Estrategias de Hibridación in situ Fluorescente para el diagnóstico
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Fluorescent in situ Hybridization Historia • Hibridación in situ •Desarrollada por Pardue & Gall (1969) -Muy pocas secuencias de DNA disponibles -Radioisótopos ·Alto entrenamiento ·Seguridad ·Tiempo • Hibridación in situ Fluorescente •Pinkel & Gray (1984) •Detección de secuencia blanco por fluorescencia •Método rápido •Discriminativo •Inofensivo •Relativamente fácil Fundamentos Desnaturalización 37ºC 95ºC Metodología •Desnaturalización de la sonda •Desnaturalización del DNA Cromosómico •Hibridación Sonda-DNA Cromosómico Hibridación in situ Fluorescente FISH (Clásico) •Multicolor Karyotyping •Spectral Karyotyping •Multicolor banding FISH •Fiber FISH •Q-FISH •Flow-FISH •Chromosome combing •Padlock FISH •CGH •Array-CGH •etc.!! Sondas Sondas Definición Fragmentos de DNA homólogos a la secuencia blanco, marcados con una molécula detectable directamente o mediante una reacción inmunoquímica Estos fragmentos deben cubrir una región de por lo menos 70 kb para poder ser detectados al microscopio. Sondas: Sondas región específicas: Sondas gen-específicas: Sondas de pintado cromosómico total: Hibridación in situ Fluorescente en diagnóstico oncológico Genética Clínica Citogenética Clásica Genética Molecular Citogenética Molecular Análisis de Metafases •Translocaciones •Cromosomas Marcadores •Inversiones (pericéntricas) •Anomalías numéricas •Microdeleciones Análisis de Metafases Citogenética de interfase Diversidad de sondas específicas (proyecto genoma) Simplificación de protocolos Disminución del tiempo de análisis Mejora notable en los métodos de marcado de sondas Mejora en los sistemas de tomas de imágenes y software Información valiosa en núcleos interfásicos FISH en interfases HERRAMIENTA CLÍNICA Citogenética de interfase Algunos usos específicos Estudio de mosaicismos Muestras pequeñas Células tumorales Células inactivas FISH en interfases Se obtiene información de una gran variedad de muestras Permite obtener información específica en muestras pequeñas Independiente de la presencia de células metabólicamente activas Es necesario establecer criterios propios Sujeto a variaciones técnicas importantes Debido a: Calidad de la sonda Calidad de la fijación Background Reactivos de detección Interpretación de las señales Especificidad de la sonda Temperatura de desnaturalización Variabilidad entre reacciones Diseño de sondas Cent. 22qter (C+) HIRA (Tuple1) PPM1F TOP3B Diseño de sondas Para aplicación en Oncología Diseño de sondas Para aplicación en Oncología •Sondas Locus específicas •Sondas Break Apart •Sondas Doble fusión •Sondas Tumores sólidos Sondas Oncológicas Locus Específicas 17p13.1 (TP53) FXR2 SHBG 17p13.1 SAT2 150Kb TP53 (20Kb) WDR79 EFNB3 DYH2 Izq, Normal. Der, P53- 17q25.3 Isocromosoma 17q Sondas Oncológicas Locus Específicas 1p36 (TP73) 1p36.32 150Kb TP73 Control 1q44 Sondas Oncológicas Locus Específicas 5q15-q31 (SHGC85191/EGR1) Control 5q11.2 SHGC85191 EGR1 Sondas Oncológicas Tumores sólidos CANCER DE MAMA: Her 2/neu (erb2) Es un oncogen que se encuentra en la célula normal en dos copias únicamente Enumeración 17 (17p11.2) (C+) Her 2/neu Distintos mecanismos pueden llevar a la amplificación de este gen, desencadenando la enfermedad. Sondas Oncológicas Tumores sólidos Procesado: Microtomo Tacos de parafina Señal al microscopio Cortes de 4- 6 µ Sondas Oncológicas Tumores sólidos Celula normal: dos copias de Her 2/neu dos señales verdes representan dos cromosomas 17 dos señales rojas representan dos copias del oncogen Celulas con amplificaciones Las señales verdes representan los cromosomas 17, las señales rojas representan del oncogen amplificado Sondas Oncológicas Tumores sólidos Células normales Células anormales Diseño de sondas Translocación BCR-ABL Diseño de sondas Cromosoma Philadelphia en Leucemia Mieloide Crónica •95 % de los pacientes tiene esta fusión •Su presencia activa una tirosina kinasa requerida para su función transformante •La evolución es seguida a través del porcentaje de células con cr. Phi en sangre •El método más apropiado para esto es FISH Diseño de sondas Translocación BCR-ABL ¿Porqué FISH ? •Los métodos moleculares (PCR) dan la respuesta: SI ó NO •FISH: respuesta cuantitativa (%) •Los métodos moleculares (PCR) pueden contaminarse con falsos positivos •FISH: no es pasible de contaminación intermuestras Translocación BCR-ABL (Sonda Fusión Simple) 140Kb Crom. 22 52Kb Crom. 9 BCR 350Kb ABL 421Kb BCR-ABL - Falsos positivos 5-13% BCR-ABL + Sondas de Doble Fusión Translocación BCR-ABL (Sonda Doble Fusión) 140Kb Crom. 22 BCR 52Kb Crom. 9 1300Kb ABL 876Kb BCR-ABL - Falsos positivos 0.5% BCR-ABL + Diseño de sondas MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia) Sondas Break Apart MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia) (Sonda Break apart) MLL Crom. 11 MLL normal MLL translocado Conclusiones Finales •Simple de aplicar •Resultados obtenidos en corto tiempo •Fácil de interpretar •Funciona en casi cualquier célula o tejido •Herramienta en investigación •Herramienta diagnóstica MUCHAS GRACIAS [email protected]
