Escrito Detección de gránulos de PHAs en la cepa USBA 355 2

DETECCIÓN DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS
EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis.
KARINA BLANCO MARIN
PONTIFCIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
DICIEMBRE DE 2010
2
DETECCION DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS
EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis.
KARINA BLANCO MARIN
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C.
DICIEMBRE DE 2010
3
DETECCION DE DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS
EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis.
KARINA BLANCO MARIN
APROBADO
4
DETECCION DE DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS
OLIHIDROXIALCANOATOS
EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis.
KARINA BLANCO MARIN
APROBADO
__________________________________
Ingrid Schuler Garcia, Ph D.
Decana Académica
Facultad de Ciencias
5
AGRADECIMIENTOS
A Dios por permitirme llegar hasta aquí y por brindarme todos los días la seguridad de
su compañía en todas las acciones realizadas.
A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA), de la Pontificia
Universidad Javeriana, que permitió el desarrollo de este trabajo.
A la Doctora Sandra Baena por su colaboración, conocimientos aportados y su por
infinita paciencia y dedicación que día a día hacia posible este proceso de
investigación.
A mis compañeros de USBA: Carolina Rubiano, Javier Gómez, Luisa Fernanda Bernal,
Ángela Mantilla, Estefanía Sánchez y Laura Poveda por su apoyo, acompañamiento,
colaboración y aporte incondicional en este proyecto.
A Tuti por darme su mano y estar ahí para todo lo que necesitaba, por el aporte, por su
confianza, por su inmensa amistad y su don de hacerme reír.
A Andrés Felipe y su familia por acogerme como un integrante más y brindarme todo
su apoyo y confianza.
Y finalmente a papá y mamá quien con su infinito amor lograron engrandecer mi
espíritu con sus consejos para darme la fuerza y el acompañamiento necesario para
lograr este trabajo.
6
RESUMEN
Un microorganismo identificado como nuevo género y nueva especie Tistlia consotensis (Díaz
Cárdenas et al. 2010) presenta inclusiones citoplasmáticas que podrían sugerir la presencia de
gránulos de polihidroxialcanoatos (PHA). Los PHAs son poliésteres sintetizados por bacterias
en forma de inclusiones citoplasmáticas, como reserva de materia orgánica y energía,
principalmente cuando las células se encuentran en condiciones desequilibradas en los
suministros de nutrientes. Sus propiedades son similares a los termoplásticos, como el
polipropileno y el polietileno, y el gran número de mezclas de co-polímeros hace posible
obtener polímeros con las propiedades deseadas para un amplio rango de posibilidades. El
objetivo general del estudio fue detectar los gránulos de PHAs que se almacenan como
reserva, en la cepa USBA 355 Tistlia consotensis. Alterando las concentraciones de la fuente
de carbono, la fuente de nitrógeno y la concentración de sal, optimas de crecimiento para la
cepa T. consotensis, promoviendo las condiciones de stress para la producción del polímero.
La consecuente producción de gránulos es detectada mediante coloración con Negro Sudan,
Este trabajo de grado pretende demostrar que un microorganismo aislado de condiciones
salinas con limitaciones o excesos nutricionales tienen la capacidad de producir de forma
natural acumulados de polihidroxialcanoatos, que contribuyen como mecanismo de
almacenamiento de energía para la célula en condiciones de stress.
Para evaluar la influencia de los factores (condiciones nutricionales manipuladas) que
intervienen en la producción de PHAs se desarrolló un diseño factorial de 3x3x2 para analizar
todas las posibles combinaciones de los niveles de los factores en cada réplica del
experimento. La detección de los gránulos por la técnica de Negro Sudán arrojó resultados
positivos en la influencia de la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno.
7
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. Introducción………………………………………………………………......
1
2. Formulación del problema y Justificación del estudio…………………..
2
3. Marco Teórico………………………………………………………………...
3
3.1. Definición Polihidroxialcanoatos……………………………………………
3
3.2. Características físicas y químicas………………………………………….
4
3.2.1.
4
Figura 1. Estructura general de los polihidroxialcanoatos……………
3.3. Clasificación Polihidroxialcanoatos………………………………………...
4
3.4. Síntesis de PHA en procariotas…………………………………………....
5
3.4.1.
Figura 2. Vías metabólicas microbianas para la síntesis de PhaA: 3cetotiolasa; PhaB: (R)-reductasa 3-cetoacil-CoA reductasa, PhaC:
PHA sintasa o de la polimerasa; PhaG, (R)-3-hidroxiacil ACP:
transacilasa CoA; PhaJ, (R hidratasa enoil-CoA) específico. ………..
7
PHAs sintasas y Especies Representativas……………………………
7
3.5. Formacion de los gránulos de PHAs…………………………………………
9
3.6. Detección y cuantificación de PHAs….………………………………………
10
3.6.1.
Detección………………………………………………………………...
10
3.6.2.
Cuantificación…………………………………………………………....
10
4. Objetivos………………………………………………………………………
10
4.1. Objetivo General…………………………………………………………......
10
4.2. Objetivos Específicos……………………………………………………....
10
5. Metodología…………………………………………………………………..
11
5.1. Microorganismo………………………………………………………………
11
5.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento…………………………
11
5.3. Detección de la presencia de gránulos de PHAs…………………………...
11
5.3.1.
Tabla 1. Medición de producción de gránulos de PHAs………………
12
5.4. Factores para síntesis de gránulos de PHA’s en Tistlia consotensis ……
12
5.4.1.
Fuente de carbono……………………………………………………...
12
5.4.2.
Fuente de nitrógeno………………………………………………….....
12
5.4.3.
Concentración de sal…………………………………………………...
12
3.4.2.
8
5.5. Diseño Factorial……………………………………………………………..
5.5.1.
12
Tabla 2. Diseño estadístico de 3x3x2 para evaluar diferentes
concentraciones de nutrientes para poner a prueba la capacidad de
producción de PHAs del microorganismo USBA 355………………….
13
5.6. Detección de gránulos de polihidroxialcanoatos………………………...
14
5.6.1.
Técnica de tinción Negro Sudan……………………………………...
14
6. Resultados y Discusión…………………………………………………......
14
6.1. Detección de gránulos de PHA por tinción negro sudan………………..
14
6.1.1.
Figura 5. Detección de gránulos de PHA, por coloración con Negro
Sudan en control positivo (Ralstonia Picketti)………………………….
15
6.2. Detección de gránulos de PHAs con respecto al tiempo de
crecimiento…………………………………………………………………....
6.2.1.
15
Figura 6. Cinética de crecimiento (Densidad óptica λ= 580nm ) de
la cepa Tistlia consotensis y producción de gránulos de PHA con
respecto al tiempo de crecimiento, por 24 horas de muestreo, en
condiciones
físicas
y
nutricionales
optimas
de
16
crecimiento……...……………………………………………………..
6.3. Anova para seleccion de modelo factorial…………………………………..
17
6.3.1.
Tabla 3. Análisis de varianza…………………………………..…….....
17
6.3.2.
Tabla 4. Resultados estadísticos análisis de varianza……………...
18
6.3.3.
Efecto de la fuente de carbono, fuente de nitrógeno y concentración
de
sal
evaluados,
sobre
la
producción
de
gránulos
de
polihidroxialcanoatos………………………………………………………
19
6.3.3.1. Figura 7. Interacción entre el factor A: fuente de carbono (glucosa)
y el factor B (cloruro de amonio)…………………………………………
20
6.3.3.2. Figura 8. Interacción entre el factor A: fuente de carbono (glucosa)
y el factor C: concentración de sal………………………
21
6.3.3.3. Figura 9. Interacción entre el factor B: fuente de nitrógeno (cloruro
de amonio) y el factor C: concentración de sal…………….
23
7. Conclusiones…………………………………………………………………
24
8. Recomendaciones…………………………………………………………...
24
9. Referencias Bibliográficas…………………………………………………
25
9
1. INTRODUCCIÓN
La problemática generada por el uso indiscriminado de plásticos sintéticos y su persistencia en
el ambiente ha estimulado la investigación para el desarrollo de nuevos materiales y métodos
de producción que permitan generar plásticos o materias primas que presenten las mismas
propiedades pero que tengan un periodo de degradación más corto. La palabra plástico se
refiere a ciertos tipos de materiales sintéticos obtenidos mediante fenómenos de polimerización
o multiplicación artificial de los átomos de carbono en largas cadenas moleculares de
compuestos orgánicos. En general, son derivados del petróleo, aunque algunos se pueden
obtener a partir de otras sustancias naturales (Segura et.al.2007).
Desde que Maurice Lemoigne descubrió en 1926 que la bacteria Bacillus megaterium produce
Polihidroxialcanoatos (PHA), denominado polihidroxibutirato (PHB), se han reportado más de
300 bacterias capaces de producir PHA. Los PHA’s no son más que precursores de polímeros
naturales producidos por bacterias, que constituyen una familia de poliésteres, acumulados
intracelularmente, en forma de gránulos, compuestos de ácidos R-3 hidroxialcanoicos. Se
producen partir de sustratos orgánicos, como carbohidratos (glucosa, sacarosa), aceites,
alcoholes, ácidos orgánicos, hidrocarburos, y los acumulan en grandes cantidades dentro de la
célula bacteriana en forma de gránulos, llegando a constituir hasta 90% de la biomasa. A nivel
biológico la acumulación de este polímero se puede considerar como una estrategia
desarrollada por las bacterias para su supervivencia en ambientes cambiantes. Además de
servirle a la célula como fuente de carbono, también sirve como fuente de energía en el
proceso de enquistamiento, como en el caso de Azotobacter sp. y de esporulación (Bacillus),
así como barrera del oxigeno para la protección del complejo nitrogenasa, ya que actúa como
compuesto oxidable y también es constituyente de la membrana citoplasmática de las bacterias
(Castillo Franco, 2008).
Por sus propiedades físicas semejantes a las de los plásticos derivados del petróleo (ya que
estos polímeros presentan propiedades que van desde plásticos rígidos y quebradizos, hasta
los semejantes al hule) y por ser producidos a partir de recursos renovables, los PHA han sido
ampliamente estudiados presentándose como una alternativa biotecnológica para la producción
de plásticos biodegradables (Segura et.al.2007).
La cantidad de polímero producido y acumulado depende de la especie bacteriana y de las
condiciones en las que se cultiva. Como ya se ha mencionado, los PHAs se acumulan de
manera un tanto similar a la acumulación de grasas de reserva en los animales, bajo ciertas
condiciones nutricionales. En general, condiciones de desbalance nutricional en el medio
utilizados para el cultivo bacteriano, que favorezcan una alta producción. Para producir PHA
10
son especialmente favorables condiciones de cultivo en las que hay una concentración alta de
fuente de carbono (que la bacteria utilizará como materia prima para sintetizar el PHA), por
ejemplo sacarosa, pero además existe una limitación para el crecimiento, como niveles de
oxígeno bajos o escasez de otros nutrientes (Kim, 2008; Segura et.al.2007).
Existen varios factores que deben ser considerados en la selección de microorganismos para la
producción industrial de PHA, tales como la capacidad de la célula para utilizar una fuente de
carbono de bajo costo, la velocidad de crecimiento, la velocidad de síntesis y la capacidad de
acumulación del polímero de una cepa en particular sobre la base del sustrato (Martínez et al.
2004). Motivo por el que rrecientemente, se ha estado explorando estrategias de cultivo con el
fin de obtener una producción de PHAs con el mejor rendimiento, estas estrategias no se
logran sobre el cálculo en papel, si no con ensayo y error lo que permite evidenciar bajo un
estudio organizado y estadísticamente probado, que el efecto de diferentes nutrientes,
concentraciones y condiciones de cultivo proveen la información necesaria para determinar el
medio de producción adecuado.
El objetivo de este trabajo de grado, se trató principalmente en demostrar la presencia de
gránulos de polihidroxialcanoatos en la cepa Tistlia consotensis USBA 355, acumulados en
forma de inclusiones citoplasmáticas y además determinar las variaciones nutricionales que
podrían influir en la detección de gránulos de PHAs.
2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÔN DEL PROBLEMA
En trabajos de investigación previos, realizados en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología
Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana, sobre la diversidad microbiana, se
encontró un microorganismo la cepa USBA 355 identificado como nuevo género y nueva
especie, Tistlia consotensis (Díaz Cárdenas et al. 2010), que por medio de microscopia
electrónica sugirió la presencia de inclusiones citoplasmáticas que podrían tratase de gránulos
de PHA. Con base en esta evidencia, este estudio comprobó la presencia de dichos gránulos
de almacenamiento de carbono y energía mediante la combinación de variables nutricionales
para la determinación cualitativa de polihidroxialcanoatos.
Teniendo en cuenta que los Polihidroxialcanoatos representa un precursor importante en la
producción de plásticos biodebradables. La importancia de este trabajo se basó principalmente
en la descripción de una cualidad con aplicación biotecnológica en la cepa USBA 355 Tistlia
consotensis aislada de un manantial salino, Salado de Consotá, ubicado en el departamento de
Risaralda (Colombia), que representa una alternativa biodegradable. Ya que los plásticos de
origen químico constituyen una parte de los desechos sólidos. Debido a su baja densidad no es
apreciable el porcentaje en masa con el que contribuyen a los desechos totales, pero el
11
porcentaje en volumen es grande,
y conociéndose que el consumo destacado de estos
materiales en la sociedad moderna se incrementa día a día. Razon por la cual la problemática
de los plásticos en el medio ambiente es de gran relevancia y pretende ser disminuida (Rozsal,
et al. 2004).
3. MARCO TEORICO
3.1. DEFINICION DE POLIHIDROXIALCANOATOS
Los polihidroxialcanoatos son macromoléculas de origen microbiológico que se acumula en
forma de gránulos discretos a altos niveles de rendimiento en peso seco. Gran variedad de
procariotas tiene la capacidad de acumular PHAs como inclusiones citoplasmáticas insolubles
en agua, que representan compuestos de almacenamiento de carbono y energía los cuales son
sintetizados bajo condiciones desbalanceadas de crecimiento, principalmente cuando la fuente
de carbono se encuentra en exceso y cualquier otro nutriente se encuentra en condiciones
limitadas al mismo tiempo (Pötter & Steinbûchel, 2006).
Los PHAs constituyen una familia de polímeros biodegradables son una clase de poliéster
microbiano con un gran potencial en la aplicación de plásticos convencionales. Una vez que se
extraen los PHAs de la célula bacteriana, estas moléculas muestran propiedades similares a
algunos plásticos es conveniente para las bacterias almacenar el exceso de nutrientes dentro
de la célula, en especial cuando su forma física en general no se ve afectada. Los PHAs
contribuyen al desarrollo sostenible al ser originados por recursos renovables y por su
capacidad de biodegradación, son llamados “polímeros doblemente verdes” (Rozsal, et al.
2004), El poli (3 – hidroxialcanoatos) (PHAs) Como comunes, como el polipropileno. Además
de ser biodegradables, los PHAs son reciclables como los termoplásticos petroquímicos (Lara
& Gjalt. 1999).
3.2. CARACTERISTICAS QUIMICAS Y FISICAS
Diversos PHAs que han sido identificados son principalmente poliésteres lineales de principio a
fin compuestos de monómeros de ácidos grasos 3-hidroxi. En estos polímeros el grupo
carboxilo de un monómero forma un enlace éster con el grupo hidroxilo del monómero vecino.
12
3.2.1.
Figura 1. Estructura general de los polihidroxialcanoatos. (Imagen: Ojumo et al 2003)
Hasta el momento se han identificado más de 150 ácidos hidroxialcanoicos, saturados e
insaturados, halógenos, aromáticos, etc, los cuales son incorporados a la cadena lateral del
PHA y a su vez cambian sus propiedades físicas, esta variabilidad depende del tipo del
sustrato que se suministra, y de su especificidad (Madison & Huisman, 1999).
3.3. CLASIFICACIÓN DE LOS POLIHIDROXIALCANOATOS
La clasificación de los polihidroxialcanoatos depende de una amplia variedad de PHA que han
sido estudiados en diversas bacterias, hasta la fecha, alrededor de 150 componentes
diferentes de los PHA han sido identificados (Steinbüchel y Valentín, 1995). Los PHAs pueden
dividirse en dos grandes grupos, dependiendo del número de átomos de carbono en la cadena
polimérica. Estos pueden ser de cadena corta o de cadena media, los polihidroxialcanoatos
tienen una longitud de cadena corta de 3-5 átomos de carbono. En cuanto a los
polihidroxialcanoatos con una longitud de cadena media, generalmente tienen de 6 -14 átomos
de carbono. Otra clasificación conocida, se basa en la composición del polímero dado que ésta
varía en función de los sustratos utilizados (Pötter & Steinbuchel, 2007).
La masa molecular de los PHAs es del orden de 50 kilo-Dalton hasta 100 kilo-Dalton esto
depende de la naturaleza del polímero, intracelularmente se puede llegar a encontrar en estado
liquido y amorfos, que después de la extracción con solventes orgánicos, este pasa a un
estado cristalino confiriéndole características rígidas pero a su vez quebradizo. En cuanto al
punto de fusión es relativamente alto (180ºC) pero cerca al punto de degradación térmica
(200ºC) (Castillo Franco, 2008)
13
3.4. SINTESIS DE PHA EN PROCARIOTAS
Como se ha descrito anteriormente, los PHAs son acumulados si la fuente de carbono se
encuentra en exceso y si al mismo tiempo el crecimiento se ve limitado por otro nutriente como
el hierro, el magnesio, el nitrógeno, el azufre, el fosfato o el potasio (Pötter y Steinbüchel 2006)
ademas también se describen dos formas de clasificación de los PHAs de cadena corta y de
cadena larga, cuya formación metabólica difiere de acuerdo a los sustratos.
Las vías metabólicas de síntesis de los polihidroxialcanoatos de cadena corta y de cadena
media han sido ampliamente estudiadas (Steinbuchel & Eversloh, 2003). El principal
intermediario para la biosíntesis de polihidroxialcanoatos de cadena corta (PHASCL) es el acetil
– CoA, proveniente principalmente principalmente de la oxidación de diferentes fuentes de
carbono como carbohidratos, ácidos orgánicos y alcoholes; la producción de PHAs a partir de
carbohidratos (sacarosa, glucosa y fructosa) está compuesta por tres enzimas clave. (Volova et
al. 2004)
La primera enzima perteneciente a la vía biosintética de los polihidroxialcanoatos es la β
cetotiolasa, la cual cataliza la condensación de dos moléculas de acetil – CoA para formar
acetoacetil – CoA, esta enzima es codificada por el gen phaA.
El siguiente paso es la reducción del acetoacetil-CoA a (R) – 3 – Hidroxibutiril – CoA, catalizada
por la acetoacetil - CoA reductasa dependiente de NADPH. La expresión de esta enzima es
codificada por el gen phaB (Volova et al. 2004, Suriyamogkot et al. 2004).
La principal enzima señalada en la síntesis de PHA es denominada PHA sintasa, responsable
por la polimerización de unidades de (R)–3–hidroxiacil-CoA, formando el polihidroxialcanoato.
Esta enzima es absolutamente estereoespecifica para los esteroisomeros (R), y su
especificidad por el sustrato definirá la naturaleza del polímero final. Esta enzima puede ser
encontrada en los gránulos de PHA durante la acumulación, en donde la moléculas de
hidroxiacil-CoA servirán de sustrato para esta enzima, codificada por el gen phaC (Rehm,
2003)
La incorporación de diferentes monómeros depende principalmente del microorganismo y de la
fuente de carbono utilizada. Diferentes vías metabólicas, presentes en los microorganismos
son los responsables por la formación de diferentes moléculas de hidroxiacil – CoA. Por lo que
existen dos grupo de sustratos utilizados en la biosíntesis de estos polímeros: los sustratos
relacionados y los sustratos no relacionados (Steinbuchel, 1996). La síntesis a partir de
sustratos relacionados se denomina de esta forma ya que la composición del polímero
14
producido refleja el sustrato proporcionado; este tipo de síntesis es la que permite la
incorporación de mas diversidad de monómeros al polímero. (Cortes, 2008)
En la síntesis a partir de sustrato no relacionados, cuando son cultivados en presencia de
glucosa, fructosa, glicolato, acetato, glicerol, etc., producen un polímero conteniendo 3 –
hidroxidecanoato (3HD) como principal constituyente, además del 3 – hidroxioctanato (3HO), 3
– hidroxihexanoato (3HHx), 3 – hidroxidodecanoato, entre otros como constituyentes
secundarios. La síntesis de PHAs de cadena media (PHAMCL), a partir de sustratos
relacionados y sustratos no relacionados, pueden ser diferenciadas por las vías metabolicas
que proporcionan los intermediarios. Mientras que en la síntesis a partir de sustratos
relacionados, la β oxidación de ácidos grasos es la principal via para suministrar intermediarios.
En la síntesis a partir de sustratos no relacionados la biosíntesis de ácidos grasos suple los
intermediarios (Cortes, 2008).
El metabolismo de ácidos grasos representa una de las vías metabolicas mas comunes para
suplir monómeros de hidroxialcanoato (HA) a la síntesis de PHAs. Los intermediarios
generados mediante la degradación de ácidos grasos via β oxidación pueden proveer
hidroxialcanoil – CoA (HA-CoA) como sustrato para PHAsMCL (Cortes, 2008).
Una segunda ruta para la síntesis de PHAMCL en bacterias es a través del uso de intermediarios
de la biosíntesis de ácidos grasos de novo, la cual provee monómeros de 3 – hidroxiacil – CoA
que generalmente es metabolizada a acetil – CoA, como carbohidratos, acetatol o etanol. El
gen phaG codifica la enzima que enlaza la biosíntesis de ácidos grasos de novo y la síntesis de
PHA (Hoffmann et al. 2000). El producto de este gen cataliza la conversión de (R) – 3
hidroxiacil – ACP intermediario de la via de biosíntesis de ácidos grasos a su correspondiente
derivado CoA (Cortes, 2008).
15
(Imagen: http://openwetware.org/wiki/Work_Area)
3.4.1.
Figura 2. Vías metabólicas microbianas para la síntesis de PhaA: 3-cetotiolasa; PhaB:
(R)-reductasa 3-cetoacil-CoA reductasa, PhaC: PHA sintasa o de la polimerasa; PhaG,
(R)-3-hidroxiacil ACP: transacilasa CoA; PhaJ, (R hidratasa enoil-CoA) específico.
Por otra parte la síntesis de PHA’s de cadena media se ve directamente influenciado por la
enzima PHA sintasa de grupo II, esta enzima tiene mayor afinidad por sustratos a partir de
metabolismo de carbohidratos, donde se produce moléculas de acetil coA, las cuales vía
malonil coA, son incorporadas a la síntesis de Novo de ácidos grasos, donde es generado el 3hidroxiacil, el cual es transportado de la ACP (Acil Carrier Protein) para la coenzima A (CoA)
donde es polimerizado por la acción de la PHA sintasa. (REHM et al. 1999; Castillo, 2008 y
Volova et al. 2004)
3.4.2.
PHAs SINTASAS Y ESPECIES REPRESENTATIVAS
Algunas PHAs sintasas han sido clonadas y caracterizadas a nivel bioquímico o molecular.
Cuatro diferentes clases de PHA sintasas son diferenciadas. PHA sintasas Clase I, que son
representadas por la enzima de Ralstonia eutropha; estas enzimas tienen preferencia al
aceptar tioesteres de tipo CoA de ácidos hidroxialanoicos de cadena corta, como sustratos y
consiste de solo un tipo de subunidad (PhaCSCL). Este tipo de PHA sintasa actúa
principalmente en bacterias acumuladoras de PHA de cadena corta. (PHASCL) (Pöter &
Steinbuchel, 2006).
16
3.4.2.1. FIGURA 3. Clases de PHA sintasa (Imagen: actualizado Pötter & Steinbüchel de 2006)
Los PHAs de Clase II son representados por la enzima de Pseudomona oleovorans estas
aceptan tioesteres CoA de ácidos hidroxialcanoicos de cadena media, como sustrato y
contiene un solo tipo de subunidad (PhaCMCL) (Pöter & Steinbuchel, 2006). Los PHA sintasa
Clase III, son representadas por la enzima de Allochromatium vinosum, esta sintasa contiene
dos diferentes tipos de subunidades (Pha C y PhaE) y acepta tioesteres CoA de ácidos
hidroxialcanoicos de cadena corta como sustrato y en algunos casos ácidos hidroxialcanoicos
de cadena larga. Por último los PHA sintasas Clase IV, que están representados por la enzima
extraida de Bacillus megaterium y Bacillus sp., estos también constan de dos diferentes tipos
de subunidades (PhaC y PhaR) y presentan afinidad por sustratos del rango aceptado por PHA
sintasas de Clase III) (Pöter & Steinbuchel, 2006).
17
3.4.2.2. Figura 4. Ejemplo de la acción de los genes en la producción enzimática y la acción de
cada una de estas sobre el sustrato. (Imagen: Kim, 2008)
3.5. FORMACIÓN DE LOS GRÁNULOS DE PHAs.
Los PHAs son acumulados intracelularmente (como polímeros amorfos o móviles) en gránulos
de diferentes tamaños, ellos están rodeados por una monocapa fosfolipidica, que contiene
PHAsinas PhaF y PhaI, polimerasas, despolimerasas y proteínas citosólicas no especificas
ligadas al gránulo. La PhaI participa en la formación y estabilización de los gránulos, mientras
que la Pha F está involucrada en la estabilización de los gránulos y actúa como regulador
(Cortes, 2008).
La función de la monocapa fosfolipídica aun no ha sido bien establecida (Pötter & Steinbüchel
de 2006), aunque se cree que es necesaria por el contacto de los PHAs con el agua,
previniendo la transición del poliéster del estado liquido amorfo a una forma cristalina más
estable, y también se cree que desempeña un papel como barrera protectora evitando daño
celular causado por la interacción de los PHAs con las estructuras internas celulares o con las
proteínas citosólicas. En caso tal en que la monocapa fosfolipidica sea en realidad requerida
para proteger las células desde el comienzo de la formación del gránulo, puede ser asumido
que esta envoltura puede ser extendida alrededor del polimero, tan larga como se incremente
el tamaño del mismo. Por ello deben existir enzimas específicamente involucradas en la
síntesis de la monocapa fosfolipidica asociadas con el poliéster (Cortes, 2008).
18
3.6. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PHA’s
Se han empleado diferentes técnicas para la detección gránulos del polímero intracelular. Los
colorantes lipofílicos Negro Sudan, Azul de Nilo A y Rojo de Nilo, son ampliamente utilizados
(Burdón, 1946).
3.6.1.
DETECCIÓN
Después de Hartman, quien primero sugirió el uso de negro Sudán B, en lugar de Rojo Sudán,
como una tinción de grasa bacteriana (Hartman, 1940), la coloración con Negro Sudan en
solución alcohólica se confirmó como la técnica de mayor valor, dado que el procedimiento
demuestra el contenido graso intracelular de las bacterias, por medio de la preparación de
suspensiones de los organismos, formándose una película bacteriana y generando el contraste
de observación con safranina, la cual permite visualizar la presencia o ausencia de polímero de
naturaleza lipídica neutra en forma de gránulos intracelulares. (Burdón, 1946; Erazo et al.
2009).
3.6.2.
CUANTIFICACIÓN
El método cuantitativo de detección de los polihidroxialcanoatos es mediante cromatografía de
gases, utilizando como patrón interno, acido benzoico, el cual establece tiempo de retención
determinados para cada uno de los tipos de estructuras y cantidad de carbonos presente en
ellas, esta cuantificación depende de la extracción previa de los gránulos de PHA del interior de
las células y adicionalmente se debe despolimerizar por métodos como metanólisis para formar
metil – esteres propanolisis para formar propil – ester (Castillo, 2008).
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Detectar la producción de gránulos de Polihidroxialcanoatos en la cepa Tistlia consotensis.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Identificar la presencia de gránulos de PHA’s de acuerdo a la fase de crecimiento de la
cepa Tistlia consotensis (USBA 355)
2. Identificar la presencia de gránulos de PHA’s de acuerdo a cambios de condiciones
nutricionales.
19
5. METODOLOGIA
5.1. MICROORGANISMO
La cepa USBA 355: Tistlia consotensis se encuentra en la colección de microorganismos del
departamento de Biología de la Pontificia Universidad Javeriana. Fue aislada de un manantial
salado, situado en los andes colombianos, en el laboratorio de la Unidad de Saneamiento y
Biotecnología Ambiental. La secuencia genética del análisis de 16s rRNA la ubica dentro del
género Tistlia en la familia Rhodospirillaceae, de la clase Alphaproteobacteria, El nombre de la
especia T. consotensis, está relacionado con la ubicación geográfica la cual fue aislada por
primera vez en el manantial salino de Consotá, ubicado en el departamento de Risaralda,
Colombia. (Díaz – Cárdenas, et al. 2010)
Tistlia consotensis es una célula estrictamente aerobia, de coloración Gram negativa, miden de
0,6 – 0,7 x 3,0 – 3,5 µm, se reproduce por fisión binaria, muestra desplazamiento corporal, no
posee pilis y no forma esporas, es ligeramente curva y ligeramente halófila. Muestra
crecimiento en un rango de 20-40ºC (mesofílica) y un óptimo de 30ºC, crece en un rango de
pH entre 5.0 a 8.0 con un pH óptimo en 6,5 – 6,7. De metabolismo quimioheterótrofa, utiliza
glucosa o peptona como única fuente de carbono (Díaz – Cárdenas, et al. 2010).
5.2. MEDIOS DE CULTIVO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Los requerimientos nutricionales básicos, fueron empleado en medio aerobio con: 1g/L NH4Cl;
0.3g/L K2HPO4; 0.3g/L KH2PO4; 8g/L NaCL; 0.1g/L CaCl2; 0.1g/L KCl; 10g/L de Solución de
oligoelementos; (Balch et al. 1979) 0.05 g/L de Extracto de levadura y 5g/L NaHCO3. En
condiciones de agitación de 300 r.p.m. El pH del medio se mantuvo un óptimo entre 6.5 – 6.7.
El medio se llevo a agitación con el fin de lograr una mezcla homogénea para las sales y
demás componentes del medio. Posteriormente, alícuotas de 10mL fueron distribuidas en
tubos tapa rosca de 16x150mm y se llevaron a esterilización en autoclave por 20 minutos a 15
psi, una vez auto clavado, finalmente a los tubos con el medio básico se le adicionó 0.1mL de
Glucosa por cada tubo de 10mL para conseguir una concentración final de glucosa de 20mM
(Baena et al. 1998 y Díaz – Cárdenas. 2010).
5.3. DETECCIÓN DE LA PRESENCIA DE GRÁNULOS DE PHA
La determinación de la producción de gránulos en la cepa Tistlia consotensis, se llevó a cabo
por medio del muestreo de un cultivo liquido de crecimiento, en las condiciones de cultivo
óptimas para el crecimiento del microorganismos (6.2), cada dos hora durante 24 horas. En
cada muestreo, se montó una lámina de coloración con Negro Sudan, por triplicado y se evaluó
20
la presencia de gránulos. Esto se hizo para encontrar la hora aproximada en que se empieza a
producir el polímero y de esta forma, establecer el tiempo de muestreo para la detección de
gránulos bajo las condiciones nutricionales manipuladas. Esta detección cualitativa se realizó
con base a la cantidad de gránulos observados por campo óptico (Tabla 2), para
posteriormente ser interpolados de manera cualitativa.
5.3.1.
Tabla 1. Medición de producción de gránulos de PHAs
Gránuloss por campo óptico
Determinación cuantitativa
0 a 20
0
20 a 60
1
60 a 100
2
Mayor a 100
3
5.4. FACTORES PARA SÍNTESIS DE GRÁNULOS DE PHAs EN Tistlia consotensis
Las concentraciones de carbono y nitrógeno fueron alteradas del medio básico utilizado, en el
cual, el microorganismo tiene las condiciones óptimas para su crecimiento. Basados en el
criterio de Pötter y Steinbügel 2006; Madison & Huiman, 1999; Martínez et al. 2004; Ojumo et
al. 2004 y Saito y Doi, 1993, la acumulación de PHAs está dada cuando la fuente de carbono
esta elevada y otros nutrientes se encuentran limitados al mismo tiempo. Para este estudio se
realizó un diseño factorial similar al aplicado por Quillaguamán y colaboradores en 2007, en el
que se aplica una combinación de variables para evaluar la producción del polímero.
5.4.1.
Fuente de carbono Se evaluaron tres concentraciones diferentes de glucosa (fuente
de carbono) 30mM, 40mM y 50mM (9,008g/L),
5.4.2.
Fuente de nitrógeno (NH4Cl), A partir de la concentración óptima para el crecimiento
de la cepa (1,05g/L), tres concertaciones diferentes de NH4Cl:
¼ - ½ y ¾ partes de
esta concentración, equivalentes a: 0.2625g/L – 0.525 g/L y 0.7875 g/L se evaluaron
para determinar su influencia en la producción de gránulos.
5.4.3.
Concentración de sal (NaCL), Dos concentraciones diferentes de sal, 5g/L y 23g/L
fueron evaluados.
5.5. DISEÑO FACTORIAL
Dado a la presencia de tres factores, fuente de carbono; fuente de nitrógeno y concentración
de sal, con 3, 3 y 2 niveles respectivamente se diseñaron las posibles combinaciones de esos
niveles en todos los factores, (Tabla 1) lo que permitió el estudio del efecto de cada factor
sobre la variable respuesta que correspondía a una sola, la producción de gránulos de PHA.
21
Este diseño arroja un total de 18 ensayos diferentes, para los cuales se tuvieron en cuenta 3
repeticiones para validar la prueba, por lo tanto la suma de ensayos fue de 54 y la cuya
evaluación se llevo a cabo de manera aleatoria. Adicionalmente se realizaron evaluaciones
para el control positivo con Ralstonia pickettii que fue mantenida en condiciones normales en
medio básico con las mismas condiciones para el mantenimiento y reproducción de T.
consotensis y control negativo Escherichia coli puesto en crecimiento en medio caldo nutritivo,
obtenidas del cepario del departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana.
La interpretación de datos obtenidos se realizó con software de análisis estadístico DesignExpert versión 6.0.
5.5.1.
TABLA 2. Diseño estadístico de 3x3x2 para evaluar diferentes concentraciones de
nutrientes para poner a prueba la capacidad de producción de PHAs del
microorganismo USBA 355.
VARIABLES EVALUADAS
ENSAYO
GLUCOSA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
30 mM
40 mM
50 mM
30 mM
40 mM
50 mM
30 mM
40 mM
50 mM
30 mM
40 mM
50 mM
30 mM
40 mM
50 mM
30 mM
40 mM
50 mM
NH4CL
Partes/ Conc. Inicial Concentración g/L
¼
¼
¼
½
½
½
¾
¾
¾
¼
¼
¼
½
½
½
¾
¾
¾
0.2625
0.2625
0.2625
0.525
0.525
0.525
0.7875
0.7875
0.7875
0.2625
0.2625
0.2625
0.525
0.525
0.525
0.7875
0.7875
0.7875
22
NACL
5 g/L
5 g/L
5 g/L
5 g/L
5 g/L
5 g/L
5 g/L
5 g/L
5 g/L
23 g/L
23 g/L
23 g/L
23 g/L
23 g/L
23 g/L
23 g/L
23 g/L
23 g/L
5.6. DETECCIÓN DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS
5.6.1.
Técnica de tinción Negro Sudan (Burdón, 1946): 1. Se lleva una gota del cultivo ya
sea con el control positivo o con el microorganismo prueba (Cepa USBA 355) 2. Se
difunde el cultivo en un portaobjetos limpio y libre de grasa que debe tener un área de
alrededor 10mm x 30mm. Poner en fuego retirado el portaobjetos permitiendo así que
se fije y se seque el frotis. 3. La fijación bacteriana en este caso se llevara a cabo por
coagulación del citoplasma. 4. Se ponen unas pocas gotas (3 – 5) de solución negro
sudan a una concentración de 0,3% p/v en etanol al 70% v/v. 5. Después de 5-10
minutos el etanol presente en el tinte se debe evaporar o se puede retirar el exceso
cuidadosamente, empleando el borde de un pedazo de papel filtro. 6. Inmediatamente
después se sumerge el portaobjetos en xileno (di-metilbenceno) por 10 segundos,
teniendo la precaución de las reglas de seguridad de este compuesto dada a su alta
volatilidad por la presencia de gases tóxicos. Esperar a que el xileno se seque. 7.
Posteriormente se debe usar un colorante de contraste como la solución de safranina.
8. Después de 10 segundos enjuagar suavemente el portaobjetos bajo una corriente de
agua, y se deja secar de nuevo. 9. Después de completamente seco el portaobjetos se
añade una gota de aceite de inmersión y se pone bajo el lente 100X de microscopio.
Los gránulos de PHA’s son detectados como incrustaciones muy oscuras dentro de las
células de color rosa (Practical Biotechnology).
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. DETECCIÓN DE GRÁNULOS DE PHA POR TINCIÓN NEGRO SUDAN
La técnica de tinción, Negro Sudán, resultó ser la herramienta de estudio base para continuar
con el desarrollo de este trabajo de grado, a partir de la cual se determinó en cada tiempo de
muestreo de esta forma evaluar la única variable respuesta de interés (producción de
polihidroxialcanoatos). A partir de la microscopia electrónica realizada a T. consotensis en
estudios previos, se evidenció la presencia de inclusiones citoplasmáticas de carácter lipídico lo
cual sugería la formación de gránulos de PHAs. Esto fue confirmado con la coloración realizada
bajo condiciones nutricionales óptimas para el crecimiento de la cepa (glucosa 20mM, NH4Cl
1,05g/L y NaCl 5g/L) donde se detectó la presencia de estos gránulos. Esta evidencia fue
soportada utilizando Ralstonia picketti como control positivo (figura 5) y Escherichia coli como
control negativo.
23
Célula de Contraste
color Rosa (Safranina)
Gránulo PHA con
Negro Sudan
6.1.1.
Figura 5. Detección de gránulos de PHA, por coloración con Negro Sudan en control
positivo (Ralstonia Picketti)
6.2. DETECCIÓN
DE
GRÁNULOS
DE
PHAs
CON
RESPECTO
AL
TIEMPO
DE
CRECIEMIENTO.
Los PHAs se sintetizan y acumulan en el interior de las células en la mayoría de las bacterias
en una condición de crecimiento desfavorable, tales como la limitación de nitrógeno, fósforo,
oxígeno o magnesio y cuando la fuente de carbono de origen se encuentra en exceso. (Ojumu
et al. 2004) Sin embargo, la producción de los gránulos en T. consotensis se identificó sin
utilizar alguna estrategia nutricional que estimulara la producción del polímero o que llevara a la
cepa a condiciones de estrés que promoviera la acumulación de la fuente de carbono como
material de reserva y/o energía. Aunque las estrategias nutricionales mencionadas
anteriormente, son utilizadas para simular las condiciones que conducen a la producción
eficiente de PHA, se ha reportado que algunas bacterias como A. eutrophus, A. latus y la cepa
mutante de Azotobacter vinelandii tienen la capacidad de acumularlos durante su crecimiento,
como podría llegar a ser el caso de la cepa T. consotensis (Yu, 2001; Du et al. 2001; Du y Yu,
2002).
A partir de la cinética de crecimiento realizada para T. consotensis en condiciones óptimas y en
agitación, se determinó que su fase exponencial inició en la hora 8 de crecimiento hasta la hora
18, donde comenzó la fase estacionaria. Durante la cinética evaluada se realizó la tinción de
Negro Sudan cada dos horas por 24 horas de muestreo. Se observó la detección del polímero
a partir de la hora 6, al inicio de la fase exponencial (Figura 6), lo cual posiblemente indica que
la cantidad detectada está relacionada de manera directa con el aumento de la biomasa, y que
24
los mecanismos involucrados en la producción de PHAs,, probablemente generaron influencia a
partir de la hora 6 aproximadamente.
Crecimiento y Produccion de gránulos de PHA's
4
4,500
4,000
3
LN (X/Xo)
3,500
3,000
2,500
2
2,000
1,500
1
1,000
0,500
0,000
Produccion granulos PHA
5,000
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Tiempo (Horas)
Crecimiento cepa T. consotensis
Produccion granulos PHA
y = 0,191x + 0,0381
R² = 0,947
Lineal (Crecimiento cepa T. consotensis)
6.2.1.
Figura 6. Cinética de crecimiento (Densidad óptica λ=
= 580nm ) de la cepa Tistlia
consotensis y producción de gránulos de PHA con respecto al tiempo de crecimiento,
por 24 horas de muestreo, en condiciones físicas y nutricionales óptimas de
crecimiento.
La figura 6,, muestra el aumento de producción de PHAs en cada tiempo de muestreo (13
muestras) junto al aumento de biomasa, durante 24 horas de crecimiento. En la hora 6 se
identificó el punto de partida de detección del polímero, con una cantidad de gránulos
presentes por campo no mayor a 1. (Tabla 1)
1 que se mantuvo hasta la hora 8, en la cual
comenzó a aumentar la biomasa y por consiguiente
consiguiente la detección del polímero hasta la hora 14,
donde no se evidencio un aumento tanto de biomasa como de gránulos presentes por campo
de muestra. Lo que conduce a pensar que los gránulos son movilizados y metabolizados
metaboli
como
fuente de energía y carbono una vez que la
l limitación de nutrientes se ve disminuida en el
medio (Heok, 2009). A partir del comportamiento observado se determinó la hora 12 como el
tiempo máximo requerido para la formación del polímero, y este tiempo de crecimiento se utilizó
para evaluar la presencia de gránulos en condiciones de estrés nutricional en T. consotensis.
25
En conclusión es importante tener en cuenta que existen varios factores que deben ser
considerados en la producción los PHAs, frente a la evaluación con el comportamiento de
crecimiento de la cepa, tales como la capacidad de la célula para utilizar la fuente de carbono,
la tasa de crecimiento, la velocidad de síntesis del polímero y la acumulación máxima de éste,
sobre la base del sustrato (Ojumu et al. 2004). Lo que refleja que es posible que la cepa,
mejore el rendimiento en cuanto a la producción de PHAs siempre y cuando se aumente la
velocidad de crecimiento mediante el estudio en la utilización de otra fuente de carbono frente a
la producción de PHAs.
6.3. ANOVA. ANALISIS DE VARIANZA PARA EL MODELO FACTORIAL.
En este trabajo, el efecto de los diferentes nutrientes y las condiciones de cultivo, se evaluaron
con el objetivo de observar la influencia de estos factores nutricionales en la producción de
PHAs por T. consotensis y la detección de los gránulos. Esto se realizó mediante un modelo
estadístico de diseño factorial (3x3x2), que determinó el grado de influencia de cada uno los
factores evaluados (fuente de carbono, fuente de nitrógeno y concentración de sal) y
integración de los mismos.
Los resultados obtenidos se analizaron para validar los efectos principales sobre la variable
respuesta (producción de gránulos de PHAs) y comprobar que la variación observada en los
resultados es debida a un efecto real de cada factor y no al error experimental. (Ferré, 2003)
Que para efectos del estudio el programa Design-Expert arrojó los siguientes resultados.
Tabla 3. Análisis de varianza.
6.3.1.
Source
Sum of
DF
Mean square
F Value
Prob > F
Squares
Model
Significant
17.28
13
1.33
14.95
< 0.0001
A
10.11
3.00
1.50
2.22
0.11
0.33
3.56
1.56
2.00
20.83
2
2
1
4
2
2
40
4
36
53
5.06
1.50
1.50
0.56
0.056
0.17
0.089
0.39
0.056
56.87
16.88
16.88
6.25
0.62
1.87
< 0.0001
< 0.0001
0.0002
0.0005
0.5404
0.1666
7.00
0.0003
B
C
AB
AC
BC
Residual
Lack of fit
Pure Error
Cor Total
26
The Model F-value of 14.95 implies the model is significant. There is only a 0.01% chance that a "Model
F-Value" this large could occur due to noise.
Values of "Prob > F" less than 0.0500 indicate model terms are significant. In this case A, B, C, AB are
significant model terms.
Values greater than 0.1000 indicate the model terms are not significant. If there are many insignificant
model terms (not counting those required to support hierarchy), model reduction may improve your
model.
The "Lack of Fit F-value" of 7.00 implies the Lack of Fit is significant. There is only a
0.03% chance that a "Lack of Fit F-value" this large could occur due to noise. Significant lack of fit is bad
-- we want the model to fit.
La interpretación del ANOVA determinó que: “F-valor” de 14,95 implica que el modelo es
significativo. Determinando que existe una posibilidad de 0.01% de que el "Modelo F-valor" de
este tamaño pueda ocurrir debido al error. En síntesis el resultado del análisis demuestra que
los datos se ajustan al modelo estadístico, mediante el valor F, que evalúa dentro de un
análisis de varianza que los valores esperados de una variable cuantitativa en varios grupos
definidos previamente se diferencian entre sí. (González Ed. 2006)
Los valores de "Prob> F" menor que 0,0500 indican que los términos del modelo son
significativos. Para este caso A (fuente de Carbono), B (fuente de nitrógeno), C (Concentración
de sal) y AB (Relación fuente de carbono vs fuente de nitrógeno) son términos significativos del
análisis de varianza. Frente a la interpretación de la respuesta esperada, justifica, que los datos
obtenidos predicen que el comportamiento de estos factores deben ser altamente considerados
para la cuantificación de la variable respuesta, (producción de gránulos de PHA’s) En cuanto a
los factoeres que presentan valores superiores a 0.1000, no son significativos y no influyen en
la variable respuesta, como la relación AB (fuente de carbono y concentración de sal) y la
relación AC (fuente de nitrógeno y concentración de sal).
6.3.2.
Tabla 4. Resultados estadísticos Análisis de Varianza
Std. Dev.
Mean
C.V.
PRESS
R – Squared
Adj R – Squared
Pred R – Squared
Adeq Precision
0,30
1,94
15,33
6,48
0,8293
0,7739
0,6890
15,370
El análisis de varianza estadístico determinó que el comportamiento de los resultados
obtenidos (a partir de la coloración con Negro Sudán) señalo una baja dispersión de los datos y
la linealidad de los mismos es cercana a 0,9 lo que puede predecir un resultado satisfactorio
27
muy cercano a la realidad, a la hora del análisis de los datos bajo un modelo estadístico de
diseño factorial.
6.3.3.
EFÉCTO
DE
LA
CONCENTRACION
FUENTE
DE
SAL
DE
CARBONO,
EVALUADOS,
FUENTE
DE
NITROGENO
SOBRE LA PRODUCCION
Y
DE
GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS
La evaluación de la interacción entre los factores evaluados (fuente de carbono, fuente de
nitrógeno y concentración de sal) determino el grado de influencia de cada uno de ellos sobre
la variable respuesta (producción de gránulos de polihidroxialcanoatos), por lo tanto como ya
se ha mencionado numerosos factores afectan la producción del polímero, tales como la
concentración de sustratos, relación carbono-nitrógeno e incluyendo factores que no se tienen
bajo control en este estudio, como el pH, temperatura, agitación y tasa de aireación, de forma
similar a cualquier tipo de fermentación (Grothe et al, 1999; Du et al, 2001; Du y Yu, 2002).
La manipulación de la condiciones en la fuente de carbono y nitrógeno (siendo las más
reportadas) y la concentración de sal en el medio básico, para el crecimiento óptimo de T.
consotensis, se han utilizado en este estudio para promover la detección del polímero. Pues
como ya se mencionado en la revisión, las inclusiones intracelulares correspondientes a
gránulos de PHAs, son producidos en condiciones nutricionales no balanceadas.
La relación de estos factores: A, concentración de glucosa y B, concentración de cloruro de
amonio así como los diferentes niveles evaluados (concentración de cloruro de amonio) (B1,
B2 y B3) para cada uno fue graficado por el software de análisis utilizado, (Expert – Design) y
se puede evaluar a continuación.
28
DESIGN-EXPERT Plot
Interaction Graph
B: Cloruro de amonio
Granulos
3.2725
X = A: Glucosa
Y = B: Cloruro de amonio
Design Points
2.70438
Granulos
B1 0,2625
B2 0,5250
B3 0.7875
Actual Factor
C: NaCl = 5
6
2.13625
6
12
3
1.56813
1
3
30
40
50
A: Glucosa
6.3.3.1. Figura 7. Interacción entre el factor A: Fuente de carbono (Glucosa) y el factor B
(Cloruro de amonio)
Para la interpretación de la variable respuesta, correspondiente a la producción de gránulos de
PHA en los factores A (glucosa) y B (Cloruro de amonio) bajo tres niveles diferentes, se
evidenció que la mayor producción de gránulos está dada a un concentración de glucosa de
50mM, junto con el nivel B1 que corresponde a la menor concentración de cloruro de amonio
(0,2625g/L), la grafica también demuestra que la menor concentración de glucosa (30mM) junto
con la mayor concentración de cloruro de amonio (0,7875g/L) también influye de manera
negativa en la producción de los gránulos, lo que confirma que la relación carbono – nitrógeno
está directamente relacionada en la producción. Esto es sustentado por la teoría explicada por
diferentes autores, que cuando los suministros de nutrientes están desequilibrados, es
ventajoso para las bacterias ya que estas tienen la capacidad de almacenar el exceso de
nutrientes dentro de la célula. (Madison y Huisman, 1999; Berlanga et al. 2006; Ojumu et al.;
Du y Yu, 2002).
29
Sólo unos pocos PHAs pueden ser sintetizados a partir de carbonos simples, tales como ácidos
grasos o la glucosa. Teniendo en cuenta que los PHA son sintetizados por polimerización de
coenzima A (CoA), podría ser posible concluir que en este caso la fuente de carbono (glucosa)
es el precursor más importante (figura 6) en la producción de acetil CoA, teniendo en cuenta
que el sustrato utilizado (glucosa) hace parte del grupo de los carbohidratos y que la síntesis de
PHAs este mediada por la consecuente producción de acetoacetil CoA, para que
posteriormente se produzca (R) – 3 – hidroxiacil CoA y finalmente el polihidroxialcanoato.
Cuyas reacciones se deben llevar a cabo por las enzimas phaA, PhaB y PhaC (Figura 1). Al
parecer podrían ser activadas ante el exceso de glucosa en limitación de cloruro de amonio, lo
que genera una condición desbalanceada.
DESIGN-EXPERT Plot
Interaction Graph
C: NaCl
Granulos
3.2725
X = A: Glucosa
Y = C: NaCl
6
Design Points
2.70438
Granulos
C1 5
C2 23
Actual Factor
2.13625
B: Cloruro de amonio = 0,2625
5
8
1.56813
1
30
40
50
A: Glucosa
6.3.3.2. Figura 8. Interacción entre el factor A: Fuente de carbono (Glucosa) y el factor C:
Concentración de sal.
30
En cuanto a la relación entre los factores de concentración de sal y glucosa, (C y A). La
concentración de sal, no muestra participación en el proceso de producción, ya que es posible
observar en la figura 8, que tanto la menor como la mayor detección de gránulos se ve
reflejada cuando la concentración de glucosa es igual a 30 y 50mM respectivamente, mientras
que la influencia de la concentración de sal está siendo arrastrada, de acuerdo al aumento en
la concentración de glucosa.
De igual forma la relación entre la concentración de sal y el cloruro de amonio (C y B) no se
determinó como un factor fuerte en la influencia de producción del polímero dado que en el
análisis conjunto entre la figura 9 y la figura 7, es posible analizar que la mayor detección de
gránulos esta marcado, cuando la concentración de cloruro de amonio es baja (0,2625g/L) y
esta detección se ve disminuida cuando la concentración de NH4Cl aumenta. Concluyendo que
la limitación de nitrógeno en el medio de cultivo es una de las causas que favorecen la
biosíntesis de estos polímeros, ya que al producirse el desbalance nutricional y la condición de
estrés, la síntesis de proteínas y el metabolismo celular se ven impedidos y se podría pensar
que esta condición de ausencia, activa un mecanismo de defensa para lo que genera un factor
respuesta al generar reserva de energía (Castillo 2008).
Sin embargo es importante mencionar, que aunque la condición salina no representa un factor
que influya en la producción del polímero, si representa una ventaja industrial, debido a que la
extracción del gránulo por choque osmótico en células halófilas disminuye costos de
producción cercanos al 60% (Quillaguamán et al 2010). Este proceso por medio utilización de
agua en bajas concentración salina, genera la lisis celular permitiendo la liberación del gránulo.
31
DESIGN-EXPERT Plot
Interaction Graph
C: NaCl
Granulos
3
X = B: Cloruro de amonio
Y = C: NaCl
Design Points
Granulos
C1 5
C2 23
Actual Factor
A: Glucosa = 30
2.37632
5
3
1.75264
1.12895
3
6
0,5250
0.7875
0.505273
0,2625
B: Cloruro de amonio
6.3.3.3. Figura 9. Interacción entre el factor B: Fuente de Nitrógeno (Cloruro de amonio) y el
factor C: Concentración de sal.
En el trabajo de Quillaguamán y colaboradores en el 2007, desarrollaron la optimización de
Halomonas boliviensis para la producción de polihidroxibutirato por medio de un diseño factorial
que involucraba diferentes fuentes de nitrógeno y la utilización de sacarosa como fuente de
carbono y determinaron que las altas concetraciones de este causaban una efecto positivo en
la producción del polímero debido a la condición de estrés generado y la activación de
mecanismos que permitieron la acumulación del exceso. En sintesis la fuente de carbono
marcó la pauta principal en la producción de polihidroxialcanoatos en T. consotensis, dado que,
como se ha analizó anteriormente, la mayor concentración de este, garantiza el estrés de la
célula, lo que promueve la acumulación de gránulos en el interior, mediante la vía de glucolisis
y la posible que la producción de Acetil – CoA, entendiendo que este es el principal precursor
para la síntesis de polihidroxialcanoatos. Sin embargo se recomienda que otros factores físicos
32
sean evaluados y controlados para determinar la influencia en la producción del polímero y
complementar una lista de factores que intervengan en el proceso.
7. CONCLUSIONES.
•
La detección de los PHAs se encontró entre la hora 6 y la hora 18 de crecimiento en
condiciones optimas en la cepa Tistlia consotensis USBA 355.
•
La condición de estrés con mayor influencia en la detección de gránulos de PHA se
observó con la mayor concentración de glucosa evaluada y la menor concentración de
cloruro de amonio.
8. RECOMENDACIONES.
•
Para la complementación de este trabajo, es necesario hacer una cuantificación de los
gránulos de PHAs producidos en los factores evaluados que arrojaron respuestas
favorables.
•
Evaluar rangos menores de salinidad a los evaluados.
•
Detección de genes PHA sintasa.
33
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
BARBOSA M., ESPINOSA A., MALAGÓN D., MORENO N. 2005. Producción De Poli-B
Hidroxibutirato (Phb) por Ralstonia eutropha ATCC 17697. Universitas Scientiarum, Vol. 10 pp.
45 - 54
BLACH W., FOX G., MAGRUM F., WOLFE R. 1979 Methanogens: Revaluation of a unique
biological group. Microbiol Rev. Vol. 43 pp. 260 – 296.
CASTILLO F. 2008. Efecto del gen FadH1en la producción de PHA conteniendo monómeros
insaturados por Pseudomonas putida. Trabajo de grado para optar al título de Microbiólogo
Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias.
CRABTREE K., McCOY E., BOYLE W., & ROHLICH G. 1965. Isolation, Identification, and
Metabolic Role of the Sudanophilic Granules of Zoogloea ramigera1. Applied microbiology Vol.
3 (2) pp. 218 – 226.
DIAZ CARDENAS C., PATE B.K.C. & BAENA S. 2010. Tistlia consotensis gen. nov., p. nov., an
aerobic, chemeoheterotrophic, free living, nitrogen fixing alphaproteobacterium, isolated from a
Colombian saline spring. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol
60 pp. 1437 – 1443.
DU G. AND YU J. 2002. Green Technology for Conversion of Food Scraps to Biodegradable
Thermoplastic Polyhydroxyalkanoates. Environ. Sci. Technol., Vol. 36 (24), pp. 5511–5516.
ERAZO E., ROSALES S., ORTÍZ F., y
ÁLAVA C. 2009. Informe final Proyecto:
“bioprospeccion de microorganismos productores de phas y acidos grasos de interes industrial
aislados del lago Guamuez en el departamento de Nariño. Universidad Nacional Abierta y a
Distancia, UNAD. Pasto. Colombia.
FULL T., JUNG T & MADIGAN M. 2006. Production of poly-b-hydroxyalkanoates from soy
molasses oligosaccharides by new, rapidly growing Bacillus species. Journal compilation, The
Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology. Vol. 43 pp. 377–384.
da
GONZÁLEZ M. MIGUEL. Ed. 2006. Bioestadística amigable, 2
Edicion, Ediciones Diaz de
Santos, Madrid, España. 919 p.
HOFFMANN N., STEINBÜGHEL A., REHM BHA. 2000. The Pseudomonas aeruginosa phaG
gene product is envoved in the synthesis of polyhydroxyalkanoic acid consisting of medium –
34
chain – length constituents from non-related carbon sources. FEMS Microbiol. Biotehnol. Vol.
184. pp. 253 – 259.
JOSHI, P. & JAYSAWAL, S. 2010. Isolation and characterization of poly βhydroxyalkanoate
producing bacteria from sewage sample. Journal of Cell and Tissue Research Vol. 10(1) pp.
2165-2168.
KENNETH L. BURDON. 1946. Fatty material in bacteria and fungi revealed by staining dried,
fixed slide preparations. Department of Bacteriology and Immunology, Baylor University College
of Medicine, Houston, Texas.
KIM HEOK. 2008. Biosynthesis and characterization of Polyhydroxyalkanoates by a locally
Isolated chromobacterium sp. Usm2. Thesis submitted in fulfillment of the requirements for the
degree of Master of Science. Universiti Sains Malaysia.
KHANNA
S.,
AND
SRIVASTAVA
A.
2005.
Recent
advances
in
microbial
polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry. Vol 40 pp. 607–619
LARA
MADISON
&
GJALT
HUISMAN.
1999.
Metabolic
Engineering
of
Poly(3
Hydroxyalkanoates): From DNA to Plastic. Microbiology and molecular biology reviews. Vol.: 63
No 1. Pp. 21 – 53.
MARTINEZ JORGE; RODRIGUEZ MAYLEN; FERNANDEZ ANA; VILLAVERDE MARIO;
LOPEZ ALEJANDO; MARIN DANIESYI; NUÑES ROBERTO; GALEGO NORMA; CARBALLO
MARIA. 2004. Produccion de polihidroxialcanoatos en bacterias diazotrofas. Influencia de la
aeración en la síntesis de poli β hidroxibutirato en azospirillum brasilense cepa 7. Habana –
Cuba. Revista Biología Vol. 18, (1) pp. 87 – 95.
MUKHOPADHYAY M., PATRA & A.K. PAUL. 2005. Production of poly(3-hydroxybutyrate) and
poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Rhodopseudomonas palustris SP5212. World
Journal of Microbiology & Biotechnology. Vol 21 pp. 765–769.
OJUMU T., YU J. & SOLOMON B. 2004. Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterial
biodegradable polymer. African Journal of Biotechnology Vol. 3 (1), pp. 18-24.
PANTAZAKI A., TAMBAKA M., LANGLOIS V., GUERIN F. AND KYRIAKIDIS D. 2003.
Polyhydroxyalkanoate
(PHA)
biosynthesis
in
Thermus
thermophilus:
Purification
and
biochemical properties of PHA synthase. Francia, Molecular and Cellular Biochemistry Vol 254
pp. 173–183.
35
PÔTER MARKUS – STEINBÛCHEL ALEXANDER. 2006. Biogenesis and Structure of
Polyhydroxyalcanoate Granules. Biochemistry Vol. 40 pp. 607–619.
QIANG G. AND WU Q. 2005. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering
materials. Biomaterials Review. Vol 26 pp. 6565–6578
QUILLIGUAMÁN JORGE; MUÑOZ MARLENE; MATTIASSON BO; HAITTI-KAUL RAJNI. 2007.
Optimizing conditions for poly(β-hydroxybutyrate) production by Halomonasboliviensis LC1 in
vbatch culture whit sucrose as carbon source. Rev. Apply Biotechnology Vol. 74 pp. 981 – 986.
QUILLAGUAMÁN J., GUZMÁN H., VAN-THUOC D & HATTI-KAUL R. 2010. Synthesis and
production of polyhydroxyalkanoates by halophiles: current potential and future prospects. Appl
Microbiol Biotechnol. Vol 85 pp. 1687–1696.
REHM B., 2003. Polyester synthases: natural catalysis for plastics. Biochem. J. Vol. 376 pp. 15
– 33.
ROZSAL CHAVATI, DUPEYRON DANAY, GALEGO NORMA, CYRAS VIVIANA y VAZQUEZ
ANALÍA. 2004. Miscibilidad de mezclas poliméricas de polihidroxialcanoatos. Revista
Iberoamericana de Polímeros. Vol. 5 (2) pp. 56 – 66.
SALMIATI Z. UJANG, M.R. SALIM, G. OLSSON 2009. Recovery of Polyhydroxyalkanoates
(PHAs) from Mixed Microbial Cultures by Simple Digestion and Saponification. Institute of
Environmental and Water Resource Management (IPASA), Universiti Teknologi Malaysia.
STEINBÜCHEL A. & EVERSLOH T. 2003. Metabolic engineering and pathway construction for
biotechnological production of relevant polyhydroxyalcanoates in microorganisms. Biochen.
Eng. Vol 16, pp. 81 – 96.
STEINBUCHEL, A. 1996. PHB and other polyhydroxyalkaoic acid. In: REHM H. Dr. & REED G.
Dr. Biotechnology: Products of Primary Metabolism, Volume 6, Second Edition.
REVELO D., GROSSO M.V., MORENO N., MONTOYA D. 2007. A most effective method for
selecting a broad range of short and medium chain-length polyhidroxyalcanoate producing
microorganisms. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 Vol.10 (3) pp. 348 – 357.
36
SURIYAMONGKOL P., WESELAKE R., NARINE S., MOLONEY M., SHAH S. 2007.
Biotechnological approaches for tha production of polyhydroxyalkanoates in microorganisms
and plant. Review Biotechnology Advances. Vol: 25 pp.148 – 175.
UCHINO K., SAITO T. AND JENDROSSEK D. 2008. Poly(3-Hydroxybutyrate) (PHB)
Depolymerase PhaZa1 Is Involved in Mobilization of Accumulated PHB in Ralstonia eutropha
H16. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 74 (4) pp. 1058–1063.
USMAN ARSHAD, NAZIA JAMIL, NIGHAT NAHEED & SHAHIDA HASNAIN. 2007. Analysis of
bacterial strains from contaminated and non-contaminated sites for the production of
biopolymers. African Journal of Biotechnology Vol. 6 (9) pp. 1115-1121.
VISHNUVARDHAN S., THIRUMALA M., KISHORE REDDY T. AND MAHMOOD S. 2008.
Isolation of bacteria producing polyhydroxyalkanoates (PHA) from municipal sewage sludge.
World J Microbiol Biotechnol. Vol. 24 pp. 2949–2955.
VOLOVA; KALACHEVA;GORBUNOVA & ZHILA. 2004, Dynamics of Activity of the Key
Enzymes of Polyhydroxyalkanoate Metabolism in Ralstonia eutropha B5786. Rev: Applied
Biochemistry and Microbiology, Vol. 40, ( 2) pp. 170–177.
XUAN JIANG , JULIANA A. RAMSAY, BRUCE A. RAMSAY. 2006. Acetone extraction of mclPHA from Pseudomonas putida KT2440. Journal of Microbiological Methods Vol: 67 pp. 212–
219.
37