Método colorimétrico cuantitativo para la determinación de

Proti
C
Método colorimétrico cuantitativo para la determinación
de proteínas en orina y líquido cefalorraquídeo
SIGNIFICACION CLINICA
Proteínas en orina
Una cantidad de proteínas plasmáticas de pequeño peso
molecular son filtradas normalmente en forma libre a través
del glomérulo renal y luego son, en parte, reabsorbidas por
los túbulos renales.
Hay condiciones fisiológicas o benignas donde se puede
observar un aumento en la excreción urinaria de proteínas
como en el ejercicio violento, fiebre, hipotermia, embarazo.
La medición de las proteínas urinarias es importante en la
detección de patología renal. La proteinuria en la enfermedad
renal puede resultar de una disfunción glomerular o tubular.
En el primer caso se da por un aumento en el pasaje a través
de los capilares del glomérulo y caracterizada por la pérdida
de proteínas plasmáticas de igual o mayor tamaño. En el
segundo caso se da por una disminución en la capacidad
de reabsorción de proteínas por los túbulos.
Entre las patologías en las que se produce un aumento en
la excreción de proteínas urinarias se encuentran: síndrome
nefrítico, síndrome nefrótico, hipergammaglobulinemia monoclonal, nefropatía diabética, infecciones del tracto urinario.
Proteínas en líquido cefalorraquídeo (LCR)
La determinación de proteínas en LCR es útil para evaluar
la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en muchas
enfermedades inflamatorias o infecciosas del SNC, como
ocurre en las meningitis bacterianas, virales o de otros orígenes, encefalitis, poliomielitis, neurosífilis, esclerosis múltiple,
hemorragia cerebral, tumores cerebrales o espinales. Otros
desórdenes ocasionan una producción anormal de proteínas
dentro del SNC como las enfermedades desmielinizantes.
La sensibilidad del presente método lo hace apropiado para
ser usado en líquidos biológicos tales como orina y líquido
cefalorraquídeo donde la concentración de proteínas con
respecto a la del plasma es demasiado baja como para determinarla por métodos empleados habitualmente para suero.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Las proteínas presentes en la muestra reaccionan en medio
ácido con el complejo Rojo de Pirogalol-Molibdato originando
un nuevo complejo coloreado que se cuantifica espectrofotométricamente a 600 nm.
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: solución estabilizada de Rojo de Pirogalol
0,1 mmol/l, molibdato de sodio 0,1 mmol/l en buffer succinato 50 mmol/l.
S. Standard: solución de albúmina 100 mg/dl (1,0 g/l).
REACTIVOS NO PROVISTOS
- Agua destilada.
- Solución fisiológica.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Reactivos Provistos: listos para usar.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales
de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos.
Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de
acuerdo a la normativa local vigente.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE
ALMACENAMIENTO
Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC)
hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
El Reactivo A debe protegerse de la luz.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS
REACTIVOS
Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua
destilada, lecturas de absorbancia a 600 nm del Reactivo A
superiores a 0,250 D.O. o inferiores a 0,030 D.O. son indicio
de deterioro del mismo.
MUESTRA
Orina o líquido cefalorraquídeo
a) Recolección: obtener orina ocasional o de 24 horas.
Medir la diuresis.
En caso de que las muestras sean turbias, es conveniente
centrifugarlas.
b) Aditivos: no se requieren.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- la hemólisis puede ser causa de resultados falsamente
aumentados tanto en orina como en LCR;
- los conservantes para orina tales como ácido clorhídrico,
ácido benzoico o timol pueden ser causas de resultados
falsamente disminuidos;
- algunas drogas o medicamentos pueden interferir en la
reacción. Referirse a la bibliografía de Young para los
efectos de las drogas en el presente método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la
orina puede conservarse refrigerada (2-10oC) hasta 8 días o
congelada (-20oC) hasta 3 meses. El LCR puede conservarse
3 días refrigerado (2-10oC) o 3 meses congelado (-20oC).
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MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Espectrofotómetro o fotocolorímetro para lecturas a 600 nm
(580-620 nm).
- Baño de agua a 37oC.
- Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.
PROCEDIMIENTO
Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar el ensayo. En tres tubos o cubetas
espectrofotométricas marcados B (Blanco), S (Standard)
y D (Desconocido), colocar:
B
S
D
Standard
-
20 ul
-
-
-
20 ul
1 ml
1 ml
1 ml
Muestra
Reactivo A
Mezclar e incubar los tubos durante 10 minutos a 37oC.
Leer en fotocolorímetro entre 580-620 nm o en espectrofotómetro a 600 nm, llevando a cero el aparato con el Blanco.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL
El color de la reacción es estable durante 30 minutos por
lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.
CALCULO DE LOS RESULTADOS
1) Proteínas en orina de 24 horas
D
mg de proteínas /24 horas =
x V x 1000
S
siendo:
V = volumen de la diuresis expresado en litros /24 horas
1000 = mg/l del Standard
CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI
Proteínas (mg/dl) x 10 = Proteínas (mg/l)
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
Proteger el Reactivo A de la luz.
El material empleado debe estar libre de tensioactivos, caso
contrario se obtendrán valores discordantes.
PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas
muestras en un mismo día se obtuvo:
Nivel
14 mg/dl
100 mg/dl
D.S.
± 0,66 mg/dl
± 2,30 mg/dl
C.V.
4,7 %
2,3 %
b) Sensibilidad: en espectrofotómetro a 600 nm, un Standard de 100 mg/dl proporciona una lectura de aproximadamente 0,200 D.O., lo que significa que para 0,001 D.O. el
mínimo cambio de actividad detectable será de 0,5 mg/dl.
c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/dl de proteínas. Para valores superiores, diluir la muestra 1:2 ó 1:4
con solución fisiológica y repetir la determinación. Corregir
los cálculos multiplicando por el factor de dilución empleado.
Si se desea aumentar la sensibilidad analítica en muestras
normales o levemente aumentadas, pueden emplearse 50 ul
de muestra. En este caso, es preferible diluir el Standard 1:2
(1+1) con agua destilada, y usar este standard de 50 mg/dl en
la prueba, de tal manera de ajustar la calibración a los valores
normales bajos.
PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS
Para las instrucciones de programación consulte el manual
del usuario del analizador en uso.
PRESENTACION
- 1 x 100 ml (Cód. 1690007).
- 4 x 20 ml (Cód. 1009317).
- 4 x 20 ml (Cód. 1009282).
- 2 x 60 ml (Cód. 1009631).
2) Proteínas en orina ocasional
D
mg/dl proteínas =
x 100
S
3) Proteínas en líquido cefalorraquídeo
D
mg/dl proteínas =
x 100
S
METODO DE CONTROL DE CALIDAD
Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Proti
U/LCR Control 2 niveles) con concentraciones conocidas
de proteínas, con cada determinación.
VALORES DE REFERENCIA
Orina de 24 horas: 30-140 mg/24 horas (hasta 160 mg/24
horas en embarazadas)
Orina ocasional: 25 mg/dl
LCR: 15-45 mg/dl en personas sanas. En personas de más
de 60 años, este rango se extiende hasta 60 mg/dl.
Estos valores son orientativos. Es conveniente que cada
laboratorio establezca sus propios rangos, dado que pueden variar de acuerdo a la población de pacientes y a las
condiciones del laboratorio.
BIBLIOGRAFIA
- Watanabe, N.; et al. - Clin. Chem. 32:1551, 1986.
- Fujita, Y.; Mori, I.; Kitano, S. - Benseki Kagaku 32:379, 1983.
- Watson, M.; Scott, M. - Clin Chem. 41/3:343, 1995.
- Killingsworth, L. - Clin. Chem. 28/5:1093, 1982.
- Orsonneau, J.; Douet, P.; Massoubre, C; Lustenberger, P.;
Bernard, S. - Clin. Chem. 35/11:2233, 1989.
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",
AACC Press, 4th ed., 2001.
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Símbolos
Los siguientes símbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab.
C
P
V
X
Este producto cumple con los requerimientos
previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de
productos sanitarios para el diagnóstico "in vitro"
Representante autorizado en la Comunidad
Europea
M
Xn
Nocivo
Uso diagnóstico "in vitro"
Contenido suficiente para <n> ensayos
Elaborado por:
Corrosivo / Caústico
Xi
Irritante
H
Fecha de caducidad
l
Límite de temperatura (conservar a)

No congelar
F
i
Calibr.
b
Consultar instrucciones de uso
Calibrador
Control
Riesgo biológico
Volumen después de la reconstitución
Cont.
Contenido
g
Número de lote
b
c
h
Control Positivo
Control Negativo
Número de catálogo
M Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Producto Autorizado A.N.M.A.T.
Cert. Nº: 1128/95
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Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
UR120903