M. anisopliae

INFORME TECNICO FINAL DEL PROYECTO
Título: Métodos alternativos para el control de la garrapata (Boophilus
microplus) en el trópico mexicano (clave 31-2007-0552)
Responsable:
Roger Iván Rodríguez Vivas. RFC: ROVR660622-1E2
Institución:
Universidad
Zootecnia
Autónoma de Yucatán. Facultad de Medicina Veterinaria
y
Colaboradores:
Rocio Borgez Argaez, CICY
Zeferino García Vázquez, INIFAP
Alberto Rosado Aguilar, UADY
Armando Aguilar Caballero, UADY
Martha Elena Méndez González, CICY
Edelmira Galindo Velasco, UAC
Fecha de Inicio:
1/02/08
(DÍA / MES / AÑO)
(DÍA / MES / AÑO) Fecha de Termino: 30/11/09
Período que abarca el presente informe:
Fuente(s) de Financiamiento:
FUNDACIÓN PRODUCE YUCATÁN, A.C.--------------------------------$ 190,000
1
2. INFORME FINANCIERO:
Asignado
Radicado
Saldo
Ejercido
$190,000
$
$
3. INFORME FÍSICO (SEÑALAR EL GRADO DE AVANCE EN EL
CUMPLIMIENTO DE CADA UNO DE LOS OBJETIVOS Y METAS
PLANTEADAS EN EL PROTOCOLO).
Se logró el 100% de los objetivos y metas planteadas. A continuación se
describen:
Objetivo y Meta
% de
cumplimiento
Objetivo: Evaluar in vitro la actividad ixodicida de 15 extractos
100%
de especies vegetales contra garrapatas Boophilus microplus
en las fases de larvas y adultas.
Meta: Identificar plantas con poder ixodicida
100%
Objetivo: Evaluar el efecto entomopatógeno de tres cepas del
100%
hongo M. anisopliae para el control de larvas y garrapatas
adultas de B. microplus.
Meta: Identificar la cepa de M. anisopliae con mejor eficacia
100%
para controlar fases de larvas y adultas de B. microplus.
Objetivo: Determinar la naturaleza de la fracción activa
100%
ixodicida de dos extractos de especies vegetales (se planeó el
inició de esta actividad en el segundo semestre y finalizará en
el tercer semestre en la segunda fase del proyecto).
Meta: Conocer la naturaleza de la fracción activa ixodicida de
100%
dos extractos de especies vegetales
4. ACTIVIDADES REALIZADAS DURANTE LA FASE 1 DEL PROYECTO
(DETALLADAS): (De Mayo a Febrero)
4.1. Evaluación in vitro de plantas con poder ixodicida.
De Febrero a Abril de 2008 se realizaron 5 salidas de campo y se colectaron
500 garrapatas adultas de B. microplus y fueron incubadas obteniéndose
2
1,000,000 larvas aproximadamente. Las larvas fueron utilizadas para realizar
50 bioensayos con diferentes disolventes con el propósito de seleccionar el
mejor (en disolución del extracto, inocuidad en larvas y seguridad para el
técnico) para las pruebas definitivas. A partir de este estudio se seleccionó al
Tween 20. Esta es una propuesta innovadora, siendo esta la primera vez que
se utiliza para la disolución de extractos de plantas en bioensayos con
garrapatas B. microplus. A su vez se estandarizó la técnica de bioensayo a
utilizar.
De Abril a Julio se realizaron 10 salidas de campo y se colectaron 1200
garrapatas adultas que fueron incubadas obteniéndose 2,500000 larvas
aproximadamente. También se colectaron 15 plantas con ayuda de
etnobotánicos para la identificación de la especie. De cada planta se colectó
2000 g aproximadamente y se llevaron al Centro de investigaciones Científicas
de Yucatán. Posteriormente se procedió a separar las estructuras de cada
planta (hoja, tallo y raíz), se secaron en estufas a 40 ºC por tres días y se
molieron en un molino mecánico. Una vez molidas se sometieron en frascos
con metanol por 48 hrs y se procedió a la concentración de 45 extractos. Ya
obtenidos los extractos de las 15 plantas, se realizaron 450 bioensayos contra
larvas de garrapatas B, microplus a concentración del 10 %. De las 15 plantas
evaluadas se obtuvieron 9 plantas con eficacia >80%. Con base en los
resultados de eficacia con hoja, fueron seleccionadas las tres plantas con
mayor eficacia (Petiveria alliacea, Havardia albicans y Caesalpinha gaumeri),
las cuales fueron evaluadas nuevamente mediante bioensayos (120
bioensayos más) a diferentes concentraciones contra garrapatas B. microplus
en las fases de larvas (20%, 10%, 5% y 2.5%) y adultas (20% y 10%). Para ello
se tuvieron que realizar 5 salidas más a campo para colectar 600 garrapatas
adultas
que
fueron
incubadas
obteniéndose
1,500,000
larvas
aproximadamente. A su vez también se realizaron mas colectas de Petiveria
alliacea, ya que no se contaba con suficiente material vegetal para llevar a
cabo los estudios in vivo con bovinos infestados con garrapatas B. microplus
(programados para el segundo año del proyecto).
Del 30 de Junio al 30 de Agosto de 2008 el M. en C. Alberto Rosado Aguilar
asistió a seis módulos de capacitación y actualización en la ciencia de animales
de laboratorio impartidos por expertos del Laboratorio de Ensayos Biológicos
(LEBi) y de la Asociación Centroamericana, del Caribe y Mexicana de la
Ciencia de los Animales de Laboratorio (ACCMAL) en la Universidad de Costa
Rica. El primer módulo cursado y aprobado se título: Introducción a la ciencia
de animales de experimentación. En este módulo se conoció a las especies
animales, razas y líneas que son utilizados para pruebas experimentales con
fármacos o productos naturales. El segundo módulo cursado y aprobado se
título: Biología de los animales de laboratorio. En este modulo se aprendió y
reforzó conocimientos sobre anatomía y fisiología de los animales utilizados
para experimentación con fármacos o productos naturales. El tercer módulo
cursado y aprobado se título: Manejo de animales de laboratorio. En este
módulo se aprendió y práctico las diferentes técnicas de manejo y
mantenimiento de animales en bioterios. El cuarto módulo cursado y aprobado
se título: Vías de administración de muestras. En este módulo se aprendió y
practicó las diferentes técnicas utilizadas para la administración de fármacos y
3
productos naturales por vía intravenosa, intramuscular, oral, subcutánea,
intradérmica y tópica en animales de laboratorio. El quinto módulo cursado y
aprobado se tituló: Técnicas especiales, donde se conoció y practicó las
diferentes técnicas toxicológicas (irritabilidad dérmica, toxicidad oral aguda,
sensibilidad, inhalación, irritabilidad ocular y toxicidad dérmica) utilizadas por la
EPA (Environmetal Protection Agency) de Estados Unidos para evaluar
fármacos y productos naturales en animales de laboratorio. El sexto modulo se
titula: Proyecto de investigación con biomodelos. En este módulo se realizó un
protocolo para evaluar la toxicidad de las plantas a utilizar en la fase in vivo de
la tesis de doctorado. Además durante estos meses de estancia en la
Universidad de Costa Rica se realizó un trabajo de toxicidad con las 9 plantas
que tuvieron eficacia >80% contra larvas de B. microplus teniendo como
objetivo evaluar la toxicidad en animales de laboratorio de extractos
metanólicos de las hojas Petiveria alliacea, hojas de Havardia albicans,
Caesalpinha gaumeri y Capraria biflora; tallos de Solanum tridinamum y
Solanum eriantum; corteza de Bursera simarouba y Cassearia corymbosa; y la
raíz de Ocimum micrantum. En este periodo se realizaron 32 bioensayos de
toxicidad (Cuadro 1) utilizando las técnicas toxicológicas según la EPA
(Environmental Protection Agency) de Estados Unidos. Doce bioensayos de
irritabilidad dérmica, 10 de toxicidad oral aguda, 7 irritabilidad ocular y 3 de
toxicidad dérmica. Para la realización de los bioensayos se requirieron de 117
animales de laboratorio (albinos) que fueron: 30 conejos, 72 ratas y 15 ratones
de la raza Nueva Zelanda y las Líneas Wistar y Swiss respectivamente. A todos
los animales diariamente se les proveía agua, alimento y se procuraba
mantener limpias las jaulas y el área donde estaban los animales. Una vez
realizados los bioensayos se procedía todos los días a la observación de los
animales y se anotaba los datos en una bitácora. El periodo de observación
dependió de la técnica utilizada e iba de 3 hasta 14 días. Posterior a la
observación los animales eran sacrificados (excepto los conejos) por métodos
de eutanasia como la decapitación, sobredosis de barbitúricos y dislocación
cervical. A Los animales eutanasiados que se utilizaron para toxicidad oral
aguda y toxicidad dérmica se les practicó la necropsia y se inspeccionaron los
órganos para detectar alguna anomalía o algún signo de toxicidad.
De Agosto del 2008 hasta Noviembre de 2009 se determinó la naturaleza de la
fracción activa ixodicida de la planta que presentó mayor eficacia (Petiveria
alliacea). En esta parte fitoquímica, se realizaron particiones con hexano,
acetato de etilo y metanol para determinar si los compuestos con actividad
ixodicida eran de baja, media o alta polaridad. Una vez determinado que la
actividad ixodicida es conferida por los compuestos no polares del extracto
hexánico, se procedió a analizar la muestra hexánica en el cromatógrafo de
gases y se obtuvo el perfil cromatográfico del extracto. Posteriormente se
procedió a fraccionar el extracto hexánico filtrándolo en una columna de tonsil
con el objetivo de eliminar la clorofila presente en el extracto y obtener
fracciones menos complejas. La columna tonsil se corrió con el sistema
hexano-acetona (relación 100:0 hasta 0:100) con un volumen de 200 ml para
cada fracción.
Además durante estos meses también se estuvo determinando la naturaleza de
la fracción activa ixodicida de la planta Havardia albicans, la cual quedó como
4
la segunda de mayor eficacia contra garrapatas adultas de B. microplus.
Petiveria alliacea, en esta parte fitoquímica, se realizaron particiones con
hexano, acetato de etilo y metanol para determinar si los compuestos con
actividad ixodicida eran de baja, media o alta polaridad. Una vez realizadas las
particiones se llevaron a cabo los bioensayos a una única concentración (10%)
para obtener el porcentaje de mortalidad larval de en los extractos hexánicos,
de acetato de etilo y metanólicos. Se obtuvo el perfil cromatográfico del
extracto. Las fracciones serán evaluadas contra larvas de B. microplus en el
segundo año del proyecto (Fase 2).
4.2. Evaluación in vitro del hongo M. anisopliae para el control de
garrapatas B. microplus.
Se usaron tres cepas (Ma34, Ma14 y Ma2) del hongo M. anisopliae que fueron
aisladas de: suelo Michoacano la M34 y Ma14 de suelo del estado de Colima,
la Ma2 de Diatraea sacharalis del estado de Colima. Estas cepas fueron
reproducidas en condiciones de laboratorio y almacenadas en refrigeración
hasta su uso. Las cepas fueron diluidas con una solución de Tween 80 para
dejarlas en una concentración final deseada.
Para la evaluación de cada cepa del hongo M. anisopliae se obtuvo 50
garrapatas adultas hembras repletas de B. microplus de un rancho previamente
diagnosticado como resistente al efecto de los piretroides, organofosforados y
amitraz. Las garrapatas que se estudiaron pesaban de 200 a 220 mg.
Para la evaluación de las cepas del hongo sobre larvas de B. microplus, se
pegaron en cinta maskin-tape (aproximadamente 100 larvas), y posteriormente
se inocularon durante un minuto en los diferentes tratamientos y ser
depositadas en cajas de petri individuales que con anterioridad se prepararon
con papel filtro y se humedecieron, una vez puestas las larvas se procedió a
sellar las cajas de petri con cinta y se incubaron a 28 °C y 90 % de humedad y
cada 48 hrs se observó la mortalidad de las larvas y la presencia de micelios.
Para esta prueba se realizaron tres repeticiones por cada concentración del
hongo y su control.
Se calculó el porcentaje de mortalidad se dividió el número de garrapatas
adultas y larvas muertas entre el número de garrapatas adultas y larvas totales
estudiadas, y el resultado se multiplicó por 100.
Se determinó la significancia estadística de la eficacia de cada cepa para el
control de B. microplus se usó el programa estadístico de varianza One-Way
ANOVA de StatGraphic Plus. Para determinar las concentraciones letales se
utilizó el programa de análisis Probit mediante el programa Polo plus el cual
permite conocer de manera cuantitativa el comportamiento de la muestra
evaluada mediante diferentes concentraciones del hongo M. anisopliae.
5
Plan de trabajo para el próximo año del proyecto (Fase 2):



Realizar la purificación de los compuestos activos de P. alliacesa
y H. albicans y probarlos contra garrapatas adultas de B.
microplus.
Evaluar los extractos de P. alliacea in vivo contra animales
infestados con garrapatas adultas de B. microplus.
Evaluar el efecto entomopatógeno del hongo M. anisopliae para el
control de B. microplus en la fase parásita (en bovinos) y no
parásita (en pasto).
5. RESULTADOS Y PRODUCTOS RELEVANTES DE ACCIONES DEL
PROYECTO ALCANZADOS HASTA LA FASE 1:
5.1. Evaluación in vitro de plantas con poder ixodicida.
De las 15 plantas evaluadas se obtuvieron 9 plantas con eficacia >80% y
fueron las hojas (95.7±2.9 %) y tallo (99.2±0.5 %) de Petiveria alliacea; hoja
(87.9±8.6 %) y corteza (98.8±1.0%) de Diospyros anisandra; las hojas de
Havardia albicans (93.0±12.0), Caesalpinha gaumeri (90.1±4.8 %) y Capraria
biflora (86.6±9.9 %), tallos de Solanum tridinamum (98.0±1.7 %) y Solanum
eriantum (97.8±1.8 %), corteza de Bursera simarouba (99.1±0.7 %) y Cassearia
corymbosa (99.5±0.5 %); y la raíz de Ocimum micrantun (87.0±3.2 %). Con
base en los resultados de eficacia con hoja, fueron seleccionadas las tres
plantas con mayor eficacia (Petiveria alliacea, Havardia albicans y Caesalpinha
gaumeri), las cuales fueron evaluadas nuevamente mediante bioensayos a
diferentes concentraciones contra garrapatas B. microplus en las fases de
larvas (20%, 10%, 5% y 2.5%) y adultas (20% y 10%) obteniéndose que P.
alliacea fue la planta que presentó mayor eficacia en adultas (mortalidad (87%),
inhibición de la oviposición (91%) e inhibición de la eclosión larval (16%).
En la estancia en la Universidad de Costa Rica se realizó un trabajo de
toxicidad con las 9 plantas que tuvieron eficacia >80% contra larvas de B.
microplus teniendo como objetivo evaluar la toxicidad en animales de
laboratorio de extractos metanólicos de las hojas y tallo de Petiveria alliacea,
hojas de Havardia albicans, Caesalpinha gaumeri y Capraria biflora; tallos de
Solanum tridinamum y Solanum eriantum; corteza de Bursera simarouba y
Cassearia corymbosa; y la raíz de Ocimum micrantum. Como resultado de las
pruebas toxicológicas se obtuvo que ninguno de los extractos evaluados en los
animales de laboratorio utilizando diferentes vías de administración presentó
toxicidad relevante, es decir, los extractos pueden ser utilizados de forma oral o
tópica en los animales sin verse afectados en su estado de salud (Cuadro 1).
6
Cuadro 1. Relación de técnicas, dosis, tipo de animal y toxicidad de 9 plantas
(12 extractos metanólicos) en animales de laboratorio.
Planta
Parte
TWEEN 20
RO 7 – PA
Irritabilidad
dérmica
Toxicidad oral
aguda
Ratas y conejos
Ratas
10%
Ratón 1 dosis
Irritabilidad ocular
Toxicidad
dérmica
Conejos
Ratas
(0)
Tallo
400 mg/ ml (0)
Hoja
500 mg/ ml (0)
5000 mg/ kg (0)
Tallo
500 mg/ ml
(0)
5000 mg/ kg (0)
Hoja
500 mg/ ml
(0)
5000 mg/ kg (0)
Raíz
500 mg/ ml
(0)
5000 mg/ kg (0)
RN 6- ST
Tallo
300 mg/ ml
(1)
5000 mg/ kg (0)
RF 7- OM
Raíz
300 mg/ ml
(0)
RF 7- BS
Corteza
300 mg/ ml (1)
2000 mg/ kg (0)
RJ 7- CC
Corteza
350 mg/ ml (0)
5000 mg/ kg (0)
RO 7- HA
Hoja
500 mg/ ml (1)
5000 mg/ kg (0)
1000 mg/ ml (1)
5000 mg/ kg (0)
CG
Hoja
500 mg/ ml (1)
5000 mg/ kg (0)
1000 mg/ ml (0)
5000 mg/ kg (0)
RF 8- CB
Hoja
500 mg/ ml (0)
5000 mg/ kg (0)
1000 mg/ ml (0)
Total animales
9 conejos y 27 ratas
15
15
21
30
117
Total de ensayos
12
5
5
7
3
32
RN 6- SE
1000 mg/ ml (0)
1000 mg/ ml (0)
5000 mg/ kg (0)
1000 mg/ ml (0)
1000 mg/ ml (1)
En la determinación de la naturaleza de la fracción activa ixodicida de la planta
que presentó mayor eficacia (Petiveria alliacea), la planta fue particionada con
hexano, acetato de etilo y metanol para determinar si los compuestos con
actividad ixodicida eran de baja, media o alta polaridad. Una vez realizadas las
particiones se llevaron a cabo los bioensayos a una única concentración (10%)
obteniéndose un porcentaje de mortalidad larval de 93.63%, 6.44% y 5.21% en
los extractos hexánicos, metanólicos y de acetato de etilo, respectivamente.
Una vez determinado que la actividad ixodicida es conferida por los
compuestos no polares del extracto hexánico, se procedió a analizar la muestra
hexánica en el cromatógrafo de gases y se obtuvo el perfil cromatográfico del
extracto. Al fraccionar el extracto hexánico se obtuvieron 9 fracciones finales de
Petiveria alliacea, que fueron evaluadas contra larvas de B. microplus,
obteniéndose los siguientes resultados (Cuadro 2).
7
Cuadro 1. Eficacia de nueve fracciones del tallo de la planta P. alliacea contra
larvas de B. microplus.
F1
39.6%
F2
20.2%
F3
09.1%
F4
10.1%
F5
50.0%
F6
23.8%
F7
16.7%
F8
41.8%
F9
26.8%
F: Fracción
Como se puede observar en el cuadro 1 las fracciones de la planta P. alliacea
presentan una baja eficacia contra larvas de B. microplus, por lo cual se
necesita evaluar mas colectas de esta planta para seleccionar el material con
mayor eficacia y poder llevar a cabo los estudios in vivo con animales
infestados con garrapatas adultas de B. microplus.
Adicionalmente se inició la determinación de la naturaleza de la fracción activa
ixodicida de la planta Havardia albicans, la cual quedó como la segunda de
mayor eficacia contra garrapatas adultas de B. microplus. En esta parte
fitoquímica, se realizaron particiones con hexano, acetato de etilo y metanol
para determinar si los compuestos con actividad ixodicida eran de baja, media
o alta polaridad. Una vez realizadas las particiones se llevaron a cabo los
bioensayos a una única concentración (10%) obteniéndose un porcentaje de
mortalidad larval de 45.93%, 60.26% y 85.23% en los extractos hexánicos, de
acetato de etilo y metanólicos respectivamente. Una vez determinado que la
actividad ixodicida es conferida por los compuestos polares del extracto
metanólico, se procedió a analizar la muestra metanólica en el cromatógrafo de
gases y se obtuvo el perfil cromatográfico del extracto. Posteriormente se
procedió a fraccionar el extracto metanólico filtrándolo en una columna de
Sephadex. La columna Sephadex se corrió con el sistema metanol 100 con un
volumen de 10 ml para cada fracción, obteniéndose 34 fracciones. Estas
fracciones se aplicaron en una placa cromatográfica de placa fina y se luyeron
utilizando el sistema cloroformo-metanol-agua 7:3:0.5. En la placa se observó
que había fracciones muy similares, por lo cual se agruparon obteniéndose 9
fracciones finales. Una vez obtenidas las 9 fracciones se procedió a
concentrarlas para eliminar el disolvente y se corrieron nuevamente en otra
placa con el mismo sistema con el propósito de observar cuantos compuestos
posee cada fracción. Estas 9 fracciones serán evaluadas contra larvas de B.
microplus en el segundo año del proyecto (Fase 2).
5.2. Evaluación in vitro del hongo M. anisopliae para el control de
garrapatas B. microplus.
En la figura 1 se presenta el porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B.
microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x108
conidias/ml. Se observa que las garrapatas tratadas con la cepa Ma34 presentaron
100% de mortalidad a partir del día 11 postinfección, mientras que las cepas Ma14 y
Ma2 lo alcanzaron hasta el día 13 y 20 postinfección respectivamente.
8
Porcentaje de mortalidad
100
100
90
90
80
80
65
60
65
Ma14
55
Ma34
45
40
Ma2
20
15
5
0
1
4
5
6
7
20
8 11
12 13
Dias posinfeccion
14
15
18 19
Figura 1. Porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B. microplus expuestas
a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/ml.
En la figura 2 se presenta el porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B.
microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x107
conidias/ml. Se puede observar que a partir del día cinco se presentó las primeras
mortalidades de garrapatas adultas tratadas con la cepa Ma14, alcanzando 100% al
día 20; sin embargo, las garrapatas tratadas con la cepa Ma34 presentaron
mortalidades a partir del día ocho y teniendo 100% de mortalidad al día 13 . Las
garrapatas tratadas con la cepa Ma2 presentaron mortalidad más tardía que en la
dilución anterior y finalizó con un 70% de mortalidad a los 20 días.
Pocentaje de mortalidad
100
90
85
80
75
70
70
60
50
45
40
Ma14
35
25
20
10
0
1
4
5
6
7
8
Ma34
5
11 12 13
20
Días posinfección
10
15
14
15
Ma2
18
19
Figura 2. Porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B microplus expuestas
a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x107 conidias/ml.
En la figura 3 se presenta el porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B.
microplus expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x106
conidias/ml, se puede observar que las cepas Ma34 y Ma14 tuvieron un
9
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
85
90
80
70
65
55
45
40
15
10
5
1
4
5
6
7
8 11
12 13
Días pos-infección
20
25
Ma14
Ma34
25
Ma2
14 15 18 19 20
Figura 3. Porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de B. microplus expuestas
a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/ml.
En la figura 4 se presenta el porcentaje de mortalidad de larvas B. microplus
expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/ml.
Se observó que las larvas tratadas con la cepa Ma34 presentaron una elevada
mortalidad a partir del día seis postinfección, alcanzando un 57% de mortalidad al
día 20, mientras que las larvas tratadas con la cepa Ma14 empezaron el mismo día
que la Ma34 hasta alcanzar un 62% de mortalidad al día 20 postinfección. Al igual
que las anteriores la cepa Ma2 presento mortalidad al día 6 postinfección; sin
embargo, sólo alcanzó un 20% mortalidad al día 20 postinfección.
100
90
Porcentaje de mortalidad
Porcentaje de mortalidad
comportamiento más lento en cuanto a la mortalidad; sin embargo, la cepa Ma34
alcanza 100% de mortalidad al día 18 mientras que la cepa Ma14 finaliza con 65%
de mortalidad; la cepa Ma2 tuvo un comportamiento paulatino alcanzando 80% de
mortalidad al día 20.
80
70
61
60
56
50
44
40
21
14
20
10
0
0
0
2
4
9
5
1
6
22
7
52
Ma 34
Ma14
Ma2
47
32
30
62
57
31
23
9
24
17
14
11
20
2
8
10
12
14
Dias posinfeccion
16
18
20
10
Figura 4. Porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas
de M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/ml.
En la figura 5 se presenta el porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus
expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x107 conidias/ml.
Se observa que las larvas tratadas con las cepas Ma34 y Ma14 presentaron
mortalidad a partir de día seis postinfección, alcanzando un 52% y 61% de
mortalidad al día 20 respectivamente, mientras que las larvas tratadas con la cepa
Ma2 empezaron a morir a partir del día ocho demorando hasta alcanzar un 19% de
mortalidad al día 20 postinfección.
Porcentaje de mortalidad
100
90
80
70
60
57
50
50
40
32
30
25
20
10
0
38
0
0
2
4
13
10
14
14
0
1
1
4
8
Ma 34
Ma14
Ma2
32
25
17
6
46
42
61
52
10
12
14
Días posinfección
14
11
9
16
18
19
20
Figura 5. Porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas
de M. anisopliae a una concentración de 1x107 conidias/ml.
En la figura 6 se presenta el porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus
expuestas a tres cepas de M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/ml.
Se observa que las larvas tratadas con las cepas Ma34 y Ma14 empezaron a
presentar mortalidad a partir del día seis postinfección, llegando a 34% y 45% de
mortalidad al día 20, mientras que las larvas tratadas con la cepa Ma2 empezaron
a morir a partir del día ocho alcanzando únicamente un 26% de mortalidad final del
estudio.
11
Porcentaje de mortalidad
100
90
80
70
60
Ma 34
50
40
30
35
13
9
13
11
24
20
14
5
0
10
0
35
0
0
2
4
6
16
6
1
8
13
4
10
12
14
Días posinfección
16
35
39
30
21
16
20
18
45
34
26
Ma14
Ma2
20
Figura 6. Porcentaje de mortalidad de larvas de B. microplus expuestas a tres cepas
de M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/ml.
En el Cuadro 3 se presentan las concentraciones letales (CL) de tres cepas del
hongo M. anisopliae que matan al 50%, 90% y 99% de B. microplus en la fase
de adulta y larva a los 20 días postinfección. Se observa que las cepas Ma14 y
Ma34 fueron eficaces para el control de garrapatas adultas necesitando desde
1x106 hasta 1x107.5 conidias/ml de M. anisopliae para matar al 99%
respectivamente. Asimismo, se observó que las cepas Ma14 y Ma34 fueron
eficaces para el control de larvas necesitando entre 1x10 6.3 y 1x107.1
conidias/ml de M. anisopliae para matar al 50% respectivamente.
Cuadro 3. Concentraciones letales (CL) de conidias/ml de tres cepas del hongo
M. anisopliae que matan al 50%, 90% y 99% de garrapatas adultas y larvas de
B. microplus (20 días postinfección). Las CL se obtuvieron mediante el análisis
Probit.
Cepas
M. anisopliae
Ma2
Ma14
Ma34
- No tuvo eficacia.
50% de
mortalidad
Adulta Larva
6
< 1x10 1.9x106
<1x106 1.2x107
90% de
mortalidad
Adulta Larva
6
4.7x10 < 1x106 -
99% de
mortalidad
Adulta Larva
7
3.5x10 1x106
-
En el cuadro 4 se presenta la micosis de garrapatas adultas de B. microplus
expuestas a tres cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones, se
puede observar que la cepa Ma34 a la dilución 1x10 7 conidias/ml, fue la que
mejor comportamiento presentó alcanzando 100% de micosis al día 20
postinfección, así también, en la dilución 1x106 conidias/ml alcanzó 65% de
micosis al día 20; la cepa Ma14 alcanzó 80% y 50% de micosis en las
diluciones 1x108 y 1x107 respectivamente; la cepa Ma2 sólo alcanzó 35% y
25% de micosis en las diluciones 1x108 y 1x106 respectivamente.
12
Cuadro 4. Porcentaje de micosis de garrapatas adultas de B. microplus
expuestas a tres cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones
Conidias/ml
Cepa Ma2
1X108
1X107
1X106
Cepa Ma34
1X108
1X107
1X106
Cepa MA14
1X108
1X107
1X106
Días postinfección
10 días
14 días
20 días
% de micosis
% de micosis
% de micosis
0
10
35
0
0
0
0
20
25
15
5
0
100
95
40
100
100
65
5
5
0
25
40
0
80
50
5
En el Cuadro 5 se presenta el porcentaje de micosis en larvas de B. microplus
expuestas a tres cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones, en la
que se observa que la cepa Ma14 fue la que mejor se comportó ya que al final
del estudio alcanzó 38%, 28% y 21% de micosis en las diluciones 1x10 8, 1x107
y 1x106 respectivamente; la cepa Ma34 sólo alcanzó 19% y 17% de micosis en
las diluciones 1x108 y 1x107 respectivamente. La cepa Ma2 no tuvo efecto
sobre las larvas de B. microplus.
Cuadro 5. Porcentaje de micosis en larvas de B. microplus expuestas a tres
cepas de M. anisopliae a diferentes concentraciones
Conidias/ml
Cepa Ma2
1X108
1X107
1X106
Cepa Ma34
1X108
1X107
1X106
Cepa Ma14
1X108
1X107
1X106
10 días
% de micosis
0
0
0
Días postinfección
14 días
% de micosis
0
0
0
20 días
% de micosis
0
0
0
7
2
0
13
5
0
19
17
3
7
9
6
26
18
16
38
28
21
En el Cuadro 6 se presenta el índice de eficiencia reproductiva en garrapatas
adultas de B. microplus tratadas con tres cepas diferentes de M. anisopliae , el cual
se evaluó mediante el programa de análisis de varianza y se observa que la única
cepa que presentó significancia estadística entre las tres diluciones es la Ma34, ya
que el control es diferente a las tres diluciones; la dilución de 1x108 es diferente a la
13
dilución de 1x106 y al control; la dilución 1x107 es igual a la dilución de 1x108 y
1x106, pero es diferente al control: La dilución de 1x10 6 es igual a la dilución de
1x107 pero diferente a la dilución de 1x108 y al control.
Cuadro 6. Índice de eficiencia reproductiva en garrapatas adultas de B. microplus
tratadas con tres cepas diferentes de M anisopliae.
Cepas
Ma34
Ma14
Ma2
1x108
0.250c
0.492a
0.553a
1x107
0.433cb
0.497a
0.578a
1x10 6
0.496b
0.452a
0.557a
Control
0.562a
0.562a
0.562a
E.E
0.022
0.031
0.021
P
<0.001
NS
NS
Literales diferentes entre las tres diluciones por cepa y el control tienen significancia estadística
(horizontalmente)
E.E= Error Estándar
NS= no significativo
P= Probabilidad
En el Cuadro 7 se presenta el índice de eficiencia reproductiva en garrapatas
adultas de B. microplus tratadas con tres cepas diferentes de M. anisopliae, el cual
se evaluó mediante el programa de análisis de varianza, y se observa que en
cuanto a cepas en la dilución de 1x108 la Ma34 es la única que tuvo una
significancia estadística ya que fue diferentes a Ma2, Ma14 y el control; en la
dilución de 1x10 7 tanto la Ma2 como la Ma34 son eficaces ya que ambas son
diferentes una de otra así como también de Ma14 y el control que son iguales y por
ultimo en la dilución de 1x106 ninguna cepa resultó ser eficaz ya que todas tuvieron
un comportamiento similar.
Cuadro 7. Índice de Eficiencia Reproductiva en garrapatas adultas de B. microplus
tratadas con tres cepas diferentes de M. anisopliae
Conidias/ml
1x108
1x107
1x106
Ma2
0.553ª
0.578ª
0.557a
Cepas
Ma34
0.250b
0.433b
0.496a
Control
Ma14
0.492ª
0.498ab
0.453a
0.562ª
0.562ab
0.562ª
E.E
0.023
0.024
0.027
P
<0.001
<0.001
NS
Literales diferentes
entre las tres cepas por dilución y el control tienen significancia estadística
(horizontalmente)
E.E= Error Estándar
NS= no significativo
P= Probabilidad
14
5.3. Productos.
a) Logros obtenidos.

Se dispone de un nuevo solvente (Tween 20 al 2%) para evaluar
extractos de plantas en bioensayos contra larvas de B. microplus.

Se dispone de nueve plantas (no toxicas) con eficacia mayor del 80%
para el control de la garrapata B. microplus.

Se obtuvieron dos plantas (Petiveria alliacea y Havardia albicans) con
potencial ixodicida para ser usadas como alternativa de control contra
larvas y adultas de la garrapata B. microplus.

Se cuenta con la cepa Ma34 que presentó la mayor eficacia para el
control de garrapatas adultas de B. microplus en condiciones in vitro, ya
que produjo mayor mortalidad, menor concentración de conidias/ml para
producir efectos, menor índice reproductivo y mayor micosis.

Se cuenta con la cepa Ma14 que presentó mayor eficacia para el control
de larvas de B. microplus en condiciones in vitro, ya que produce mayor
mortalidad, menor concentración de conidias/ml para producir efectos y
mayor micosis.
b) Publicaciones científicas:
Como producto de esta fase se publicó un artículo científico:
Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I., Borges-Argaez
R., García-Vázquez Z., Méndez-González M., Cáceres-Farfán M., DorantesEuán, A. 2008. Actividad ixodicida de extractos crudos de Diospyros anisandra
contra larvas de Riphicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae). Tropical
and Subtropical Agroecosystems. 8: 297-301. Se anexa artículo publicado.
Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I,, Borges-Argaez
R. García-Vázquez Z., Méndez-González M. Acaricidal effect from plant crudeextracts on Riphicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae) larvae.
Veterinary Parasitology. Aceptado, en prensa.
Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodriguez-Vivas R.I., Borges-Argaez
R., Garcia-Vazquez Z., Mendez-Gonzalez M. 2009. Acaricidal activity of
extracts from Petiveria alliacea (Phytolaccaceae) against the cattle tick,
Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: ixodidae). Tropical and Subtropical
Agroecosystems. En prensa.
15
c) Resúmenes y presentaciones.
Además como parte del proyecto se hicieron las siguientes
publicaciones y presentaciones en congresos nacionales e internacionales:
 Rosado-Aguilar J.A. Aguilar-Caballero AJ., Rodriguez-Vivas R.I., Borges
R., Garcia Z., Mendez M., Dorantes A., Caceres M. 2007. Evaluation of
three solvents as vehicle of crude methanolic plant extracts in the larval
immersion test using Boophilus microplus ticks. XII Conference of
WAAVP. Gent Belgium. August 19-23, 2007.
 Cáceres-Farfan M., Coello-Victurin E.A., Rosado-Aguilar J.A., MéndezGonzález M., Rodríguez-Vivas R.I., Aguilar-Caballero A., Borges-Argáez
R. 2008. Eficacia de residuos metanólico de Havardia albicans
(leguminosae) para el control de larvas y adultas de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus. VI Seminario Internacional de Parasitología
Animal 2008. Boca del Río Veracruz, del 3 al 5 de Septiembre.
 Coello-Victurin E.A, Cáceres Farfan M, Rosado Aguilar J.A, Méndez
González M, Rodríguez Vivas R.I., Aguilar Caballero A, Borges Argáez
R. 2008. Evaluacion de la actividad ixodicida de Petiveria alliacea
(phytolaccacea) contra larvas de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus)
microplus. VI Seminario Internacional de Parasitología Animal 2008.
Boca del Río Veracruz, del 3 al 5 de Septiembre.
 Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I., BorgesArgaez R., García-Vázquez Z., Méndez-González M., Caceres-Farfan M.
2008. Evaluación de la actividad acaricida de extractos de especies
vegetales contra larvas de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus)
microplus resistentes a ixodicidas. VI Seminario Internacional de
Parasitología Animal 2008. Boca del Río Veracruz, del 3 al 5 de
Septiembre. Ojeda-Chi, M.M., Rodríguez-Vivas, R.I, Galindo-Velasco, E.
2009. Efecto in Vivo de las Cepas MA14 Y MA34 de Metahrizium
anisopliae para el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en la
fase no parásita. XVII Foro de Investigación. 20-21 de enero de 2009.
pp. 85-87.
 Rosado-Aguilar J.A. Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas, R.I., BorgesArgaez R., García Vázquez, Z., Méndez-Gonzáles, M., Cáceres-Farfán,
M., 2009. Actividad acaricida de extractos de Petiveria alliacea
(Phytolaccaceae) contra la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)
microplus (Acari: ixodidae). XVIII Foro de Investigación. 7-8 de julio de
2009. pp. 38-44.
 Ojeda-Chi, M.M., Rodríguez-Vivas, R.I, Galindo-Velasco, E., 2009.
Evaluación del hongo entomopatógeno Metahrizium anisopliae
(Deuteromycotina: Hyphomycetes) para el control de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus (Acari: ixodidae) en condiciones de laboratorio y
de campo en el trópico mexicano. XVIII Foro de Investigación. 7-8 de
julio de 2009. pp. 159-166.
 Rosado-Aguilar J.A., Aguilar-Caballero A., Rodríguez-Vivas R.I., BorgesArgaez R., García-Vázquez Z., Méndez-Gonzáles M., Cáceres-Farfán M.
2009. Actividad acaricida de extractos de Petiveria alliacea
(Phytolaccaceae) contra la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)
microplus (Acari: Ixodidae). VIII Congreso Nacional de Parasitología
16
Veterinaria. 26-28 de Octubre de 2009. Mérida, Yucatán, México. pp. 8791.
d) Capítulo de libro.
Fue aceptado para su publicación el capítulo: Rosado-Aguilar, J.A., RodríguezVivas, R.I., Borges-Argaez, R., Aguilar-Caballero, A.J., Mendez, M. 2009. Uso
de plantas como alternativa de control de garrapatas en Yucatán, México.
Estudio de la Diversidad Biológica del Estado de Yucatán. En Prensa.
e) Boletín técnico.
Se publicó el Boletín técnico:
Rodríguez-Vivas, R.I. et al. (2007). Métodos alternativos de control de garrapatas
en el ganado bovino. Boletín Técnico. Fundación Produce, Yucatán. Mérida,
México.
f) Tesis de Maestría y doctorado.
Se encuentran en proceso las siguientes tesis:
Evaluación del efecto entomopatológico de las cepas Ma34 y Ma2 del hongo
Metharizium anisopliae para el control in vivo de Boophilus microplus. FMVZUADY. Maestría en Producción Animal Tropical, Opción Salud Animal. Por MVZ.
Melina Ojeda Chi.
Uso de extractos de plantas como ixodicidas para el control de la garrapata
Boophilus microplus. FMVZ-UADY. Doctorado en Ciencias Agropecuarias. Por el
M. en C. José Alberto Rosado Aguilar.
g) Entrenamiento de estudiante de doctorado.
Se capacitó al estudiante de Doctorado (M.C. José Alberto Rosado Aguilar) en
la Universidad de Costa Rica. Esta estancia tuvo como objetivo conocer los
diversos métodos y técnicas toxicológicas en fármacos y plantas aplicados en
animales de laboratorio.
6. COMENTARIOS GENERALES Y OBSERVACIONES AL DESARROLLO
DEL PROYECTO:
Se finalizó la fase 1 del proyecto y se solicita el financiamiento de la fase 2 del
proyecto que tiene como objetivos:
17
 Evaluar el efecto entomopatógeno de una cepa del hongo M. anisopliae
para el control de garrapatas adultas de B. microplus a nivel de campo.
 Evaluar la actividad ixodicida de dos extractos de especies vegetales
contra garrapatas Boophilus microplus a nivel de campo.
 Concluir con la determinación de la naturaleza de la fracción activa
ixodicida de dos extractos de especies vegetales.
7. ANEXOS:
(incluir una fotografía que ilustre el avance del proyecto)
Incluir la información siguiente:
Número de productores beneficiados (hasta la presente fecha)
Directos: Ninguno
Indirectos: Ninguno
Potenciales: Ninguno
Técnica de inmersión larval para evaluar extractos de 15 plantas contra larvas
de B. microplus en el laboratorio de Parasitología del Campus de Ciencias
biológicas y Agropecuarias de la UADY.
18
Larvas y adulta de B. microplus afectada con el hongo entomopatógeno M.
anisoliae en los bioensayos realizados.
19
8.- NOMBRE Y DOMICILIO DE BENEFICIARIOS DIRECTOS
Elaboración:
Dr. Roger I. Rodríguez Vivas
Nombre y firma del Investigador o
Técnico responsable del Proyecto
Fecha: 11/12/09
(DÍA / MES / AÑO)
Revisado y Aprobado:
Dr. José de Jesús Williams
Nombre y firma del Jefe de Campo
o Director de la
Institución/dependencia
Fecha:
11/12/2009
(DÍA / MES / AÑO)
20