Métodos serológicos para el Diagnóstico de la - BVS-INS

Métodos serológicos para el
Diagnóstico de la Bartonelosis.
Jenny Merello Flores
IMT ¨Alexander von Humboldt¨
Universidad Peruana Cayetano Heredia
INTRODUCCION:
Bartonella bacilliformis (Bb), bacteria
hemotrófica capaz de invadir y replicarse en
eritrocitos y células endoteliales humanas.
La infección resultante se manifiesta como una
enfermedad bifásica (aguda y crónica).
Hasta el 2003 se han reportado casos autóctonos
en 12 de los 24 departamentos del país: Piura,
Cajamarca, Amazonas, La Libertad, Ancash,
Lima, Ica, Huancavelica, Huánuco, Junin,
Ayacucho y Cuzco.
INTRODUCCION:
Se hace necesario conocer métodos de
diagnóstico rápidos y sensibles.
Existen pocos reportes difundidos sobre técnicas
de inmuno-diagnóstico para la enfermedad.
La detección de anticuerpos contra Bb, tiene
como ventajas:
*Evitar largos períodos de incubación como en
los cultivos;
*Obtención de muestras difíciles, o
INTRODUCCION:
*Implementación de equipos altamente
especializados y ambientes especiales para
realizar cultivos y pruebas por biología
molecular.
La desventaja es que la respuesta de anticuerpos es
inespecífica en los humanos, hay reacción cruzada!.
Bartonella bacilliformis
(Microfotografía electrónica)
Diagnósticos Serológicos
DIAGNOSTICOS SEROLOGICOS:
 En 1928, Noguchi realizó los primeros estudios sobre
inmunidad humoral por fijación de complemento.
 En 1942, Howe usó la técnica de aglutinación.
 En 1972, Colichón y Cantella usaron hemoaglutinación.
 En los últimos años se han desarrollado otras pruebas
serológicas como: test de anticuerpos fluorescentes (IFI,
IFA), hemoaglutinacion indirecta, ELISA y Western blot.
P. Pachas.¨ La Bartonelosis en el Perú¨. Módulos Técnicos, OGE/INS 2000 .
INMUNOPRECIPITACION:
 Knobloch y col. (1985):encuentran una sensibilidad del
método en 27.8%.
 Knobloch y col. (1988): Identifica 6 antígenos de pared
celular, Considerando 2 bandas antigénicas para Bb (65 y
75 kDa). Dando resultados específicos.
Knobloch J, Solano L, Alvarez O, Delgado E. Antibodies to Bartonella bacilliformis as determined by
fluorescence antibody test, indirect haemagglutination and ELISA. Trop Med Parasit 1985;36:183-185
Knobloch J. ¨Analysis and preparation of Bartonella bacilliformis antigens¨. Am. J. Top. Med. Hyg. 1988;39:173-178.
IFI, IFA:
Chamberlin y col.(2000):
 Con IFI demostraron 74% de sensibilidad en pacientes
con enfermedad de Carrión en Caráz (prevalencia de
38%). 92% de los controles negativos fueron seronegativos.
 Con IFA, a partir antígeno cultivado en células Vero
obtiene 82% sensibilidad para fase aguda y 93% para fase
convaleciente, siendo su especificidad del 92%.
Chamberlin J, Laughlin l, Gordon S, Romero S, Solorzano N, & Regnery RR. Reserved.
Serodiagnosis of Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay: Test
Development and Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of
Clinical Microbiology, Nov. 2000, p. 4269–4271 Vol. 38, No. 11 American Society for Microbiology.
ELISA:
 Knobloch y col.(1985): Un estudio en Cajamarca
reporta una sensibilidad del 54.6% para esta técnica. No
encontró reacción cruzada con sueros que contenían
anticuerpos contra otras bacterias.
Usando HPLC prepara 7 antígenos de los cuales sólo
uno de 48 KDa. Reacciona específicamente para Bb
cuando se aplica esta técnica
Además, antígeno crudo produce reacciones
inespecíficas (reacción cruzada contra Chlamydia
psittaci).
Knobloch J, Solano L, Alvarez O, Delgado E. Antibodies to Bartonella bacilliformis as determined by
fluorescence antibody test, indirect haemagglutination and ELISA. Trop Med Parasit 1985;36:183-185
WESTERN BLOT:
Knobloch y col.(1988), realizan el primer
estudio e identifican 24 proteínas antigénicas a
partir de Ag. crudo de los cuales, 6 son
detectadas específicas para sueros de pacientes
con Bartonelosis (18, 26, 36, 48, 65 y de 75 kDa).
Knobloch J. ¨Analysis and preparation of Bartonella bacilliformis antigens¨. Am. J. Top. Med. Hyg.
1988;39:173-178.
WESTERN BLOT:
Xing y Raoult (2000), usando antígeno crudo
encuentran 11 bandas inmunoreactivas, siendo
detectados con suero policlonal de ratón anti-Bb
(120,104,71, 54, 47 41, 37,27 y 25 KDa).
Xing Z and Raoult D. ¨Diferentiation of Bartonella species by a microimmunofluorescence assay,
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroforesis and western immunoblotting¨.
Clinical an Diagnostic Laboratory Immunology, July 2000, p. 617-624..
WESTERN BLOT:
 Koset y col (2000):trabajando en áreas no endémicas de
Amazonas, encuentra a partir de Antígeno crudo por
método de sonicado, dos bandas inmuno-reactivas para
Bb:17 y 18 KDa, siendo sensible en un 70% para fase
aguda y 94% para fase crónica; y específica en ambos
casos en un 100%.
Reacción cruzada con Brucella (40%), Salmonella (4%),
Chlamydia p.(5%), Coxiella b.(10%).
Kosek, M. Lavarello R. Gilman R. Delgado J. Maguiña C. Verastegui M. Lescano A. Mallqui V. Kosek J.
Recavarren S. And Cabrera L. ¨Natural History of infection with Bartonella bacilliformis in a nonendemic
population¨ . The Journal of Infectious Diseases, 2000; 182:865-872.
WESTERN BLOT:
 Mallqui y col. (2000): Comparan antígeno crudo obtenido
por los métodos de sonicado y extracción con glicina.
Obteniene una sensibilidad del 94% para fase crónica, en
ambos métodos; y una sensibilidad del 70 y 30% para los
métodos de sonicado y glicina respectivamente, en la fase
aguda.
La especificidad fue del 100% en ambos métodos.
Observaron reacción cruzada(Brucella 34%,Clamydia 5%
y Coxiella 7%, no reaccion con B. Henselae)
V. Mallqui, E. C. Speelmon, M. Verastegui, C. Maguiña-vargas, P. Pinell-salles,R. Lavarello, J. Delgado, M.
Kosek, S. Romero,y.& R. Gilman. ¨Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis¨. clinical and
diagnostic laboratory immunology,jan. 2000, p. 1–5 vol. 7, no. 1
Inmunoblot para sonicado
+
-
-Bb +A
+C
CONCLUSIONES:
 Antígeno crudo: se han detectado hasta 6 antígenos
inmuno-reactivos (18,26,36,48,65 y 75 KDa), en suero de
pacientes con bartonelosis (Knobloch,1990)
Mallqui reporta 7 antígenos inmunoreactivos(entre 13-42
KDa).2 específicos para Bb, fase crónica (17 y 18 KDa.)
 Pared celular: se han identificado 6 probables antígenos
de pared celular(25,46,65,75,99 y 160 KDa), 2
antigenicas para Bb de 65 y 75 KDa. (Knobloch,1988)
 Membrana externa: se ha encontrado 3 proteínas
purificadas (31.5, 42 y 45 KDa),con alta
inmunoreactividad para Bb(Minnick, 1994)
Conclusiones:
 LPS de membrana externa: se ha encontrado una
proteína de 5 KDa. poco reactiva para pruebas inmune.
 Citoplasmática:Un proteína de 65 KDa, a sido
identificada como inmuno-específica para B.bacilliformis.
(Knobloch,1990)
Seroprevalencia para Bartonelosis
A u to r
Año
K n o b lo c k
1985
C a ja m a rc a , P e rú
S o la n o
1988
G ra y
1988
M in a y a
1993
H u a r i,
A n ca sh ,
P e rú
S h u m p illa n ,
P om a b a m b a , P e rú
C a rh u a z , H u a ra z ,
P e rú
Am ano
C h a m b a r le
in
D e lg a d o
Lugar
P re v a le n c ia
6 3 .6
T é c n ic a
P o b la c ió n
P o b la c ió n
g e n e ra l
2 1 .7
50
49
4 1 .2 5
C o n E L IS A , A F
y HI
E L IS A
AF.
HI
A g lu tin a c ió n e n
la m in a
E L IS A
E L IS A
E L IS A
E L IS A
7 7 .2 7
E L IS A
9 1 .4
1997
M a n a b i, E c u a d o r
21
E L IS A
17
E L IS A
1998
O ro
y
Z a m o ra
C h in c h ip e ,
Ecuador
C a ra z ,
A n ca sh ,
P e rú
B o n g a ra ,
A m a z o n a s, P e rú
1999
P o b la c ió n
g e n e ra l
A s in to m á tic o s
S in to m á tic o s
P o b la c ió n to ta l
P e rso n a s
s in
a n te c e d e n te
P e rso n a s
con
a n te c e d e n te
C o n ta c to
de
casos
C o n ta c to
de
casos
T IF
P o b la c ió n to ta l
7 7 .6
W e s te rn b lo t
9 4 .6
W e s te rn b lo t
P o b la c ió n
g e n e ra l
P e rso n a s
le s io n e s
e ru p tiv a s
P. Pachas.¨ La Bartonelosis en el Perú¨. Módulos Técnicos, OGE/INS 2000.
con
Laboratorio de Microbiología
Experimental
Instituto de Medicina Tropical
”Alexander von Humbolt”
Universidad Peruana Cayetano Heredia
¨Western blot como técnica de
diagnóstico para bartonelosis¨
OBJETIVOS
Objetivo Principal:
Encontrar antígenos inmunogénico para
Bartonella bacilliformis utilizando la técnica de
Western Blot para el diagnóstico de bartonelosis
(fase aguda y crónica).
Objetivos específicos:
 Obtener antígenos a partir de cepas estandar y aislados
de pacientes con bartonelosis (fase aguda y crónica).
 Aplicar la técnica de Western blot en el diagnóstico de la
bartonelosis para laboratorio.
 Encontrar el antígeno específico más reactivo para el
diagnóstico de la Bartonelosis (fase aguda y crónica)
MATERIALES Y METODOS
Cepas bacteriales:
 Se prueba la cepa estandar ATCC 35685 de Bartonella
bacilliformis.(Donación Dr. Rito Zerpa)
 Además de cepas obtenidas a partir de aislados de
pacientes que llegan al Laboratorio de Microbiología
Experimental, IMT-AvH, UPCH.
Condiciones de cultivo:
 Las bacterias son cultivadas de acuerdo al protocolo
referido por Mallqui y col. (2000):
Medio bifásico (Medio F1 + RPMI enriquecido con
buffer HEPES,Na2CO3 y SFB al 10% ). Siendo incubado
a 30°C por 7 a 14 días, 2 repiques en medio líquido
(RPMI, HEPES, Na2CO3 y SFB al 10%) por 14 a 21días,
30 °C.
Preparación de Antígeno:
 Células intactas son obtenidas a partir del centrifugado
del cultivo,lavado en tres tiempos con buffer
SORENSON, resuspendido luego en 5ml de PBS, pH 7.2.
 El antígeno crudo es obtenido por SONICADO.
 La concentración de proteína es determinada por el
método de BRADFORD.Almacenamiento a –70
 El antígeno es preparado en una solución SDS -Tris-HCl
(pH 8.0), para una concentración final de proteína de
0.1µg/µL.
SDS-PAGE – Inmunotransferencia y
blot:
 Se usan geles al 12%. Proteínas estimadas por el uso de
un marcador de peso molecular estandar pre-teñido de
amplio rango (6.9 a 201.1 KDa).
 El antígeno separado por SDS-PAGE es transferido a
papel de nitrocelulosa 0.45µm.
 Tiras conteniendo el antígeno son enfrentadas a sueros
1/50 en controles positivos y negativos para Bartonelosis.
Uso de conjugado anticuerpos para humano horseradishperoxidasa IgG
 Anticuerpos específicos para Bartonella bacilliformis son
visualizados con DBA por 10 minutos.
Identificación de banda diagnóstica:
Bandas antigénicas obtenidas son comparadas
con bandas de grupos de sueros de pacientes con
bartonelosis confirmados por lámina y cultivo
(controles positivos para fase aguda y crónica), y
grupos de sueros de personas sin bartonelosis de
zona no endémica (controles negativos).
Por la referencia, se tiene en cuenta reacciones
cruzadas con Chlamydia psittaci, Bartonella
henselae, Coxiella burnetti y Brucella sp.
RESULTADOS PRELIMINARES
Resultados Preliminares:
 Se obtiene baja producción de antígeno por el método
bifásico.
 Se revelan por SDS-PAGE 30 bandas proteícas que van
de 8.6 a 201 KDa.
 Obtenemos: 7 bandas antigénicas de <20, 36, 40,56, 65,
70, y <100 Kd para sueros con fase aguda.
 Obtenemos: 9 bandas antigénicas de 17, 18, 36, 46, 60,
65,70,80,110 KDa. para sueros con fase crónica.
 Controles negativos revelan bandas de 14, 42, 75 KDa.
Discusiones:
 En nuestro avance, inmunoblot por sonicado revela
presencia de nuevas bandas antigénicas, tanto para fase
aguda como crónica de la enfermedad.
 Coincidimos con Mallqui en la obtención de las 2 bandas
antigénicas específicas para fase crónica (17 y 18 KDa)
 Con Knobloch con la banda 36 y 65 KDa para fase aguda.
 A pesar de la alta sensibilidad y especificidad de la
técnica se espera a futuro trabajar con antígenos
purificados que permitan mejores resultados para el
diagnostico de la enfermedad.