Agrobacterium tumefaciens es una bacteria presente en la tierra

ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS
…. DESTERRANDO MITOS
Patricia Laura Marconi y Julieta López
Fundación Pablo Cassará- Saladillo 2468 C1440FFX, Cdad. A de .-Bs As-Argentina
e-mail: [email protected]
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria presente en la rizósfera y agente
causal de la enfermedad conocida como “agalla en corona”. Esta bacteria, produce
el crecimiento de tumores en los tejidos de los vegetales atacados. Estos tumores
se deben a que el A. tumefaciens es uno de los pocos organismos capaces de
transformar genéticamente una célula vegetal, utilizando un sistema para la
transferencia e integración de genes heterólogos altamente evolucionado. Ante la
herida o daño producido en la zona del cuello de una planta susceptible esta
bacteria es atraída por quimiotaxis en respuesta a sustancia liberadas al medio
ambiente por las células de la planta dañada. La formación de la agalla depende de
la cepa de Agrobacterium y el plásmido que ésta porte. Así, las cepas con el
plásmido Ti (del inglés tumor-induction) codifican para la síntesis de reguladores de
crecimiento que mimetizan hormonas vegetales. La integración y expresión de la
región Ti del plásmido al genoma vegetal garantiza la sobreproducción en esas
células transformadas de auxinas y citocininas (hormonas vegetales) en una
concentración superior a la normal. La resultante es un crecimiento y aumento de la
división celular de las líneas modificadas genéticamente (MG) o transgénicas
dando un fenotipo característico de la enfermedad. Además, estas células
transformadas sintetizan hidratos de carbono característicos de estas cepas de
Agrobacterium con el único fin de proveerles de alimento. En síntesis, el parásito
transforma el genoma del huésped, en este caso las células vegetales, para
convertirlas en fábricas de alimento.
El crecimiento tumoral es el resultado de la integración estable (heredable)
en el genoma vegetal de un segmento de ADN proveniente del plásmido Ti de la
bacteria. El ADN transferido o ADN-Ti está delimitado por repeticiones directas de
25 pares de bases, y cualquier secuencia de ADN entre estos bordes será
transferido al ADN de la célula vegetal (Figura 1, secuencia en amarillo). Este
segmento de ADN foráneo puede integrarse en diferentes lugares de los
cromosomas del vegetal permitiendo la expresión de los transgenes.
1
Cromosoma
bacteriano
Escherichia coli
Eco RI (1)
RB
CAM V35S
Ampi R
ORI
generico
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Eco RI (1)
RB
CAM V35S
Ampi R
Eco RI (1)
RB
CAM V35S
Ampi R
ORI
generico
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Eco RI (1)
ORI
RB
CAM V35S
Ampi R
ORI
generico
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Eco RI (1)
RB
CAM V35S
Ampi R
generico
ORI
generico
4308 bp
Amplificación E. coli
recombinante
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Eco RI (1)
RB
CAM V35S
Ampi R
ORI
generico
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Eco RI (1)
RB
Eco RI (1)
CAM V35S
RB
CAM V35S
Ampi R
Ampi R
ORI
ORI
generico
RR
generico
4308 bp
4308 bp
RR
RR
Eco R1 (1350)
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
Hind III (1750)
nos
nos
LB
LB
Eco R1 (1350)
Cromosoma
bacteriano
+
Hind III (1750)
nos
LB
Plásmidos-sist binario
Agrobacterium sp.
+
Co-transformación Agrobacterium
CAM V35S
Ampi R
generico
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Pl
ás
mi
do
ssi
st
bi
na
célulasriovegetales
Infección
con Agrobacterium sp.
recombinante
Eco RI (1)
RB
Eco RI (1)
RB
ORI
CAM V35S
Ampi R
ORI
generico
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Eliminación de la cepa de Agrobacterium sp.
recombinante de las líneas celulares
vegetales exitosamente transformadas
Cultivo de células vegetales
genéticamente modificadas
Figura 1: etapas del proceso de transformación vegetal utilizando como vector de infección
Agrobacterium tumefaciens recombinante.
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Las singulares características de este patógeno natural atrajeron la atención
de los científicos por la posibilidad de utilizarlo como vector para introducir genes
extraños o heterólogos al genoma de una planta. Por lo cual, esta propiedad se la
utiliza hoy en día para lograr la obtención de células, tejidos, órganos o plantas
genéticamente modificadas.
El primer experimento se llevó a cabo con células de tabaco transformadas
con Agrobacterium donde se observó que la expresión del fenotipo tumoroso
permitía el crecimiento de estas células bajo cultivo in vitro sin la adición de
fitohormonas. Esta propiedad conferida por la transformación del genoma resultaba
conveniente para la selección de las células exitosamente transformadas de las
que no lo eran ya que estas últimas morían.
Hoy en día se ha perfeccionado la metodología utilizando cepas de
Agrobacterium que portan dos vectores (sistemas binarios), uno de ellos con
secuencias específicas para desarrollar el mecanismo de infección (sin la región
codificante para los genes tumorogénicos) y el otro vector, vector Ti, con la
secuencia de ADN a ser transferidas al genoma de la planta.
Etapas del proceso:
La transformación y expresión de una proteína heteróloga o recombinante es
un proceso largo y multidisciplinario que puede ser dividido en 4 grandes áreas
para su mayor comprensión. La primera es la construcción de un vector con una
secuencia de ADN que codifique y exprese el transgén en un sistema vegetal
superior (eucariota); la segunda es la selección de líneas celulares vegetales
exitosamente transformadas y el cultivo en gran escala para obtener en forma
masiva la proteína recombinante; la tercera es la recuperación y purificación de la
proteína recombinante; y la cuarta y última es la caracterización del producto final.
Veamos en detalle algunas de las etapas involucradas:
El vector es ADN circular de simple cadena con secuencias específicas que
regulan la expresión del transgen y otras secuencias que sirven de herramientas
para seleccionar los organismos que han sido transformados exitosamente. Estas
secuencias de selección son otros trasngenes que le confieren resistencia al
organismo transformado a ciertos agentes letales. Por ejemplo, una secuencia que
suele agregarse al vector es la resistencia a antibióticos o herbicidas. Así, luego del
evento de transformación, se le agrega al medio de cultivo la toxina de selección –
por el ejemplo: ampicilina. De esta manera, solo los organismos exitosamente
transformados sobrevivirán a la condición de estrés impuesta (medio de cultivo con
el agregado de ampicilina) ya que expresan una enzima que impide el efecto tóxico
de la misma. Además, el transgén debe ser acompañado por secuencias
flanqueantes que regulen su expresión. La más importante de estas secuencias es
3
el promotor que actúa como una señal de direccionamiento para la célula,
indicando cuánto y dónde comienza la secuencia a transcribir. Otras secuencias
pueden ser agregadas al vector cuando la proteína requiere modificaciones
postraduccionales. Estas secuencias dirigen el polipéptido dentro de la célula y van
direccionando el camino a recorrer para que vaya sufriendo cada uno de las
modificaciones requeridas para ser funcional (clivaje de polipéptidos, glicosilación,
plegamiento de estructuras cuaternarias, formación de puntes disulfuro, entre
otras).
Por ejemplo, la expresión de anticuerpos suele necesitar modificaciones
postraduccionales para lo cual se le agrega secuencias de direccionamiento en el
extremo C-terminal del polipéptido. Estas señales son secuencias de
reconocimiento para dirigir el polipéptido a organelas específicas dentro de la
célula. En esas organelas se producirá la glicosilación o el agregado de glucósidos
en el extremo C-terminal de la proteína que codifica para el anticuerpo. Otras
señales, como KDEL, retienen el fragmento de anticuerpo recombinante en el
lumen del Retículo Endoplasmático permitiendo, de esta manera, la formación de
puentes disulfuro y el correcto plegamiento del anticuerpo entre otras funciones de
estabilización.
La figura 2 muestra en detalle una típica construcción de un vector de
transformación obtenido por técnicas de biología molecular. La ingeniería que lleva
a la construcción del vector es crucial y determinante para la obtención de la
proteína recombinante con un alto rendimiento de producción, estabilidad y calidad.
Eco RI (1)
RB
CAM V35S
Ampi R
ORI
generico
4308 bp
RR
Eco R1 (1350)
Hind III (1750)
nos
LB
Figura 2: detalle de un vector de transformación obtenido por ingeniería que porta sitios de
reconocimiento para el corte con enzimas de restricción (EcoR1, y HIND III), promotor CAM
V35S), resistencia a ampicilina, la proteína recombinante (en rojo) y una secuencia de
terminación (nos).
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La transferencia del vector construido a las células vegetales se puede llevar
a cabo por numerosas técnicas. La figura 1 sintetiza la metodología de
transformación utilizando A. tumefaciens, como sistema para introducir transgenes
en células vegetales. El resultado es la incorporación de la secuencia de ADN
diseñada especialmente y que dirige el vector al genoma del vegetal. Así, cuando
las células vegetales recombinantes expuestas al agente de selección, sobrevivan
y comiencen a dividirse transmitirán la secuencia transgénica a su progenie. De
esta manera solo las líneas celulares exitosamente transformadas serán capaces
de sobrevivir.
Por último, se espera que la producción de proteínas en el vegetal
recombinante sea máxima para llevar a cabo la cosecha. Las plantas
transformadas podrán ser cultivadas en forma tradicional a campo, o bajo distintos
sistemas de confinamiento o de contención como ser invernáculos o biorreactores.
La liberación de material transgénico a campo conlleva una serie de requisitos
legales que se deben cumplimentar para asegurar la inocuidad del cultivo y el
impacto sobre el ecosistema.
El material vegetal recombinante recolectado con el compuesto de interés
puede ser purificado y sometido a los controles de calidad de la proteína
recombinante producida. También se está estudiando la posibilidad de producir
alimentos que porten proteínas heterólogas de interés farmacéutico. Tal es el caso
de las vacunas comestibles (ver más adelante).
Qué se produce por esta metodología.
1- Cultivos intensivos a campo -Soja transgénica –
Los cultivos agronómicos surgieron hace unos 10.000 años cuando los primeros
hombres civilizados comenzaron a ser sedentarios e iniciaron la domesticación de
ciertas especies. Estos cultivos fueron manipulados genéticamente a través de
entrecruzamientos sexuales (“Mejoramiento tradicional”). Con el correr de los siglos
se comenzó a tener mayor conocimiento de la biología de las especies
domesticadas y la existencia de una gran variabilidad genómica útil que el
productor manipuló para mejorar las variedades y obtener mayores rindes. Así, las
tierras cultivables han ido en aumento siglo tras siglo. Y este aumento de
rendimientos y variedades cultivables han permitido el desarrollo de la humanidad.
Esto, sin duda, ha generado la modificación de los ecosistemas de las zonas
agrícolas desplazando las especies salvajes hacia zonas marginales. Hoy en día es
difícil imaginar cuál era el aspecto de la pampa húmeda previa a la colonización
europea.
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A partir de la década del ´90 se inició una nueva tecnología capaz de introducir
mejoras genéticas pero sin intervención de entrecruzamientos sexuales: la
manipulación directa de los genes o “Biotecnología”. El mejoramiento tradicional o
clásico permite la obtención de plantas elite con caracteres agronómicos deseables
para una región, en un período de cultivo determinado o para la resistencia a
condiciones bióticas desfavorables, entre otras. En cambio, la biotecnología
posibilita el cambio de un caracter determinado siendo esta una alternativa nueva
que posibilita dirigir el producto a un solo carácter agronómico deseable. Por
ejemplo, se obtiene una variedad resistente al ataque de una determinada
enfermedad como las variedades trasngénicas “RR”. Esta “nueva variabilidad” se
introduce en variedades comerciales sujetas al mejoramiento clásico. Las
metodologías combinadas: “variedades elite” por mejoramiento tradicional más
transformación genética produce plantas que posibilitan batir records de cosechas.
Para el caso variedad “soja Asgrow 5403RR” se inició el programa de
mejoramiento en varias etapas en la década del ´90. La primera fue la obtención de
la variedad sojera Asgrow 5403 por mejoramiento tradicional. La introducción de
esta variedad permitió alcanzar records de cosechas en la zona central-sur de la
Pampa Húmeda. Esta variedad fue obtenida a partir del cruzamiento de dos
variedades americanas de elite: Essex, del grupo V y Williams del grupo III. La
variedad comercializada tenía un alto potencial de rendimiento con resistencia
marcada a nemátodes de agalla.
En una segunda etapa se procedió a introducir genes para la obtención de la
variedad “RR”. Los genes fueron:
 CP4, codifica para una enzima que permite la tolerancia al herbicida
Roundup
 CTP, gen que induce y direcciona la síntesis de CP4 dentro de la planta.
La empresa, o el mercado, obtienen una variedad que vuelve a batir records
de cosecha. Pero lo más interesante es que esta línea transgénica vuelve a ser
usada para aplicar un plan de mejoramiento tradicional. De esta manera, año a año
se van obteniendo nuevas variedades que satisfacen la demanda del campo,
permiten expandir fronteras agrícolas y que portan eventos transgénicos.
2- Molecular farming
Los avances logrados durante la última década en el campo de la medicina
han llevado a la industria farmacéutica a descubrir y producir nuevas drogas por
biotecnología. Estos nuevos agentes terapéuticos recombinantes obtenidos por
ingeniería genética conllevan una ingeniería de producción costosa que requiere
una inversión económica y de tiempo considerables ya que el desafío consiste en
introducir el ADN recombinante en el interior de células que van a pasar a ser
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biofábricas. Además, la expresión de estos transgenes debe dar un producto
exactamente igual al que se obtendría en el sistema de producción natural ya que
los requerimientos de la industria farmacéutica son extremadamente estrictos.
Hoy en día los agentes terapéuticos recombinantes son producidos en su
mayoría por cultivo in vitro de líneas celulares animales (hibridomas), animales
recombinantes o microorganismos. Estas líneas celulares son obtenidas a partir de
la introducción de una o más secuencias de ADN (transgenes) que codifican para
uno o varios polipéptidos recombinantes. Así, el acervo genético de estas líneas
celulares es modificado y, en consecuencia, puede producir la o las proteínas de
interés.
Dentro de las numerosas tecnologías disponibles ha resultado atractivo para
la industria farmacéutica la producción de proteínas recombinantes en cultivos
vegetales denominada “molecular farming”. Esta estrategia de producción de
agentes terapéuticos recombinantes se basa en la capacidad de las plantas de
integrar y expresar genes foráneos y de producir proteínas recombinantes en
cantidades masivas y a un costo relativamente bajo respecto a los cultivos
tradicionales como células animales. Esto se debe a que, virtualmente, todas las
células vegetales son eucariotas (con un sistema de endomembranas) y poseen la
maquinaria necesaria para llevar a cabo la síntesis de proteínas igual de eficiente a
la de un mamífero con las modificaciones postraduccionales, traslacionales,
postraslacionales, y secretorias necesarias. Los sistemas vegetales funcionan
como biorreactores o biofrábricas vivientes para la producción de fármacos a un
costo menor al de los sistemas de cultivo de células animales debido a que utilizan
simples medios de cultivo salinos con una concentración proteica muy baja.
Otra ventaja es la seguridad que representa la producción de proteínas
recombinantes con fines farmacéuticos para humanos en sistemas vegetales. Esto
se debe a que no existe interacción entre los patógenos virales y bacterianos de los
vegetales con los animales.
3- Vacunas orales
Otra área de investigación intensa dentro del “molecular farming” es el de las
vacunas orales, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Actualmente, están en
desarrollo vacunas producidas en plantas comestibles (papa, banana, maíz, entre
otras) para numerosas enfermedades humanas y de aplicación veterinaria que
brindan protección frente a agentes infecciosos como cólera y E. coli
enterotoxigénica (ETEC), diarrea viral bovina, hepatitis B, cáncer, entre otros.
La idea central de estos procesos es que los vegetales tienen la capacidad de
almacenar proteínas en forma natural a temperatura ambiente ya que el tejido de
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almacenaje es el propio tejido vegetal protector de la proteína recombinante.
Además, utilizar plantas, semillas o tejidos comestibles que puedan ser consumidos
crudos o con un mínimo de procesamiento conlleva una ventaja extra. Esto
implicaría reducir los costos de almacenamiento con la eliminación de las cadenas
de frío necesarias para mantener hoy en día las vacunas en forma estable y,
asimismo, eliminar la etapa de purificación de la proteína recombinante. Estas
ventajas no solo son económicas sino que implicaría poder acercar las vacunas a
poblaciones subdesarrolladas en forma segura y sin infraestructura También
facilitaría la administración en niños evitando los molestos pinchazos que implican
los inyectables. Para el área veterinaria significa una reducción de costos por
consumibles y equipo especializado para aplicar vacunas.
Sin embargo, hoy en día todavía se está aún lejos de producir vacunas por esta
metodología aunque se encuentran avanzados los estudios en este campo de
investigación. Entre los problemas a superar se puede citar la forma de dosificar las
vacunas y evitar que pasen las proteínas recombinantes a las cadenas alimentarias
dentro del ecosistema. Además, la ingestión y exposición a los jugos gástricos de
las proteínas recombinantes implica una ingeniería adicional para aumentar la
estabilidad de los péptidos y resistencia contra la degradación que puedan sufrir al
ingresar al organismo.
Bioseguridad y ética
La Argentina es pionera en el cultivo de OGM (organismos genéticamente
modificados), a partir de 1991 comienza a generarse interés por parte del sector
privado y de grupos de investigación nacionales para la realización los primeros
ensayos con OGMs. La Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria
(CONABIA) se crea como una primera instancia de consulta y apoyo técnico para
asesorar al Secretario de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación en la
formulación e implementación de la regulación para la introducción y liberación al
ambiente de materiales genéticamente modificados. Actualmente, la CONABIA está
constituida por representantes de los sectores público y privado involucrados en la
Biotecnología Agropecuaria, “siendo este Cuerpo un grupo interdisciplinario e
interinstitucional que regula los permisos para liberar al medio ambiente organismo
genéticamente modificados”.
“El monitoreo posterior de los ensayos, a cargo del ex -Instituto Nacional de
Semillas (INASE) y el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
(SENASA) tiene por objeto evaluar en el sitio el real cumplimiento de lo presentado
en las solicitudes y también estar preparado para aplicar medidas que eviten
efectos adversos sobre el ambiente (tales como diseminación de malezas)”.
Además, se efectúan controles de los lotes, posteriores al momento de cosecha;
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ello tiene la finalidad de limitar la posible transferencia de la información genética
contenida en los materiales genéticamente modificados a otros organismos.
Actualmente, el riesgo de liberar OGM a campo no es mayor que la
implicancia de tener un área destinada a cultivos intensivos. Los agentes agresivos
para el medio ambiente como los agroquímicos, herbicidas, el desplazamiento de la
flora y fauna nativa son realidades para la agroindustria. La responsabilidad del
Gobierno es fiscalizar que el impacto producido sea el menor posible y que
garantice la conservación del acervo genético del país.
Conclusiones
La tecnología y los recursos humanos capacitados para obtener OGM son
accesibles para llevar a cabo esta tecnología segura, eficiente y económica que
permite obtener subproductos de alto valor agregado a precios accesibles y
ecológicamente seguros. Los estudios realizados hasta el momento indican que es
posible acceder a sistemas de producción más complejos tendientes a aumentar el
valor agregado de los productos agrícolas. El desarrollo de plantas, órganos,
tejidos, o células vegetales genéticamente modificados en sistemas confinados
como ser birreactores o invernáculos es una tecnología limpia muy segura para el
medio ambiente. En la actualidad, se están llevando a cabo numerosos estudios
sobre la producción de proteínas recombinantes, en general con fines farmacéutico
o veterinario, utilizando plataformas de producción vegetal en varios centros de
investigación del país.
La Argentina ha sido pionero en el mundo en la producción intensiva de
plantas transgénicas y actualmente es una de sus principales fuentes de ingresos.
El maíz y la soja son los principales cultivos para la agroindustria del país. Según
los últimos datos, el aumento de los precios de estos cultivos supera el 60%, siendo
la cosecha de maíz de 22 millones TN en la última campaña (7 TN más que la
campaña anterior). Para la campaña venidera se calcula una siembra de 4 millones
de hectáreas (30% más que la campaña actual) debido principalmente al anuncio
del nuevo plan de biocombustibles de EEUU.
Sin embargo, la sociedad debe entrar en el gran debate centrando en el
dilema entre alimentar con los excedentes de las cosechas records a más
habitantes o utilizarlo en la generación de biodisel. Otro debate aún pendiente es la
distribución desigual de las ganancias que generan los OGM. Ya que estos cultivos
tienen un menor costo de producción asociado a un mayor costo de producto final
debido al valor agregado de la biotecnología. La sociedad en su conjunto debe
instruirse y participar de estos debates.
Lecturas recomendadas:
Ciencia Hoy, 11 (62), 2001; Ciencia Hoy, Vol. 15 (87), 2005)
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