secuenciación de adn

SECUENCIACIÓN DE ADN
Una técnica propia de la Ingeniería Genética es la determinación de la
secuencia de nucleótidos de un ADN, conocida como secuenciación de dicho
ácido nucléico.
Se ha conseguido gracias a las enzimas de restricción y a la
posibilidad de obtener numerosas copias de un ácido nucléico por clonación.
Se pueden conseguir muchos fragmentos, de diversos tamaños y lo que
se trata es de recomponer la molécula original como si se tratase de un puzzle.
Así se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano.
El método más usado para la secuenciación es el conocido como
técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado
conociéndose actualmente como la técnica del didesoxi.
Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos (figura
1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos
un nucleótido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.
Figura 1
Como los nucleótidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay
que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucleótido será imposible
que se una otro nucleótido y la cadena terminará aquí
Abreviadamente,
éste
sería
el
método
a
seguir:
Como la técnica se basa en la síntesis de ADN, para hacer la reacción de
secuenciación se necesita:
•
Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que
se va a secuenciar.
Biología
y
Geología
SECUENCIACIÓN DE ADN
•
Se necesita un "cebador" (pequeña hebra de ADN de reducido número
de nucleótidos) para iniciar la síntesis. Es un corto oligonucleótido
complementario del extremo de la cadena.
•
También desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP,
dCMP.
Por último didesoxirribonucleótidos de una base en cada una de las
cuatro reacciones de secuenciación: didesoxi de ADENINA (ddATP)
didesoxi de TIMINA (ddTTP) didesoxi de CISTEINA (ddCTP)
didesoxi de GUANINA (ddGTP)
•
Biología
y
Geología
Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador,
pero cesa al incorporarse un didesoxinucleótido (Figura 4).
Posición 5
Posición 10
Figura 4
Posición 14
SECUENCIACIÓN DE ADN
Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen
de la situación del didesoxinucleótido incorporado. En el caso expuesto en el
dibujo, esta reacción de secuenciación se hace con un didesoxi de ADENINA,
lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podrá continuarse la
polimerización de nuevos nucleótidos, nos queda por tanto un pequeño
fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN
original, en ese lugar estará el nucleótido complementario que lleva TIMINA.
En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14
nucleótidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA.
Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un
didesoxirribonucleotido distinto. Los fragmentos resultantes se separan por
tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas
de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia
del ADN. (Figura 5)
COMENTARIO
1. ¿Qué importancia tiene el uso de didesoxirribonucleótidos?
2. ¿Qué posible aplicación se le puede dar a este método?
3. ¿Qué es la Taq ADN polimerasa? ¿Para qué se emplea?
Biología
y
Geología