% de acetonitrilo.
Si
consideramos
esta
descripción
para indicar que la
relación de mezcla
es 9:1 esto implica
que la relación en
volumen de la
solución de buffer
de 20mM de ácido
fosfórico (sódico) a
pH
2.5,
con
acetonitrilo
es
9:1,
en
otras
palabras,
la
cantidad
correspondiente
está medida fuera
de la preparación y
posteriormente
mezclada. Por otro
lado,
si
se
considera
esta
descripción
simplemente como “10% de acetonitrilo”, esto implica que la 20 mM de acido fosfórico
(sódico) ajustado a pH2,5 es usado, y que este es diluido con acetonitrilo dentro de la
preparación. Aplicando la última interpretación los cambios en los volúmenes relativos y la
concentración de buffer 20 mM de ácido fosfórico (sódico) es consecuentemente mayor.
Existe una tendencia de pensar que no hay diferencias significativas entre estas dos
interpretaciones.
La figura 2., Sin embargo muestra como los métodos de mezcla usados pueden tener un
efecto significativo en el análisis de los resultados (particularmente en los tiempos de
retención). En general, dependiendo de la preparación de las fases móviles en HPLC, se
puede notar que “A:B= 3:2 (V:V)”, indica que la cantidad de solución A corresponde a un
volumen relativo de 3 a que la cantidad de solución B corresponde a un volumen relativo
de 2, que son medidas separadas y posteriormente mezcladas, como comúnmente se
debería interpretar. (En la práctica, el volumen total de la mezcla deberá ser inferior que el
volumen relativo de 5 = 3+2).
Los problemas mencionados no solo ocurren en la preparación de las fases móviles, sino
también en la preparación de las muestras y en otras diluciones. Sin embargo las
diferentes prácticas y las convenciones usadas en diferentes campos ( ej, farmacéuticos, e
industria química), causando además una potencial causa de confusión. Documentos
oficiales, como la Farmacopea Japonesa, el “Standard Methods” para análisis para
químicos de higiene, y la (JIS) de sus siglas Estándar de Industria Japonesa, da unos
principios generales y unas definiciones relacionadas para la preparación de las soluciones.
Es recomendable referirnos a estos documentos y esforzarnos a diario para utilizar la
notación que evite la confusión.
Escrito por: Juan Felipe Barrios
Químico, Especialista en Aplicaciones, Unidad de Instrumental
Purificación y Análisis de Fluidos.