DETERMINACIÓN DE UN MEJOR MEDIO DE - DICyT-UAP

DETERMINACIÓN DE UN MEJOR MEDIO DE CULTIVO EN LA FASE DE
ESTABLECIMIENTO PARA LA PROPAGACIÓN IN VITRO DE PLÁTANO (Musa
paradisiaca)
Universidad Amazónica de Pando, Área de Ciencias Biológicas y Naturales, Laboratorio
de Biotecnología Vegetal
Gabriela Ancasi Espejo: Responsable Laboratorio de Biotecnología Vegetal del A.C.B.N.
(Responsable de la Ejecución de la Investigación).
Julio Ricardo Montero Tonconi: Docente del Programa de Biología del A.C.B.N.
(Docente Investigador)
Napoleón Juan Ferreira Castedo: Docente del Programa de Biología del A.C.B.N.
(Docente Investigador).
Israel Muñoz Guzmán: Estudiante del Programa de Biología del A.C.B.N.
(Estudiante Investigador).
ABSTRACT
This research was conducted at the Laboratory of Plant Biotechnology of the Department of
Biological and Natural Sciences of the Amazonian University of Pando, in 2014. The aim of
the study was to determine better culture medium in the establishment phase for propagation
in vitro banana (Musa paradisiaca), 20 were selected and characterized mother plants
RIBBON (Transfer Research National Center for the Amazon). A completely random design
(CRD) with three different culture media and 12 repetitions was used. The culture media were:
M1) Murashige and Skoog (MS) was supplemented with ascorbic acid 100mg / L and Lcysteine 2ml / lt, M2) Murashige and Skoog (MS) was supplemented charcoal 2 g / l M3
Murashige and Skoog (MS) supplemented with ascorbic acid 100mg / Lt and cítrico100mg /
Lt acid. The variables evaluated were: The survival of the former Plantes, where
contamination and oxidation was observed. The results showed that in the first phase of
establishment, the best answer for the survival of the former Plantes banana (Musa
paradisiaca), was with the culture medium 3, wherein a lower oxidation state (0.26) was
obtained and observed that 72% of the total non-contaminated explants explants.
Keywords: In vitro culture, culture media, establishment.
RESUMEN
Este trabajo de investigación fue realizado en el laboratorio de Biotecnología Vegetal del Área
de Ciencias Biológicas y Naturales de la Universidad Amazónica de Pando, en el año 2014.
El objetivo del estudio fue determinar un mejor medio de cultivo en la fase de establecimiento
para la propagación in vitro de plátano (Musa paradisiaca), fueron seleccionadas y
caracterizadas 20 plantas madres del CINTA (Centro Investigación Nacional de Trasferencia
para la Amazonia). Se empleó un diseño completamente aleatorio (DCA) con tres diferentes
medios de cultivo y 12 repeticiones. Los medios de cultivo fueron los siguientes: M1)
Murashige y Skoog (MS) fue suplementado con ácido ascórbico 100mg/lt y L-cisteina 2ml/lt,
M2) Murashige y Skoog (MS) fue suplementado carbón activo 2gr/lt el M3 Murashige y
Skoog (MS) suplementado con ácido ascórbico 100mg/Lt y ácido cítrico100mg/Lt. Las
variables evaluadas fueron: La sobrevivencia de los explantes, donde se observó la
contaminación y oxidación. Los resultados mostraron que en la primera fase de
establecimiento, la mejor respuesta para la sobrevivencia de los explantes de plátano (Musa
paradisiaca), fue con el medio de cultivo 3, donde se obtuvo un menor grado de oxidación
(0,26) y contaminación (0,2).
Palabras claves: Cultivo in vitro, medios de cultivo, establecimiento.
INTRODUCCIÓN
El plátano (Musa spp.) es una planta frutal de gran importancia alimenticia, económica y
sociocultural, del género
Musa perteneciente a la familia de las musáceas, ampliamente
cultivada en las regiones tropicales del mundo. El plátano ocupa el cuarto lugar en los
alimentos después del arroz, el trigo y maíz (Lassoudiere, 2007).
Actualmente los principalmente productores de este cultivo son los departamentos de
Cochabamba, Norte de La Paz, Santa Cruz, Beni y Pando dicha producción no solamente es
para la población rural, sino también para la población urbana por las exigencias del mercado
en el uso de la gastronomía; más aún cuando las exigencias son cada vez mayores con el
aumento de la población y el desarrollo de las zonas urbanas.
En los últimos años los cultivares platanales han presentado susceptibilidad a enfermedades
como la sigatoka negra, herque, y el mal de panamá que ha ocasionado pérdidas en la
producción de frutas y ha afectado la disponibilidad de material vegetal de propagación sano
en campo (Aular y Casares,2011)
La micro propagación in vitro es una técnica que permite la reproducción masiva de plantas
libres de organismo Fito patógenos, se constituye una herramienta para el mejoramiento
genético (Roux et al. 2002).
En la fase establecimiento in vitro de tejidos vegetales en la propagación del plátano presenta,
limitado por contaminación y oxidación letales en los explanes y en el medio de cultivo. Esto
constituye uno de los problemas serio y frecuente, desde el inicio y durante el mantenimiento
de un tejido cultivado in vitro (George1996,Laukkanen et al. 2000, Murkutey Shanti-Patil
2003, Tang y Newton 2004).
El objetivo de la investigación fue: Determinar un mejor medio de cultivo en la fase de
establecimiento para propagación in vitro de plátano (Musa paradisiaca), para lograr la
sobrevivencia de los explantes.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación
El presente trabajo de investigación se realizó en el año 2014 en el Laboratorio de
Biotecnología Vegetal del Área de Ciencias Biológicas y Naturales de la Universidad
Amazónica de Pando.
Material biológico
El material vegetal usado en esta investigación fue recolectado en el Centro de Investigación
de Nuevas Tecnologías de la Amazonia (CINTA) de la Universidad Amazónica de Pando
(UAP).
METODOLOGÍA
1. Recolección del material vegetal de campo
Para la descripción morfológica del plátano, se utilizó la lista de descriptores para Musa sp
publicados, por el Instituto Internacional de Recursos Filogenéticos (IPGRI) (Franco e
Hidalgo 2003).
Se caracterizó morfológicamente la mejor variedad de la de la zona, considerando la calidad
del fruto, tamaño uniforme del fruto, uniformidad de color, sabor delicioso y aceptabilidad en
el mercado.
La planta seleccionada tuvo un tamaño mediano, con buena calidad de racimo y
aparentemente sanas (libres de enfermedades), una vez seleccionada morfológicamente se
marcó con una cinta plástica y se identificó con un número. La muestra seleccionada tenia las
condición fitosanitaria (planta sana), se escogió a los hijos espada de 20-30 cm con un
pedúnculo (o pedículo) de 5 a 10 cm de diámetro.
La muestra seleccionada tuvo meristemo viable. Todos los hijuelos (cormos) seleccionados
fueron extraídos e identificados con el mismo número de la planta madre. Paralelamente, una
vez recolectadas las muestras de cada planta, también porciones de hojas de la misma planta
para descartar las plantas que presenten virus (se toma una muestra de hoja de Aprox. 10x10
cm) en el análisis fitopatológico
2.
Protocolo para cultivo in vitro de plátano (Musa paradisiaca) en la fase establecimiento.
Para evaluar los medios de cultivo en la fase de establecimiento para la propagación in vitro de
plátano se siguieron los siguientes pasos: Preparación de medios de cultivo (tabla1),
Desinfección del material vegetal y establecimiento del cultivo de plátano.
Medios de cultivo
Los medios de cultivo utilizados se describen en la tabla 1.
Establecimiento
Se usaron cormos de tamaño de 10 cm de forma cuadrada se desinfestaron con hipoclorito de
sodio (NaClO) al 30% (v/v) durante 12 horas, alcohol al 70% por 30 segundos, hipoclorito
de sodio (NaClO) al 5% con dos gotas de tawi 20 por 15 minutos, agrobac 3g /L durante 5
minutos, los cormos fueron reducidos a un tamaño de 3 cm dentro de la cámara de flujo
laminar, se colocó en hipoclorito de sodio (NaClO) al 3.5% durante 5 minutos, luego se
colocó en una solución 30mg/Lt de cisteína, posteriormente se redujeron a 1cm y fueron
depositados en solución de ácido ascórbico 10mg/10mL por 10 segundos.
Pará la introducción, se colocó en cuarenta 48 horas, se les aplico ausencia de luz total para
reducir el proceso de oxidación. Una vez cicatrizadas las heridas se evaluaron las variables de
respuestas: Grado de Oxidación (agentes internos) con una escala de 0 a 5 (que es 0 y que es
5), según escala de Novak et al. (1994) la variable de contaminación se evaluó con una escala
de 1 a 2 (donde 1= planta contaminada, 2=planta no contaminada).
El experimento fue implementado en un diseño experimental completamente aleatorio (DCA)
con tres tratamientos y doce repeticiones. Los tratamientos fueron los siguientes: 1), ácido
ascórbico 2) carbón activo.3)ácido ascórbico y ácido cítrico.
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Se realizaron análisis de varianza de un grado de libertad previa verificación de normalidad y
homeostacidad de las variables. Las comparaciones de medias fueron realizadas a una P<0.01
de probabilidad, mediante la prueba de Proc GLM y Mixed del SAS (SAS, 2004)
RESULTADOS
Análisis de varianza para el grado de oxidación y porcentaje de contaminación de los
explantes, en tres diferentes medios
Grado de oxidación
El análisis de varianza para el grado de oxidación por efecto de fenolización muestran que
existieron diferencias significativas entre ellas (p <0.01). El coeficiente de variación (C. V.)
fue de 15% y el valor de R2 de 0.95. Medio 3 tuvo el menor grado de oxidación (0,26).En
cambio las oxidación de los otros medios fueron
estadísticamente superiores (0,6– 1,1)
(tabla1)
Tabla 1. Análisis de varianza para el grado de oxidación de los explantes in vitro de
plátano (Musa paradisiaca)
Oxidación
FV
tratamiento
Error
C.V.
6
66
15
R2
0.95
C.V.= Coeficiente de Variación
GL
CM
0.3**
**=Significativo al 0.01
La comparación de medias se observó que el medio de tres tuvo el menor grado de
oxidación estadísticamente (0,26). En cambio las oxidación de los otros dos medios de
cultivo fueron estadísticamente superiores (0,6 – 1,1). (figura1)
Figura 1. Grado de oxidación de los explantes de plátano, sometidas a tres diferentes medios
de cultivo
Porcentaje de contaminacion de los explantes
La contaminación se evaluó durante los 30 días, que por efecto de hongo se contaminaron
4/36 explantes y por efecto de bacteria 6/36 explantes, donde el total de explantes
contaminados son 10 y 26 de explante no contaminados (Tabla 2)
Tabla 2. Explantes contaminados por efecto de bacterias y hongos de plátano (Musa
paradisiaca)
Nº
Explantes
iniciales
(Vellaco)
Nº Explante
contaminado
por hongo
Nº Explante
contaminado por
bacteria
Total de
Explantes
contamina
dos
Total de
Explantes no
contaminados
36
4
6
10
26
El porcentaje de contaminación de los 36 explantes de plátano, 12 ex plantes se contaminaron
por efecto de hogos y bacteria que equivale el 28% y 26 explantes no se contaminaron que
equivalen al 72% (Figura 2)
Porcentaje de Contaminacion
Nro. de Ex plantes
36
72%
30
24
18
12
28%
6
0
Contaminados
No contaminados
Figura 2. Porcentaje de contaminación de los explantes de plátano
DISCUSIÓN
La oxidación de compuestos fenólico en cultivo in vitro son catalizados por la enzima
polifenol oxidasas (PPO) que producen quinonas, las cuales son especies químicas muy
reactivas y propensas a reaccionar causando daño e incluso la muerte celular Amiot et al.
1996, Bray et al. 2000). Murashige(1974) señala que en la etapa de establecimiento in vitro en
algunas especies es necesario agregar al medio de cultivo antioxidantes para que evitar la
oxidación del ex plante o medio de cultivo. Los antioxidantes más usados en el plátano son el
ácido ascórbico, ácido cítrico y L-cisteína, estos compuestos se utiliza antes del
establecimiento del material o adicional al medio de cultivo (George,1996; Jiménez, 1998).
Según (Aliyu 2005) menciona que mediante la adición de carbón activo(CA) se evita la
oxidación del explante. Sin embargo en el presente estudio observó que el tratamiento
tres
(Murashige y Skoog (MS) suplementado con ácido ascórbico y ácido cítrico obtuvo menor
grado de oxidación (0.26) que con el tratamiento dos (Murashige y Skoog (MS) suplementado
con carbón activo obtuvo mayor grado de oxidación (0.60). El ácido cítrico y ascórbico son
los antioxidantes más utilizados en cultivo in vitro para evitar la oxidación en los tejidos (Roca
& Mrogniski citado Aguirre 2010). Los productos químicos antioxidantes como el ácido
cítrico y ácido ascórbico, presenta una mayor efectividad cuando se los utiliza de manera
conjunta. (Pérez et al 2014)
Otro delos factores de los principales problema para la propagación in vitro es la
contaminación
(Alonso, 2002).La contaminación, más que matar a los explantes
directamente, invade el cultivo haciendo que el explante no sea apto para su micro
propagación (Debergh & Read, 1991; citados por Recalde, 2007). Existen varios compuestos
químicos que se utiliza para la desinfección en la fase de establecimiento en cultivo in vitro
entre ellos el NaClO, con menor frecuencia el cloruro de calcio Ca(ClO), (Aguirre et.al.,
2010). En la presente investigación se utilizó hipoclorito de sodio (NaClO) con
concentraciones de 5%,3.6% y 2% en diferentes tiempos menores a 15 minutos donde se
obtuvo el 70% de ex plantes sin contaminación (libre de hongos y bacterias). Según (Fernando
et al 2004) menciona que a altas concentraciones de NaClO y/o tiempos muy prolongados
(mayores a 20 minutos) inhiben el crecimiento del ex plante.
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