OBTENCIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS GENES QUE

OBTENCIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA UNA
ENDO-β-1,4-XILANASA Y UNA EXO-β-1,4-XILOSIDASA A PARTIR DE Aspergillus
niger GS1.
Gracia Nava, M. A.; Regalado González, C.; Amaro-Reyes, A.
Facultad de Química/Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos.
Universidad Autónoma de Querétaro.
RESUMEN
a hemicelulosa es la segunda fuente de carbono orgánico más abundante en la naturaleza.
La hidrólisis de la hemicelulosa, compuesta principalmente por xilanos, se lleva a cabo
por endo-β-D-xilanasas (E.C. 3.2.1.8) y exo-β-xilosidasas (E.C. 3.2.1.37). Los hongos
filamentosos, como Aspergillus niger, son productores conocidos de enzimas hemicelulolíticas.
A. niger GS1 ha demostrado capacidad para hidrolizar al xilano y aprovechar sus productos como
fuente de carbono. Se diseñaron oligonucleótidos iniciadores para obtener y secuenciar los genes
estructurales completos de una endo-xilanasa y una exo-xilosidasa a partir del RNA total A. niger
GS1. Los productos de RT-PCR fueron ligados en el vector de propagación pGEM-T y
transformados en células competentes de E. coli JM109. Las colonias transformadas se digirieron
con la enzima de restricción EcoRI para verificar el inserto. La secuenciación de las
transformantes positivas confirmó una xilosidasa de 2415 pb y una xilanasa de 636 pb.
L
INTRODUCCIÓN
El material vegetal consiste principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina. La hemicelulosa
es la segunda fuente de carbono orgánico fijo más abundante en la naturaleza. Las hemicelulosas
principales son xilanos y galactomananos; a diferencia de la celulosa, está compuesta por más de
una unidad monomérica e incluye además de glucosa, xilosa, manosa, galactosa, ramnosa y
arabinosa. La hidrólisis del material hemicelulósico se efectúa por endo-β-D-xilanasas (E.C.
3.2.1.8), arabinofuranosidasas (E.C. 3.2.1.55), acetil xilano esterasas (E.C. 3.1.1.72),
glucuronidasas (E.C. 3.2.1.139) y exo-β-xilosidasas (E.C. 3.2.1.37) (Okafor, 2007). Las xilanasas
y xilosidasas se han utilizado en el blanqueo de pulpa de papel, para aumentar el volumen de la
masa en panadería, aumentar eficiencia de conversión en alimentación animal, clarificación de
vinos y jugos de fruta, entre otros. (Oksanen, 2000). Los hongos filamentosos, como Aspergillus
niger, secretan una amplia variedad de enzimas degradadoras de la pared celular de plantas
(Levasseur, 2005); además, pueden producir proteínas recombinantes homólogas (hasta de 10
g/L) y heterólogas a nivel industrial, tal como α-galactosidasa, lactoferrina humana, taumatina,
interleuquina-6 humana, glucoamilasa, entre otras (Wang, 2005). A. niger como sistema de
transformación tiene la ventaja de mostrar estatus de generalmente reconocido como seguro
(GRAS), capacidad de realizar modificaciones post-traduccionalestales como glucosilación,
crecimiento rápido en medios de bajo costo y poseer un material genético relativamente bien
estudiado.
El entendimiento a nivel molecular de la secreción de proteínas en hongos filamentosos es aún
insuficiente. La secreción de proteínas ocurre principalmente en las puntas de la hifa creciente, ya
que su porosidad facilita el paso de exoenzimas a través de la pared celular (Punt, 1994). El
objetivo de este trabajo consistió en secuenciar y obtener los genes completos que codifican para
una endo-β-1,4-xilanasa y una exo-β-1,4-xilosidasa, a partir del RNA total de A. niger GS1.
1
MATERIALES Y MÉTODOS
Se empleó el RNA almacenado a -70 °C de la cepa A. niger GS1 (Regalado, 2000) de la
colección de cultivos del Laboratorio de Biotecnología de Alimentos, DIPA, UAQ. Este hongo
ha mostrado capacidad para hidrolizar al xilano y aprovechar sus productos como fuente de
carbono.
Se realizó la síntesis de la cadena de DNA complementario (cDNA) mediante el equipo de
transcriptasa reversa (RT) RevertAid™ H (Fermentas™), el cual utiliza una versión de la RT del
virus murino Moloney de leucemia, genéticamente modificada. El cDNA sintetizado se amplificó
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se ensayaron diferentes programas de PCR
utilizando un termociclador Perkin Elmer 2400 para obtener productos definidos a partir de
iniciadores (oligos) diseñados con base en secuencias consenso homólogas de endo-xilanasas y βxilosidasas de especies de Aspergillus reportados en la base de datos del NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) junto con un oligo dT18 (Ausubel, 1995).
Los productos obtenidos por RT-PCR se purificaron y clonaron utilizando el plásmido pGEM-T
Easy Vector II (Promega). Se utilizaron cepas competentes de E. coli JM109 (Promega), para la
propagación de los plásmidos transformados. La identificación de las clonas recombinantes se
fundamenta en que el vector posee el gen ampr que codifica para la β-lactamasa y el gen lacZ
que, además de codificar para β-galactosidasa, posee el sitio de inserción para nuestro producto
de RT-PCR. La expresión del gen clonado está bajo control del promotor lacZ. Por lo tanto,
solamente si ocurre inserción se producirá crecimiento de clonas recombinantes blancas en un
medio de cultivo adicionado con ampicilina, IPTG (inductor) y de 5-bromo-4- cloro-3-indolil-βD-galactopiranósido (X-Gal), que al oxidarse previa reacción con β-galactosidasa (clonas no
transformadas) cambia a color azul. Finalmente, el DNA plasmídico de las cepas transformadas
de E. coli JM109, previamente digeridas con EcoRI (Fermentas) para verificar la inserción de los
productos de PCR, se enviaron a secuenciación a Molecular Cloning Laboratories (MC Lab, San
Francisco, CA). Las secuencias se identificaron por alineamiento con secuencias homólogas de la
base de datos del NCBI.
Se efectuó electroforesis en geles de agarosa 0.7% (80 V, 400 mA, 50 min) para identificar los
insertos. La programación del termociclador para el PCR fue para la desnaturalización 94 °C/30
s, alineamiento 60 °C/40 s y extensión 72 °C/2 min, con una rampa máxima a 15 ciclos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de la secuencia consenso (Tabla 1) se diseñaron los oligonucleótidos iniciadores
denominados XI (hacia adelante) y X4 (hacia atrás), para el gen de xilanasa, y JI y J4, para el gen
de xilosidasa (Tabla 2), y fueron proporcionados por Sigma-Aldrich.
Los productos obtenidos con los oligos diseñados y el RNA total de A. niger GS1 fueron ligados
en el vector de propagación pGEM-T y transformados en células competentes de E. coli JM109.
Se produjo crecimiento de clonas recombinantes blancas en medio PDA adicionado con
ampicilina, IPTG y X-Gal (Fig. 2). La eficiencia de transformación fue de 1-5x104 ufc/µg DNA.
Se seleccionaron colonias transformadas de E. coli JM109 para realizar una digestión con la
enzima de restricción EcoRI con la finalidad de verificar el inserto (Figura 3).
Los insertos ligados exitosamente al vector de clonación aparecen como una banda a una longitud
de ~5000 pb para xilosidasa (carril 4 y 6) y ~3500 pb para xilanasa (carril 8), recordando que la
longitud del vector p-GEM-T es de 3000 pb. Finalmente se extrajo el DNA plasmídico de las
transformantes positivas y la secuenciación por MCLAB confirmó una xilosidasa de 2415 pb y
una xilanasa de 636 pb.
2
Tabla 1. Secuencia consenso resultante del alineamiento de diferentes genes fúngicos de
xilanasa, reportados en el NCBI.
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
ACAGCAATAT
AGCTCTCTTC
CGCCCTGCCC
TACAACGGCA
TGGGAGGATG
AAGCGGTGAC
TACTCTGCCA
CTCCTCAGGC
GCTCGGCCAC
ACACTCGACG
TCGAGAGAGC
GCAGCATGGG
CGGTGCTGGC
AGTCAAAAGA
CGGTTCAACT
CTTCACAGAC
GATATATTTC
TGACCAGGAC
AATATCATGA
CGGAACCTGT
ACCTTGGTGA
GAGTCAGCTC
TGTACCCTTA
ATACAGCGCT
CGAATACTAC
AAGCCTTGGT
AACGAGGCCA
ACGCGCACAT
TTCGGCAATA
AGCGCCAGTG
TATCAAAGCG
CGAGGCCGTA
AATCAACTCT
CCAATACATA
AGGCTTTTCT
AGGTCACTGC
TCTGGTGTCG
CTTCACCTAC
CGACTTCGTC
GGCTAAATCT
TCTGGCTCCT
ATCGTCGAGG
ACCGTGTACT
TCATCACAGG
CTGGAACGGT
GCAACTTCAA
TCACGATCTC
AGCTTTTTTC
TATGGTGTGG
CTTTTTCTCG
TTATCTATAT
TCTATTACAC
GGCTTTTGCA
CGAAGTGCCG
GACGAGAGTG
GTTGGTTTGG
CTAGGATCTA
CCTACCTCGC
ATTACGGTGA
CTGATGGAAG
AACAAGCACG
GACTATTGCC
TTATCAGGTC
TCTTAGGAGA
AGGTGGTGTG
CGGGGCGACT
CTTTTCCTCG
AAAAAAAAAA
ATATCCATTC
GGTCTTTGGT
GTATCAACTA
CCGGAACATT
GCTGGACCAC
ACGGTTTCAG
TGTGTACGGC
TTACAACCCT
CACCTACCAA
TTCACGCAGT
AACCATTTCA
ATGGCGGTGG
TAAGAGATAA
ATGATCGGATC
GTCGGCGGCT
CTGTTTCTCT
AAAAAAAAAA
ACCAACATTC
CACGGCATCG
CGTGCAGAAC
TTCCATGTAC
TGGTTCCTCT
ATCTATCACC
TGGGTCAACT
TGCAGCTCGG
GTCTGCACCG
ACTTCTCCGT
ACTTCTGGGC
AGGCATGGAG
GTGCCTTAGT
CGGGCTCTGG
GCGTTTTCAA
ATCCAACGAT
AAA
60
120
180
240
300
361
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1013
Tabla 2. Secuencias de oligos diseñados para obtener los genes de endo-xilanasa y exoxilosidasa.
Nombre
Secuencia (5´ - 3´)
Número de bases
X1
X4
J1
J4
CCATGGATGAAGGTCACTGCGGC
GGATCCTTAGTGGTGATGGTGATGATGAGAAGATATCGTGACAC
CCATGGATGGCGCACTCAATGTCTCG
CTGGATCCCTAGTGGTGATGGTGATGATGCTCCTTCCCCGGCCAC
23
44
26
45
Sitio de restricción; cola de histidina; codón de paro; codón de inicio. Los subíndices 1
indican secuencia río abajo (“forward”), mientras que los 2 indican secuencia río arriba
(“reverse”).
Figura 1. Transformantes de E. coli JM109 en PDA/ampicilina/IPTG y X-Gal. Eficiencia de
transformación: 1-5x104 ufc/μg DNA.
3
pb
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pb
5000
3000
2000
800
400
Figura 2. Digestión con EcoRl de células transformadas de E. coli JM109. Carriles: 1 y 7)
marcador 1kb (Plus DNA Ladder, GibcoBRL); 2, 3, 5 y 9) vector pGEM-T (3000 pb); 4 y 6)
vector con inserto de xilosidasa (a 5000 pb); 8) vector con inserto de xilanasa (3000 pb); 10)
marcador de bajo P.M. (Invitrogen).
CONCLUSIONES.
Se obtuvieron secuencias homólogas (99%) correspondiente a un gen de endo-β-1,4-xilanasa
(U39784) y uno de β-1,4-xilano xilosidasa (XM_001389379) en A. niger GS1
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4