IA-RECAT-PE-007-RE-001.

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DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE DESEMPEÑO
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1. OBJETIVO
Establecer una guía para probar la aptitud de los métodos así como la capacidad del personal apoyándose en los
parámetros estadísticos del procedimiento.
2. ALCANCE
Aplica a la determinación de parámetros de desempeño de los métodos analíticos no normalizados, métodos
normalizados empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados
utilizados para el control de alimentos, análisis químicos y residuos químicos en la sección RECAT.
3. RESPONSABILIDAD Y AUTORIDAD
3.1. Analista: Llevar a cabo los ensayos que permitan determinar los parámetros de desempeño según este
procedimiento.
3.2. Jefe de sección: Supervisar al personal en la ejecución de los ensayos establecidos en este procedimiento y
realizar la determinación de los parámetros de desempeño.
4. DEFINICIONES
Blanco de muestra o blanco de matriz: Muestra en la cual no se tiene concentración detectable de analito.
5. ABREVIATURAS Y/O SIGLAS
C.V.: Coeficiente de variación: (Desv. STD/promedio)*100
Desv. STD: Desviación estándar
IA: Inocuidad de Alimentos
LC: Límite de cuantificación
LD: Límite de detección
LDs: Señal del límite de detección
LMR: Límite máximo de residuos
PE: Procedimiento Específico
RE: Reporte
RECAT: Residuos y Contaminantes en Alimentos de Origen Terrestre
.
6. REFERENCIAS Y /O BIBLIOGRAFIA



IA-RECAT-PE-007-RE-001 Informe de validación de Método.
Miller, J; Miller, J. Estadística y quimiometría para química analítica. Prentice Hall, Madrid 2002 pp.112-150
Directiva 2002/657/CE por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de
los métodos analíticos y la interpretación de los resultados. Diario Oficial de las Comunidades Europeas.
Agosto 2002, página L 221/11 – L 221/15
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Revisión de los criterios basados en el rendimiento de los métodos de análisis para los residuos de
medicamentos veterinarios en alimentos. Comité del CODEX sobre residuos de medicamentos veterinarios
en los alimentos. Washington DC. EE.UU. Marzo 2003, página 2-10
Thompson, M; Ellison S. L. R.; Wood, R. Harmonized guidelines for single laboratory validation of methods of
analysis. IUPAC technical report. Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835–855, 2002
7. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
7.1 Fundamento Teórico
Se define validación como la demostración o confirmación basada en la recopilación y análisis de la evidencia
objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso específico propuesto y se define validación de
un procedimiento analítico, como el procedimiento para establecer por medio de estudios de laboratorio, una base
de datos que demuestren científicamente que un método analítico tiene las características de desempeño
adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. Para el caso de
metodologías utilizadas en nuestro laboratorio se evalúan los siguientes parámetros:
7.1.1 Linealidad y ámbito de trabajo
7.1.2 Límites de detección y cuantificación
7.1.3 Sensibilidad de calibración
7.1.4 Especificidad.
7.1.5 Precisiones: repetibilidad (instrumental y en muestras) y reproducibilidad intralaboratorial o precisión
intermedia
7.1.6 Veracidad (recuperación)
7.1.7 Robustez
7.1.8 Cedasticidad
Deben establecerse los requerimientos del cliente para su satisfacción y los requerimientos establecidos por las
normativas regulatorios al laboratorio, en donde se instituyen los límites máximos de residuos de productos
veterinarios o contaminantes naturales en productos de origen animal.
Se debe definir y seleccionar la metodología utilizada. En general la metodología consta una primera fase de
extracción, limpieza de extractos y una fase final de cuantificación instrumental. Debido a la diversidad de criterios
de evaluación de algunos de los parámetros mencionados, a continuación se detallarán algunas definiciones.
7.1.1 Linealidad y ámbito de trabajo:
La linealidad se refiere al intervalo de concentración para el cual se obtiene una respuesta lineal. El ámbito de
trabajo se define tomando en cuenta la linealidad y factores de importancia y conveniencia para la
metodología determinada (por ejemplo el límite máximo permitido).
7.1.2
Límites de detección y cuantificación
7.1.2.1 Límite de detección (LD): Es la mínima concentración que puede ser atribuida al analito,
convencionalmente se define como la concentración correspondiente a una respuesta igual a la
señal del blanco (yb) más tres veces la desviación estándar de la señal del blanco (LD S = yb + 3 *
sb), esta respuesta es interpolada en la curva de calibración para obtener la mínima concentración
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detectable. El cálculo se puede realizar con 20 o más determinaciones del blanco de muestra.
Este cálculo puede llevar a un estimado optimista del LD. Otra forma de calcular el LD está
definida por Miller-Miller, a partir de la desviación estándar del ajuste (sx/y) y el valor del intercepto
(b), ambos obtenidos para la curva de calibración. El LD se obtiene como la concentración
correspondiente a la respuesta calculada utilizando el valor del intercepto del ajuste de calibración
más tres veces la desviación estándar del ajuste (LDS = b + 3 * sx/y) esta respuesta es interpolada
en la curva de calibración para obtener la mínima concentración detectable. De esta forma el
resultado es un estimado más conservador del LD.
7.1.2.2 Límite de cuantificación (LC): es la menor concentración de analito que puede ser determinada
con la precisión y exactitud adecuadas. Se expresa como la señal del blanco más 10 veces su
desviación estándar, análogamente al LD, se pueden utilizar los datos de intercepto y desviación
estándar de ajuste como señal y desviación estándar del blanco, respectivamente.
7.1.3 Sensibilidad de calibración
La sensibilidad de calibración se define como el cambio de respuesta dividido por el correspondiente cambio
de concentración del estándar, este parámetro se obtiene como la pendiente de la curva de calibración.
7.1.4. Especificidad o selectividad
Capacidad de un método de distinguir entre el analito que se está midiendo y otras sustancias.
7.1.5. Precisión
Expresa la coincidencia entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestreos de una misma
muestra homogénea bajo condiciones establecidas.
La precisión está relacionada inversamente con la dispersión de los datos, la cual se estima de manera
absoluta por la Desviación Estándar (Desviación Típica Experimental) o de manera relativa por el Coeficiente
de Variación (C.V.) el cual corresponde a la desviación estándar relativa expresada como porcentaje.
En una validación interna la precisión de una metodología puede considerarse en dos niveles: repetibilidad y
reproducibilidad intralaboratorio o precisión intermedia. La primera se refiere a la precisión bajo las mismas
condiciones (laboratorio, analista, equipo, etc.); la reproducibilidad intralaboratorio se refiere a la precisión
variando algún parámetro (diferente analista, diferente día, etc.).
7.1.6. Veracidad
Expresa la concordancia entre un valor obtenido con el valor considerado como verdadero. Este parámetro se
puede determinar utilizando material de referencia certificado o por medio de muestras fortificadas con
cantidad conocida de analito.
7.1.7. Robustez
Se refiere a la capacidad de la metodología para soportar pequeños cambios en los factores que pueden
afectar de una u otra forma el resultado analítico. Es esencial evaluar que tanto pueden influir esos pequeños
cambios con el fin de determinar puntos críticos del método. La robustez de un método se puede evaluar
empleando un simple conjunto de experimentos conocido como diseño factorial incompleto, el cual se
describe en el procedimiento.
7.1.8. Cedasticidad
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7.1.8.1.
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Homocedasticidad: Propiedad de una variable aleatoria que tiene varianza finita constante. Se
dice que existe homocedasticidad cuando la varianza de los errores estocásticos de la regresión
es la misma para cada observación i (de 1 a n observaciones), es decir:
donde
es un escalar constante para todo i. Lo que significaría que habría una distribución de
probabilidad de idéntica amplitud para cada variable aleatoria.
7.1.8.2.
Heterocedasticidad: El modelo lineal general presenta heterocedasticidad cuando los errores
tienen distinta varianza, E(ui2) = σi2 (el subíndice de σi2 indica que la varianza cambia con la
observación i).
7.2 Linealidad y ámbito de trabajo
7.2.1 Se preparan disoluciones patrón de concentraciones adecuadas en al menos 6 niveles, incluyendo el
blanco, tomando como referencia lo indicado en el método de análisis, los LMRs y/o la información
histórica del laboratorio.
7.2.2 Se realiza la lectura de estas disoluciones estándar, se grafican las curvas de calibración y con base
a los datos de correlación y estimación lineal se determina la linealidad. Aplicando las herramientas
estadísticas validas para la evaluación (mínimos cuadrados, o análisis de varianzas).
7.2.3 El ámbito de trabajo se define de acuerdo a la linealidad y a lo que sea más adecuado para los
requerimientos del cliente o los límites máximos de residuos establecidos en las normativas nacionales
internacionales regulatorias del laboratorio. Esto se debe hacer para al menos 5 curvas de calibración.
7.3 Límites de detección y cuantificación
7.3.1 El límite de detección (LD) y el límite de cuantificación (LC) se determinan dependiendo de la
metodología; mediante:
a. El criterio de Miller-Miller utilizando datos de curvas de calibración preparadas sobre la matriz, donde
estas se someten a todo el procedimiento analítico.
b. La lectura independiente de por lo menos 10 blancos matriz. Al evaluar otras matrices similares, se deben
realizar al menos 5 blancos matriz para cada una.
Se determina el promedio de la señal del equipo obtenida de estas 10 lecturas de blancos matriz en análisis,
igualmente se determinará su desviación estándar.
Cada valor obtenido del cálculo será interpolado en la curva de calibración promedio obtenida en la variable
anterior (linealidad y ámbito de trabajo), para obtener su valor de concentración.
7.4. Sensibilidad
7.4.1 Esta se determina promediando los valores de pendiente de al menos 5 curvas de calibración. Estas
curvas de calibración pueden ser las mismas utilizadas para en el punto 6.1.
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7.5. Especificidad
7.5.1 Se analizan al menos 10 muestras blancos para ver si existen interferencias en la región en la cual se
espera que aparezca la señal que define la presencia del analito. Al evaluar otras matrices similares, se deben
realizar al menos 5 blancos matriz para la especificidad. Se pueden utilizar los análisis efectuados para la
determinación del los límites de detección y cuantificación.
7.6 Precisión: repetibilidad y reproducibilidad intralaboratorial
7.6.1 La repetibilidad instrumental se determina analizando la dispersión de por lo menos 6 lecturas
diferentes de una muestra blanco fortificada y se expresa como coeficiente de variación (C.V.), estas lecturas
se deben de realizar en un mismo día.
7.6.2 La repetibilidad de la metodología se determina analizando la dispersión de por lo menos 6
determinaciones de una misma muestra fortificada o positiva, analizada bajo las mismas condiciones de
analista, instrumento, mismo set de muestras, etc. Se expresa como coeficiente de variación (C.V.) en tres
ámbitos de concentraciones de trabajo, los cuales estén entre bajo medio y alto.
7.6.3 La reproducibilidad intralaboratorial o precisión intermedia se determina analizando la dispersión de
por lo menos 6 determinaciones de muestras fortificadas de concentración dentro del ámbito de trabajo y
analizadas en diferentes días, y/o diferentes analistas, se expresa como coeficiente de variación. Se puede
utilizar la información histórica del laboratorio de las recuperaciones obtenidas durante los análisis.
7.7 Veracidad
7.7.1 Se determina mediante el análisis de por lo menos 6 muestras blanco fortificadas en cada uno de 3
niveles de concentración; estos se definen tomando en cuenta el ámbito lineal y/o los Límites Máximos de
Residuos (por ejemplo, a 0,5; 1 y 1,5 veces el LMR). Se expresa como porcentaje de recuperación. Se
pueden utilizar datos históricos del laboratorio o bien datos obtenidos en los experimentos anteriores.
7.8. Robustez
7.8.1 Definir la matriz en estudio, especificando siete factores para evaluar su efecto en la metodología de
análisis, a cada factor se le asigna una letra.
7.8.2 Para cada factor se definen dos valores a probar: uno mayor (+) y otro menor (-) al de referencia; el
ámbito debe considerar como valor central el valor del factor indicado en el método.
7.8.3 Se realizan ocho experimentos por duplicado cada en uno utilizando una muestra que contenga en una
cantidad cuantificable de analito (real o fortificada), variando los factores a evaluar su efecto según se indica
en el siguiente cuadro:
Experimento Factor
1
2
3
4
5
A
+
+
+
+
-
B
+
+
+
C
+
+
+
D
+
+
-
E
+
+
-
F
+
+
+
G
+
+
-
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6
7
8
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
7.8.4 Una vez obtenidos los resultados, para evaluar el efecto de cada factor se calcula la diferencia entre el
promedio de los resultados para los cuales el factor es positivo (+) con el promedio de los resultados en los
que el factor es negativo (-); así por ejemplo para el factor A se promedian los cuatro primeros resultados y se
resta al promedio de los cuatro últimos resultados.
7.8.5 Se considera que un factor influye en el resultado cuando la diferencia obtenida en el paso anterior es
mayor que dos veces la desviación estándar de repetibilidad, lo cual lo convierte en un punto crítico de control
del procedimiento técnico.
7.9 Cedasticidad
Para evaluar la cedasticidad se realiza una comparación entre las varianzas (dispersiones) de los diferentes
niveles para la variable dependiente. Se recomiendan 2 métodos para llevar a cabo este análisis.
7.9.1 Prueba de Cochran (Distribución G)
Las k dispersiones para los niveles se ordenan de mayor a menor. Se selecciona la varianza mayor y se compara
contra la sumatoria de las varianzas. Es una prueba rápida, se emplea para casos de distribución normal y
cuando los grados de libertad entre niveles son iguales.
Gexp 
si2( máx )
k
s
i 1
2
i
Si el valor del estimador Gexp calculado es menor al valor crítico tabulado para G ( fi(máx), k, a ) (anexo 1) se dice que
es el método es HOMOCEDASTICO.
7.9.2. Prueba de Bartlett
Si los grados de libertad para cada una de las k dispersiones de los niveles es mayor a 2, se calcula la media
aritmética suspendida para las varianzas (s2pool) y sus grados de libertad (fpool). Se obtiene el estimador Bexp y si
este es menor al valor tabulado para x2( k-1, a ) (anexo 2) es HOMOCEDASTICO.
k


2.30259  f pool  log(s 2pool )   f i  log(si2 ) 
i 1



k


1
1
1 
 
1 


 3  (k  1)  i 1 f i f pool 

Bexp

En esta prueba se calcula el valor de la media aritmética suspendida (s2pool) de las varianzas para los k niveles,
así como los grados de libertad correspondientes (fpool) de la siguiente manera.
f
k
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 si2

del SENASA,
Propiedad
k
 fi
2
Normativo
pool
s
i
i 1
i 1
k

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fi
pool 
i 1
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Es una prueba cuyo cálculo se emplea para casos de distribución normal y cuando los grados de libertad entre
niveles son diferentes pero mayores a 2.
En ambas pruebas, es suficiente que una de las dispersiones sea diferente de las demás para que el resultado
sea HETEROCEDASTICO.
Si hay Homocedasticidad:
El ajuste se realiza sin ponderación.
El ajuste se puede realizar con ponderación opcionalmente.
Si hay Heterocedasticidad:
El ajuste se debe realizar con ponderación.
7.10 Análisis de resultados
7.10.1 Se realiza un informe de validación con todos los datos obtenidos utilizando el registro “Informe de
validación de Método” IA-RECAT-PE-007-RE-001.
7.10.2 Para la interpretación de los resultados se toman como parámetros de referencia los siguientes:
Concentración
≤ 1 µg/kg
>1 µg/kg ≤ 0,01 mg/kg
> 0,01 mg/kg ≤ 0,1 mg/kg
> 0,1 mg/kg ≤ 1 mg/kg
> 1 mg/kg
Repetibilidad máxima (%)
35
30
20
15
10
Precisión intermedia
máxima (%)
53
45
32
23
16
Intervalo de recuperación
(%)
50 - 120
60-120
70-120
70-110
70-110
Si la validación del método arroja valores aceptables de acuerdo a los parámetros de referencia, los límites de
detección y cuantificación están por debajo del Límite Máximo de Residuos (LMR) y el de detección es al menos
la mitad del LMR (cuando aplique), se hace una declaración de que el método es apto para el uso provisto.
7.11 Revalidación
Una vez que el procedimiento técnico se ha validado en los siguientes casos los métodos deben revalidarse en la
extensión indicada:
7.11.1 En caso que se utilice otro equipo, otro detector o bien una sensibilidad diferente para el mismo detector
(diferente atenuación, diferente longitud de onda de absorción, entre otros) se debe verificar la linealidad,
ámbito de trabajo, límites de detección y cuantificación, sensibilidad y la repetibilidad instrumental.
7.11.2 Cuando se hagan modificaciones al procedimiento que no hayan sido consideradas como un parámetro
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robusto del método o bien que en la identificación de fuentes de incertidumbre se hayan considerado como
un aporte importante se debe evaluar al menos repetibilidad de la metodología y veracidad.
7.11.3. Un analista nuevo en la realización del procedimiento técnico debe ser inducido y evaluar al menos
repetibilidad de la metodología y veracidad.
7.11.4 Cuando se realice el procedimiento en una matriz diferente se debe evaluar al menos repetibilidad de la
metodología, veracidad y la especificidad.
8. ANEXOS
Anexo 1.
Tabla 1. Valores críticos de G (P=0,05) para un contraste de dos colas
Tamaño de muestra
3
4
5
6
7
8
9
10
Valor crítico
1,155
1,481
1,715
1,887
2,020
2,126
2,215
2,290
Anexo 2.
Tabla 2. Valores críticos de X2 (P=0,05)
Tamaño de muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Valor crítico
3,84
5,99
7,81
9,49
11,07
12,59
14,07
15,51
16,92
18,31
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