Pesquisa Neonatal para EDL Enfermedades Huerfanas Dr Victor R
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Pesquisa Neonatal Para Enfermedades de Depósito Lisosomal (EDL): Enfermedades Huérfanas Víctor R. De Jesús, PhD Team LLead, T d Bi Biochemical h i lM Mass S Spectrometry LLaboratory b Newborn Screening and Molecular Biology Branch Cali 2011 National Center for Environmental Health Division of Laboratory Sciences Enfermedades de Depósito Lisosomal (EDL) Grupo p de sobre 40 enfermedades genéticas g Mutaciones de genes que codifican enzimas intra-lisosomales Otras enzimas pueden causar EDL (e (e.g., g coactivadores, coactivadores proteínas de membrana) Defectos enzimáticos resultan en la acumulación de macromoléculas en el lisosoma • La acumulación de estas macromoléculas resulta en disfunción celular, de tejidos, y fallo celular Enfermedades de Depósito Lisosomal (EDL) Célula Normal Célula Afectada Enfermedades de Depósito Lisosomal (EDL) La incidencia de EDL individuales es muy y rara,, p pero pan-étnica Incidencia de grupo ha sido estimada en 1:7,000 1:7 000 to 8,000 8 000 Existen g grupos p más p propensos p a tener EDL Poblaciones con descendencia Ashkenazi judía (Tay Sachs) Descendencia sueca (Gaucher tipo 3) Diagnóstico de EDL complicado por la variabilidad en expresión clínica ¿Por qué iniciar PN para EDL? Algunas EDL se expresan durante el periodo neonatal y/o infantil Varias EDL responden a diferentes tratamientos en el periodo asintomático Tratamiento temprano en muchos casos mejora el panorama clínico de pacientes con EDL La Pesquisa Neonatal Salva Vidas 4 Millones de bebés anualmente en EEUU Programa de d monitoreo i poblacional bl i l más grande d Enfermedades tratables en el período neonatal Prevención de retardación mental, muerte y otros efectos adversos > 50 Enfermedades detectadas con tecnologías existentes 6000 Neonatos identificados y tratados anualmente Consideraciones p para PN de EDL ¾ “Historia natural” de EDL no ha sido caracterizada de manera extensiva ¾ ¿Correlación genotipo/fenotipo? ¾ Es difícil predecir el curso progresivo de EDL ¾ Consideraciones económicas ¾ Falta de consenso en documentos guías para diagnosticar y dar seguimiento a pacientes con EDL Métodos para PN EDL en gotas de sangre seca Fluorometría MPS-I (Hurler) MPS III B MPS-III-B MPS-VII Fabry Gaucher Niemann-Pick Tay-Sachs y Sandhoff Pompe Gangliosidosis Espectrometría p de Masa Tandem (MS/MS) MPS-II (Hurler) MPS MPS-II (Hunter) MPS-IV A (Morquio) MPS-VI (Maroteaux-Lamy) Fabry Gaucher Niemann-Pick Krabbe Pompe Ensayos enzimáticos en DBS por métodos fluorométricos 4-MU sustrato 1. enzima Buffer Sustrato con/sin inhibidor 2. 20h at 37oC 4MU glucosa 3. Enzyme deficiency LSD disease 4. Stop Cortesía de Petra Olivova, Ph.D., Genzyme Ensayo para EDL por MS/MS 15 µl 1x3mm DBS Substratos Extracción Líquido/Líquido q q 70 µ µl 37°C,1hr 1x3mm DBS 30 µl sustrato para Krabbe 37°C, ° 19-24 hr h Evaporación Extracción de Fase Sólida Elución Análisis por MS/MS (Zhang, XK et al, Clin Chem 2008; 54(10):1725–1728) Varios estados norteamericanos realizan actividades relacionadas a PN de EDL Estudio piloto Legislado, no activo Tamizaje para Krabbe Actividades del CDC para apoyo de pesquisa neonatal general Servicios de aseguramiento g de calidad (NSQAP) Producción y distribución de materiales de gotas de sangre seca (DBS) Programas de proficiencias, controles de calidad Evaluación de papel de filtro Todo lote nuevo es evaluado para determinar sus características analíticas Proveer comparaciones entre lotes y fabricantes di ti t distintos Actividades del CDC para apoyo de pesquisa neonatal EDL Producción y distribución de materiales de DBS para control de calidad de ensayos para PN de EDL Certificación • Homogeneidad, precisión y linearidad • Estabilidad de DBS Conformidad para ensayos de laboratorio • MS/MS • Métodos por fluorometría Desarrollo de materiales para proficiencias Actividades del CDC para apoyo técnico de PN de EDL por MS/MS Protocolos técnicos (SOPs) para el ensayo y Muestras de DBS QC con certificado de análisis Materiales para la optimización del sistema de MS/MS P/IS: / 0 to 5 p para determinar linearidad,, rango g Entrenamientos en el laboratorio del CDC 12 personas, 10 programas Certificación de DBS QC - Homogeneidad GAA (umol/L/hr) GAA QCL 0409 GAA‐QCL 0409 1.40 1 20 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 1 10 20 40 60 Card Number 90 120 160 Certificación de DBS QC – p precisión y linearidad GALC QC 4-2009 Linearity GALC QC 4-2009 Activity y (umol/L/h) 7.5 CV=7.52% 5.0 CV=12 69% CV=12.69% 2.5 0.0 CV=13.89% QC LOW QC MED Enzym e activity (umol//L/Hr) 7 6 5 4 3 y = 0.0616x + 0.0454 2 R = 0.999 2 1 0 0 20 QC HIGH Ensayo y por p MS/MS 40 60 % Cord Blood 80 100 120 Actividades del CDC para apoyo técnico PN de EDL por MS/MS - reactivos reacti os Diagrama para disponibilidad de reactivos (sustrato/IS) Diseñados por el grupo del Dr. Gelb en Univ. Washington Fabricados por Genzyme Corporation y registrados con US FDA (ASR), Union Europea (símbolo CE) Enviados al CDC Control de calidad interno, distribución por CDC L b de Labs d PN L b de Labs d diagnóstico di ó ti F bi Fabricantes t de d kits kit de d NBS Actividades del CDC para apoyo técnico de PN de EDL por MS/MS - reactivos Reactivos disponibles para PN de 6 EDL Fabry, Gaucher, Krabbe, Niemann-Pick A/B, Pompe, MPS-I Disponibles para programas de PN y de investigación Reactivos son libres de cargo Laboratorios interesados reciben formulario para p ordenar reactivos Información I f ió necesaria i para envíos í New York: PN para Krabbe Disease Agosto 7, 2006 hasta Septiembre 12, 2011 1,368,767 Screened for low GALC Activity Threshold activity ≤12% daily mean High Throughput MS/MS Dried Blood Spot Dried Blood Spot 536 DNA sequencing q g started 396 sequencing completed 166 low activity polymorphisms Venous Blood & Follow up 230→ Counseling and 230 Venous Confirmation 85 low risk 19 mod. risk 115 no risk 3H labeled - natural substrate 0.3 - 0.5 ηmol/h/mg protein 0.15 - 0.3 ηmol/h/mg protein 7 “saludables” hasta 49 meses 11 high risk (4 KD*) < 0.15 ηmol/h/mg protein 3 → HCT, 1 muerte, 1 anemia hemolítica crónica *4KD Predicted to have infantile form 1 → rehusó HSCT Based on genotype and neurodiagnostic testing Datos cortesía de Dr. Joseph Orsini, NYDOH Niveles de actividad enzimática IDUA por ensayos MS/MS y fluorometría Actividades en desarrollo • Programa de proficiencias • Colección de muestras de pacientes con: Gaucher, Fabry, Pompe, MPS I, MPS II, Krabbe, NP, MPS IV, MPS VI, MLD • Nuevos métodos y tecnologías • Multiples p reacciones para p MS/MS (Austria, Washington) g • Tecnología microfluídica Ensayo MS/MS “Triplex” ¾ Una sola incubación optimizada para tres EDL: Pompe, Fabry y MPS-I ¾ Desarrollado por el grupo del Dr. Gelb (UW) ¾ Basado en una sola muestra de 1/8” ¾ Utiliza los reactivos provistos por CDC ¾ Estudio piloto en Washington (EEUU) ha demostrado su utilidad en programas de PN A tandem mass spectrometry triplex assay for the detection of Fabry, Pompe, and mucopolysaccharidosis-I (Hurler). Duffey TA, Bellamy G, Elliott S, Fox AC, Glass M, Turecek F, Gelb MH, Scott CR. Clin Chem. 2010 Dec;56(12):1854-61. Simplified i lifi d newborn b screening i protocoll for f lysosomal l l storage disorders. di d Metz TF, Mechtler TP, Orsini JJ, Martin M, Shushan B, Herman JL, Ratschmann R, Item CB, Streubel B, Herkner KR, Kasper DC. Clin Chem. 2011 Sep;57(9):1286-94. Digital i i l Microfluidic i fl idi Platform l f for f Multiplexing l i l i Enzyme Assays: Implications li i for f Lysosomall Storage Disease i Screening i iin Newborns. b Sista RS, Eckhardt AE, Wang T, Graham C, Rouse JL, Norton SM, Srinivasan V, Pollack MG, Tolun AA, Bali D, Millington DS, Pamula VK. Clin Chem. 2011 Aug 22. Posibilidades y Realidades Posibilidades Expandir historia natural de EDL Facilitar detección temprana – eliminar la odisea diagnóstica Desarrollar terapias menos costosas Crear conciencia sobre enfermedades raras Realidades PN para EDL llega a sobre 500,000 recién nacidos en EEUU anualmente Consejería genética sobre EDL para familias Métodos más específicos, datos de niveles poblacionales de enzimas lisosomales disponibles Resumen PN para EDL es posible para 6 enfermedades Ensayos diseñados para procesar gran número de muestras Reactivos disponibles sin costo (MS/MS) Información obtenida por PN de EDL útil para mejor j entendimiento de enfermedades raras Disponibilidad de terapias Resumen Materiales DBS QC disponibles para asegurar la calidad de los ensayos en laboratorios de PN Los materials provistos por CDC QC son útiles para ensayos por MS/MS, fluorometría y tecnología microfluídica i fl ídi C C apoya actividades CDC act dades de pesqu pesquisa sa neonatal eo ata pa para a EDL a nivel mundial ¿Por Qué Debemos Mantener La Calidad lid d en lla Pesquisa Neonatal? Detección exacta y temprana de enfermedades congénitas ocurre a nivel mundial! Para mas información… Newborn Screening Translational Research Initiative Robert F. Vogt, PhD Principal Investigator Newborn Screening Translation Research Initiative Tel: 770-488-7971 Fax: 770-488-7459 Email: [email protected] rfv1@cdc gov Hui Zhou, PhD Senior Scientist, Scientist CDC Foundation Fo ndation Newborn Screening Translation Research Initiative Tel: 770-488-4861 F 770 Fax: 770-488-7459 488 7459 Email: [email protected] ¡Gracias por su atención!
