DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50-48) DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLOGICAS CON DAPHNIA magna. CATALINA MARIA GAMEZ ROJAS EMILCE JINETH RAMIREZ RIVEROS UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTA Y SANITARIA BOGOTÁ D.C 2008 1 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL 50-48) DEL HERBICIDA GLIFOSATO ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLOGICAS CON DAPHNIA magna CATALINA MARIA GAMEZ ROJAS EMILCE JINETH RAMIREZ RIVEROS Trabajo de grado para optar al Título de Ingenieros Ambientales y sanitarios Director PEDRO MIGUEL ESCOBAR MALAVER QUÍMICO INDUSTRIAL LIC. QUÍMICO Y BIOLOGÍA UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTA Y SANITARIA BOGOTÁ D.C 2008 2 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Nota de aceptación: Firma del Director de Tesis Firma del Jurado Firma del Jurado Bogotá D.C., Diciembre de 2008 3 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Gracias a Dios, porque indudablemente ha estado conmigo en cada paso dado. Hoy y siempre gracias a mi familia, a mis padres, hermanos, tíos y muy especialmente a mis abuelitos Leito y José por brindarme el ánimo, apoyo, cariño y consejos a lo largo de mi existencia. Soy muy afortunada por recibir su amor y ejemplo. A Kike, por ser la persona con la que siempre podré contar, por soñar y crecer a mi lado. Gracias por creer en mí. Un gracias a Catalina por haber estado ahí, en los momentos tristes y alegres, por tener siempre tendida su mano amiga. Llegar al final de este logro, no hubiese sido posible sin la cooperación desinteresada de todas y cada una de las personas que han sido soporte en los momentos de desfallecimiento, para ellos mi más sincero agradecimiento. JINETH RAMIREZ 4 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna A mis padres por su comprensión, apoyo Y por darme en la vida todo lo necesario para lograr mis metas, A mis hermanas quienes con una palabra, en el momento indicado Me llenaron de valor para seguir adelante, A mis cuñados por sus sabios y valiosos consejos, A mi familia en general por su aporte de una u otra forma En el logro de esta meta para mi vida. A Juan José por llegar a mi vida, por enseñarme la verdadera felicidad, Por cada una de sus sonrisas, abrazos, besos, y por toda su comprensión. A Sonery por su verdadero amor y por darle a mi vida mi mayor alegría. A mis amigas quienes me acompañaron no solamente en el crecimiento intelectual sino también en el personal, A Jineth por su verdadera e incondicional amistad. Cada uno de los días felices y difíciles de mi vida, cada uno de mis triunfos, Cada una de las personas y Empresas que forman parte de mi vida, No existirían, de no ser por la presencia y el amor tan grande de DIOS. CATALINA GAMEZ 5 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna AGRADECIMIENTOS Al profesor Pedro Miguel Escobar nuestro director de tesis, quien no solamente nos brindo sus conocimientos sino, todo el apoyo que estuvo en sus manos y compartió con nosotros sus buenos consejos para seguir adelante. A los profesores Rubén Darío Londoño y Edwin Beltrán, por su colaboración en la contextualización de nuestro tema de tesis. Al grupo de monitores del laboratorio de Ingeniería ambiental y Sanitaria, encabezado por el laboratorista Oscar Fernando Contento, por su colaboración durante el desarrollo de nuestro trabajo de investigación. A los investigadores de bioensayos quienes nos colaboraron cuando los necesitamos. 6 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna INTRODUCCIÓN Desde 1992, se inicio la práctica de aspersión aérea con Glifosato bajo la presentación comercial de Roundup Ultra aprobada por el Consejo Nacional de Estupefacientes (CNE). En un principio este herbicida fue asperjado bajo una tasa de 8 L/ha pero a finales del año 2002, el CNE aprobó el incremento de la concentración en la mezcla de aspersión hasta 10,4 L/ha sobre cultivos de coca y de 2.5. El glifosato además es usado como madurante de caña, desecante de granos y para el control de malezas en cultivos de arroz. Entre 1986 y 1996 el uso del glifosato se triplicó en Estados Unidos y en Europa su uso se incrementó en 129% entre 1991 y 1995, por las declaraciones de Monsanto de que el herbicida no es peligroso para los humanos y que es ambientalmente seguro. Pero de acuerdo con informaciones de Cox (1995) y de Dinham (1998), existen resultados de investigaciones científicas acerca de herbicidas que contienen glifosato, independientes de Monsanto, que contradicen las indicaciones de la empresa fabricante del veneno y muestran una visión muy diferente sobre los riesgos de salud y ambientales de estos herbicidas. Con el auge de la ecotoxicología - ciencia que predice los efectos de los agentes potencialmente tóxicos en los ecosistemas naturales- (Hoffman 1995) se ha reforzado la idea de realizar monitoreo y pruebas de toxicidad para la detección, predicción y control de los efectos de diferentes tipos de sustancias sobre los ecosistemas, en particular el acuático. En Colombia las Entidades de Manejo y Administración del Recurso EMAR, son las encargadas de la realización de bioensayos y del establecimiento de la CL50-96 de las sustancias de interés sanitario. Aunque la legislación existe (Decreto 1594 de 1984) la capacidad de gestión es muy baja y no define con que especies se deben realizar estas determinaciones. Actualmente, sólo algunas entidades estatales como la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca C.A.R. dentro del programa de control de la contaminación de aguas bajo su jurisdicción ha empezado a realizar dichos bioensayos, usando Daphnia magna. La Daphnia magna tiene varios aspectos biológicos interesantes que las hace ideales para los ensayos. A su corta vida (3 o 4semanas) y una vez alcanzada su madurez se reproduce cada 24 horas aprox. pero la característica más interesante es su sensibilidad a los tóxicos ya que es capaz de detectar la presencia de, por ejemplo, 0,005 mg. de mercurio en el agua y aún menores concentraciones de numerosos pesticidas y residuos industriales. 7 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Con Daphnia magna se hacen generalmente dos tipos de bioensayos: de toxicidad aguda y de toxicidad crónica. En los de toxicidad aguda se evalúa la concentración del tóxico (conocido o desconocido) que es capaz de matar o inmovilizar el 50 % de la población (CL50 o CE50) en 48 horas. Si un test de toxicidad aguda no detecta efecto alguno de mortandad o inmovilización esto no siempre significa que el agua analizada no contenga sustancia alguna capaz de producir otro tipo de daño. Para estos casos se utilizan los test de toxicidad crónica en los que la evaluación se basa en la capacidad reproductiva o el crecimiento de los individuos. Es posible, entonces, con estas técnicas dar una respuesta sobre la incidencia de efluentes industriales en un ambiente acuático. 1 El presente proyecto busca por medio de la realización de ensayos toxicológicos, identificar el efecto del herbicida Roundup 747 en el medio acuático con ayuda de la especie Daphnia magna bajo condiciones experimentales específicas y controladas, lo que permitirá determinar la concentración letal media (CL50) del herbicida expuesto a diferentes concentraciones. Como resultado del proyecto, se busca que en un futuro se replanteen las normas vigentes para la protección de ecosistemas acuáticos, teniendo en cuenta que la microfauna en cuerpos de agua juega un papel importante y que por medio de los bioensayos se puede tener una visión justificada de cuáles son los factores o componentes específicos que causan un impacto en ellos. _____________________ 1 8 Daphnia magna en ecosistemas acuáticos, Instituto Nacional de Limnología (INALI) DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna GLOSARIO BIOENSAYO Método para evaluar la potencia relativa de un agente sobre organismos vivos, mediante la comparación del efecto del agente con el de una solución patrón o “Standard”. CADENA TRÓFICA También llamada cadena alimentaria, es la corriente de energía y nutrientes que se establece entre las distintas especies de un ecosistema en relación con su alimentación. CONTAMINANTE Sustancia introducida en el ambiente como resultado, por lo menos en forma parcial, de la actividad humana y que produce efectos adversos no deseados sobre los organismos individuales y sobre el ecosistema. DUREZA Concentración en el agua de sales de calcio y magnesio. Se suele expresar en mg/l de carbonato de Calcio. DOSIS Cantidad de sustancia que se absorbe en 24 horas expresada con relación a kilogramos de peso corporal. ECOSISTEMA ACUÁTICO Es la unidad funcional básica de interacción de los organismos vivos entre sí y de estos con el ambiente acuático en un espacio y tiempo determinado. ECOTOXICOLOGIA Es el estudio de la relación dosis o concentración / efecto de tóxicos liberados al ambiente sobre los sistemas bióticos incluyendo los niveles de organización inferiores y superiores al nivel de organismos. 9 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ECOTOXICOLOGIA ACUATICA Es el estudio cualitativo y cuantitativo de los efectos adversos de xenobióticos sobre los ecosistemas acuáticos. EFECTO Es el cambio biológico producido tanto en el nivel de organismo individual como en niveles de organización inferiores o superiores al individuo, asociado a la exposición al tóxico. EFIPIO Capsula protectora, la cual se encuentra en la cámara incubadora de las Daphnia magna, engrosando sus paredes, en ella se desarrollan los machos de esta especie, cuando cambian las condiciones favorables del ambiente o el cultivo. Su característica principal es su color oscuro. ENSAYO DE TOXICIDAD Permite la detección y evaluación de la capacidad de un agente de producir efectos tóxicos adversos sobre organismos vivos. ENSAYOS DE LABORATORIO Reproducción parcial de las condiciones reales del ambiente. REPLICA Batería de ensayo que contiene un número especificado de organismos en una concentración dilución de muestra definida o de agua de dilución como control. RESPUESTA Es la proporción de los problemas que manifiesta un determinado efecto definido. TOLERANCIA Es la habilidad de un organismo a tolerar una condición dada por un periodo de tiempo prolongado de exposición, sin que muera. 10 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TOXICIDAD Es la capacidad de una sustancia de causar algún efecto nocivo sobre organismos vivos que depende de la cantidad administrada o absorbida, vía de ingreso al organismo, distribución a lo largo del tiempo después de su administración, naturaleza y severidad del daño producido, tiempo necesario para producir el efecto. TOXICO Es el agente que puede producir un efecto adverso, daño referido a la estructura y función del sistema, donde la introducción puede ser deliberada (efluentes) ó accidental (derrames). La cantidad liberada debe superar un nivel umbral para que se manifieste el efecto. Se establece la relación concentración / respuesta, duración de la exposición por medio de Ensayos de toxicidad. TOXICIDAD AGUDA La toxicidad aguda tiene por objeto determinar los efectos de una dosis única y muy elevada de una sustancia. Usualmente, el punto final del estudio es la muerte del animal y la toxicidad aguda se expresa por la dosis letal 50, que viene a representar más o menos la dosis de la sustancia que produce la muerte en el 50% de los animales. PARTENOGÉNESIS Es una forma de reproducción basada en el desarrollo de células sexuales femeninas no fecundadas, que se da con cierta frecuencia en crustáceos. XENOBIOTICO Son aquellas sustancias producidas por actividades antrópicas. 11 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna RESUMEN Mediante pruebas de toxicidad aguda se evaluó la concentración letal media del Herbicida Glifosato Roundup 747 en el cladócero Daphnia magna. Se preparó agua reconstituida dura (160-180 mg/I CaCO3), para el mantenimiento de las colonias y las pruebas de toxicidad. El sistema utilizado en el laboratorio para la realización de los bioensayos durante el período de experimentación fue de tipo estático, de corta duración y sin renovación, teniendo en cuenta las recomendaciones de protocolos internacionales estandarizados para la realización de pruebas ecotoxicológicas, los cuales fueron efectuados por un periodo de siete meses, donde fue necesario realizar el cultivo y mantenimiento de la especie de Daphnia magna teniendo en cuenta la parámetros de su hábitat agua dura, dureza, pH, temperatura y oxígeno disuelto; al igual que su alimento con las algas Scenedesmus acutus. Con el propósito de comprobar la buena condición de los organismos se realizaron pruebas de sensibilidad en todos los tratamientos con K2Cr2O7. La medida de toxicidad empleada permitió determinar la concentración efectiva del tóxico que inmovilizaba el 50% de la población en un período de 48 horas (CL50-48), mediante la aplicación del Método Probit del programa estadístico SAS (1990). Para la realización de estas pruebas de toxicidad se tuvo en cuenta la realización de diez pruebas preliminares con concentraciones de 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10 mg/litro.En los resultados obtenidos en la prueba de sensibilidad se encontró una CL50-48 para el dicromato de potasio de 1, 09254 ppm. En cuanto a la sensibilidad de Daphnia magna al herbicida, se determinó que la CL 50-48 fue de 42, 9053 ppm, la cual fue comparada con la concentración letal media en Dahpnia pulex (CL 50-48: 19 ppm) y en peces (CL 50-48: 1, 088 ppm), observándose que la especie Daphnia pulex es las más sensible al herbicida en estudio. Debido a las especificaciones tóxicas del herbicida, las autoras elaboraron un protocolo para el almacenamiento, manipulación, transporte y disposición de residuos de herbicidas generados a lo largo de investigaciones científicas en el laboratorio de bioensayos de la Universidad de la Salle. 12 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ABSTRACT By acute toxicity tests evaluated the average lethal concentration of Roundup herbicide Glyphosate 747 in the cladocerans Daphnia magna. Was prepared reconstituted hard water (160-180 mg / I CaCO3), for the maintenance of the colonies and evidence of toxicity. The system used in the laboratory for conducting bioassays during the experimental period was kind of static, short-term, without renewal, taking into account the recommendations of standardized protocols for testing ecotoxicological, which were carried out by a period of seven months, where it was necessary to make the cultivation and maintenance of the species Daphnia magna taking into account the parameters of their habitat hard water, hardness, pH, temperature and dissolved oxygen, like their food with algae Scenedesmus acutus. With the aim of checking the condition of the bodies were tested for sensitivity in all treatments with K2Cr2O7. The extent of toxicity employed allowed us to determine the effective concentration of toxic immobilized for 50% of the population over a period of 48 hours (CL50-48), using the statistical method Probit program SAS (1990). For the realization of these toxicity tests took into account the completion of ten preliminary tests with concentrations of 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10 mg / litro. The results in the sensitivity test was found to CL50-48 Potassium dichromate of 1,09254 ppm. With regard to the sensitivity of Daphnia magna to the herbicide, it was determined that the CL50-48 was 42, 9053 ppm, which was compared with the median lethal concentration in Dahpnia pulex (CL50-48: 19 ppm) and fish (CL50-48: 1,088 ppm), observed that the species Daphnia pulex is the most sensitive to the herbicide in study. Due to the specifications of the toxic herbicide, the authors developed a protocol for the storage, handling, transportation and disposal of waste generated herbicides along scientific research in the laboratory bioassays of the Salle University. 13 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 1. OBJETIVOS 1.1. OBJETIVO GENERAL Determinar la concentración letal media (CL Roundup 747 sobre ecosistemas 50-48) del Herbicida Glifosato acuáticos mediante pruebas toxicológicas con Daphnia magna. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar la sensibilidad de la Daphnia magna expuestas a Dicromato de potasio. Establecer una comparación entre los resultados obtenidos de la concentración letal media (CL 50-48) en los estudios toxicológicos al Herbicida Glifosato Roundup 747, bajo diferentes especies en la Universidad de la Salle. Definir pautas para el manejo y disposición de residuos del herbicida Glifosato Roundup 747 en el laboratorio. 14 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2. MARCO TEORICO 2.1. TOXICOLOGIA El término toxicidad se emplea para describir la naturaleza de los efectos perjudiciales producidos y las condiciones necesarias para su producción. La toxicología estudia las relaciones entre la cantidad de sustancia introducida en el organismo y el efecto biológico obtenido, tanto a nivel cualitativo como cuantitativo. Esta ocurre toda vez que una sustancia entra en contacto con una superficie corporal como la piel, los ojos o la mucosa del sistema digestivo o respiratorio1. En la sociedad moderna, la toxicología es ya un elemento importante de la salud ambiental y de la salud en el trabajo. Ello es así porque muchas organizaciones, tanto gubernamentales como no gubernamentales, utilizan la información toxicológica para evaluar y regular los peligros presentes tanto en el lugar de trabajo como en el medio ambiente general. La toxicología es un componente crucial de las estrategias de prevención, pues proporciona información sobre peligros potenciales en los casos en que no hay una exposición humana amplia. Si se fuese a establecer el origen de la toxicología se debería situar paralelamente con el origen de la biología, porque en el momento en que aparece la vida, aparece el riesgo que ésta entre en contacto con agentes nocivos que ponen en peligro el funcionamiento normal del organismo. Pero la toxicología como se puede observar en la Figura N° 1, abarca todas las ciencias básicas como la __________________ 1. Instituto nacional de seguridad e GuiasMonitor/SaludMedicina/III/Ficheros/mtiii02.pdf 15 higiene en el trabajo. Disponible en Internet: DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Química, Biología, Farmacología etc., y tiene como áreas fundamentales la analítica y experimental. Este proyecto se enfocará en el área experimental que se aplica en las ciencias ambientales mediante la ecotoxicología la cual se describirá más adelante. Figura N° 1 Tipos de toxicología Fuente: Repetto, 1997 Los métodos de la toxicología son así mismo muy utilizados por la industria en el desarrollo de productos, pues permiten obtener una información valiosa para el diseño de determinadas moléculas o formulaciones. Mediante la concentración letal media CL50 se calcula estadísticamente un agente químico o físico que se espera cause una mortalidad en el 50% de los organismos de una población bajo un conjunto de condiciones definidas. 2.2. TOXICIDAD La toxicidad es la capacidad de una sustancia de causar algún efecto nocivo sobre organismos vivos. Depende de2: ____________________ 2. 16 www.monografias.com/trabajos42/parametros-toxicologicos-agua/parametros-toxicologicos-agua.shtml DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Cantidad administrada o absorbida Vía de ingreso al organismo Distribución a lo largo del tiempo después de su administración. Naturaleza y severidad del daño producido. Tiempo necesario para producir el efecto. 2.2.1. Categorías de toxicidad y clasificación de la toxicidad Las categorías de toxicidad se refieren a una calificación arbitraria de las dosis o niveles de exposición que causan efectos tóxicos. Se habla así de “sumamente tóxico”, “muy tóxico” y “moderadamente tóxico”. Lo más frecuente es que estas expresiones se apliquen a la toxicidad aguda. La clasificación de la toxicidad se refiere a la agrupación de las sustancias químicas en categorías generales conforme a su efecto tóxico principal. Se habla así de sustancias alergénicas, neurotóxicas y carcinógenas. Los tóxicos son definidos por la OSHAS (Administración para la seguridad y salud ocupacional) como un producto químico que se encuentra en una de estas 3 categorías: Un producto químico que tiene una dosis letal media (DL50) de más de 50 miligramos por kilogramos pero no más de 500 miligramos por kilogramo de peso corporal cuando administrado oralmente a ratas albinas de entre 200 y 300 gramos de peso. Un producto químico que tiene una dosis letal media (DL50) de más de 200 miligramos por kilogramo pero no más de 1000 miligramos por kilogramo de peso corporal cuando administrado por contacto continuo durante 24 horas (o menos si la muerte ocurre durante las siguientes 24 horas) con la piel desnuda de conejos albinos de entre 2 a 3 kilogramos de peso. 17 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Un producto químico que tiene una concentración letal media (CL50) en el aire de más de 200 partes por millón pero no más de 2000 partes por millón por volumen de gas o vapor, o más de 2 miligramos por litro pero no más de 20 miligramos por litro de niebla, humo, o polvo, cuando administrado por inhalación continua durante una hora (o menos si la muerte ocurre en menos de una hora) a ratas albinas de entre 200 y 300 gramos de peso. 2.2.2. Relación dosis-efecto Es la relación entre la dosis y el efecto a nivel individual. Un incremento de la dosis puede incrementar la intensidad de un efecto o su gravedad. Puede obtenerse una curva de dosis-efecto a nivel de todo el organismo, de la célula o de la molécula diana. 2.2.3. Relación dosis-respuesta Es la relación entre la dosis y el porcentaje de individuos que presentan un determinado efecto. Al incrementarse la dosis lo normal es que aumente el número de individuos afectados en la población expuesta. Pueden establecerse varias curvas de dosis-respuesta respecto de una misma sustancia química (una curva para cada tipo de efecto). En la mayoría de los efectos tóxicos, cuando se estudian en poblaciones grandes, la curva de dosisrespuesta tiene una forma sigmoidea. La curva de dosis-respuesta refleja las variaciones entre individuos de una misma población. La pendiente de la curva varía según la sustancia química de que se trate y también entre los diferentes tipos de efectos, en la siguiente grafica se puede apreciar un tipo de curva dosisrespuesta, donde la región NOEC representa la dosis o concentración más alta a la cual no se observa ningún efecto y la región LOEC representa la concentración mínima donde aún se observa efecto de mortalidad. 18 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Curva Dosis-Respuesta. 0 a 1.-Región NOEC; 2.-LOEC; 3.-Región Lineal; y 4.-Respuesta Máxima En el caso de algunas sustancias que tienen efectos específicos (carcinógenos, iniciadores, mutágenos) la curva de dosis-respuesta podría ser lineal desde la dosis cero dentro de un determinado intervalo de dosis. Esto significa que no hay un umbral y que hasta las dosis pequeñas representan un riesgo. Por encima de ese intervalo de dosis, el riesgo puede incrementarse a una tasa superior a la lineal3. 2.3. TOXICIDAD AGUDA La toxicidad aguda tiene por objeto determinar los efectos de una dosis única y muy elevada de una sustancia. Usualmente, el punto final del estudio es la muerte del animal y la toxicidad aguda se expresa por la dosis letal 50, que viene a representar más o menos la dosis de la sustancia que produce la muerte en el 50% de los animales4. Cuando se quiere determinar el efecto de un determinado toxico sobre una especie, lo primero que debe hacerse es determinar las condiciones del cultivo tanto en el cultivo de los organismos como en el bioensayo mismo, a fin de proporcionar condiciones estándar que permitan la reproducibilidad de las pruebas. _____________ 3 SILBERGEL, Ellen K. Enciclopedia de salud y seguridad en el trabajo. capitulo 33. [citado14 de Agosto de 2007]. TOXICOLOGIA AMBIENTAL Evaluación de Riesgos y Restauración Ambiental. 1996-2001, The University of Arizona 4 19 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna En segundo lugar deben realizarse dos tipos de pruebas a fin de hallar las concentraciones del toxico que causen un efecto adverso en los organismos. 2.4. TOXICOLOGIA AMBIENTAL La toxicología ambiental evalúa los impactos que producen en la salud pública la exposición de la población a los tóxicos ambientales presentes en un sitio contaminado. Los tóxicos son los xenobióticos (cualquier substancia que no ha sido producida por la biota) que producen efectos adversos en los organismos vivos. Estos impactos producidos se miden por su: 2.4.1. Exposición Es el contacto de una población o individuo con un agente químico o físico. La magnitud de la exposición se determina midiendo o estimando la cantidad (concentración) del agente que está presente en la superficie de contacto (pulmones, intestino, piel, etc.) durante un período especificado. 2.4.2. Ruta de exposición Es el camino que sigue un agente químico en el ambiente desde el lugar donde se emite hasta que llega a establecer contacto con la población o individuo expuesto. El análisis de la ruta de exposición describe la relación que existe entre las fuentes (localizaciones y tipo de derrames ambientales) y los receptores (localización de las poblaciones, patrones de actividad, etc.). Se consideran como rutas significativas las que dan lugar a exposición humana. Las rutas de exposición consisten generalmente de cuatro elementos: fuentes y mecanismos de emisión de tóxicos. medio de retención y transporte (o medios en el caso de que haya transferencias de un medio a otro). punto de contacto potencial entre el medio contaminado y los individuos. vía de ingreso al organismo. 20 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.4.3. Vía de exposición Es el mecanismo por medio del cual el tóxico entra en el organismo. Para el propósito de la toxicología ambiental, se consideran de importancia la ingestión, la inhalación y el contacto cutáneo (absorción cutánea). 2.4.3.1. Ingestión Cuando el tóxico se ingiere, entra al TGC, (tracto gastro intestinal) la mayor cantidad se absorbe en el estómago y en los intestinos. El sitio de absorción depende en parte del estado de ionización del compuesto. Los ácidos débiles es más probable que se absorban en el estómago, donde hay un pH bajo, mientras que las bases débiles, que están menos ionizadas a pH alto, se absorben mejor en el intestino donde existen estas condiciones. 2.4.3.2. Inhalación La inhalación es la vía de exposición a gases, vapores de líquidos volátiles, aerosoles y partículas suspendidas en el aire. Los sitios de absorción son la nariz y los pulmones. La nariz actúa como un limpiador o trampa para los gases solubles en agua y los muy reactivos así como, para retener las partículas grandes. Las moléculas de los gases se absorben en el espacio alveolar de los pulmones, disolviéndose en la sangre, hasta que las concentraciones del gas en ambas fases llegan al equilibrio. La solubilidad de gases en la sangre depende fundamentalmente de su solubilidad en agua y de la presión parcial del gas en el aire inhalado. Si se incrementa la concentración de un gas en el aire, se incrementará su velocidad de difusión en los pulmones, hasta alcanzar la nueva concentración de equilibrio en la sangre. La región del aparato respiratorio en el que se depositan las partículas y aerosoles depende de su tamaño. Las partículas de 5 μm o más grandes se depositan en la región nasofaríngea, que es la región más alta. Las partículas de 1 a 5 μm son depositadas en la región traqueobronquiolar del pulmón, que es la región 21 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna intermedia. Las partículas de 1 μm y más pequeñas penetran a los sacos alveolares de los pulmones. Estas pueden ser absorbidas a la sangre o bien, pueden ser eliminadas a través del sistema linfático. 2.4.3.3. Absorción cutánea La piel, a diferencia del epitelio del intestino y de los alvéolos pulmonares, no está diseñada para la absorción de substancias útiles al organismo. La permeabilidad a través de la piel es muy baja debido a que está formada por varias capas, algunas de ellas muy gruesas y con muy escasa irrigación sanguínea. Para que una substancia se absorba por la piel debe difundirse a través del estrato córneo y las demás capas de la epidermis, antes de contactar los vasos capilares sanguíneos y linfáticos de la dermis y pasar al torrente sanguíneo. 5 2.4.4. Tiempo de exposición Para la toxicología ambiental las exposiciones se clasifican de acuerdo a la magnitud del período de exposición en: • Exposiciones crónicas: Son las exposiciones que duran entre 10% y el 100% del período de vida. Para el caso del hombre entre 7 y 70 años. • Exposiciones subcrónicas: Son exposiciones de corta duración, menores que el 10% del período vital. Exposiciones agudas: efecto letal u otro efecto producido en un tiempo relativamente corto, usualmente dentro de los 4 días para peces o macro vertebrados y periodos más cortos ( 2 días) para organismos más pequeños, estas exposiciones suceden en un solo evento. ___________ 5, TOXICOLOGIA AMBIENTAL: Evaluación de Riesgos y Restauración Ambiental © 2001 The University of Arizona http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxam 22 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.5. INDICADORES DE TOXICOLOGIA Las siguientes unidades de medida expresan los valores de concentración de contaminantes y las dosis recibidas por un organismo, sirviendo como indicadores: 2.5.1. Dosis Letal Media DL50 Dosis es la cantidad de toxico que penetra en el organismo y Dosis Letal 50 es la dosis individual de una sustancia que provoca la muerte del 50% de la población animal debido a la exposición a la sustancia por cualquier vía distinta a la inhalación. Normalmente expresada como miligramos o gramos de material por kilogramo de peso del animal. 2.5.2. Concentración Letal Media CL50 Concentración letal 50 es la concentración, obtenida por estadística, de una sustancia de la que puede esperarse que produzca la muerte, durante la exposición o en un plazo definido después de ésta, del 50% de los animales expuestos a dicha sustancia durante un periodo determinado. El valor de la CL50 se expresa en peso de sustancia por unidad de volumen de aire normal (miligramos por litro, mg/L). 2.5.3. Concentración Efectiva CE50 Concentración del tóxico que produce efectos negativos apreciables en el 50 por ciento de la población (pérdida del equilibrio, frecuencia respiratoria, en un tiempo determinado). 2.5.4. CL50 asintótica Concentración de tóxico a la cual CL50 llega hacerse constante para un tiempo de exposición prolongado. 2.5.5. Concentración de efectos no observados (CENO) La mayor concentración a la cual no se observa reacción crónica alguna en las especies ensayadas. 23 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.5.6. Concentración de efectos mínimos observables (CEMO) La menor concentración de tóxico a la cual puede observarse algún efecto sobre la especie ensayada. 2.5.7. Nivel de efectos agudos no observados (NEANO) Es la mayor concentración del tóxico para la cual la mortalidad registrada es del 10% o inferior. 2.5.8. Partes por Millón (ppm) Para determinar la concentración de una substancia química en un volumen se utilizan las partes por millón de partes iguales. Cada millonésima parte de este volumen, correspondiente a la substancia de nuestro interés, se considera una parte por millón de la substancia. Las ppm se utilizan para determinar concentraciones muy pequeñas de gases en la atmósfera. 2.5.9. Efectos Es el cambio biológico producido tanto en el nivel de organismo individual como en niveles de organización inferiores o superiores al individuo, asociado a la exposición del tóxico. Estos pueden ser: 2.5.9.1 Efecto agudo Corto tiempo de exposición (horas, días) donde la severidad es la mortalidad y se determina la concentración que causa la mortalidad del 50% de la población expuesta (CL50). 2.5.9.2 Efecto letal Causa la muerte por acción directa como consecuencia de la exposición a una determinada concentración del agente tóxico. 2.5.9.3. Efecto subletal Se produce por debajo del nivel que causa la muerte directamente, como resultado de la exposición a una determinada concentración del agente tóxico. 2.5.10. Respuesta Proporción de la población expuesta al tóxico que manifiesta el efecto definido 24 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.6. ECOTOXICOLOGIA El principio de la ecotoxicología es que los organismos vivos son herramientas esenciales para la evaluación de la calidad ambiental, puesto que ellos son los que están expuestos a los efectos combinados de la ecotoxicidad. 6. La ecotoxicología ambiental estudia los efectos nocivos de sustancias altamente tóxicas (químicas o físicas) presentes en el ambiente, sobre organismos vivos, los cuales son parte esencial en los ecosistemas (vegetales, microorganismos, animales y el hombre), en esta interviene la toxicología y la ecología; su finalidad es evaluar el riesgo ecológico que se puede presentar por la presencia de sustancias potencialmente tóxicas en un ambiente acuático reuniendo así, la suficiente información para la protección de los ecosistemas. En este estudio se debe resaltar las características de la sustancia entre ellas: distribución en el ambiente, patrones de descarga, efectos en organismos vivos, degradación, actividad biológica, formas de bioacumulación, etc., así como las características y las propiedades de los ecosistemas. Con ella se evalúa la probabilidad de ocurrencia de efectos adversos que pueden ocurrir o están ocurriendo en ecosistemas que se encuentran en exposición a sustancias de interés sanitario que producen estrés en los organismos, esta evaluación está determinada en dos elementos: Exposición de organismos en estudio con agentes contaminantes: interacción entre frecuencia, intensidad y respuesta de los organismos frente a sustancias que alteran su ecosistema. _____________________________ 6 LEVIN, S. A., M. A.. KELLY y K. D. KIMBALL. 1989. Ecotoxicology: problems and approaches. Springer-Verlag. 25 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Características de los efectos producidos por sustancias tóxicas: relación dosis-respuesta entre la sustancia química contaminante y los efectos que produce en el organismo. En ocasiones, la única diferencia entre toxicología y ecotoxicología parece estar centrada en las especies seleccionadas para las pruebas toxicológicas. Sin embargo, la diferencia esencial entre las dos ciencias radica en su enfoque frente al problema. La toxicología concierne a los efectos sobre los organismos individuales, estudia los efectos de la introducción directa del compuesto dentro del organismo y focaliza su atención en una sola especie (incluido el hombre), y en sus estudios se habla de dosis de aplicación, mientras que, la ecotoxicología se ocupa de los efectos sobre los ecosistemas y su interés abarca toda la biota, incluyendo los aspectos estructurales y funcionales del ecosistema expuesto y en sus estudios se habla de concentración del xenobiótico en el medio. La ecotoxicología estudia el destino y los efectos de los contaminantes en los ecosistemas, intentando explicar las causas y prever los riesgos probables. La ecotoxicología prospectiva evalúa la toxicidad de las sustancias antes de su producción y uso. La ecotoxicología retrospectiva se ocupa de confirmar si la sustancia produce daños en el ecosistema. 2.7 BIOENSAYOS Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad se desconoce (FAO, 1981). Los bioensayos, o pruebas de toxicidad son experimentos que miden el efecto de uno o más contaminantes en una o más especies (Reish y Oshida, 1987), permiten evaluar el grado de toxicidad de una sustancia química, un efluente, un 26 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna cuerpo de agua, etc., empleando organismos vivos (Esclapés, 1999). Puede determinarse la influencia relativa de cada factor sobre los parámetros biológicos estudiados. Los rangos de variación de los factores considerados pueden ser mayores que los existentes en el ambiente natural, lo que muchas veces facilita el estudio de su modo de acción. También pueden estudiarse combinaciones de dos o más factores, lo que permite revelar la existencia de antagonismos o sinergismos entre ellos. La posibilidad de controlar muchas de las variables hace posible la eliminación de las fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a cabo (Rodríguez et al., 1995). Para proteger el medio acuático es necesario fijar límites superiores a las descargas de contaminantes perjudiciales químicos y físicos, además de vigilar y regular las descargas que se realicen posteriormente. Los límites superiores de las descargas se derivan de la consideración de los criterios apropiados de calidad de agua formulados a partir de datos de respuestas para sistemas biológicos (bioensayos crónicos o agudos) (FAO, 1981). Los individuos son expuestos a concentraciones crecientes del tóxico para determinar cambios en el organismo. En general la muerte es el criterio más utilizado en la prueba de CL50 horas. Uno o más controles son utilizados en organismos expuestos a similares condiciones excepto cuando existe falta de disponibilidad del tóxico (Reish y Oshida, 1987). Los bioensayos toxicológicos tienen por finalidad determinar las concentraciones de un tóxico dado que ocasionen efectos dañinos o nocivos en un organismo modelo. Estos efectos pueden incluirse en las siguientes categorías: 27 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Afectación del término de vida Alteración de la tasa de crecimiento Cambios de los parámetros reproductivos (Reish y Oshida, 1987). Cuando se produce algún efecto se anota el efecto y la concentración del compuesto químico. Si el organismo de prueba muere se anota la concentración letal. Esta es la manera por la cual se determina en un laboratorio la toxicidad de un compuesto químico. Puede ocurrir que a bajas concentraciones de un compuesto químico muchos de los animales de prueba mueran, esto significa que el compuesto en cuestión es muy tóxico. Cuando sabemos cómo de tóxico es un compuesto, también sabemos los efectos de este compuesto cuando una cierta concentración se presenta en una zona. 2.7.1. Tipos de bioensayos 2.7.1.1. Ensayos de respuesta directa 2.7.1.1.1. Bioensayos de toxicidad Bioensayos agudos: Cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico a una especie en particular. El valor calculado se denomina concentración letal media (CL50), y representa la concentración que causa la muerte al 50 % de la población experimental, en un tiempo determinado (generalmente 48 o 96 horas) (Esclapés, 1999). De tipo estático: Se efectúa sin la renovación continua del flujo constante de las diluciones sometidas al ensayo (FAO, 1981). Sin renovación: los organismos se exponen a la misma solución de prueba el tiempo de duración del ensayo (Esclapés, 1999). 28 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Con renovación: los especimenes se someten a una preparación fresca de la misma concentración inicialmente empleada, periódicamente (generalmente cada 24 horas) (Esclapés, 1999). Tal renovación puede ser necesaria cuando importantes sustancias tóxicas se deterioran, o son absorbidas, o se pierden por cualquier otra razón, con suficiente rapidez para influir considerablemente con los resultados del ensayo (FAO, 1981). De flujo continuo: Circula continuamente una corriente de sustancia de prueba nueva en contacto con los individuos experimentales (Esclapés, 1999). Se realizan con la renovación continua o casi continua de las diluciones sometidas al ensayo, con el fin de mantener casi constantes las concentraciones de las sustancias tóxicas activas (FAO, 1981). Bioensayos crónicos: Estiman la concentración efecto media (CE50), la cual es la concentración de la sustancia de prueba que causa un efecto al 50% de la población experimental, al cabo de un tiempo determinado; depende del estadío de vida considerado o del ciclo de vida del organismo empleado. Alternativamente, un ensayo definitivo puede utilizarse para estimar el tiempo requerido para producir un efecto al 50% de los organismos (TE50), a una concentración específica (Esclapés, 1999). Bioestimulación: Se mide la facultad de las aguas residuales o de las sustancias químicas de estimular la multiplicación y el desarrollo de algas, efecto este de eutroficación que frecuentemente se traduce en una superabundancia o proliferación de algas (FAO, 1981). Bioensayos de repelencia: Trata de medir en el laboratorio las reacciones de escapes de los animales acuáticos frente a un contaminante. Al organismo 29 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna utilizado (generalmente pez o crustáceo de buen tamaño) se le ofrece la oportunidad de elegir entre aguas "contaminadas" y aguas "limpias" en un tubo o tanque pequeño; el gradiente de interfaz puede ser brusco. Los aparatos y procedimientos miden también, por lo general, cuando existe la atracción hacia el contaminante. Para las especies con motilidad el escapamiento puede ser a veces la respuesta subletal clave, de naturaleza más sensible y más significativa que el deterioro de la reproducción medido mediante ensayos de toxicidad crónicos. Sin embargo, es particularmente difícil predecir, a partir de estos resultados de laboratorio, lo que ocurriría en el medio. Las respuestas de escape pueden estar o no relacionadas con la toxicidad del contaminante, en algunos casos los organismos no pueden soportar determinadas concentraciones tóxicas o pueden ser atraídas por ellas (FAO, 1981). Bioacumulación: Son necesarios para las sustancias que se acumulan en las plantas y animales acuáticos; las grandes concentraciones de sustancias tóxicas en los tejidos pueden causar la muerte, pero el organismo es capaz de acumular durante algún tiempo cantidades menores sin sufrir daño. En este último caso, los depredadores pueden acumular las sustancias en grado tal que resulte nociva para ellos o para los depredadores del nivel trófico siguiente (FAO, 1981). 2.7.1.2 Ensayos de respuesta indirecta 2.7.1.2.1. Ensayos organolépticos Algunos contaminantes pueden producir olores o sabores desagradables en los organismos acuáticos. El contaminante puede no ser nocivo para el organismo acuático, pero puede ocurrir que el organismo pierda valor económico. El mejor procedimiento consiste en la evaluación por parte de personas experimentadas en bromatología y emplear gran número de catadores diestros (FAO, 1981). 30 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.7.1.2.2. Ensayos de bioestimulación Los efectos de los nutrientes adicionales pueden ser indirectos, como por ejemplo, la producción de sustancias tóxicas o la desoxigenación del agua debida a la proliferación de algas (FAO, 1981). En el cuadro N° 1 se puede observar de manera resumida, los tipos de bioensayos. 2.8. ENSAYOS PRELIMINARES Estos ensayos se utilizan para determinar en forma preliminar, la toxicidad de una sustancia o de los efluentes. Los tratamientos son dos y consisten de un control (se usa agua de la localidad o agua de laboratorio preparada para el cultivo) y efluente sin diluir (100 %). El número de réplicas, densidad de los organismos y procedimientos generales son los mismos empleados en el ensayo definitivo para la especie en cuestión. La determinación de oxígeno disuelto, temperatura, alcalinidad, dureza total y conductividad específica se realizan como en el ensayo definitivo (Rodríguez y Esclapés, 1995). Estos ensayos están diseñados para proveer un estimado preliminar de las concentraciones, cuando se desconoce la toxicidad de la muestra a evaluar. Se preparan de cinco a diez diluciones de exposición. En este tipo de ensayo, es suficiente que las concentraciones de las soluciones de exposición sean aproximadas, por lo que se pueden utilizar cilindros graduados para su preparación. Este ensayo permite definir el orden de magnitud del intervalo de las concentraciones entre las cuales se debe realizar el ensayo definitivo (Rodríguez y Esclapés, 1995). 31 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna CUADRO No. 1 Clasificación de los Bioensayos BIOENSAYOS DE TOXICIDAD ENSAYO DE RESPUESTA INDIRECTA ENSAYO DE RESPUESTA DIRECTA BIOENSAYO AGUDO DE TIPO ESTATICO BIOENSAYO CRÓNICO BIOESTIMULACION BIOENSAYO DE REPELENCIA DE FLUJO CONTINUO SIN RENOVACION ENSAYO ORGANOLÉPTICO CON RENOVACION FUENTE: Elaboración propia 32 BIOACUMULACIÓN ENSAYO DE BIOESTIMULACIÓN DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.9 ENSAYOS DEFINITIVOS Es un experimento en el cual un grupo de organismos se exponen durante un período de tiempo determinado a una serie de concentraciones de un efluente o un compuesto de interés (Esclapés, 1999). El propósito de este ensayo es establecer las curvas de concentración respuesta y los valores de las CL50 24 y 48 horas; para determinar estos parámetros se deben emplear cinco o más concentraciones con rangos establecidos entre 1.5 y 2.0mg por litro (Alberdi, 1990). En esta prueba, diferente al tipo de ensayo preliminar, cada concentración debe correr por triplicado (USEPA, 1987). El intervalo de trabajo estará comprendido entre la concentración a la cual el 100% de los organismos mueren y la concentración que produce una mortalidad no mayor al 10%. La concentración más baja podrá ser aquella que no causa efecto en los organismos de prueba. Las sucesivas concentraciones se incrementarán sobre la base de un múltiplo constante hasta alcanzar aquella que resulte lo suficientemente alta para matar el 100% de la población expuesta (Tortorelli, 1990). 2.10 ORGANISMO ÓPTIMO PARA LA REALIZACION DE BIOENSAYOS Representativo de ambientes tropicales, de amplia distribución en el país o de importancia comercial (Esclapés, 1999). Disponibilidad, ser fáciles de encontrar, en número suficiente y colectarse sin dificultad. Que sean representativos para los estudios estadísticos. De fácil cultivo, lo que garantiza un adecuado suministro de organismos en los ensayos y el establecimiento con exactitud de la edad o estado de desarrollo. La 33 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna edad es de suma importancia en los bioensayos, ya que la sensibilidad puede variar significativamente durante su desarrollo (Esclapés, 1999). Especies con gran susceptibilidad a exposiciones con sustancias xenobióticas. Garantizando proporcionar resultados que ofrecen una alta protección al resto de la cadena trófica (Esclapés, 1999). 2.11 DAPHNIA magna Daphnia son pequeños crustáceos planctónicos, entre 1 y 3 mm de longitud. Taxonómicamente las Daphnias pertenecen a la familia Daphnidae y al suborden Cladócera, llamados comúnmente pulgas de agua debido a su estilo de natación (dando pequeños saltos en el agua), aunque son insectos tienen muchas diferencias como por ejemplo: la respiración por medio de agallas, poseen un par de antenas y tienen cinco pares de patas los cuales utilizan para alimentarse y para la locomoción. Figura N° 2 Anatomía de la Daphnia magna Fuente: www.asalab.it/docs/Image/Daphnia_magna.jpg Daphnia magna ha sido usada por muchos años en los Estados Unidos, Canadá y Europa como organismo de test para llevar a cabo estudios de toxicidad. La distribución geográfica de la especie en este continente ha sido reportada en el 34 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Norte y el Noreste de Norte América. Todos los hábitats en los que la especie ha sido encontrada son en cuencas alcalinas o salinas de California y el oeste del Canadá. Se encuentra en aguas dulces a temperaturas aproximadas de 15 a 30°C, siendo la temperatura óptima entre 18 y 28°C. Daphnia magna fue traída del “Instituto de reservas nacionales de agua” que se encuentra ubicado en (Ontario, Canadá). Casi todos los de cultivos de Daphnia magna ahora en uso, no son descendientes de especies recolectadas en Norteamérica. McCarthur y Baillie afirman que “Daphnia magna Strus var. Schaefferi, es un vestigio posterior de un stock importado hace años como alimento favorito de peces, del continente europeo”. El stock de este organismo en la EPA, puede tener un origen similar, al haber sido obtenido de la universidad de Michigan (Goulden op.cit.). Su papel fundamental es que es un organismo representativo de una cadena trófica, porque, la utilización de estos sirve como indicador natural de la contaminación del medio ambiente. 2.11.1. TAXONOMIA En la siguiente tabla se resume el grupo taxonómico al cual pertenece la Daphnia magna: Tabla N°1: Taxonomía Daphnia magna Clase: Sub-clase: Crustacea Branchiopoda Orden: Sub-orden: Familia: Género: Cladócera Anomópoda Daphniidae Daphnia Especie: Nombre vernacular: Daphnia Magna Cladócero de agua dulce ó pulga de agua Fuente: ESCOBAR, P.M, GARCIA, L.E. Determinación de la CL50 de los detergentes mediante pruebas estáticas utilizando Daphnia magna. Universidad de la Salle. 1993 35 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.11.2. MORFOLOGIA Estos organismos se caracterizan por poseer un cuerpo comprimido lateralmente y ovalado; no se distinguen segmentos como en otros crustáceos. Presentan dimorfismo sexual marcado, la hembra es más grande que el macho, presentan un carapacho de quitina transparente, las antenas o apéndices con numerosas setas y ojo compuesto, además de, una cavidad embriónica con huevos y embriones situados en la parte dorsal, entre el carapacho y el dorso del cuerpo. 7 El corazón se encuentra en la parte superior de la espalda, justo detrás de la cabeza, y su ritmo cardíaco promedio es de aproximadamente 180bpm en condiciones normales. Daphnia, al igual que muchos animales, son propensos a la intoxicación por alcohol, y excelentes organismos para el estudio de los efectos de compuestos tóxicos. 8 Estos organismos son incoloros o transparentes pero, a veces se observa una coloración rosada o roja debido a la presencia de hemoglobina en el interior del cuerpo. La presencia de hemoglobina dependerá de la cantidad de oxigeno disuelto en el agua. Por esta razón, en aguas bien aireadas las Daphnia son incoloras, mientras que en aguas estancadas presentan un color rosado. Son organismos filtradores, y los bordes de los apéndices del tronco, están provistos de cerdas finas filtrantes (Mc Innis, 1989). Estas cerdas filtrantes retienen organismos (generalmente pertenecientes al nanoplanctón) y partículas muy finas (menores de treinta micras). __________________ 7 Cultivo de microcrustaceos de agua dulce. 1991 www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S06.htm 8. Disponible en:.wikipedia.org/wiki/Daphnia. 36 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Mediante el movimiento de apéndices del tronco el alimentado filtrado que se encuentra en el agua, se dirige hacia adelante a lo largo de los apéndices y es dirigido contra el cuerpo inmediatamente detrás de la boca. Las mandíbulas mastican el extremo anterior del lado de la masa alimenticia, y dirigen los fragmentos a la boca. Una de las características anatómicas más destacadas de las pulgas de agua es que la mayor parte de su cuerpo está rodeado por una concha o caparazón, que en realidad es como su esqueleto externo. Periódicamente las pulgas de agua cambian de caparazón para poder crecer y expandirse, antes de que la siguiente capa pueda endurecerse. 9 La Figura N° 3, indica cada una de las partes de la Daphnia magna. Figura 3: Partes de la Daphnia magna Fuente: RICO ORDÁS, José Manuel; MENÉNDEZ VALDERREY, Juan Luís. Asociación ASTURNATURA.. <http://www.asturnatura.com/articulos/artropodos/branquio.php>. _______________________ 9. Contreras, Op. Cit, p 19 37 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.11.3. REPRODUCCION La reproducción de esta especie es masiva en condiciones óptimas. Bajo buenas condiciones se reproduce por partenogénesis (sin necesidad de machos) y en condiciones deficientes (falta de alimento, superpoblación, falta de agua) se reproduce mediante huevos de resistencia (intervienen machos y hembras) capaces de aguantar mucho tiempo en malas condiciones, incluso soportan los jugos gástricos de los animales, eclosionando cuando las condiciones vuelvan a ser buenas, estos huevos tienen incluso mecanismos para adherirse a las plumas de las aves y así poder ser dispersados por el viento. Los huevos de resistencias se observan dentro de unas estructuras de color negro, el efipio, que llevan en la zona dorsal de su cuerpo. Pueden vivir por varias semanas durante el verano y hasta cien días si no son depredadas. El periodo de huevo se desarrolla completamente dentro de la cámara de cría de la madre. El periodo juvenil presenta entre cuatro y cinco estadios. El adolescente es breve y varía entre 1 o 2; es en este periodo donde se desarrollan la primera camada de huevos dentro del ovario. El adulto en cambio presenta mayor número de estadios. La aparición de la función reproductiva es la que marca el comienzo de este último periodo. (Alberdi, 1990). 2.11.4. CICLO DE VIDA La vida de una Daphnia no exceda de 120 días en condiciones optimes de temperatura. Por ejemplo, los organismos pueden vivir hasta 108 días a 30 ° C, mientras que algunos organismos vivos viven sólo 29 días a 28 ° C. Pueden vivir por varias semanas durante el verano y hasta cien días si no son depredadas. 38 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna El periodo de huevo se desarrolla completamente dentro de la cámara de cría de la madre. El periodo juvenil presenta entre cuatro y cinco estadios. El adolescente es breve y varía entre 1 o 2; es en este periodo donde se desarrollan la primera camada de huevos dentro del ovario. El adulto en cambio presenta mayor número de estadios. La aparición de la función reproductiva es la que marca el comienzo de este último periodo. (Alberdi, 1990). 2.11.5 ALIMENTO Las Daphnias son crustáceos depredadores, se pueden alimentar de bacterias, algas, detritus, levaduras y de zooplancton de menor tamaño, que constituyen generalmente su única fuente de alimentación. 2.11.6. PARAMETROS AMBIENTALES 2.11.6.1. Habitat Son organismos ampliamente distribuidos en lagos, reservorios artificiales, charcos temporales y aguas de desecho. Son abundantes en ambientes con alta concentración de materia orgánica en donde proliferan bacterias, levaduras y microalgas. Especies de Daphnia pueden cohabitar con Moina, Copépodos y Brachiópodos. La daphnia o pulga de agua (Daphnia magna) vive de forma salvaje en Europa, África, Asia y América del Norte, se dice que es una especie cosmopolita. ___________________ 10 www.botanical-online.com, 1999-2008, el mundo de la naturaleza. 39 10 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.11.6.2. Temperatura Daphnia magna es especialmente resistente a cambios extremos de temperatura desde O°C a 22°C y se consideran 18°C-20°C como su temperatura óptima. 2.11.6.3. Requerimiento de oxígeno Estos organismos habitan en medios donde la concentración de O2 es variable, ya que pueden crecer tanto en completa saturación de O2 hasta concentraciones muy bajas. Estas concentraciones están en relación a temperatura, concentración de materia orgánica, concentración de microalgas, etc. La supervivencia en medios pobres de oxígeno depende de la capacidad de sintetizar hemoglobina. Este fenómeno está en relación directa del oxígeno ambiental. Un incremento en hemoglobina está en razón directa de alta temperatura y excesiva densidad de población. Incluso la hemoglobina está presente también en los huevos y la síntesis de hemoglobina también está relacionada con la concentración de CO2 ambiental. 2.11.6.4. Requerimiento de pH El pH óptimo en estas especies es difícil de determinar. En términos generales, el pH oscila entre 7.5 – 8.0. 2.12 OTROS REQUERIMIENTOS Existe en estas especies una alta sensibilidad a cambios del equilibrio iónico a diferentes concentraciones de cationes en el medio. Las reacciones de Daphnia a la presencia de sales de fosfatos y nitratos (0.5 mg/l) es interesante, pues estimula la reproducción y la madurez sexual. Los huevos contienen carotenoides y su síntesis requiere de la presencia de luz. Es importante mencionar que la madurez sexual también está influenciada por la presencia de luz. 40 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna La abundancia y distribución de estas especies depende de la variación estacional pues el número y tamaño de huevos de resistencia partenogenéticos y la madurez sexual dependen de las variaciones de T°, S‰, pH y luz, entre otros. Un exceso de luz solar reduce considerablemente una población. En relación a la producción de huevos efipios (huevos de resistencia) dependen de la temperatura principalmente. Las colectas de estos organismos de los medios naturales para su cultivo, deben hacerse en primavera y verano. 2.13 ECOLOGIA Los componentes animales de las aguas dulces constituyen un entramado diverso de organismos representantes de casi todos los grupos taxonómicos. La evaluación de la dinámica de la población y de ciertas importantes características de conducta adaptiva que influyen en esta dinámica, resultan fundamentales para las formulaciones sobre la productividad de poblaciones de especies en concreto de la comunidad entera. Detrás de cualquier evaluación de la productividad de los animales, están su alimento y sus relaciones tróficas con las plantas y con los demás animales, además de las interacciones de competencia y depredación, que permiten un mayor éxito de una especie sobre las otras. El cladócero de agua dulce, es un animal planctónico que tiene un papel muy importante en el ecosistema acuático toda vez que al recoger y alimentarse de organismos más pequeños, sirven a su vez como alimento para animales mucho mayores. 41 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.14 CRITERIOS PARA SU ESCOGENCIA Daphnia ha sido utilizada en estudios de tolerancia por mucho tiempo. Los resultados obtenidos por diferentes investigadores son comprables y en general, los dáfnidos son menos tolerantes a sustancias tóxicas que los peces. Daphnia magna es la más grande de los dáfnidos, alcanzando un tamaño de 5 mm aproximadamente. Los neonatos son de 0,8 y 1 mm de longitud, y pueden observarse sin ayudas ópticas. Las hembras individuales de Daphnia magna tiene un promedio de longevidad de 26 días a 28°C, y pueden criarse individualmente en pequeños recipientes y en cultivos masivos, en acuarios grandes. Cuando las condiciones del cultivo son óptimas, las hembras liberan sus primeros neonatos a los diez días de cultivadas a 25°C, después de esto son liberados nuevos neonatos cada dos o tres días. Se producen 20 o más neonatos por camada, mientras se mantengan las condiciones adecuadas de cultivo. Los neonatos son menos tolerantes a muchas sustancias que los animales más viejos.11 ________________ 11 , Escobar Malaver Pedro, García Luis, Determinación de la toxicidad aguda de los detergentes mediante sistemas estáticos utilizando Daphnia Magna, 1993. 42 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.15 METODOS DE ANALISIS PARA RESULTADOS DE TOXICIDAD El método a usar para determinar los valores de CL50 en pruebas de toxicidad aguda depende de la forma de la distribución de tolerancias12, es decir el porcentaje de organismos de una población dada que se verá afectada a una cierta dosis. Generalmente los métodos más usados son los siguientes: Método Probit (paramétrico). Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico). Método de Sperman-Karber (no paramétrico). Método gráfico1 2.15.1. Metoto Probit El Probit se basa en la cuantificación probabilística de la vulnerabilidad, en este caso un medio acuático (ríos, lagunas etc.,) ante efectos físicos de una magnitud determinada que se suponen conocidos. Dicho método consiste en la aplicación de correlaciones estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre la población u otros elementos vulnerables a los fenómenos físicos peligrosos. El método de análisis Probit permite estimar la CL50 ajustando los datos de mortalidad mediante una técnica de probabilidad para estimar los valores que siguen una distribución logarítmica de tolerancias. El porcentaje de organismos afectados o muertos por la acción tóxica de una sustancia se transforma a unidades Probit. Una de las restricciones del método es que para el cálculo de la CL50 deben obtenerse valores intermedios entre 0 y 100% de mortalidad. 12 Tolerancia se refiere al porcentaje de organismos de una población dada que se verá afectada a una cierta dosis. Así, la distribución de tolerancias es una cierta distribución de frecuencias o de probabilidades de tolerancias a las distintas dosis del tóxico. 43 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Para el ejercicio de la obtención de CL50 en este trabajo, se usara este método el cual evaluara la relación concentración-respuesta del herbicida Roundup sobre la Daphnia magna. 2.15.1.1. Analisis Probit Al realizar las pruebas de toxicidad aguda, se obtienen las siguientes variables para el cálculo de la CL50: • Concentración de la sustancia o dosis (d). • Número de individuos (n). • Número de organismos muertos o afectados (r). • Porcentaje de efecto (p). La representación gráfica de p vs. d, o relación dosis-respuesta, genera una curva parabólica que muchas veces presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal. Una forma de abordar este problema es transformando d a una escala logarítmica (X = log10(d), lo cual mostrará una relación dosis-respuesta de forma S o sigmoidea normal, para, obtener la distribución de p vs. X que será de tipo normal. Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a unidades Probit (buscando en una tabla de distribución normal el valor de z correspondiente a una probabilidad acumulada igual a p y sumándole a continuación cinco unidades), se obtiene una distribución de puntos en un sistema bivariado de tipo lineal, los cuales se procesan según un análisis de regresión típico. Vale la pena enfatizar que el Probit es una transformación sobre la tasa de efecto (p), y la ecuación generada es de la forma: 44 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna y a bx Donde: y (expresado en unidades Probit) = z + 5 z= Variable normal estándar = zO tal que la Prob (z ≤ zO) = p a y b son los estimadores de los parámetros de la recta de regresión Así, cuando p= 50% entonces y = 5, por lo tanto: X5= log10 CL50, entonces CL50 = 105 Para facilitar los cálculos, simplemente se puede usar un software como el suministrado por la EPA, El procedimiento Probit permite encontrar estimadores mverosímiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos, analizando porcentajes de efecto vs. dosis dentro del marco de la regresión. 13 2.15.1.2 Aceptabilidad de los resultados • La mortalidad en el control negativo no debe exceder el 10%. • La concentración final de oxígeno disuelto debe ser mayor de 2 mg/L. • La CL50 para el tóxico de referencia deberá estar dentro de los límites de confianza preestablecidos en la carta control. _____________________________________ 13 DÍAZ BÁEZ, María Consuelo, PICA GRANADOS, Yolanda RONCO, Alicia. Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. [citado 5 de Agosto de 2007]. Disponible en Internet: http://www.idrc.ca/openebooks/1477/#page_65gs\\bioensayos\Capítulo 5_ Métodos Estadísticos para el Análisis de Resultados de Toxicidad Internacional 45 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna En caso de emplear un control positivo de concentración cercana a la CL50, los valores de mortalidad obtenidos deberán encontrarse cercanos al 50%. Se puede considerar aceptable el encontrar mortalidades entre el 33 y 57%. 14 2.15.2. Análisis de varianza (ANOVA) La abreviatura ANOVA proviene del inglés Analysis Of Variance. La teoría y metodología del análisis de la varianza fueron desarrolladas e introducidas por R.A. Fisher durante los primeros años de la segunda década del siglo XX. El número de análisis de la varianza que utiliza ANOVA proviene del hecho de que a pesar de que comparamos medias, el estadístico de contraste que utiliza ANOVA se basa en el cociente de dos estimadores de la varianza. El objetivo del análisis de varianza es comparar si los valores de un conjunto de datos numéricos son significativamente distintos a los valores de otro o más conjuntos de datos. Para este tipo de análisis se requiere que el número de replicas por tratamiento sea superior a tres y que todos los tratamientos tengan el mismo número de replicas. En el caso que las replicas sean menores de tres no se deberá proceder con una prueba hipótesis. La técnica de contraste de hipótesis sirve para comprobar si una determinada hipótesis sobre un hecho vinculado a un experimento aleatorio se puede aceptar o se tiene que rechazar. Para esto se establece una hipótesis nula y una hipótesis alternativa. 15 _________________________ 14 APHA, 1998, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed., American Public Health Association, Ap. 8010G., Washington D.C., pp. 8-20, 8-23. 15 El análisis de la varianza (ANOVA). Josep Gibergans Bàguedisponible en www.uoc.edu 46 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna HIPOTESIS NULA: Todas las medidas poblacionales de las que provienen las muestras son iguales. Ho: µ1 = µ2 = µ3 Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos. HIPOTESIS ALTERNATIVA: No todas las medidas son iguales H1: las medidas no son iguales Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. En la prueba ANOVA, se reúne evidencia muestral de cada población bajo estudio y se usan estos datos para calcular un estadístico muestral. Después se consulta la distribución muestral apropiada para determinar si el estadístico muestral contradice la suposición de que la hipótesis nula es cierta. Si es así, se rechaza; de lo contrario no se rechaza. Hemos de recordar que en la prueba de varianza con dos poblaciones se calcula el coeficiente de las varianzas muestrales y se verifica con arreglo a la distribución F. Este procedimiento también se usa en ANOVA para probar la hipótesis nula. Se supone que todas las poblaciones bajo estudio tienen la misma varianza, sin importar si sus medias son iguales. Es decir, ya sea que las poblaciones tengan medias iguales o distintas, la variabilidad de los elementos alrededor de su respectiva media es la misma. Si esta suposición es válida, entonces se puede probar la hipótesis nula de las medias poblacionales iguales usando la distribución F. 47 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna El análisis de varianza parte de algunos supuestos que han de cumplirse: La variable dependiente debe medirse al menos a nivel de intervalo. Independencia de las observaciones. La distribución de la variable dependiente debe ser normal. Homogeneidad de las varianzas Los modelos de efectos aleatorios asumen que en un factor se ha considerado tan sólo una muestra de los posibles valores que éste puede tomar, estos modelos se usan para describir situaciones en que ocurren diferencias incomparables en el material o grupo experimental. El ejemplo más simple es el de estimar la media desconocida de una población compuesta de individuos diferentes y en el que esas diferencias se mezclan con los errores del instrumento de medición. La técnica fundamental consiste en la separación de la suma de cuadrados (SS, 'sum of squares') en componentes relativos a los factores contemplados en el modelo. El número de grados de libertad (gl) puede separarse de forma similar y se corresponde con la forma en que la distribución chi-cuadrado describe la suma de cuadrados asociada, (glTotal = glError + glFactores ). Los datos de resultados de ANOVA deben ser registrados en las tablas que se observan en el (Anexo I). 2.16 HERBICIDAS Un herbicida es un producto fitosanitario utilizado para matar plantas indeseadas. Los herbicidas selectivos matan ciertos objetivos, mientras preservan la cosecha relativamente indemne. Algunos actúan interfiriendo con el crecimiento de las malas hierbas y se basan frecuentemente en las hormonas de las plantas. Pero los herbicidas utilizados para limpiar grandes terrenos no son selectivos y matan toda planta con la que entran en contacto16. 48 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.16.1. Clasificación de herbicidas Los herbicidas se clasifican según su finalidad, su modo de actuación y según el momento de aplicación; a continuación se nombrarán de manera resumida: 2.16.1.1. Por su finalidad Total. Es aquel que destruye toda la vegetación sobre la que se aplica. Puede ser selectivo si se aplica en dosis menores. Selectivo. Son aquellos que en condiciones normales destruyen las malas hierbas y no el cultivo. En un tratamiento selectivo hay que tener en cuenta: Dosis exacta que recomienda la casa comercial. La máxima uniformidad posible en la distribución del producto. Naturaleza de la planta. Empleo del producto adecuado. 2.16.1.2. Por su modo de actuación Residuales. Son aquellos que permanecen en el suelo el suficiente tiempo como para ir matando las malas hierbas en el momento de su germinación; estos productos no son tóxicos para la planta cultivada o se descomponen en productos no tóxicos antes de que nazca ésta. __________________________ 16. Casley J.C. Manejo de malezas para países en desarrollo. Capitulo 10, Herbicidas. Deposito Documentos de la FAO. 49 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se aplican después de la siembra del cultivo y antes de su germinación. De contacto. Aquellos que matan las plantas sobre las que caen, pero su acción tóxica es de muy poca duración y se descomponen rápidamente en sustancias no fitotóxicas o se evaporan. En este tipo de herbicidas hay que tener en cuenta el factor mojabilidad, ya que solamente quema las partes que moja. Sistémicos. Penetran en el interior de la planta, mezclándose con la savia y repartiéndose por toda ella. Actúan por translocación. 2.16.1.3. Según el momento de aplicación Pre- siembra o preplantación. Son los que se aplican después de la preparación del suelo, pero antes de la siembra o plantación. Preemergencia Son los productos que se aplican después de la siembra de la planta cultivada, pero antes de su germinación. Post-emergencia. Son aquellos que se aplican después del nacimiento de las malas hierbas y de la planta cultivada17. 2.16.2. Formulación Los herbicidas se fabrican en forma relativamente pura, que se denomina herbicida de grado técnico. Este puede ser sólido o líquido, y raramente es adecuado para ser ________________________________ 17. Dorronsoro Carlos, García Inés. Contaminación del suelo. Tema 13 Herbicidas. Universidad de Granada España. 50 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna usado así en el campo. Por ejemplo, el herbicida para avena silvestre difenzoquat se fabrica en la forma de sulfato de metilo y es fácilmente soluble en agua (765 g/1), pero la solución acuosa de difenzoquat no tiene actividad herbicida a menos que se agregue un tensoactivo o surfactante no-iónico a la solución. El tensoactivo o surfactante facilita la retención y penetración del herbicida y se incorpora en el producto comercial, que es un concentrado soluble. El producto formulado de todos los herbicidas aplicados mediante asperjadoras tiene que ser soluble o miscible, en un vehículo conveniente, que es generalmente agua. Además de presentar buenos resultados en el campo, tiene que ser estable durante el transporte y almacenaje y ser capaz de soportar situaciones climáticas extremas. Al igual que los concentrados solubles, se formulan compuestos solubles en agua en forma de granulados dispersables en agua, que contienen sólidos molidos finamente combinados con agentes de suspensión y dispersantes (tensoactivos o tensoactivo o surfactantes). Se pueden agregar directamente en el tanque de la asperjadora y verter limpiamente desde el envase (por ej., metsulfuron-metil). En el caso de compuestos con baja solubilidad, el ingrediente activo puede molerse hasta convertirlo en un polvo, mezclarlo con un portador inerte y un tensoactivo o surfactante y ser vendido como un polvo humedecible o humectable. Varios herbicidas son ácidos débiles y reaccionan con bases para formar sales y con alcoholes para formar ésteres. Las sales son solubles en agua, insolubles en aceite y tienen baja volatilidad, mientras que los ésteres son insolubles en agua, solubles en aceite y tienden a tener alta volatilidad. Los ésteres generalmente tienen una actividad herbicida superior a las sales, pero su alta volatilidad puede provocar daños a plantas que se encuentran fuera del área a tratar. Los ésteres de la mayoría de otros grupos de herbicidas, incluyendo los ésteres de ácido ariloxifenoxialcanoico (por ej. fenoxaprop-etil) no son volátiles18. 51 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna El contenido de ingrediente activo (i.a.) se expresa sobre la etiqueta del producto como g i.a./peso o volumen del producto y/o como % i.a. p/p (peso del i.a. como % del peso de i.a. + portador + formulantes). A menudo se describe el i.a. de las formulaciones de éster y sal de ácidos débiles como e.a. (equivalente ácido), ya que el ácido es el ingrediente fitotóxico liberado en la planta. 2.16.3. Mezclas Mientras que algunos productos son formulaciones de un solo ingrediente activo (por ej., glifosato), la mayoría de los productos formulados son mezclas de dos o más ingredientes activos. Las mezclas aumentan el espectro de malezas controladas y/o combinan la actividad de contacto o sistémica con la residual (por ej., 2, 4-D más atrazina). En los productos formulados, los componentes de la mezcla han sido evaluados por su compatibilidad física y química en el tanque de aspersión, por efectos adversos sobre la fitotoxicidad contra las malezas y por su selectividad en los cultivos. Las mezclas de tanques consisten en la unión en el tanque de aspersión de dos o más productos herbicidas formulados independientemente y otros plaguicidas. Los beneficios de las mezclas de tanque son los ahorros que se pueden hacer en el tiempo consumido para la aplicación y menor cantidad necesaria del vehículo del asperjado (agua). Además, a menudo dosis reducidas de los herbicidas individuales son efectivas. Sin embargo, algunas mezclas han resultado antagónicas19. ___________________________ 18,19 Rodríguez Tineo Elio. Protección y sanidad vegetal. Sección 2 Combate y control de malezas. Universidad central de Venezuela. 2000. 52 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Algunas mezclas de tanque aumentan la fitotoxicidad y pueden dañar al cultivo: por ejemplo, los insecticidas organofosforados bloquean el metabolismo de propanil en arroz. Es de la mayor importancia cumplir las instrucciones de las etiquetas con respecto a las mezclas de tanque, y si se contemplan mezclas "no incluidas en la etiqueta", se debe evaluar su efectividad y seguridad para el cultivo antes de su uso rutinario. Como regla general, surgen más problemas con las mezclas de tanque de herbicidas de aplicación foliar que con los de aplicación al suelo. 2.16.4. Coadyuvantes Los productos herbicidas comúnmente contienen tensoactivos o surfactantes y otros componentes para asegurar buenas características de almacenaje y facilitar su mezcla con el agua en el tanque de la asperjadora. Estos formulantes también ayudan a la retención sobre y la penetración dentro de las malezas objeto de la aplicación. Para ciertas malezas y bajo determinadas condiciones climáticas, se puede aumentar la acción del herbicida mediante tensoactivos o surfactantes o coadyuvantes oleosos, que se mezclan en el tanque con el herbicida. Las moléculas de los tensoactivos o surfactantes tienen dos partes diferenciadas. El extremo lipofílico generalmente está compuesto de estructuras en forma de largas cadenas hidrocarbonadas o de anillos benzénicos y posee baja solubilidad en agua y alta solubilidad en aceite. La parte hidrofílica tiene una fuerte afinidad por el agua. Existen tres tipos principales de tensoactivos o surfactantes, determinados por la estructura química de la porción hidrofílica de la molécula. Los amónicos y catiónicos se ionizan en agua para formar sustancias cargadas negativa y positivamente, respectivamente. Los tensoactivos más ampliamente usados son los no iónicos, que son fáciles de usar y no son afectados por aguas duras. Los tensoactivos disminuyen la tensión superficial de las gotas del asperjado y aumentan su cobertura sobre la superficie del follaje. 53 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Un coadyuvante inadecuado puede provocar la pérdida de la actividad fitotóxica y/o daños al cultivo, y por lo tanto, sólo deben usarse los coadyuvantes recomendados en la etiqueta del producto para cada herbicida, maleza y situación de cultivo, o por un asesor local experto. Se recomienda enfáticamente la evaluación de los coadyuvantes bajo condiciones locales (Holloway 1993) por una amplia reseña sobre formulaciones y coadyuvantes. 2.16.5 Como actúan los herbicidas Pueden actuar vía radicular o vía foliar. Los que se absorben por vía foliar deben atravesar la cutícula o entrar por los estomas. Los que penetran por las raíces lo hacen disueltos conjuntamente con las sustancias alimenticias del suelo. Una vez que ha penetrado en el interior del vegetal, puede ejercer su acción alrededor de su zona de penetración o moverse a lo largo de la planta si es de translocación. En este caso el herbicida produce su acción tóxica en donde se almacena, o a lo largo de su trayecto20. 2.16.6. Factores que afectan la actividad de los herbicidas La efectividad puede variar según numerosos factores: absorción (solubilidad del herbicida), naturaleza del suelo, naturaleza del herbicida, acidez del suelo, humedad, volatilización, degradación, disponibilidad de herbicidas en el suelo, insolación, temperatura, precipitaciones, viento y otros factores culturales. ___________________ 20. Dorronsoro Carlos, García Inés. Contaminación del suelo. Tema 13 Herbicidas. Universidad de Granada España. 54 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.16.7. GLIFOSATO El uso de herbicidas de amplio espectro aplicados por vía aérea con el fin de erradicar los cultivos ilícitos causa graves e innecesarios problemas de salud en personas y animales, contamina suelo, aire, agua y alimentos, y destruye cultivos básicos, animales de cría y peces base de la sobrevivencia de comunidades campesinas e indígenas y atenta contra la biodiversidad21. 2.16.7.1. Estructura y propiedades del glifosato 2.13.7.1.1. Fórmula del Glifosato Composición: Sal isopropilamina de N-(Fosfono metil) glycina. ROUNDUP: Solución viscosa de color ambarino claro OO || || HO - C - CH2 - NH - CH2 - P - OH | OH Fuente. Fred Slyfe. Universidad de Illinois. 1992. 2.16.7.1.2. Formulación comercial del glifosato El Glifosato es una molécula formada por una fracción de glicina y un radical aminofosfato unido como sustituyente de uno de los hidrógenos del grupo -amino. _____________________ 21 .Kaczewer Jorge. Toxicología del Glifosato: Riesgos para la salud humana. 2002. Disponible en: www.ecoportal.com.ar/content/view/full/21199 55 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Como producto protector de cultivos, constituye uno de los descubrimientos agroquímicos más importantes de este siglo, siendo el herbicida de mayor uso en el mundo por ser efectivo, seguro y porque permite su aplicación de diversas maneras. Las formulaciones de glifosato se encuentran registradas en más de cien países, incluyendo los Estados Unidos; en donde ha sido aprobado por la E.P.A. (Agencia de Protección Ambiental) para ser utilizado en más de sesenta cultivos agrícolas, en manejo de bosques sometidos a intervención para su conservación, y en sistemas de cultivos diferentes, incluidos el mantenimiento de canales y vías y los jardines públicos y domésticos. (130 aplicaciones en total). Bajo los siguientes numerales se hará una presentación resumida para caracterizar los aspectos relevantes de la constitución químico biológico del herbicida Glifosato. 2.16.7.2. Características Generales Glifosato es un herbicida no selectivo de acción sistémica, de amplio espectro, y adecuado para el control de muchas especies de malezas, en tratamientos de post emergencia al follaje. No actúa sobre las semillas que existieran por debajo del suelo y tampoco es absorbido por las raíces. En igualdad de condiciones también se puede decir que no es de acción residual prolongada y que no es ni actúa como herbicida esterilizante del suelo. La casi totalidad de las formulaciones comerciales del Glifosato son fáciles de manejar, muy solubles en agua y químicamente muy estables en cualquier proporción. 2.16.7.3. Propiedades Físico - Químicas Por la naturaleza de sus propiedades físicas y químicas el Glifosato es un plaguicida perteneciente al grupo de los herbicidas de acción sistémica, por la vía del follaje. No es apto para tratamientos de control de malezas por la vía del sistema radicular. El Glifosato es una solución líquida, clara, viscosa y de color ambarino; normalmente tiene una concentraciones de iones H de 4,4 a 4,9 y una gravedad específica de 1,17. Prácticamente inoloro o con un ligero olor a amina; tiene un peso molecular de 56 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 169,08 y un punto de fusión de 200o C. En la siguiente tabla se indica algunos de sus propiedades. Tabla N° 2 Propiedades Fisicoquímicas COMPUESTO PURO (INGREDIENTE ACTIVO) SAL DE GLIFOSATOISOPROPILAMONIO Fórmula Molecular Peso Molecular C3 H8 N O5 P 169.1 g/mol Estado físico Sólido blanco C8 H17 N2 O5 P 22.2 g/mol Liquido viscoso color ambar ó amarilla Inodoro ó con ligero olor a amina 1,160 - 1.180 g/mol No aplica (estado (líquido) PROPIEDAD Olor Inodoro Densidad Punto de fusión 0.5 g/ml 184.5 °C Presión de vapor Punto de Ebullicion pH en solución al 1% Solubilidad en agua Otros solventes Estabilidad Coeficiente de Partición octanol/agua Constante de Ley de Henry Corrosividad 3 x 10 ^ (-7) mm Hg a 25 °C 1.84 x 10 ^ (-7) mm de Hg a 45°C Se descompone 2.5 12.000 ppm a 25°C Ninguno 32 días a 25 °C y pH = 5.7 ó 9 Se descompone 4,7 900.000 ppm a 25°C Sólo soluble en agua 32 días a 25 °C y pH = 5.7 ó 9 Pow = -2.8 < 7 X 10 ^ (-11) No corrosivo N.D. N.D. No corrosivo Fuente: Documento Plan de Manejo Ambiental Erradicacion de Cultivos Ilícitos. 2000 2.16.7.4. Tipos de Formulaciones Comerciales El glifosato se comercializa en la forma de concentrados solubles de la sal isopropanolamina del N- (Fosfonometil) glicine, en los cuales se integran el Glifosato y los ingrediente inertes requeridos para cada tipo de formulación comercial. Aunque la forma de comercialización más común son los concentrados solubles en agua, también es posible tener acceso a las siguientes preparaciones para uso específicos: 57 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Ingrediente de grado químicamente puro (Para uso de laboratorio) Ingrediente de grado técnico. Concentrados emulsionables y concentrados en emulsiones invertidas Concentrados solubles en agua, de diferente concentración Polvos mojables, solubles en agua y para espolvoreo y Formulaciones fumigantes Formulaciones granulares y Formulaciones encapsuladas 2.16.7.5. Surfactantes En la formulación de un herbicida se presentas tres componentes básicos, la sustancia o ingrediente activo; el disolvente o vehículo, que generalmente carece de efecto fitotóxico; y el coadyuvante o surfactante. Este último es inerte y por tanto carece de acción pesticida, lo que no quiere decir que se descarte su potencial toxicológico. Este tiene como objeto incrementar la actividad del ingrediente activo y el control del efecto deriva, al reducir la ruptura de la mezcla en gotas tan pequeñas que pueden ser arrastradas del área de aplicación Ingrediente activo: Glifosato, N-(Fosfonometil) glicina, en sal isopropilamina, 41,0% Inertes (Seboaminas etoxiladas)* 59,0 % Algunas de las formulaciones comerciales del Glifosato incorporaban un surfactante conocido como POEA, en una proporción cercana al 15 %. Este compuesto, según varias investigaciones toxicológicas, puede ser causa de daños gastrointestinales, ciertas afecciones al sistema nervioso central, algunos problemas respiratorios y ser capaz de destruir los glóbulos rojos en la sangre humana. Del POEA se dice, también, que puede contener una impureza identificada como 14 Dioxano la cual, se menciona igualmente, que ha demostrado tener capacidad cancerígena para animales y de causar daño en el hígado y los riñones de los humanos. 58 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna A continuación podemos ver algunas de los nombres comerciales usados en nuestro país para la distribución del glifosato y sus respectivas concentraciónes: Tabla N° 3 Presentaciones comerciales del Glifosato NOMBRE COMERCIAL Faena 320 Faena 320 SL Fuete SL Ranger SL Rocket SG Rocky SL Roundup madurante SL Roundup SG Roundup SL (Sal) Glifosato 48 SL Clinofox Glifosol SL Glyfosan SL Glyphogan 480 SL Candela 120 SL Candela XL Coloso SL Panzer 320 SL Panzer 480 SL Regio SL FIRMAS PRODUCTORAS Proficol SA Monsanto Colombia Monsanto Colombia Monsanto Colombia Monsanto Colombia Monsanto Colombia Monsanto Colombia Monsanto Colombia Monsanto Colombia Coagro Ltda Cedar Crystal Chemical Colijap Ind. Agroquímica Quimicos e Insumos Agrícolas Magan de Colombia Agroser SA Agroser SA Basf Química Colombiana Invequímica SA Invequímica SA Quimor SA CONCENTRACIÓN 320 g/L 320 g/L 480 g/L 240 g/L 74-75% 120 g/L 480 g/L 74-75% 480 g/L 48% 480 g/L 480 g/L 480 g/L 480 g/L 120 g/L 120 g/L 480 g/L 320 g/L 480 g/L 480 g/L REGISTRO ICA 1800 1775 2475 2312 1993 1757 2670 2488 756 2699 2490 2337 2234 2530 2233 2800 2609 2569 2399 2211 Fuente: Documento Plan de Manejo Ambiental Erradicación de Cultivos Ilícitos. 2000. 2.16.7.6. Propiedades, toxicidad y ecotoxicidad Glifosato es un herbicida simple, no selectivo, de amplio espectro (toda planta que reciba por lo menos un 20% de éste es controlada), de naturaleza post-emergente (post - nacimiento), con actividad sistémica en las plantas. 59 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna El producto comercial es una formulación concentrada de la sal Isopropilamina de glifosato, a concentraciones variables, con agua como solvente, y adicionado de una sustancia tensoactiva que permite su dispersión uniforme tanto en la mezcla para aplicación, como sobre el follaje de las plantas a las cuales se aplica. Nombre Químico: N - (Fosfonometil) glicina (I.U.P.A.C. y C.A.) Nombre Común: Glifosato (E-ISO, F-ISO, ) Grupo Químico: N-fosfonoaminoácido Formula estructural: Compuesto Puro (Ingrediente activo) OO OH - C - CH2 - NH - CH2 – P - OH OH Sal de Glifosato-Isopropilamonio O CH3 OH - C - CH2 - NH - CH2 - P O- O H3N+ . CH OH CH3 2.16.7.7 CONDICIONES PARTICULARES MEZCLA DE ROUNDUP La mezcla de aspersión sobre cultivos de coca y amapola se compone de glifosato utilizado bajo la presentación comercial Roundup Ultra constituyendo el 44% de la mezcla en proporción volumen/volumen lo que determina una concentración de 180 g de Glifosato como principio activo por litro de la mezcla. Además se agrega el surfactante no-iónico 60 denominado Cosmoflux 411F, cuyo uso se realiza DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna únicamente en Colombia, al 1%, y el 55% restante de la mezcla está constituido por agua. La tasa de aspersión de la mezcla sobre los cultivos para el Roundup Ultra es de 17.6 a 30.8% L/ha. Los parámetros de uso de la mezcla citados anteriormente se contraponen a los establecidos por los fabricantes de estos agroquímicos quienes recomiendan una concentración de 1.6% a 7.7% de Roundup Ultra en la mezcla y una tasa de aspersión de 2.8 L/ha. En investigaciones conducidas en Australia, la formulación Roundup ha demostrado una seria toxicidad a anfibios. En un estudio comisionado en 1995 por el Western Australian Department of Environmental Protection (DEP) y dirigido por el Dr. Joseph Bidwell del Curtin Exotoxicology Program concluyó que Roundup 360 (otra formulación de Roundup que contiene glifosato y surfactantes) puede ser agudamente tóxico a ranas adultas y renacuajos en las tasas de aplicación recomendadas (1.8 to 5.4kg/ha). Roundup 360 fue más tóxico a ranas y renacuajos que el grado técnico de glifosato solo. Fue asumido que el surfactante de Roundup, y no glifosato en sí, hubo causado el incremento en toxicidad. Hay que notar que es precisamente el mismo surfactante (POEA) que se encuentra en el Roundup utilizado en Colombia22. La toxicidad de formulaciones de glifosato a biotas acuáticas está muy bien establecida, y éste es el tema más importante para Ecuador pues muchos ríos de origen colombiano fluyen al sur, entrando en territorio ecuatoriano. En la ausencia de investigación científica sobre, entre otras cosas, las concentraciones y los efectos de las formulaciones de glifosato en tanta variedad de ecosistemas. ___________________ 22. BINLFA. Report on issues relate on the aerial eradication of illicit coca in Colombia. Released by the Bureau for International Narcotics and Law Enforcement Affairs. 2002 61 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.16.7.8. Características de acción de la mezcla El glifosato es el único herbicida comercializado que afecta la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos. Se trata de uno de los herbicidas más móviles por el floema y es especialmente efectivo contra las malezas perennes, al acumularse en el tejido de los tallos, raíces y órganos de almacenamiento. Como resultado, la división celular y el crecimiento se detienen, en una semana o menos posteriormente entrar en un proceso de necrosis. Este herbicida penetra el follaje con relativa lentitud y requiere normalmente un periodo de seis horas sin lluvia después de su aplicación para asegurar un efecto fitotóxico óptimo. Estos síntomas son más fuertes y se presentan primero en el ápice y en las zonas meristemáticas23 para luego extenderse por las partes más antiguas de la planta. La absorción del herbicida depende muchas veces de factores ambientales como la lluvia, el viento y la temperatura, pues después de la fumigación el agente químico puede evaporarse y perderse en la atmosfera, permanecer en la superficie de la cutícula o penetrar a través d la cutícula o de los estomas24. 2.16.7.9. Impacto en el agua El Glifosato es altamente soluble en agua, con una solubilidad de 12 gramos/litro a 25°C, pero se caracteriza por tener menor persistencia en el agua que en los suelos, seguramente por la adsorción a partículas en suspensión, a sedimentos y a la ______________________ 23 Son tejidos embrionarios que se multiplican activamente para formar los tejidos adultos diferenciados y a su vez originan nuevas células meristemáticas. Los meristemas permiten que se produzca el crecimiento de las plantas en sentido longitudinal y diametral. 24 Manejo de malezas para países en Desarrollo. Estudio FAO Producción y Protección Vegetal. Pag 120.1996 62 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna descomposición microbiana. Dos estudios canadienses encontraron persistencia del Glifosato en el sedimento 400 días después de su aplicación.25 Igualmente por el efecto de deriva, el Glifosato asperjado puede caer en cuerpos de agua aportando fósforo (el Glifosato es un organofosforado), y por tanto, produciendo un problema de eutroficación perjudicial para flora y fauna. Esta incidencia es corroborada por los análisis efectuados sobre los cultivos ubicados en el cordón fronterizo de Colombia y Ecuador en donde se sugiere que la concentración de fosforo en las plantas estaba incrementada en un 300% y constituía la causa de la mortalidad de las plantas a tres (3) Kilómetros de la frontera; de tal forma, era evidente el efecto deriva de las fumigaciones aéreas26. El Decreto 1843 de 1991 en el artículo 35 determina que se deberá establecer una franja de seguridad minima de 100 metros para aplicación aérea de plaguicidas, distante de ríos, carreteras, personas, animales y/o cultivos susceptibles de daño por contaminación. 2.16.7.10 Impacto en el suelo Aunque el glifosato no es aplicado directamente al suelo, una cantidad significativa puede alcanzar la superficie del mismo (Haney et al., 2002). La cantidad de glifosato disponible en el suelo depende de varios factores. ___________________ 25 26 Cox, op. Cit. MALDONADO, Adolfo. Impactos en la salud ecuatoriana. Fumigaciones fronterizas del Plan Colombia. 63 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2.17.7.10.1. Composición y pH: A mayor concentración de fosforo (P) en el suelo se reduce la capacidad de adsorción del glifosato a partículas del mismo y sus reacciones de adsorción son más débiles, lo que promueve una mayor movilidad en el glifosato. El aumento del pH del suelo incrementa la estabilidad del Al+3 y el Fe+2 y, de este modo, promueve el mantenimiento de concentraciones más altas de estos cationes. Ello conlleva a una mayor adsorción del glifosato a partículas del suelo. (Jonge et. Al., 2001). 2.16.7.10.2. Actividad microbiana del suelo y temperatura: La tasa de degradación del glifosato ha sido correlacionada con la actividad microbiana de los suelos y esta a su vez está relacionada con la temperatura. El glifosato es descompuesto por microorganismos en el suelo, agua y sedimento a través de dos vías: en una de ellas se presenta el clivaje del enlace C-N, lo cual lleva a la formación de acido aminometilfosfónico (AMPA), el cual es posteriormente transformado en metilamina (Gardner & Grue, 1996); y una segunda vía en la cual ocurre el clivaje del enlace C-P formando sarcosina (N-metil-glicina), el cual es biodegradado a glicina, formando CO2 a través de la vía del formaldehido (WHO, 1994). 2.16.7.11. Impacto en la vegetación El glifosato, por ser herbicida de amplio espectro, tiene efectos tóxicos sobre la mayoría de especies de plantas y puede ser un riesgo para especies en peligro de extinción si se aplica en áreas donde ellas viven. De acuerdo con información de la EPA, más de 74 de estas especies en Estados Unidos pueden estar en riesgo por el uso del glifosato. Además, dosis subletales pueden incrementar la susceptibilidad de algunas plantas (manzana, cebada, soya, tomate) a enfermedades causadas por hongos. 64 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Puede también inhibir hongos benéficos que ayudan a las plantas a absorber nutrientes y agua. En dosis subletales puede interferir con algunos procesos metabólicos en plantas; en frijol, inhibir la absorción de potasio y sodio, y en espárragos y lino, reducirse la producción de lignina. 65 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 3. MARCO LEGAL Para la protección de los derechos colectivos y del ambiente, la fumigación de cultivos de uso ilícito y el manejo de herbicidas en nuestro país, la reglamentación aplicada se resume a continuación. Cuadro N° 2 Legislación NORMA LEY 812 de 2003, Articulo 8, Literal A numeral 2 de la Ley 812 de 2003 Ley 99 de 1993 LEY 30 DE 1986, Articulo 91, literal g) de la Ley 30 de 1986 Decreto 2159 de 1992, Articulo 5 Decreto 1843 de 1991, Artículos 82 – 101 66 DESCRIPCION Por el cual se implementa la política de lucha contra el problema de las drogas ilícitas y el crimen organizado estará orientada hacia la desarticulación del proceso de producción, comercialización y consumo de drogas. Por el cual el Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, en ejercicio de las funciones de evaluación, control y seguimiento asignadas en la Ley, adelanta de Manera periódica visitas de control y seguimiento a las actividades del Programa y verifica el cumplimiento de las medidas establecidas en el Plan de Manejo Ambiental. Relacionada con la destrucción de los cultivos de marihuana, coca y demás plantaciones de las cuales se puedan extraer sustancias que produzcan dependencia, y teniendo en cuenta consideraciones de índole social, económica, legal, de salud, ambiental y orden público. Establece las funciones de la Dirección Nacional de Estupefacientes. Uso y manejo de plaguicidas para actividades agrícolas, indican los requisitos y condiciones técnico sanitarias para desarrollar actividades Inherentes a la aplicación de plaguicidas por vía aérea. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna RESOLUCIÓN 008 de Marzo 2 de 2007 del Consejo Nacional de Estupefacientes RESOLUCIÓN 0015 del 05 de agosto de 2005 del Consejo Nacional de Estupefacientes RESOLUCION 1054 del 30 de septiembre de 2003 Ministerio de Ambiente, vivienda y desarrollo Territorial. RESOLUCIÓN 031 de Septiembre 26 de 2003 del Consejo Nacional de Estupefacientes RESOLUCIÓN 013 de Junio 27 de 2003 del Consejo Nacional de Estupefacientes RESOLUCION 1065 de noviembre de 2001 Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial RESOLUCIÓN 005 de Agosto de 2000 del Consejo Nacional de Estupefacientes 67 Por la cual se modifica la Resolución número 0017 del 04 de octubre de 2001 que establece un procedimiento para la atención de quejas derivadas de los presuntos daños causados por la aspersión aérea con el herbicida glifosato, dentro del marco del Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos. Por el cual se autoriza al Presidente del Consejo Nacional de Estupefacientes, para decidir sobre la aspersión aérea con el herbicida Glifosato en Parques Nacionales Naturales, siempre y cuando se realice una evaluación previa para cada parque en particular. Por la cual se modifica un Plan de Manejo Ambiental y se toman otras determinaciones. En donde el MAVDT., en uso de sus facultades legales especialmente las conferidas en la Ley 99 de 1993, el Decreto 1753 de 1994, el Decreto 1180 de 2003. Bajo el precepto que en Colombia se desarrolla el “Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos mediante aspersión aérea con Glifosato”. (PECIG). Por la cual se modifica el artículo 5° de la Resolución número 0013 del 27 de junio de 2003 mediante la cual se adopta un nuevo procedimiento para el Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos”. Por la cual se revocan las Resoluciones números 0001 del 11 de febrero de 1994 y 0005 del 11 de agosto de 2000 y se adopta un nuevo procedimiento para el Programa de Erradicación de Cultivos Ilícitos. . Referente a la erradicación de cultivos ilícitos mediante aspersión aérea con el herbicida glifosato cuenta con un Plan de Manejo Ambiental. Modifica y amplia la resolución 001/94, establece procedimientos para la erradicación, define la auditoria técnica y determina la creación del Comité Técnico DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Interinstitucional, como órgano asesor para el desarrollo del Programa de Erradicación de Cultivos. Por la cual se adopta el Manual Técnico en Materia de Aplicación de Insumos Agrícolas. Resolución 1068 de 1996 RESOLUCIÓN 001 de Febrero de 1994 del Consejo Nacional de Estupefacientes Sentencia del 19 de octubre de 2004 del Consejo de Estado Mediante la cual se resolvió extender y precisar las autorizaciones concedidas para la destrucción y erradicación de cultivos ilícitos en el país, a través de los medios idóneos prescritos para tal fin. Mediante el cual se amparó la fumigación de cultivos ilícitos, señalando …”De las pruebas reseñadas no se infiere, con certeza, que el glifosato empleado para la erradicación de cultivos ilícitos produzca daños irreversibles en el medio ambiente; por el contrario, hay elementos de juicio que permiten concluir que la regeneración de las zonas asperjadas se produce en lapso no muy largo y que, en cambio, numerosas hectáreas de bosques son destruidas por causa de la tala de estos cultivadores ilícitos”. Fuente: Elaboración propia. 68 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4. METODOLOGIA En este capítulo se mencionan los diferentes procedimientos desarrollados en la elaboración del proyecto, la metodología a seguir para la elaboración de bioensayos de toxicidad con Daphnia Magna durante toda la investigación se desarrollará en cinco fases y se explica en el diagrama N° 1. 4.1. APRENDIZAJE SOBRE LA MANIPULACION DE LA DAPHNIA magna 4.1.1. Diseño Experimental En el proceso de investigación se midieron y controlaron las siguientes variables: Variables independientes: Concentración del Herbicida buscando establecer el efecto sobre la Daphnia magna. Variables dependientes: Concentración letal media (CL50-48) del herbicida en un tiempo de 48 horas de exposición por el ciclo de vida del organismo prueba puesto que el resultado depende de los efectos que los tóxicos ocasiona a los organismos prueba. Constantes: Número de organismos utilizados (20 neonatos de Daphnia magna por cada concentración) tiempo de duración de los ensayos (48 horas) y los parámetros fisicoquímicos requeridos durante el mantenimiento de los organismos y durante las pruebas toxicológicas (pH, dureza, temperatura y oxigeno disuelto). 4.1.2. Materiales y equipos de laboratorio Para desarrollar cada una de las fases del proyecto, fue necesario contar con cada uno de las materiales y equipos de laboratorio mencionados en el cuadro N°3. 69 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Cuadro Nº 3 Materiales y Equipos de laboratorio Materiales de laboratorio 16 peceras de 3 L de capacidad. 1 acuario de 30 L de capacidad. Balón aforado de 100 , 250ml 500 y 1000mL Beaker de 2000 mL Pipetas graduadas y volumétricas de 1, 5 y 10 mL, Pipeta Pasteur plásticas de 10mL Pipetas Pasteur de vidrio Micropipeteadores 10-100 μ L y 100-1000 μL Probeta de 500 y 2000 mL Lámpara luminiscente. Pipeteadores Papel aluminio. Papel Kraff Garrafón de veinte litros. Manguera delgada para aireadores Difusores Vidrio reloj Espátula Papel Parafilm. Tubos de ensayo Copas blancas de 1 onz Plástico transparente Estantería Equipos de laboratorio Microscopio trinocular CME Leica Balanza analítica. Aireador Refrigerador (4± 2 °C). Autoclave o equivalente Medidor de oxígeno disuelto pHmetro Tituladores para dureza y alcalinidad. Termómetro. Centrífuga. Temporizador Fuente: Elaboración propia 4.1.3. Adaptación al medio Antes de comenzar el trabajo experimental, fue necesario proporcionar a la Daphnia magna condiciones ambientales similares a las que estaban expuestas en su anterior hábitat, controlando los parámetros respectivos para el funcionamiento óptimo de los organismos, como se explican en la tabla N°. 4. Los organismos fueron conservados en el laboratorio en peceras de vidrio con un volumen de dos litros de agua reconstituida, estos brindan las características necesarias para cumplir con algunos de los parámetros como el fotoperiodo y la 70 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna temperatura, dentro de cada uno de los recipientes se adicionan 20 individuos, esto debido a la relación 1/100 (1 individuo por cada 100 ml de agua reconstituida) Tabla N°. 4: Parámetros de control. PARÁMETROS DAPHNIA MAGNA Fotoperiodo 16h luz / 8 h oscuridad Temperatura 20+/- 2°C Luz 600 – 1000 Lux pH 7.5 – 8.0 Oxigeno Disuelto > 6 mg/L O2 Dureza 160- 180 mg/L (CaCO3 /L) Alimentación 4.5 x 106 u. algas /individuo /día Densidad de población 1 daphnia /100 ml Longevidad 30 – 65 días Maduración sexual 10 +/- 2 días Fuente: Elaboración propia 4.2 ESTANDARIZACION DE OBTENCION DE LA CL 50-48 PRUEBAS DE TOXICIDAD PARA LA 4.2.1 Preparación del agua dura y medio Bristol. 4.2.1.1. Agua dura Para mantener condiciones optimas del cultivo de los organismos prueba en el laboratorio, se preparó agua de 160 a 180 mg de CaCO3 / litro según metodología CETESB, protocolo (LBM 05.017) y se realizaron las pruebas de toxicidad bajo condiciones de laboratorio, incorporando a la investigación características del medio controladas, para regular el cultivo sin que este presentara alteraciones. El agua se preparo con los siguientes reactivos y materiales: 71 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Cloruro de Calcio (CaCl2) Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 . 7 H2O) Cloruro de potasio (KCl) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Acuario de 30 Litros Probeta de 500 ml. Aireadores de 1 salida Plástico para cubrir acuario pH-metro Oximetro En la tabla Nº 5 se menciona la composición del agua del cultivo y la cantidad de reactivo a diluir según el volumen de la pecera a utilizar (20 ó 30 Litros) Tabla N° 5. Composición del agua de cultivo y dilución. Reactivos Cloruro de Calcio (CaCl2) Gramos/Litro 13.5 ml /20L 300 ml /30 L 450 36.5 84 125 10 10 150 400 225 600 Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 . 7 H2O) Cloruro de potasio (KCl) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Fuente: Escobar Malaver Pedro Miguel. Determinación de la toxicidad aguda de los detergentes mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia magna. Universidad de la Salle Las soluciones preparadas se deben mantener refrigeradas (4 +/- 2°C) y pueden almacenarse por un periodo de hasta 6 meses. PROCEDIMIENTO 1. Se agregó agua destilada al acuario por debajo de los 30 Litros a preparar. 72 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2. Con ayuda de una probeta de 500ml se adicionaron los volúmenes correspondientes a cada reactivo como se indica en la tabla N° 5. 3. Para la completa dilución de los reactivos se adiciona agua destilada hasta completar el volumen de 30 Litros en el acuario. 4. Se colocó 1 aireador de una salida para aumentar el oxigeno disuelto en la pecera (por un periodo mayor a 24 horas) y se tapo la pecera con un plástico, como se observa en la figura N°4 Figura N°4. Agua reconstituida Fuente: Elaboración propia 5. Se midieron los siguientes parámetros fisicoquímicos: temperatura, pH, oxigeno disuelto, dureza; siempre en un período mayor a 24 horas. Según Tabla N° 6. 6. En caso de realizar la lectura y que la dureza sea mayor a 180 mg de Ca CO3 / litro se puede agregar agua destilada, si por lo contrario es menor se le agregaba Sulfato de magnesio heptahidratado. 7. Antes de usar el agua reconstituida se comprobó que los para metros fisicoquímicos eran óptimos para el desarrollo de la Daphnia magna, esto se hizo mediante un test de viabilidad que consistió en llevar 5 neonatos en una copa con agua reconstituida y dejarlos allí durante 24 horas, después de las cuales se realizaba un conteo de organismos que debería tener más del 90% de neonatos vivos para que el agua preparada fuera apta de lo contrario se debía preparar 73 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna nuevamente. Esta prueba fue realizada cada vez que se preparo agua reconstituida. Tabla Nº 6 Parámetros de agua reconstituida METODO 2340 C Titulométrico EDTA 4500 – H B Electrodo de membrana. 4500 – 0 G. Electrométrico 2550 B Laboratorio y de campo PARAMETRO DE CONTROL Dureza pH 160 – 180 mg/L CaCO3 7.5 – 8 O.D T°C >6 mg/L 18 – 22 RANGO Fuente: Escobar Malaver Pedro Miguel. Determinación de la toxicidad aguda de los detergentes mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia magna. Universidad de la Salle DIAGRAMA No. 2 Preparación del agua dura para 30L. PREPARACION AGUA DURA Agua destilada (proveniente del Laboratorio de Ing. Ambiental) Adicionar 20L en el Acuario. Adicionar reactivos según Tabla No. 5 Temperatura. Oxigeno Disuelto. pH. Dureza. Completar el volumen de la pecera a 30 L. con agua destilada. Medir parámetros fisicoquímicos. Realizar prueba de sensibilidad. 74 Aireación constante. Leer la prueba 24 horas después y corroborar un 90% de organismos vivos Fuente: Elaboración propia Agregar 5 neonatos en 50 ml del agua dura preparada. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4.2.1.2 Preparación del medio Bristol y cultivo de algas verdes El medio Bristol según la metodología Dutka (1989) se realiza con el fin de multiplicar las algas verdes, en condiciones de laboratorio por medio de la fotosíntesis, con ayuda de una lámpara luminiscente y nutrientes para la reproducción de las mismas, las cuales después de un proceso están listas para la administración del alimento dependiendo la cantidad calculada con ayuda de la Cámara Neubauer. En la tabla Nº 7 se exponen las cantidades de compuestos para preparar el Medio Bristol. El alga utilizada en el laboratorio fue Scenedesmus acutus, suministrada por la facultad de microbiología de la Universidad Javeriana. Los materiales y equipos que se emplearon para la preparación del medio Bristol y para el cultivo de algas fueron: Recipiente de vidrio de 3.5 Litros Lámpara luminiscente Aireador de 1 entrada Beaker de 2000 ml Beaker de 500 ml Probeta de 10 ml Probeta de 2000 ml Pipeta graduada de 1 ml Pipeta graduada de 10 ml Pipeta Pasteur de vidrio Pipeteador 12 tubos de ensayo (preferiblemente plásticos) Centrifuga DINAC II Brand Agua destilada 75 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tabla Nº 7 Preparación de Medio Bristol No. COMPUESTO STOCK 1 2 3 4 5 6 NaNO3 CaCl2 .2H2O MgSO4.7H2O K2HPO4 NaCl KH2PO4 KOH EDTA FeSO4. 7H2O H2SO4 H3BO3 25.0 gr./l 2.5 gr./l 7.5 gr./l 7.5 gr./l 2.5 gr./l 17.5 gr./l 15.5 gr./ 500 ml 25.0 gr. / 500 ml 2.49 gr. / 500 ml 0.05 ml. / 500 ml 5.71 gr. / 500 ml 7 8 9 ml de Stock para 1 litro de agua destilada 10 10 10 10 10 10 1 1 1 SOLUCION DE ELEMENTOS TRAZA 10 11 12 13 14 15 ZnSO4. 7H2O MnCl2. 4H2O MoO3 CuSO4. 5H2O Co (NO3)2. 6H2O CoCl2. 6H2O 4.41 gr. / 500 ml 0.72 gr. / 500 ml 0.355 gr. / 500 ml 0.785 gr. / 500 ml 0.245 gr. / 500 ml 0.174 gr. / 500 ml 1 ml del stock combinado Fuente: Determinación de la toxicidad agua de los detergentes mediante sistemas estáticos, utilizando Daphnia Magna. Universidad de la Salle PROCEDIMIENTO: 1. Se tomaron 1500 ml de agua destilada en una probeta de 2000 ml y se adicionaron las diferentes alícuotas de macro y micro nutrientes. (Tabla No. 7) Figura No. 5 Reactivos para el medio Bristol. Fuente. Elaboración propia. 76 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2. Se adicionó en un Beaker de 2000 ml la cantidad especificada para cada uno de los reactivos, se completó con agua destilada hasta completar el volumen. 3. La solución preparada en el Beaker, se tapó con papel aluminio ó papel Kraft. 4. Se esterilizó el medio en autoclave por un periodo de 15 minutos a 121 °C y 15 libras de presión. Figura No. 6 Medio Bristol en autoclave Fuente. Elaboración propia. 5. Una vez esterilizado y enfriado el medio, se transfirió al recipiente de vidrio de 3.5L, y mediante una pipeta se adicionó una alícuota de 2ml de cultivo de algas verdes Scenedsmus Acutus concentrada. 6. El recipiente se cubrió con papel parafiilm e inmediatamente se procedió a oxigenar e iluminar con una lámpara luminiscente de 20 vatios de manera continua durante 12 a 15 días, hasta obtener el color verde oscuro. Figura N° 7. Figura No.7 Medio Bristol oxigenado e iluminado Fuente. Elaboración propia. 77 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 7. El medio Bristol ya verde se transfirió a un Beaker de 500 ml y de este a tubos de ensayo de 10 ml para centrifugar. Figura No. 8 Medio Bristol en tubos de ensayo. Fuente. Elaboración propia. 8. Se colocaron 12 tubos de ensayo durante quince minutos en la centrifuga “DINAC II Centrifuge (Brand)”, con una velocidad de 2000 a 2500 rpm, para concentrar el cultivo de las algas. Figura No. 9 Tubos de ensayo en centrifuga. Fuente. Elaboración propia. 9. Se retiró el sobrenadante y se extrajo el concentrado de las algas mediante una pipeta Pasteur. 78 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Figura No. 10 Extracción del concentrado de las algas Fuente. Elaboración propia. 10. El concentrado de algas se almacenó en un tubo falcom, se cubrió con papel parafilm y se rotulo registrando la fecha de extracción. Figura N° 11. Alimento concentrado Fuente: Elaboración propia 11. Con el fin de determinar la cantidad y frecuencia de alimentación del cultivo se realizó el conteo de algas por medio de la cámara Neubauer con un microscopio. Figura No. 12 Conteo de algas. Fuente. Elaboración propia. 79 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna DIAGRAMA No. 3 Preparación del medio Bristol. Adicionar cantidad de reactivos según Tabla No. 7 a Beaker de 2000 ml. Completar con Agua destilada a volumen del Beaker. Esterilizar en autoclave, durante 15 minutos a 121 °C y 15 libras de presión. Trasvasar a recipiente de vidrio, adicionar 2 ml de alga concentrada. Tapar, oxigenar e iluminar, máximo 15días Trasvasar a Tubos de ensayo Llevar a centrifuga DINAC II durante 15 minutos a 2000-2500 ppm Extraer concentrado con pipeta Pasteur. Conteo de algas. Fuente: Elaboración propia 80 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4.2.1.3 Conteo de algas scenedesmus acutus Para el conteo de algas se utiliza la Cámara Neubauer con una capacidad de 1 x 10-4 ml. Usada para realizar el conteo de glóbulos, en una cantidad fija de líquido. PROCEDIMIENTO 1. Para realizar el conteo, el primer paso fue agitar la solución de algas verdes concentradas que teníamos en el tubo Falcom Figura N° 11, hasta observar una coloración homogénea. 2. Se tomo una alícuota de 0.1 ml del concentrado de algas más 2.9 ml de agua destilada en un tubo de ensayo para tener una dilución de 3 ml. Se limpio la cámara Neubauer con papel de arroz. 3. Se coloco el cubreobjetos sobre los canales de la cámara y con ayuda de una micropipeta Brand o pipeta Pasteur se toma una alícuota de 0.1 ml de esta dilución y se coloca en el borde de este. Se dejo ingresar la dilución a l cámara por capilaridad en un tiempo de 2 minutos sin que pase a los canales laterales; no se puede dejar burbujas dentro de la cámara. 4. Se coloco la cámara de Neubauer en la platina del microscopio trinocular y se enfoco el objetivo 40X zoom. 5. Se localizo el cuadro central de la rejilla, el cual está dividido en 25 cuadros, teniendo cada uno un área de 0.04 mm2. 81 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Lectura en la Cámara de Neubauer 1 2 5 Figura Nº 6 4 3 Fuente: LB03 Conteo de algas con la Camara Neubauer Laboratorio Bioensayos UNISALLE 6. El número de células contadas en cada cuadro en forma diagonal se multiplico por 4 o 5 dependiendo de la cuadricula. Luego se sumaron los valores obtenidos y se calculo el promedio. 7. Se determino la cantidad de células que existen en un 1 ml, partiendo del hecho que la cámara tiene una capacidad de 1 x 10 -4 ml, de la siguiente manera: XCelulas 1 10 4 ml No.celulas 1ml 8. Este valor se multiplico posteriormente por el factor de dilución, dado así el valor real de células que existía en 1 ml. 9. Se calculo el volumen de alimento necesario para cada pecera que contenía 20 organismos Daphnia magna con la siguiente fórmula: V A B C Donde: V = Volumen del concentrado de algas A = Número de Daphnia magna por acuario. B = Dosis óptima recomendada (4.5 x 10 6 células por Daphnia 82 magna /día). DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna C = Concentración (número de células/ml) de la suspensión de algas descritas y halladas anteriormente. DIAGRAMA N° 4 METODOLOGIA CONTEO DE ALGAS CONTEO DE ALGAS Dilución de 3 ml descrito en paso 2 Cámara Neubauer Colocar 1 gota en la cámara mediante pipeta Pasteur. Ubicación de cuadricula en microscopio Lecturas diagonales (5) Limpieza con paño suave y agua destilada. Fuente: Elaboración propia. 83 Cálculos para cantidad de alimento DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4.2.2 Cultivo y mantenimiento de Daphnia magna La Daphnia magna es un cladócero internacional que es usado por diferentes universidades en nuestro país para realizar ensayos de toxicidad, dentro de estas universidades están: la Universidad Nacional, Javeriana y la Salle, además también ha sido usada por la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca (CAR). El laboratorio de microbiología de la Universidad Javeriana fue el donador de neonatos para poder iniciar el cultivo al igual que el alga de Scenedesmus acutus para su reproducción. El mantenimiento del cultivo de los organismos Daphnia magna se realizó según la metodología CETESB (L5.018) para realizar el mantenimiento y conservar un cultivo masivo de 4 edades, manteniendo así, la posibilidad de usar neonatos del primer al cuarto parto, donde su reproductividad es más alta. Además, se tuvo en cuenta que no existieran alteraciones que pudieran producir bajas en la reproducción de los organismos, entre ellas: Presencia de efipios (machos). Presencia de caparazones. Residuos que entraran en contacto con la Daphnia magna y pudieran causar efectos de mortalidad en el cultivo. Falta de oxigeno o alimentación en el cultivo. Sedimentación de alga concentrada o alimento. 84 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Para el mantenimiento y limpieza del cultivo de los organismos prueba bajo condiciones de laboratorio se utilizaron los siguientes materiales: 16 peceras. Bandeja blanca para el conteo y separación del microorganismo. Mallas filtro. Pipetas de 3 ml. Recipientes plásticos de 250 y 120 ml aproximadamente. Lavadores con agua destilada. Agua dura. Agua caliente de la llave. Toallitas absorbentes. Esponja para lavado de peceras. 4.2.2.1. Mantenimiento. El cultivo de Daphnia magna se realizó en peceras con 2 litros de agua dura para el óptimo crecimiento de los individuos. Según metodología (EPA 1994). En cada una de ellas se mantuvo 20 individuos, manejando la relación de 1/100 (1 individuo por cada 100ml de agua reconstituida), con una dureza total que pudo variar entre 160-180mg CaCO3 para su desarrollo. (Se debe tener en cuenta los parámetros de control establecidos en el protocolo LBM-M01). Cada pecera permaneció tapada, para ello se utilizó un plástico transparente evitando el polvo, sustancias químicas y vapores que afectaran la calidad del agua y alteraran el cultivo, o que permitieran el paso de luz. La iluminación es un factor que se tuvo en cuenta para llevar a cabo la cría de este crustáceo, Se debe manejar foto - periodo 16h de luz / 8h de oscuridad y una intensidad lumínica de alrededor de 800 lux. 85 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Fue necesario renovar el cultivo de la Daphnia magna, y mantenerlo en peceras separados por edad desde 0 – 1 semana hasta cuatro semanas; eliminando los organismos mayores a cinco semanas y renovando el cultivo con neonatos que se obtuvieron ese día. (CETESB /L5.018, 1992). Figura N°13. Cultivo y mantenimiento Fuente: Elaboración propia Dentro del mantenimiento general del cultivo se manejó: 4.2.2.2. Limpieza. La limpieza de las peceras se realizó los días lunes, miércoles y viernes, para retirar los caparazones de la D. magna y restos de comida encontrados en el fondo, claro está que a veces fue necesario realizar esta limpieza diariamente. Se evitó el uso de cualquier jabón o desinfectante. Los neonatos y las Daphnia magna madres se separaban en recipientes plásticos y se llevó un registro del conteo diario de los organismos. El conteo de las madres se realizó para corroborar la cantidad de individuos presentes en las peceras. Luego mediante 2 coladores se filtraba el agua depositada en las vasijas blancas, tratando de mantener los 2 L de agua dura. Cada 8 días se renovaba la mitad del agua dura, (antes de esto se realizaba la prueba de viabilidad). Figuras 14 y 15. 86 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna De igual forma, los días de limpieza se alimentaban los organismos, teniendo en cuenta el número de algas contabilizado en la cámara de Neubauer. Figura No. 14 Limpieza Figura No. 15 Filtración Fuente: Elaboración propia Fuente: Elaboración propia 4.2.3 Selección de neonatos para los ensayos. Diariamente fueron separados los neonatos para realizar los ensayos de toxicidad, estos generalmente se hacían los días martes, miércoles, jueves y sábados según la demanda que existía y teniendo en cuenta que la prueba se leía a las 48 horas. Los días viernes los neonatos se usaban para iniciar un nuevo cultivo. Figura N°16. Selección de neonatos Fuente: Elaboración propia 87 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna DIAGRAMA No. 5. Mantenimiento del cultivo de Daphnia magna. MANTENIMIENTO CULTIVO DAPHNIA magna MANTENIMIENTO LIMPIEZA SELECCIÓN DE NEONATOS 4 PECERAS (2L AGUA DURA) 20 ORGANISMOS LAVAR CON AGUA EXTRAER NEONATOS DESTILADA SEPARAR DAPHNIA magna MANTENER CONDICIONES DE CULTIVO: T: 20°C; 16h luz/8h oscuridad NUEVA SIEMBRE CADA 8 DIAS HASTA 4 SEMANAS REALIZAR PRUEBAS DE VIABILIDAD CADA 8 DIAS CAMBIO ½ AGUA DURA RECONTITUIDA REALIZAR PRUEBAS 4.2.4. Determinación DE SENSIBILIDAD Fuente: Elaboración propia. 88 REALIZAR SIEMBRA CONDICIONES DE MANTENIMIENTO INICIAL DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4.2.4. Determinación de la sensibilidad de los organismos con Dicromato de Potasio Los ensayos de toxicidad aguda empleando Daphnia magna, se llevaron a cabo teniendo como guía los protocolos de la universidad de la Salle con Daphnia pulex suministrados por el Ingeniero Pedro Miguel Escobar. Los resultados son empleados para determinar la CL50 en un periodo de exposición de 48 horas en condiciones controladas de laboratorio. Previo a la realización de los ensayos, se evaluó la sensibilidad de los organismos empleando dicromato de potasio (K2Cr2O7) como sustancia tóxica de referencia. Las condiciones generales de exposición se resumen en la Tabla Nº 8 Las diluciones para el dicromato se realizaron según la siguiente ecuación: V1 x C1 = V2 x C2 Estas diluciones fueron preparadas con agua reconstituida entre 160 a 180 mg/ L de CaCO3 y con una solución patrón preparada a 100 ppm, almacenadas y refrigeradas en frascos de vidrio de 500 ml. Sumado los resultados de estandarización se puede definir por medios estadísticos el rango de sensibilidad del organismo prueba (Daphnia magna) frente a determinado tóxico de referencia, a un tiempo de exposición y a la manifestación biológica empleada. 4.2.5. Condiciones necesarias durante la realización de un ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna Como se describe en la tabla N° 8, para la realización de un bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna, se tuvieron en cuenta algunas condiciones y factores que son necesarios para que los resultados de las pruebas no sean alterados: 89 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tabla Nº 8 Condiciones generales de exposiciones utilizadas en los bioensayos de toxicidad aguda. BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EMPLEANDO Daphnia magna Condiciones generales de exposición Temperatura 20 ± 0,5 ºC Agua de dilución Agua dura entre 160 y 180 mg CaCO3/l Unidad experimental Copas blancas Capacidad 1 onza Volumen de solución test 10 ml Edad de los organismos 6 - 24 horas Nº de organismos/copa 5 Nº de réplicas por concentración 4 Duración del test 48 horas Estimación de CL 50 Método Probit Fuente: Elaboración propia Por medio de los test preliminares se obtiene un rango de toxicidad el cual permite establecer unos intervalos mas simplificados de concentraciones del Dicromato de Potasio, para así poder llegar al resultado final esperado por medio de los test definitivos. Estos se realizan con al menos cinco concentraciones en progresión geométrica, las cuales permiten verificar un porcentaje de mortalidad entre 0 – 100%. El procedimiento utilizado para la determinación de la concentración letal media CL 50-48 con Dicromato de Potasio es el siguiente: Preparar la solución patrón de Dicromato de Potasio a 1000 ppm. Preparar cinco diluciones a partir de la solución patrón con las concentraciones establecidas para las pruebas a realizar. Separar los neonatos con un periodo de vida < 24 horas. Preparar la batería de ensayo como se describe en el numeral 4.2.6 de este documento. Agregar 10 ml de solución y el blanco control en cada una de las copas. Introducir cinco neonatos en cada una de las copas de concentración y el blanco de control. 90 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Incubar a condiciones establecidas, por un intervalo de 48 horas. Realizar la lectura de organismos muertos durante la prueba y consignar los datos. Calcular la concentración letal media por medio del método estadístico probit. (ver Anexo J) Pasar los datos por el método de análisis de varianza. (ver Anexo I) 4.2.6. Montaje para pruebas de sensibilidad y sustancias puras Por medio de los test preliminares se obtiene un rango de toxicidad, el cual permite establecer unos intervalos más simplificados de concentraciones, para así poder llegar al resultado final esperado por medio de los test definitivos. Estos se realizan con al menos cinco concentraciones en progresión geométrica, las cuales permiten verificar un porcentaje de mortalidad entre 0-100 %. PROCEDIMIENTO 1. Montar la batería (bandeja con 24 copas blancas de 1 onza), las cuales están distribuidas por las cinco (5) cinco concentraciones diferentes y un blanco (agua dura). Con cada batería se realiza una prueba de sensibilidad Herbicida. (Cada copa está marcada con la respectiva concentración). Figura No. 17 Organismos en recipiente Fuente: Elaboración propia 91 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2. Se adiciono 10 ml de los diferentes porcentajes de concentración con ayuda de una pipeta graduada en las copas, siendo preparadas cuatro (4) replicas por concentración, cada una, con su respectivo control (agua reconstituida dureza entre 160-180mg CaCO3). 3. Se llevo a cada copa 5 neonatos de 6 a 24 horas de nacidos con ayuda de una pipeta Pasteur de plástico, cada concentración necesita 20 organismos y en cada batería de ensayo se utilizan 120 organismos. Figura No. 18 Batería de prueba Fuente: Elaboración propia. 4. Se cubrió la batería con papel Kraff y con una bolsa negra preferiblemente de tela con el fin de ser aislada de la luz por 48 horas, para que la D. magna al tratar de encontrarla tuviera mayor contacto con el contaminante. Figura No. 19 y 20 Batería cubierta con papel Kraf y bolsa de tela. Fuente: Elaboración propia. 92 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 5. Al completar las 48 horas se descubrió la batería de ensayo y se realizo la lectura de los organismos muertos en cada copa. 6. Se hizo la medición de parámetros de control (pH, O.D.) después de cada prueba, tomando de manera aleatoria cualquier concentración, con el fin de demostrar que la manifestación de los organismos expuestos se debía al efecto de las sustancias puras o vertimientos y no a alteraciones de las características fisicoquímicas de las mismas. 7. Una vez realizadas cada una de las pruebas preliminares tanto para sensibilidad como para el herbicida; al obtener los rangos se prepararon las diluciones para las pruebas definitivas, repitiendo el procedimiento anterior. 4.2.7. Preparación de soluciones para pruebas preliminares y definitivas El Dicromato de Potasio es utilizado como tóxico de referencia, para establecer el grado de sensibilidad que presentan los organismos prueba. Se parte de una solución de 1000 ppm, esta se completó a un volumen de 1000 ml con agua desionizada por medio de la siguiente ecuación. 1 ppm = 1 mg/L 1000 ppm = 1 g K2Cr2O7 / 1L Después de preparada la solución patrón se determinan las diluciones tanto para las pruebas de sensibilidad como para las pruebas con el herbicida, estas diluciones son calculadas por medio de la ecuación de dilución [ ]1V1 = [ ]2V2: [ ]1 = Concentración de Solución madre V1 = Volumen a utilizar de la solución madre 93 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna [ ]2 = Concentración que deseo trabajar V2 = Volumen del Balón de aforo a utilizar Al despejar la ecuación queda: V1 = [ ]2 V2 / [ ]1 Las soluciones son preparadas para un volumen total de 250 ml, y completadas con agua dura reconstituida, se almacenan en recipientes de vidrio de 500 ml y se refrigeran a 4ºC. Figura N° 21. Soluciones para pruebas Fuente: elaboración propia 4.2.8. Preparación de soluciones para pruebas de toxicidad con el herbicida Como la presentación del herbicida era en polvo, se preparó la solución teniendo en cuenta la proporción 1g Herbicida /1000ml agua destilada, y se prepararon las diluciones como se explico anteriormente, teniendo en cuenta los rangos de concentraciones a utilizar tanto para las pruebas preliminares como para las definitivas. Inicialmente para las pruebas definitivas se tomaron rangos de concentraciones de 0.001, 0.01, 0.1, 1 y 10 ppm, partiendo de la solución patrón, posterior a estas se realizan otras pruebas preliminares tomando un rango amplio de 100, 200, 300, 400 y 500 ppm, el cual permita identificar dentro de que concentración probable estaría el rango de toxicidad para efectuar los test definitivos. El procedimiento a realizar es en esencia el mismo que se utiliza para las pruebas de sensibilidad. 94 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4.3. OBTENCIÓN Y CÁLCULO DE LA CL50-48 4.3.1. Clasificación de resultados significativos de las pruebas preliminares y definitivas Una vez finalizada cada prueba se analizo su confiabilidad, teniendo en cuenta que a medida que aumenta la concentración debe aumentar el porcentaje de mortalidad, si no es así, se descarta la prueba. La tabla Nº 9 es un ejemplo de una prueba que hay que descartar, mientras que la tabla Nº 10 se ajusta a condiciones óptimas de una prueba. El anexo D muestra el formato que se manejo en el desarrollo del proyecto, suministrado por la Universidad de la Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria. Tabla Nº 9 Prueba para descartar Blanco 0.3ppm No. de Organismos Muertos 1 2 3 4 0 0 0 0 0 0 5 1 0.8ppm 0 1 0 1 ppm 5 1 1.5ppm 2 2 ppm 4 Concentración Nominal Medidas Finales OD pH No. observadode muertes % No. Total de organismos Mortalidad Obtenido 0.0 0.3 0 30 0 0.05 5 1 5 0.6 60 3 2 3 0.50 50 1 3 0.50 55 3.85 7.65 3 3.90 7.60 Fuente: Elaboración propia Tabla Nº 10. Condiciones óptimas de una prueba Blanco 0.3ppm No. de Organismos Muertos 1 2 3 4 0 0 0 0 0 0 0 1 0.8ppm 0 1 0 1 ppm 0 1 1.5ppm 2 2 ppm 4 Concentración Nominal 95 Medidas Finales OD pH No. observadode muertes % No. Total de organismos Mortalidad Obtenido 0.0 0.05 0 5 0 0.05 5 1 0 0.1 10 3 2 3 0.50 50 1 3 0.50 55 3.83 7.66 3 3.95 7.63 Fuente: Elaboración propia DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4.3.2. Introducción de resultados en software Probit En el desarrollo del proyecto el análisis estadístico se realizó con el método paramétrico Probit, ya que se contó con el software que fue suministrado por la Corporación Autónoma Regional para mayor precisión del cálculo de la concentración letal media, y cuyo procedimiento se describe en el protocolo de bioensayos LB06, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria dándonos un margen de confiabilidad del 95%. El método probit nos muestra el límite superior e inferior, de igual forma la concentración letal media a 48 horas CL50-48 4.3.3. Validación de los resultados mediante el análisis de varianza (ANOVA) Los resultados del software fueron validados mediante el análisis de varianza (ANOVA) cuyo procedimiento se describe en el protocolo de bioensayos LB07 suministrados por la Universidad de la Salle, Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, con ayuda de sofware Excel. El análisis de varianza (ANOVA) nos permite comparar el F calculado suministrado por este, con el F teórico tomado de las tablas del libro Diseño y análisis de experimentos Douglas C. Montgomery, para finalmente formular una hipótesis nula y una hipótesis alternativa y llegar a una conclusión. 96 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4.4. COMPARACIÓN DE CL 50-48 PARA EL HERBICIDA OBTENIDO CON DIFERENTES ESPECIES EN PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN REALIZADOS EN LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE Para poder confrontar las respectivas concentraciones letales es necesario seguir los siguientes pasos: Recopilación de datos: para este es necesario disponer de la carta de control elaborada por cada uno de los investigadores, y extraer de estas las respectivas concentraciones letales medias calculadas. Comparación de datos: a través de una tabla se recopilaron las concentraciones letales medias tanto para Daphnia pulex, Daphnia magna, y peces. A partir de los resultados obtenidos se determinó la especie más sensible al herbicida en estudio, teniendo en cuenta el valor de la concentración letal media obtenida y sus características morfológicas. 4.5 ELABORACIÓN DEL DOCUMENTO FINAL Análisis de resultados: Se interpreto gráficamente las mediciones de dureza realizadas durante la ejecución del proyecto, ciclo de vida de la especie en estudio, concentración letal media CL 50-48 de la especie frente al dicromato de potasio y al herbicida en estudio. Se presenta como anexo J a este documento el protocolo para manejo, transporte, manipulación, y disposición de residuos de herbicidas generados en el desarrollo de investigaciones en la Universidad de la Salle. 97 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Diagrama N°1. Metodología propuesta METODOLOGÍA Aprendizaje sobre la manipulación de la D. magna Diseño experimenal Inducción por parte de grupo de investigador de bioensayos Estandarización de pruebas de toxicidad para la obtención de la CL50 Preparación del agua dura y medio Bristol Cultivo y mantenimiento de Daphnia magna Obtención y Cálculo de la CL50-48. Clasificación de resultados significativos de las pruebas preliminares y definitivas Introducción de resultados en el software Probit Comparación de Cl5048 para el Herbicida obtenidos con diferentes especies en la universidad de la salle Elaboración y entrega de documento final Recopilación de datos Comparar datos Selección neonatos para ensayos Determinación de la sensibilidad de los organismos con Dicromato de potasio Validación de resultados mediante el análisis de varianza Determinar la especie mas sensible al Herbicida Elaboración de protocolo para manejo, transporte, manipulación y disposición de desechos del herbicida Conclusiones y recomendaciones Preparación de soluciones para pruebas preliminares y definitivas Montaje de pruebas de toxicidad Fuente: Elaboración propia 98 Análisis de resultados DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS De acuerdo a los protocolos usados en la realización de los bioensayos, a continuación, se presentan los resultados obtenidos: 5.1. PREPARACION DEL AGUA DURA Para preparar el agua reconstituida se llevó un formato de control en el tiempo de ejecución del proyecto (anexo A), la cual se tuvo en cuenta para elaborar la gráfica Nº 1. Gráfica Nº 1 Rango de la dureza del agua Fuente: Elaboración propia En la gráfica Nº 1 se puede observar que el agua dura utilizada en el proyecto mantuvo un rango de 160 a 180 mg CaCO3, siendo esta apta para sus respectivos usos como lo fueron el mantenimiento del cultivo y preparación de soluciones para las pruebas. 99 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 5.2 CONTEO DE ALGAS scenedesmus acutus A continuación se muestra un ejemplo del conteo de las algas realizados en la ejecución del proyecto; en el anexo B están registrados el número de células /ml resultado de los conteos. Figura Nº 22 Lectura de algas en la cámara Neubauer Fuente: Elaboración propia 1 2 88 84 84 98 92 105 78 112 5 61 64 34 65 64 4 3 102 105 109 115 120 125 101 102 De las células contadas en cada cuadro en forma diagonal se multiplicó por 4 o 5 dependiendo de la cuadricula; se sumaron los valores obtenidos hallando promedio. lectura1 lectura2 lectura3 lectura4 lectura5 (88 4) (84 4) (105 4) (102 4) (61 5) lecturas 8120 X 1624células 100 (84 4) (92 4) (78 4) 1368 (98 4) (105 4) (112 4) 1596 (115 4) (125 4) (102 4) 1788 (109 4) (120 4) (101 4) 1728 (64 5) (34 5) (65 5) (64x5) 1640 su DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se determinó la cantidad de células que existen en un 1 ml, partiendo que la cámara tiene una capacidad de 1 x 10-4 ml, de la siguiente manera: 1624células 1 10 4 ml Nodecélulas = No.células 16.240106 1ml Este valor se multiplicó posteriormente por el factor de dilución, dado así el valor real de células que existe en 1 ml. El factor de dilución fue de 30 16.240 106 factordedilución 487.2 106 Se calculó el volumen de alimento que necesita cada pecera que contiene 20 Daphnia magna con la siguiente fórmula: V V A B C 20 (4.5 106 ) 487.72 106 0.184 ml dia Con base en los resultados obtenidos en el conteo de la cámara Neubauer y al Número de organismos por pecera el volumen de alimento es el que se presenta en la tabla Nº 11 Tabla Nº 11 Volumen de alimento según Nº de organismos Nº de Daphnia magna por pecera 20 18 15 12 Volumen de alimento (ml) 0.18 0.16 0.13 0.11 Fuente: Elaboración propia 101 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 5.3. CICLO DE VIDA DE LA DAPHNIA magna. Durante el desarrollo del proyecto se registro en una hoja de control (ANEXO C) la reproducción de la Daphnia magna, y se observo la época donde la especie tiene su mayor periodo de reproducción y la etapa donde su ciclo de reproducción finaliza. En la gráfica Nº 2 se observa el comportamiento del cultivo realizado el 8 de agosto del 2008 ejecutada en el proceso del proyecto (ANEXO C). Gráfica Nº 2 Comportamiento del cultivo Fuente: Elaboración propia Lo que se puede observar en la curva es el número total de neonatos en un tiempo determinado (días). Del primer día al noveno los neonatos alcanzan su edad adulta donde almacenan en su cámara de incubación los huevos de Daphnia magna hasta que las crías están totalmente formadas. 102 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna A partir del día décimo estas crías son expulsadas por las Daphnia magna periódicamente alcanzando un pico de 504 neonatos. En los días 17 y 18 hay un descenso de producción de neonatos hasta alcanzar los 203 individuos, recuperándose nuevamente desde el día 19 al día 22, alcanzando los 993 individuos, siendo esta la mejor cosecha de este cultivo. Desde el día 23 al 38 se observa un descenso variable llegando a 8 neonatos. Del día 39 al 43 se presenta una última producción significativa alcanzando un tope de 371 neonatos, donde luego se presenta un descenso variable hasta su mortalidad total. 5.4. PRUEBAS TOXICOLOGICAS 5.4.1. Pruebas con K2Cr2O7 5.4.1.1 Pruebas de Sensibilidad Las pruebas de sensibilidad, se realizaron con el fin de determinar si la especie es o no sensible a cualquier tóxico, en este caso y según los protocolos de bioensayos de la Universidad de la Salle, se maneja el dicromato de potasio (K2Cr2O7). Con este resultado se da inicio a las pruebas toxicológicas con el Herbicida. Prueba de sensibilidad preliminar con dicromato de potasio (K2Cr2O7) Para la prueba de sensibilidad preliminar fue necesario iniciar con los rangos establecidos en el protocolo LBM05, partiendo de estos rangos se establece un rango más pequeño para determinar la concentración exacta donde la mitad de los organismos expuestos viven en un término de 48 horas. La tabla Nº 12 muestra un ejemplo de las pruebas realizadas. 103 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TABLA N°.12 Prueba de sensibilidad preliminar con dicromato de potasio (K2Cr2O7) CONCENTRACION NOMINAL 1 0 0 0 0 3 5 Blanco 0.001 0.01 0.1 1 10 NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 5 5 % MORTALIDAD OBTENIDO 4 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 40 100 Fuente: Elaboración propia Se aprecia que el rango a trabajar está entre 0.1 y 10 ppm, debido a que en la concentración de 0.1 ppm muere el 0% y en 10 ppm muere el 100% de los organismos expuestos. 5.4.1.2. Prueba de sensibilidad definitiva con dicromato de potasio (K2Cr2O7) Después de realizadas las pruebas preliminares, se estableció que los organismos prueba morían en un rango de 0.1 ppm y de 10 ppm, dándose la necesidad de trabajar con rangos más cortos con el fin de hallar un valor exacto de la concentración letal media CL50-48 . La tabla Nº 13 nos muestra un ejemplo de las pruebas realizadas, para concentraciones de 0.3, 0.8, 1, 1.5 y 2 ppm, las cuales se efectuaron un total de quince (15) pruebas para obtener un resultado confiable. Los resultados de las pruebas realizadas se recopilaron en el ANEXO E Con las pruebas de sensibilidad se puede verificar las condiciones óptimas de los organismos, para posteriormente poder realizar las pruebas necesarias con el contaminante en estudio, asegurando un buen funcionamiento de los organismos. 104 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tabla N°. 13 Prueba de sensibilidad definitiva con dicromato de potasio (K2Cr2O7) CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 1 0 1 0.8 1 1 1 0 1 1.5 2 2 3 5 1 1 2 3 5 5 Fuente: Elaboración propia 1 4 5 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 10 15 25 60 100 En la anterior tabla se observa que para las concentraciones de 0.3, 0.8 y 1ppm existe un porcentaje de mortalidad de 10%, 15% y 25% respectivamente, en la concentración de 1.5ppm existe un porcentaje de mortalidad de 60% y en la concentración de 2ppm un porcentaje de mortalidad del 100%, con esto podemos concluir que el rango de sensibilidad de la especie en estudio se encuentra alrededor de 1.5 ppm. Para mayor confiablidad en los datos, este dato será comparado con el calculado por el método del probit. 5.4.1.3. Determinación de la Concentración Letal Media CL50-48 para la prueba de sensibilidad con dicromato de potasio (K2Cr2O7) para Daphnia magna. Por medio del programa estadístico probit se determino la concentración letal media en la prueba de sensibilidad trabajando con K2Cr2O7 donde nos muestra el límite superior y el límite inferior, con un límite de confianza de 95%. La tabla Nº 14 nos muestra los resultados definitivos obtenidos en este programa, donde podemos observar que los valores de la CL 50-48 para todas las pruebas están dentro de los límites calculados, y oscilan entre el mismo rango. 105 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tabla Nº 14 Carta de control de prueba de sensibilidad definitiva con Daphnia magna FECHA CL 50-48 Limite Inferior Limite Superior 10/04/2008 10/04/2008 10/04/2008 15/04/2008 15/04/2008 15/04/2008 17/04/2008 17/04/2008 17/04/2008 22/04/2008 22/04/2008 22/04/2080 29/04/2008 29/04/2008 29/04/2008 PROMEDIO 1,1867 1,0513 1,1092 1,2874 1,2548 1,1675 0,9249 0,671 1,1854 1,2453 1,1195 1,2149 0,9104 1,0535 1,0063 1,09254 0,8543 0,6201 0,9076 1,0992 0,9392 0,7019 0,7714 0,2982 0,8599 1,0818 0,9864 1,0376 0,7195 0,6575 0,8525 0,82581 1,7498 1,9266 1,365 1,5437 1,8443 2,7114 1,0722 0,9915 1,7275 1,4426 1,2536 1,4421 1,1171 1,7569 1,1757 1,54133 Fuente: Elaboración propia Realizadas quince (15) pruebas confiables y en rangos más reducidos se obtuvo una concentración Letal Media CL50-48 de 1.09254 mg K2Cr2O7 /L Daphnia magna muestra su sensibilidad donde la al K2Cr2O7, dentro de los siguientes limites calculados (límite superior: 1.54133 ppm, límite inferior: 0.8258) siendo esta una base para realizar bioensayos con diferentes tóxicos. Con estas pruebas se comprueba que la Daphnia magna es afectada por el tóxico y no por otros factores ó fallas operacionales en la aplicación del método, determinando el rango de variabilidad y sensibilidad frente al tiempo de exposición. 106 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna En la gráfica Nº 3, se presenta el comportamiento de las sensibilidades resultado de las pruebas, en donde se muestran los límites superior e inferior y el valor promedio. 107 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Gráfica Nº 3. Pruebas de Sensibilidad para Dicromato de potasio Fuente: Elaboración propia 108 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna La gráfica permite ver la dinámica que presenta la Daphnia magna como respuesta al dicromato de potasio (K2Cr2O7), mostrando una caída en la octava prueba realizada, esto pudo ocurrir por humedad debido a que el extractor de olores no estuvo encendido todo el tiempo, o por olores ofensivos que afectaron el cultivo. Al hacer una comparación entre los resultados de las pruebas preliminares y el obtenido por el método probit, se observa que el valor de sensibilidad se aproximo a una concentración de 1.5 ppm alcanzando un 60% como porcentaje de mortalidad y el obtenido por el método Probit de 1.092 ppm, indicando una cercana similitud. El valor de la concentración resultante de las pruebas preliminares de 1.5. ppm se encuentra dentro de los límites aceptables calculados por el método Probit de 0.82581 como límite inferior y 1.54133 como límite superior. Se comparó el valor de sensibilidad encontrado en la presente investigación con los encontrados en el desarrollo de actuales proyectos de investigación como se muestra en la Tabla N° 15 y con proyectos realizados en otros países como muestra la Tabla N° 16. Tabla N°. 15. Comparación de resultados de sensibilidad Año CL 50-48 (ppm) Referencia 2008 1.3723 ALVAREZ M. Y MONJE L. 2008 1.0540 SIERRA M. Y ZARATE A. 2008 1.0925 GAMEZ C. Y RAMIREZ J. Fuente: Elaboración propia 109 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tabla N° 16. Valores internacionales de la CL50-48 en Daphnia magna con dicromato de potasio. CL 50-48 País Autor / Entidad Documento (ppm) 1.2 EEUU 0.9 - 2 Honduras Toxicity determination of explosive contaminated soil leachates to Daphnia magna Haley, M.C. Checkai, R.T.; using adapted toxicity characteristics leaching C.W.; Wentsel. R.S. procedure. CESCCO (Centro de estudios y Estudios de efluentes control de contaminantes). industriales. Fuente: Elaboración propia. Se interpreta de la tabla anterior que los rangos obtenidos en el desarrollo de este documento están acordes a los datos entregados anteriormente en los ensayos hechos en el laboratorio de Bioensayos de la Universidad de la Salle y que además están dentro o cercanos a los datos internacionales, demostrando el buen estado del cultivo y garantizando la confiabilidad de los resultados entregados con el Glifosato Roundup 747. 5.4.1.4. Análisis de varianza para las pruebas de sensibilidad con dicromato de potasio (K2Cr2O7). En la tabla Nº 17 se presenta un ejemplo para realizar el análisis de varianza después de obtener la concentración letal media (CL50-48) en las pruebas definitivas de sensibilidad para validar los resultados obtenidos por el software Probit. En el anexo E se encuentra el ANOVA de las pruebas restantes. Concentración 110 Tabla Nº 17. Análisis de Varianza Número de réplicas total Promedio 1 2 0,5 1 0 3 0,75 1 1 1 5 1,25 2 3 4 12 3 R1 R2 R3 R4 0.3 0 1 0 0.8 1 1 1 2 1.5 3 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 42 10,5 Total Fuente: Elaboración propia TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 72 5 Promedio de cuadrados 14,4 Dentro de Grupos 4,5 18 0,25 Total 76,5 23 CL 50-48 LIMITE SUPERIOR LIMITE INFERIOR 6 4 24 F Calculado F Teórico 57,6 2.77 1.0513 ppm 0.6201 ppm 1.9266 ppm Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Se observa que en la prueba realizada el Fc > FT por lo tanto se rechaza la hipótesis nula (Ho), y se acepta la hipótesis alterna (H1), concluyendo que las diferentes concentraciones producen efectos distintos en los organismos prueba. 111 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 5.4.2. Prueba de toxicidad con el Herbicida Roundup 747 5.4.2.1 Prueba preliminar Fue necesario realizar varios ensayos a diferentes rangos de concentración iniciando con una variación entre 0.001 ppm a 10 ppm, donde el rango de mortalidad fue de 0%, luego se determinó ampliar notoriamente los rangos para poder encontrar con exactitud el rango a trabajar. Estos ensayos se realizaron con un rango entre 100 ppm a 500 ppm, donde en la tabla No. 18 se muestran los resultados obtenidos: Tabla N° 18. Prueba preliminar CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 100 3 4 4 5 200 5 5 5 5 300 5 5 5 5 400 5 5 5 5 500 5 5 5 5 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 80 100 100 100 100 Fuente: Elaboración propia Dado a estos resultados donde los porcentajes de mortalidad para las concentraciones de 200, 300, 400 y 500 ppm fue del 100 %, y para 100 ppm fue de 80%, se dio la necesidad de bajar las concentraciones a rangos menores a 100 ppm para determinar la CL50-48. 5.4.2.2 Prueba Definitiva Después de realizados los ensayos preliminares se concluyó que las pruebas definitivas se trabajarían para concentraciones de 20, 40, 60, 80 y 100 ppm. La Tabla N° 19 muestra los resultados obtenidos. 112 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tabla N°. 19 Prueba definitiva. CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 1 1 2 2 40 2 3 3 3 60 3 3 3 3 80 4 4 4 4 100 5 5 5 5 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 30 55 60 80 100 Fuente: Elaboración propia Se puede observar que para la concentraciones de 20, 40, 60,80 y 100 ppm el porcentaje de mortalidad fue del 30%, 55%, 60%, 80% y 100% respectivamente, concluyéndose que la concentración donde la mitad de organismos expuestos de Daphnia magna se mueren por la exposición al herbicida es 40 ppm y el rango se encuentra entre 100 ppm donde muere el 100% y 20ppm donde muere el 30% de la población. Se realizaron 12 pruebas definitivas con el Glifosato Rondup 747, con el fin de garantizar los resultados. Por cada tres pruebas realizadas con el Herbicida, se realizó una prueba con dicromato de potasio para verificar que se encontrara dentro de los limites de sensibilidad obtenidos anteriormente, por lo que se puede concluir y verificar en el Anexo E, que los valores de sensibilidad para el dicromato de potasio con la especie Daphnia magna obtenidos en los días que se realizaron las pruebas definitivas con el herbicida en estudio, si se encuentran dentro de los límites aceptables. En la tabla N°. 20 se observan los resultados calculados. 113 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tabla No. 20 Pruebas de sensibilidad con Dicromato de Potasio para pruebas con herbicida Roundup 747. FECHA CL 50-48 LIMITE SUPERIOR LIMITE INFERIOR Sept. 3 – 08 1.2874 ppm 1.5437 ppm 1.0992 ppm Sept. 10- 08 1.2374 ppm 1.3437 ppm 1.0872 ppm Sept. 17- 08 1.2671 ppm 1.4904 ppm 1.0925 ppm Fuente. Elaboración propia 5.4.2.3. Determinación de la Concentración Letal Media CL50-48 para la prueba con el Herbicida (Rondup 747) para Daphnia magna. Por medio del programa estadístico probit se determinó la concentración letal media, donde nos muestra el límite superior y el límite inferior, con un límite de confianza de 95%. La tabla Nº 21 nos muestra los resultados definitivos obtenidos en este programa. Tabla Nº 21 Carta de control de prueba de sensibilidad definitiva con Daphnia magna FECHA PRUEBA SEPTIEMBRE 3 / 2008 SEPTIEMBRE 3 / 2008 SEPTIEMBRE 3 / 2008 SEPTIEMBRE 10 / 2008 SEPTIEMBRE 10 / 2008 SEPTIEMBRE 10 / 2008 SEPTIEMBRE 17 / 2008 SEPTIEMBRE 17 / 2008 SEPTIEMBRE 17 / 2008 SEPTIEMBRE 24 / 2008 SEPTIEMBRE 24 / 2008 SEPTIEMBRE 24 / 2008 PROMEDIO CL50 (mg/L) 31,5626 48,5809 50,9970 38,2408 41,1958 45,4962 42,8240 48,9913 48,5809 41,1958 31,8725 45,3259 42,9053 Fuente: Elaboración propia 114 LIMITE INFERIOR LIMITE (mg/L) SUPERIOR(mg/L) 18,3913 41,8040 39,5340 57,7525 40,7487 62,1933 25,1876 49,6108 30,4792 51,1070 32,2849 59,1399 26,3415 58,6998 39,6084 58,7242 39,5340 57,7525 30,4792 51,1070 19,1056 41,9194 35,2295 55,3883 31,4103 53,7666 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Realizadas doce pruebas confiables se obtuvo una concentración Letal Media CL50-48 de 42,9053, mg/L un límite inferior de 31,4103 mg/L y un límite superior de 53,7666 mg/L. Mediante esta tabla se puede concluir que si en un cuerpo de agua se vierte 42.9053 mg / L de herbicida Roundup 747, se produce la muerte al 50% de los organismos Daphnia magna presentes en el. De los datos calculados por el método de Probit se puede observar una notable variabilidad de las concentraciones letales medias en las primeras tres pruebas realizadas, esto pudo ocurrir a causa de inestabilidad en el cultivo debido a factores ambientales, para el caso de las nueve pruebas restantes, la variación de los valores obtenidos es menor por lo se puede decir que los valores entregados son confiables. 115 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Gráfica N° 4. Prueba definitiva para el Herbicida Fuente: Elaboración propia 116 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Antes de realizar las pruebas toxicológicas fue necesario estabilizar el cultivo para proporcionar buenos datos sin que estos se salieran de los limites, y compararlos con las pruebas de sensibilidad para determinar si esta dentro del rango. En la gráfica Nº 4, se presenta el comportamiento de sensibilidad de la especie Daphnia magna frente al herbicida en estudio, a través de las concentraciones letales CL 50-48 que resultaron de las pruebas, en donde se muestran los límites superior e inferior de 53, 7666 ppm y 31,4103 ppm respectivamente. Se puede corroborar y comparar el valor aproximado de la concentración letal media donde el porcentaje de mortalidad este al 50% calculado en las pruebas definitivas donde el rango encontrado fue de 40 ppm con un porcentaje de mortalidad del 55%, con el obtenido por el método Probit de 42,9053 ppm, concluyéndose la cercana exactitud entre los dos datos. 5.4.2.4. Análisis de varianza A continuación (tabla Nº 22) se presenta un ejemplo para realizar el análisis de varianza después de obtener la concentración letal media (CL50-48) en las pruebas definitivas de sensibilidad para validar los resultados obtenidos por el software Probit. En el anexo E se encuentra el ANOVA de las pruebas restantes. Concentración Tabla Nº 22 Análisis de varianza Número de réplicas total Promedio 2 6 1,5 2 1 7 1,75 3 2 3 11 2,75 4 4 4 4 16 4 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 60 15 R1 R2 R3 R4 0.3 1 1 2 0.8 2 2 1 3 1.5 2 Blanco total Fuente: Elaboración propia 117 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos 6 4 24 Suma de cuadrados Grados de libertad 65,5 5 Promedio de cuadrados 13,1 Dentro de Grupos 2,5 18 0,13888889 Total 68 23 CL 50-48 LIMITE SUPERIOR LIMITE INFERIOR F Calculado F Teórico 94,32 2,77 41.1958 ppm 51.1070 ppm 30.4792 ppm Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Se observa que en la prueba realizada el Fc > FT por lo tanto se rechaza la hipótesis nula (Ho), y se acepta la hipótesis alterna (H1), concluyendo que las diferentes concentraciones producen efectos distintos en los organismos prueba. 118 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 6. COMPARACION DE RESULTADOS OBTENIDOS DE INVESTIGACIONES REALIZADAS EN LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CL50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 BAJO DIFERENTES ESPECIES. A continuación se presentan los resultados obtenidos y encontrados según investigaciones de Bioensayos por tesistas de la Universidad de la Salle: Tabla No. 23. CL50 calculados para diferentes especies. Especie de crustáceo CL 50 ppm Tiempo de exposición Estado Ambiente Daphnia pulex 86,642 48 Neonatos Dulce Daphnia pulex 23.4 48 Neonatos Dulce Peces (Trucha arco iris) 1,088 96 Neonatos Dulce Daphnia magna 42,9053 48 Neonatos Dulce Referencia PIÑEROS Gisella y QUINTERO Javier. ( 2008) Universidad Nacional de Colombia. Departamento de investigaciones científicas 2005. GAMEZ Enrique y BARRIOS Carmen (2008) RAMIREZ Jineth y GAMEZ Catalina (.2008) Los datos mencionados en la tabla, fueron extraídos de las respectivas cartas de control de pruebas de toxicidad para el herbicida. Se aprecia que la Daphnia pulex presenta mayor sensibilidad para el herbicida debido a las características morfológicas de cada especie y a las condiciones fisicoquímicas de los ecosistemas en las que se encuentran. Esto se debe a que las branquias de las Daphnia pulex son más permeables y por ende el glifosato entra más rápido y fácil a su cuerpo afectando de manera casi inmediata al microorganismo. 119 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna De igual manera, la Daphnia pulex habita en aguas blandas siendo más sensible que la Daphnia magna, ya que los organismos que residen en esta agua requieren menos tiempo para perder el calcio que se encuentra en los tejidos de las mismas, involucrando así efectos en la resistencia del organismo. Otro factor que interviene para que la sensibilidad de la Daphnia pulex sea mayor que la de Daphnia magna es el tamaño, ya que la Daphnia pulex es mucho más pequeña por lo que su proceso de intoxicación es más rápido. La toxicidad de glifosato para organismos acuáticos en nuestro país se estima como baja, correspondiendo a los intervalos de moderada a baja de las distintas legislaciones tanto en la exposición aguda como crónica, pero con los resultados obtenidos en la tabla No. 23 se puede concluir que de acuerdo a las categorías toxicológicas de la EPA en peces la toxicidad del glifosato Roundup es altamente toxica. En la tabla N° 24 podemos evidenciar que en bacterias acuáticas, Roundup inhibió seriamente la respiración en Pseudomonas chlororaphis, a una concentración de 2.623 mg/L, mientras que en Aeromonas hidrophila la respiración apenas sí se afectó en una exposición de 6 días a la misma concentración (Chan & Leung, 1.986). Tabla N°. 24 Comparación resultados bioensayos con glifosato sobre diferentes especies. ESPECIE COMPUESTO CL 50-96h Glifosato 34 mg/L Ictalurus punctatus Glifosato 32 mg/L Ciprynus carpio Glifosato 2.4 mg/L Pimephales promelas Glifosato >26 mg/L Peces. Salmo gairdneri 120 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Salmo gairdneri Roundup 14 – 33 mg/L Crustaceos Roundup 24 – 37 mg/L Daphnia pulex Roundup 19 mg /L Gammarus psudolimnaeus Roundup 42 mg/L Insectos Roundup 44 mg/L Daphnia magna Chironomus plumosus Fuente. Documento Plan de manejo Ambiental Erradicación de Cultivos Ilicitos. 2000 Haciendo referencia a determinación de la especie más sensible al herbicida, con los valores de CL 50-96 registrados en la tabla N°. 23, se observa con claridad que la especie mas sensible es la Daphnia pulex con CL 50-96 de 19 mg/L, seguida de la Daphnia magna con CL 50-96 de 24 - 37 mg/L y peces con CL 50-96 de 34 mg/L. En cuanto a la sensibilidad de los peces al herbicida, su variación va relacionada a las características morfológicas de cada una, como es el caso de la Trucha la cual presenta una sensibilidad al herbicida muy baja. Comparando los resultados de la concentración letal media del Roundup calculado en este documento (CL (CL 50-48: 50-48: 42.9053 ppm) con el registrado en la tabla N°. 21 37 ppm), podemos garantizar la confiabilidad de los resultados obtenidos. El Glifosato es letal para las plantas y las bacterias por inhibición de la actividad de la enzima enolpiruvilshikimato- fosfato sintasa (EPSPS), la cual es constitutiva de los vegetales y las bacterias. Con base en este postulado la firma Monsanto ha desarrollado, recientemente, un procedimiento para introducir un gen bacterial resistente a la acción del Glifosato sobre la EPSPS en soya, con la idea de que el Glifosato pudiera ser utilizado como herbicida selectivo en esta clase de cultivos. Estos adelantos en las investigaciones de la firma Monsanto ya han sido 121 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna divulgados a nivel científico. La tabla N°.24 hace referencia a las diferentes concentraciones letales calculadas a lo largo de diferentes proyectos de investigación para diferentes contaminantes. Tabla N°. 25 Comparación de resultados de CL 50- 48 de la especie Daphnia magna, frente a diferentes sustancias. Especie de crustáceo CL 50 ppm Tiempo de exposición Estado Sustancia Referencia Daphnia magna 0.50 48 Neonatos Cromo ALVAREZ M, MONGE L.2008 Universidad de la Salle Daphnia magna 0.053 48 Neonatos Cobre ALVAREZ M, MONGE L.2008 Universidad de la Salle Daphnia magna 9,29 exp-9 48 Neonatos Plata SIERRA M, ZARATE A.2008 Universidad de la Salle Daphnia magna 9,49 48 Neonatos Plomo SIERRA M, ZARATE A.2008 Universidad de la Salle Daphnia magna 42,9 48 Neonato Herbicida RAMIREZ J, GAMEZ C.2008 Universidad de la Salle Daphnia magna 0.4 48 Neonato Aluminio Hoyos . 1995. Universidad Nacional Facultad de Biología, área de investigación Daphnia magna 0.2 48 Neonato Aluminio Molano. 1993. Universidad Nacional Facultad de Biología, área de investigación Daphnia magna 30 48 Neonato Mercurio Reyes. 1996. Universidad Nacional Facultad de Biología, área de investigación Daphnia magna 0.05 48 Neonatos Plata Universidad Javeriana 2004. Daphnia magna 2,84 48 Neonatos Cloruro de zinc Satizabal. A. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitiaria Satizabal. A. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitiaria Satizabal. A. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitiaria Daphnia magna 5.05 48 Neonatos Cloruro férrico Daphnia magna 16.2 48 Neonatos Sulfato de Aluminio 122 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Para la elaboración de la tabla anterior, fue necesaria la consulta bibliográfica de cada uno de los documentos mencionados en la columna de referencia, para poder encontrar los valores de las concentraciones letales medias de la especie Daphnia magna para diferentes contaminantes. Podemos observar que entre las sustancias mencionadas la especie Daphnia magna, es demasiado sensible a la sustancia Plata con una CL según referencia de Universidad de la Salle 50-48, de 9.29 ^ -9 del año 2008 y muestra su comportamiento resistente frente al herbicida en estudio seguido del Mercurio con (CL 50-48: 30 ppm) de fuente de Universidad Nacional del año 1996. El ensayo de laboratorio puede corroborarse por medio natural, siempre y cuando el vertimiento sea de la sustancia tóxica utilizada en las condiciones controladas de la prueba, o en un lugar en donde se pueda asegurar que no exista la presencia de otras sustancias tóxicas diferentes a la de estudio, con el fin de evitar el sinergismo con otras sustancias o compuestos que pudieran estar presentes. 7. PROTOCOLO PARA TRANSPORTE, MANIPULACIÓN Y DISPOSICION DE RESIDUOS DE HERBICIDAS. En el ANEXO G se presenta un protocolo que tiene como objetivo prevenir la contaminación y generar una herramienta útil de incidencia positiva en la manera de almacenar, transportar, manipular y disponer los residuos de herbicidas generados en el desarrollo de proyectos de investigación en el laboratorio de Bioensayos de la Universidad de la Salle. 123 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna CONCLUSIONES De acuerdo a los resultados obtenidos durante la realización de las pruebas toxicológicas, se pudo concluir lo siguiente: Se determinó la concentración letal media (CL50-48) del herbicida sobre Daphnia magna de 42,9053 mg/L, obteniendo como resultado la base para determinar el rango de toxicidad, indicando los límites de tolerancia al que pueden estar expuestos el organismo estudiado (límite inferior: 31.4103 mg/L, límite superior: 53.7666 mg/L) Se observó que la sensibilidad obtenida para la especie Daphnia magna, se encuentra dentro del rango suministrado por los estándares internacionales y que dichos resultados permiten generar el resto de pruebas al corroborar la respuesta de este organismo frente a una sustancia tóxica. Generalmente, durante el cultivo y mantenimiento en el laboratorio, los organismos mantuvieron una alta tasa reproductiva, sin embargo, se presentaron periodos de tiempo en los cuales el periodo del ciclo de vida vario, disminuyendo de manera significativa la producción de crías (estos factores que influyeron fueron temperatura y alimentación). La temperatura en la que se mantuvieron los cultivos y se realizaron los bioensayos oscilo entre18 y 22°C. 124 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Al obtener los resultados se les realizó el análisis de varianza con una confiabilidad del 95%. Esto nos demostró estadísticamente que la hipótesis nula, la cual indica que a diferentes concentraciones de tóxico se produce el mismo efecto en los organismos, fue rechazada, aceptando la hipótesis verdadera la cual señala que a diferentes concentraciones los efectos sobre los organismos varían (a mayor concentración, mayor número de organismos muertos). Se confrontaron los resultados de la concentración letal media (CL50-48) del herbicida de las especies utilizadas en las pruebas de toxicidad, observándose que la Daphnia magna y peces son las especies mas resistentes al herbicida, debido a sus características morfológicas y características del ambiente donde habita. Se elaboró un protocolo para el almacenamiento, transporte, manipulación y disposición de residuos generados del Herbicida, durante el desarrollo de trabajos de investigación en la Universidad de la Salle. Durante toda la realización de las pruebas de toxicidad fue necesario mantener un control constante de parámetros de calidad del agua (pH, temperatura y Oxigeno Disuelto), verificando así que la muerte de los organismos se genera por el herbicida y no por otro factor, como se puede observar en los resultados presentados en este documento. La universidad como institución al profundizar en estos aspectos de la toxicología permite facilitar a las autoridades y entidades interesadas, los conocimientos necesarios, para proponer y desarrollar programas de prevención, control y seguimiento y adoptar medidas de medicina ocupacional e higiene industrial, que mejoren las condiciones de salud de 125 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna las personas involucradas en la labor de fumigaciones de cultivos bajo el herbicida en estudio. Teniendo en cuenta los casos y problemas expuestos por el uso del Glifosato RoundupR 747SG en la erradicación de cultivos ilícitos en el País, y el resultado obtenido en la presente investigación, podemos llegar a al conclusión que este herbicida (Glifosato RoundupR 747SG) es altamente tóxico para el medio ambiente y la salud humana. Comparando la legislación vigente (en cuanto a concentraciones de este herbicida y la CL50) de varios países como Estados Unidos que maneja un límite de 0.7 p.p.m., Canadá 0.28 p.p.m., Argentina 1.2 p.p.m., y el caso de Brasil y Dinamarca donde esta prohibido el uso de este herbicida agrícola por sus efectos tóxicos, Colombia maneja una normatividad imprecisa y muy flexible permitiendo rangos de 7 – 12 p.p.m. Se debe tomar mayor conciencia al usar este herbicida y realizar investigaciones mas profundas por parte de las autoridades competentes. A pesar de las justificaciones de un riesgo relativamente en la práctica de fumigación con glifosato en nuestro país, no podemos mirar estos resultados con tolerancia al saber que no ha sido soportada con estudios científicos que avalen su inocuidad y que existe un gran número de artículos científicos que advierten el riesgo de contaminación con el uso de Roundup sobre ecosistemas acuáticos. 126 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna RECOMENDACIONES Es conveniente controlar factores externos (olor a cigarrillo, colonias, limpiadores de piso) frente a la realización de pruebas, esto con el fin de que agentes ajenos a la investigación, modifiquen o alteren el resultado esperado, o que los resultados obtenidos sean poco confiables. Se deben asegurar condiciones óptimas como la temperatura e iluminación en el laboratorio de Bioensayos para evitar cualquier cambio inesperado en el mismo y evitar alteraciones a los organismos utilizados para las pruebas y por lo tanto en los resultados obtenidos. Es importante tener un control constante de parámetros como pH, O.D. y temperatura antes y durante las pruebas de toxicidad. Esto se realiza para garantizar excelentes condiciones de los organismos para la realización de las pruebas. Es recomendable realizar una prueba de sensibilidad con dicromato de potasio al mismo tiempo de la prueba con la sustancia tóxica de interés para garantizar el bueno estado de los organismos en el momento de la realización de la prueba. Se considera necesario utilizar el laboratorio de bioensayos exclusivamente para este tipo de pruebas. Si se trabaja con metales pesados o residuos peligrosos, es necesario contar con un lugar especial para preparar las soluciones y evitar la contaminación del laboratorio. Esto se debe a que existen 127 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna residuos peligrosos que se disuelven en el agua y por lo tanto pueden ocasionar la muerte de los organismos de prueba. En la medida que se obtengan resultados mediante bioensayos, con diferentes sustancias, se recomienda usar los estudios para proponer normatividad de carácter ambiental, que proteja ecosistemas y especies sensibles al herbicida en estudio. Medidas como los Planes de Gestión Ambiental pueden ser alternativas objeto de estudio para futuras investigaciones, con el fin de permitir comparar los resultados frente a las propuestas en la presente tesis. Es necesario estudiar el tipo de mecanismos de transporte y sus posibles variaciones residuales, desde el momento en que un producto químico es aplicado, hasta su acumulación en los sistemas naturales. Realizar pruebas de toxicidad con otras especies del mismo ecosistema (incluidas aves), para poder confrontar los resultados obtenidos a partir del herbicida. Se requiere determinar la concentración letal media de este herbicida en toda la cadena trófica presente en ecosistemas acuáticos. Es importante seguir realizando test de toxicidad con organismos como Daphnia magna, ya que, como se pudo comprobar en esta investigación, se emplean metodologías sencillas y de bajo costo, obteniéndose grandes beneficios, como 128 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna la detección de la contaminación en el agua y el análisis de los posibles efectos de los contaminantes que estén presentes en el medio de estudio. Se debería pensar en suspender la política de fumigación aérea, amparándonos en el principio de precaución contemplado en la ley 99 de 1993, hasta tanto se realicen los suficientes estudios acerca de la mezcla empleado para la erradicación de cultivos ilícitos y uso de este herbicida en nuestro país. Los plaguicidas antes de salir al mercado pasan por el proceso de la formulación, donde los ingredientes activos son mezclados con sustancias como solventes y coadyuvantes conocidos como “ingredientes inertes”, sobre los cuales no se da información en las etiquetas y pueden ser sustancias activas toxicológicas. Esto significa que si no se revisan y reconocen las pruebas toxicológicas con los plaguicidas comerciales como se usan realmente, no es posible evaluar con seguridad los riesgos sobre el ambiente y la salud de las personas. 129 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna BIBLIOGRAFIA ESCOBAR, P.M, GARCIA, L.E. Determinación de la CL50 de los detergentes mediante pruebas estáticas utilizando Daphnia magna. Universidad de la Salle. 1993. HERNANDEZ SAMPIERI, Roberto, FERNANDEZ COLLADO, Carlos y BAPTISTA LUCIO Pilar. Metodología de la Investigación. 3ª ed. Mac Graw Hill. México. 2003. p 113-136 BERNAL PAREDES, Alba Janneth y ROJAS AVELLA, Andrea Paola. Determinación de la concentración letal media ( CL50 del mercurio por 48 ) medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia Pulex. Bogotá. 2007. Tesis de grado (Ingeniera Ambiental y Sanitaria). Universidad de La Salle. Ingeniera Ambiental y Sanitaria. ZARATE, Felipe, SIERRA, Maria .Determinación de la concentración letal media (Cl50-48) del plomo y plata en los vertimientos de una industria galvánica, mediante ensayos toxicológicos sobre daphnia magna. 2008. Tesis de grado (Ingeniera Ambiental y Sanitaria). Universidad de La Salle. Ingeniera Ambiental y Sanitaria. ROMERO ROJAS, Jairo Alberto. Acuiquimica. ed Escuela Colombiana de Ingeniería. Primera edición. 1996. p 56, 57,58, 106, 116, y 124. CONTRERAS CARDONA, Lourdes Marcela. Evaluación preliminar de la toxicidad aguda de extractos vegetales utilizando Daphnia magna, Hydra attenuata y Allium cepa. Bogota. Universidad Nacional. 130 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna DÍAZ BÁEZ, María Consuelo, PICA GRANADOS, Yolanda RONCO, Alicia. Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. [citado 5 de Agosto de 2007]. Disponible en Internet: http://www.idrc.ca/openebooks/147-7/#page_65gs\\bioensayos\Capítulo 5_ Métodos Estadísticos para el Análisis de Resultados de Toxicidad Internacional. MARTÍNEZ YEPES, Pedro Nel, OSORIO Javier. Análisis del procedimiento para la determinación de la dl50 (dosis letal media) a través del método de Probit en un bioensayo. [citado 30 de Agosto 2007]. Disponible en Internet: http://www.monografias.com/trabajos14/dosis-letal/dosis-letal.shtml. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias. Vol 20 N° 4. Medellín Octubre/Diciembre 2007. Determinación de la toxicidad aguda de los detergentes mediante sistemas estáticos utilizando Daphnia Magna, Pedro Miguel Escobar Malaver, Luis Eduardo García, 1993. COX, Caroline. Glifosato, parte 2 La exposición humana y los efectos ecológicos. Oregón. 1995. ELSA NIVIA. Efectos sobre la salud y el ambiente de herbicidas que contienen Glifosato. 2003. Ministerio del medio ambiente. Plan de manejo ambiental Erradicación de cultivos ilícitos. 2000. 131 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ROMERO, C.E.S.F. Diagnostico del daño causado por herbicidas a cultivos. URIBE GRANJA, Camilo, Toxicología del Glifosato. Clínica de Toxicología. Bogotá. Instituto Colombiano Agropecuario ICA. División Insumos Agrícolas. Listado general de plaguicidas registrados hasta agosto 26 de 1998. Santafé de Bogotá. EPA. Technical Fact Sheets on: Glyphosate. National Primary Drinking Water Regulations. Documento obtenido por Internet, junio de 1999. 132 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO A. REGISTRO PARAMETROS DE CONTROL AGUA DURA FECHA DE PREPARACION 31/03/2008 15/04/2008 22/04/2008 29/04/2008 06/05/2008 13/05/2008 20/05/2008 27/05/2008 03/06/2008 10/06/2008 17/06/2008 24/06/2008 01/07/2008 08/07/2008 15/07/2008 22/07/2008 29/07/2008 05/08/2008 12/08/2008 19/08/2008 26/08/2008 02/09/2008 09/09/2008 16/09/2008 23/09/2008 30/09/2008 07/10/2008 14/10/2008 21/10/2008 28/10/2008 04/11/2008 11/11/2008 133 DUREZA pH OD TEMPERATURA 170 170 175 165 170 160 164 174 180 175 166 163 160 164 164 176 175 176 175 177 178 180 166 167 168 170 175 177 165 160 172 178 7.43 8.0 7.79 7.3 7.75 7.65 7.73 7.74 7.69 6.63 7.72 7.81 8.0 7.0 7.95 7.81 7.95 8.0 8.0 7.54 7.82 8.0 8.0 7.73 7.70 7.77 7.5 7.09 7.3 7.90 8.0 7.54 6.25 7.81 7.23 6.50 6.25 6.14 6.21 6.14 6.11 6.09 6.0 6.08 6.14 6.05 6.01 6.04 6.02 5.84 6.04 5.94 6.02 6.15 6.04 6.03 6.08 6.12 6.0 6.18 6.03 6.50 6.09 6.15 19.5 18.7 20.2 19.6 19.4 20.0 19.6 19.4 19.4 19.4 19.3 19.1 18.8 18.5 18.1 18.8 18.7 18.6 18.7 18.5 18.4 18.2 19.0 20.2 19.1 20.5 18.4 18.9 19.4 19.2 18.9 19.0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO B. REGISTRO ALIMENTO (Scenedesmus acutus) FECHA DE PREPARACION FECHA DE CENTRIFUGACION Nº DE CELULAS /ml 04/04/2008 18/04/2008 02/05/2008 16/05/2008 30/05/2008 13/06/2008 27/06/2008 11/07/2008 25/07/2008 08/08/2008 22/08/2008 05/09/2008 19/09/2008 03/10/2008 17/10/2008 31/10/2008 16/04/2008 30/04/2008 14/05/2008 28/05/2008 12/06/2008 25/06/2008 09/07/2008 23/07/2008 06/08/2008 20/08/2008 03/09/2008 17/09/2008 01/10/2008 15/10/2008 29/10/2008 12/11/2008 80.58*106 309.12*106 487.2*106 356.04*106 487.2*106 434.34*106 348.05*106 379.50*106 479.88*106 489.18*106 365.21*106 281.88*106 433.89*106 521.14*106 457.31*106 415.26*106 134 DOSIS ÓPTIMA RECOMENDADA (células por Daphnia/día) 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 4.5*106 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO C REGISTRO DE CONTROL DE CULTIVOS DE DAPHNIA magna 135 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna FECHA DE SIEMBRA FECHA DEL CONTROL PECERA Nº MAMAS NEONATOS 18/04/2008 25/04/2008 20 20 20 20 18/04/2008 26/04/2008 18/04/2008 28/04/2008 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 0 0 15 0 15 122 114 139 105 480 11 0 0 0 11 18/04/2008 29/04/2009 1 20 323 2 20 423 3 20 417 4 20 361 20 20 20 20 20 20 20 20 Total 18/04/2008 18/04/2008 18/04/2008 136 30/04/2008 01/05/2008 02/05/2008 1524 1 20 1 2 20 145 3 20 352 4 Total 1 20 20 399 897 10 2 20 26 3 4 Total 1 20 20 20 2 2 40 0 2 20 0 3 4 Total 20 20 0 0 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna FECHA DE SIEMBRA FECHA DEL CONTROL PECERA Nº MAMAS NEONATOS 18/04/2008 03/05/2008 1 20 135 2 20 89 3 20 194 4 20 57 Total 18/04/2008 05/05/2008 475 1 20 367 2 20 400 3 20 327 4 20 226 Total 18/04/2008 06/05/2008 1320 1 20 39 2 20 55 3 20 0 4 20 0 Total 18/04/2008 07/05/2008 94 1 20 0 2 19 95 3 20 100 4 20 35 Total 18/04/2008 08/05/2008 230 1 20 319 2 19 394 3 19 384 4 19 321 Total 18/04/2008 137 09/05/2008 1418 1 19 25 2 19 79 3 19 145 4 Total 19 227 476 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna FECHA DE SIEMBRA FECHA DEL CONTROL PECERA Nº MAMAS NEONATOS 18/04/2008 10/05/2008 2 19 221 3 17 116 4 Total 16 1 458 1 17 26 2 18 7 3 17 0 4 16 0 18/04/2008 12/05/2008 Total 18/04/2008 13/05/2008 33 1 16 0 2 17 23 3 14 52 4 14 8 Total 18/04/2008 14/05/2008 83 1 16 44 2 17 12 3 13 45 4 13 76 Total 18/04/2008 15/05/2008 177 1 15 42 2 17 36 3 12 188 4 12 119 Total 18/04/2008 16/05/2008 1 15 126 2 17 245 3 12 20 4 12 0 Total 138 385 391 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna FECHA DE SIEMBRA FECHA DEL CONTROL PECERA Nº MAMAS NEONATOS 18/04/2008 17/05/2008 1 14 105 2 17 20 3 12 23 4 12 5 Total 18/04/2008 19/05/2008 153 1 13 20 2 16 45 3 12 165 4 10 225 Total 18/04/2008 20/05/2008 455 1 13 265 2 16 318 3 10 238 4 9 202 Total 18/04/2008 21/05/2008 1023 1 13 83 2 16 39 3 10 21 4 9 0 Total 18/04/2008 22/05/2008 143 1 13 76 2 16 72 3 10 26 4 8 0 Total 18/04/2008 139 23/05/2008 174 1 20 41 2 20 99 3 6 128 4 Total 0 0 268 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna FECHA DE SIEMBRA FECHA DEL CONTROL PECERA Nº MAMAS NEONATOS 18/04/2008 24/05/2008 1 17 196 2 18 203 3 6 152 4 0 0 Total 18/04/2008 26/05/2008 551 1 16 174 2 16 73 3 6 0 4 0 0 Total 18/04/2008 27/05/2008 247 1 14 229 2 16 97 3 6 46 4 0 0 Total 18/04/2008 28/05/2008 372 1 20 87 2 16 93 3 0 0 4 0 0 Total 180 06/06/2008 13/06/2008 1 2 3 4 Total 20 20 20 20 228 215 156 175 774 06/06/2008 14/06/2008 1 20 67 2 3 4 Total 20 20 20 83 45 144 339 140 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 06/06/2008 16/06/2008 06/06/2008 17/06/2008 06/06/2008 18/06/2008 06/06/2008 19/06/2008 06/06/2008 20/06/2008 06/06/2008 21/06/2008 06/06/2008 23/06/2008 06/06/2008 24/06/2008 06/06/2008 25/06/2008 141 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 19 20 20 18 19 20 18 18 18 18 19 17 13 16 16 16 16 16 16 0 14 59 30 0 103 251 210 254 42 757 191 281 143 137 752 0 47 3 121 171 31 40 36 5 112 121 92 161 0 374 12 25 18 76 131 77 108 158 48 391 0 37 50 0 87 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 06/06/2008 26/06/2008 06/06/2008 27/06/2008 06/06/2008 28/06/2008 06/06/2008 30/06/2008 06/06/2008 01/07/2008 06/06/2008 02/07/2008 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 16 16 16 0 13 14 15 0 13 14 13 0 13 13 9 0 12 13 9 0 12 11 7 0 Total 06/06/2008 03/07/2008 06/06/2006 04/07/2008 06/06/2006 05/07/2008 06/06/2006 07/07/2008 142 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 152 207 167 0 526 114 67 66 0 247 0 46 86 0 132 226 335 137 0 698 73 37 67 0 177 69 66 33 0 168 20 9 0 0 14 8 0 0 14 7 0 0 14 5 0 28 59 0 0 87 127 77 0 0 204 93 54 0 0 147 66 34 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 06/06/2006 08/07/2008 06/06/2006 09/07/2008 08/08/2008 19/08/2008 08/08/2008 20/08/2008 08/08/2008 21/08/2008 08/08/2008 22/08/2008 08/08/2008 23/08/2008 08/08/2008 25/08/2008 08/08/2008 26/08/2008 08/08/2008 27/08/2008 143 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 0 16 0 0 0 14 0 0 0 11 19 15 14 11 19 15 14 11 19 15 14 11 19 15 14 10 18 15 14 10 18 15 12 10 18 15 12 9 18 0 100 29 0 0 0 29 0 0 0 0 0 16 36 66 77 195 93 83 20 37 233 0 352 308 230 890 0 146 160 0 306 0 117 195 192 504 0 208 41 128 377 13 84 106 0 203 2 323 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 08/08/2008 28/08/2008 08/08/2008 29/08/2008 08/08/2008 30/08/2008 08/08/2008 01/09/2008 08/08/2008 02/09/2008 08/08/2008 03/09/2008 08/08/2008 04/09/2008 08/08/2008 05/09/2008 08/08/2008 06/09/2008 08/08/2008 08/09/2008 144 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 15 12 6 18 15 12 0 15 14 12 0 15 14 12 0 15 14 12 0 14 14 12 0 14 14 12 0 13 14 12 0 13 14 12 0 11 14 12 0 226 190 741 0 51 246 282 579 0 284 188 51 423 0 256 64 0 320 0 39 177 101 317 0 320 391 282 993 0 93 112 0 205 0 99 83 42 224 0 22 71 14 107 0 16 147 76 239 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 08/08/2008 09/09/2008 08/08/2008 10/09/2008 08/08/2008 11/09/2008 08/08/2008 12/09/2008 08/08/2008 13/09/2008 08/08/2008 15/09/2008 08/08/2008 16/09/2008 08/08/2008 17/09/2008 08/08/2008 18/09/2008 145 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 1 2 3 4 Total 11 14 12 0 10 14 11 0 10 14 10 0 10 13 10 0 10 10 7 0 10 10 2 0 9 11 0 0 5 10 0 0 5 8 0 0 3 6 0 49 56 47 152 0 0 8 0 8 0 0 25 0 25 0 169 170 77 416 0 139 207 25 371 0 60 56 0 116 0 9 0 0 9 0 25 128 0 153 0 2 102 0 104 0 10 55 0 65 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 08/08/2008 08/08/2008 146 19/09/2008 20/09/2008 1 2 0 3 0 0 3 4 Total 1 2 3 4 Total 6 0 23 0 23 0 0 0 0 0 0 0 4 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Anexo D. Formato de registro de pruebas FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LB05 LABORATORIO DE BIOENSAYOS PRUEBA DE TOXICIDAD Página 8 de 8 Versión 0 LB001 FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA LABORATORIO AREA DE BIOENSAYOS REGISTRO DE DATOS DEL TEST DE TOXICIDAD AGUDA Ficha del test estático definitivo con: ______________________________ Muestra: ____________________________________________________ Datos fisicoquímicos de la muestra Conductividad: _________________ Dureza: ______________________ pH: __________________________ Inicio de la prueba: Fin de la prueba : Agua de dilución: pH: _______ , Tratamiento de la muestra Sedimentación: ______________ Filtración: ___________________ Ajuste de pH: _______________ ____ / ____ / ____ , a las ________ horas ____ / ____ / ____, a las _________ horas Dureza: _______ , Fecha de Preparación: ____ / ____ RESULTADOS Concentración nominal No. de organismos muertos 1 2 3 4 Medidas finales OD No. Observado de muertes / No. Total de organismos % mortalidad obtenido pH Elaboro: ESCOBAR MALAVER, Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia Pulex para la evaluación de muestras ambientales. Santafé de Bogotá; 1997 147 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO E RESULTADOS PRUEBAS TOXICOLOGICAS CON DICROMATO DE POTASIO 148 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna E.1.PRUEBA PRELIMINAR Abril 3 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL 1 0 0 0 0 3 5 Blanco 0.001 0.01 0.1 1 10 NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 5 5 % MORTALIDAD OBTENIDO 4 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 40 100 Fuente: Elaboración propia E.2. PRUEBAS DEFINITIVAS Abril 10 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 1 0 1 0.8 1 1 1 0 1 2 1 1 1 1.5 3 2 3 4 2 5 5 5 5 0 10 15 25 60 100 Fuente: Elaboración propia Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 2 0,5 1 0 3 0,75 1 1 1 5 1,25 3 2 3 4 12 3 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 42 10,5 R1 R2 R3 R4 0.3 0 1 0 0.8 1 1 1 2 1.5 2 Blanco Fuente: LAB M07 149 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 72 5 Promedio de cuadrados 14,4 Dentro de Grupos 4,5 18 0,25 Total 76,5 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 57,6 2.77 Fuente: LAB M07 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 1.1867 1.7498 0.8543 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 10 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 1 1 1 1 0.8 2 1 1 1 1 2 2 2 2 1.5 2 3 2 3 2 5 5 5 5 Fuente: LAB M07 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 150 1.0513 1.9266 0.6201 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 20 25 40 50 100 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Análisis de varianza Número de réplicas Concentración R1 R2 R3 R4 total promedio 0.3 1 1 1 1 4 1 0.8 2 1 1 1 5 1,25 1 2 2 2 2 8 2 1.5 2 3 2 3 10 2,5 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 47 11,75 Fuente: LAB M07 Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 59,2083333 TRATAMIENTOS 6 OBSERVACIONES 4 TOTAL 24 Promedio Grados de F de F Teórico libertad Calculado cuadrados 5 11,8416667 Dentro de Grupos 1,75 18 Total 60,9583333 23 0,09722222 121,8 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 10 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL 151 NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 1 0 1 0 0.8 1 1 1 2 1 1 2 1 2 1.5 3 3 3 3 2 5 5 5 5 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 10 25 30 60 100 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 1.1092 1.365 0.9076 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio R1 R2 R3 R4 0.3 1 0 1 0 2 0,5 0.8 1 1 1 2 5 1,25 1 1 2 1 2 6 1,5 1.5 3 3 3 3 12 3 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 45 11,25 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 67,88 5 Dentro de Grupos 2,75 18 Total 70,625 23 Promedio de cuadrados 13,575 6 4 24 F Calculado 0,15277778 88,8545455 F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 152 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Abril 15 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1.5 2 2 2 2 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 0 20 30 40 100 1.2874 1.5437 1.0992 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 0 0 0 1 1 4 1 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 1 1 1 1 2 1 2 6 1,5 1.5 2 2 2 2 8 2 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 38 9,5 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 68,8333333 5 Promedio de cuadrados 13,7666667 0,06 Grados de libertad Dentro de Grupos 1 18 Total 69,8333333 23 Fuente: LAB M07 153 6 4 24 F Calculado F Teórico 247,8 2,77 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 15 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 1 2 1 1 1 2 2 1 1 1.5 1 3 2 2 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 0 25 30 40 100 1.2548 1.8443 0.9392 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 0 0 0 1 1 5 1,25 1 1 6 1,5 3 2 2 8 2 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 39 9,75 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 1 2 1 2 2 1.5 1 2 Blanco Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL 154 6 4 24 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 67,875 5 Promedio de cuadrados 13,575 Dentro de Grupos 3,75 18 0,20833333 Total 71,625 23 F Calculado F Teórico 65,16 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 15 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 1 3 1 5 0.8 0 1 2 0 1 2 1 1 1 1.5 1 3 5 1 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 45 15 25 45 100 1.1675 2.7114 0.7019 Análisis de varianza Concentración 155 Número de réplicas total promedio 5 10 2,5 2 0 3 0,75 1 1 1 5 1,25 1 3 5 1 10 2,5 5 5 5 5 20 5 R1 R2 R3 R4 0.3 1 3 1 0.8 0 1 1 2 1.5 2 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Blanco 0 0 0 0 0 0 total 48 12 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 62,5 5 Dentro de Grupos 25,5 18 Total 88 23 Promedio de cuadrados 12,5 6 4 24 F Calculado F Teórico 1,41666667 8,82352941 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 17 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 2 2 1 3 1 1 3 3 4 1.5 5 4 5 4 2 5 5 4 4 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 156 0.9249 1.0722 0.7714 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 0 40 55 90 90 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 0 0 0 1 3 8 2 3 3 4 11 2,75 5 4 5 4 18 4,5 2 5 5 4 4 18 4,5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 55 13,75 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 2 2 1 1 1.5 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 82,2083333 6 4 24 5 Promedio de cuadrados 16,4416667 0,48611111 33,8228571 Grados de libertad Dentro de Grupos 8,75 18 Total 90,9583333 23 F Calculado F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 157 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Abril 17 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 2 2 0 2 0.8 3 2 1 3 1 3 2 1 3 1.5 5 5 5 5 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 30 45 45 100 100 0.671 0.9915 0.2982 Análisis de varianza Número de réplicas total promedio 2 6 1,5 1 3 9 2,25 Concentración R1 R2 R3 R4 0.3 2 2 0 0.8 3 2 1 3 2 1 3 9 2,25 1.5 5 5 5 5 20 5 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 64 16 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 78,8333333 5 Promedio de cuadrados 15,7666667 0,47222222 33,3882353 Grados de libertad Dentro de Grupos 8,5 18 Total 87,3333333 23 Fuente: LAB M07 158 6 4 24 F Calculado F Teórico 2,77 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 17 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 2 0.8 1 0 1 0 1 1 2 2 1 1.5 3 4 3 2 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 10 10 30 60 100 1.1854 1.7275 0.8599 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 2 2 0,5 1 0 2 0,5 2 2 1 6 1,5 3 4 3 2 12 3 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 42 10,5 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 1 0 1 1 1.5 2 Blanco Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL 159 6 4 24 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 73,5 5 Promedio de cuadrados 14,7 Dentro de Grupos 7 18 0,38888889 Total 80,5 23 F Calculado F Teórico 37,8 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 22 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 2 1 1 0 1 2 2 1 1 1.5 2 4 2 2 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 0 20 30 50 100 1.2453 1.4426 1.0818 Análisis de varianza Concentración 160 Número de réplicas total promedio 0 0 0 0 4 1 1 1 6 1,5 4 2 2 10 2,5 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 40 10 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 2 1 1 1 2 2 1.5 2 2 Blanco DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 71,3333333 5 Promedio de cuadrados 14,2666667 0,33333333 Grados de libertad Dentro de Grupos 6 18 Total 77,3333333 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 42,8 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 22 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 2 1 0 0 1 2 3 2 2 1.5 3 4 3 4 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 161 1.1195 0.9864 1.2536 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 0 15 45 70 100 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Análisis de varianza Número de réplicas Concentración total promedio 0 0 0 0 0 3 0,75 3 2 2 9 2,25 3 4 3 4 14 3,5 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 46 11,5 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 2 1 1 2 1.5 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 83,3333333 5 Promedio de cuadrados 16,6666667 0,25 Grados de libertad Dentro de Grupos 4,5 18 Total 87,8333333 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 66,6666667 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 22 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL 162 NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 1 1 1 1 1 2 2 2 2 1.5 3 2 3 1 2 5 5 5 5 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 0 20 40 45 100 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 1.2149 1.4421 1.0376 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 0 0 0 1 1 4 1 2 2 2 8 2 3 2 3 1 9 2,25 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 41 10,25 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 1 1 1 2 1.5 2 Blanco Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 70,2083333 6 4 24 5 Promedio de cuadrados 14,0416667 0,15277778 91,9090909 Grados de libertad Dentro de Grupos 2,75 18 Total 72,9583333 23 F Calculado F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 163 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Abril 29 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 1 0 1 0 0.8 2 3 1 2 1 3 3 3 2 1.5 3 3 3 3 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 10 40 55 60 100 0.9104 1.1171 0.7195 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 0 2 0,5 1 2 8 2 R1 R2 R3 R4 0.3 1 0 1 0.8 2 3 1 3 3 3 2 11 2,75 1.5 3 3 3 3 12 3 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 53 13,25 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 66,2083333 5 Promedio de cuadrados 13,2416667 0,20833333 Grados de libertad Dentro de Grupos 3,75 18 Total 69,9583333 23 Fuente: LAB M07 164 6 4 24 F Calculado F Teórico 63,56 2,77 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 29 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 1 0 1 1 0.8 1 2 2 1 1 2 2 2 2 1.5 2 3 2 3 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 15 30 40 50 100 1.0535 1.7569 0.6575 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 3 0,75 2 1 6 1,5 2 2 8 2 3 2 3 10 2,5 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 47 11,75 R1 R2 R3 R4 0.3 1 0 1 0.8 1 2 1 2 2 1.5 2 2 Blanco Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL 165 6 4 24 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 60,2083333 5 Promedio de cuadrados 12,0416667 0,15277778 78,8181818 Grados de libertad Dentro de Grupos 2,75 18 Total 62,9583333 23 F Calculado F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Abril 29 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 2 1 2 2 1 2 2 3 3 1.5 3 4 3 3 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 0 35 10 65 100 1.0063 1.1757 0.8525 Análisis de varianza Concentración 166 Número de réplicas total promedio R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0 0 0 0.8 2 1 2 2 7 1,75 1 2 2 3 3 10 2,5 1.5 3 4 3 3 13 3,25 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 50 12,5 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 75,3333333 5 Promedio de cuadrados 15,0666667 0,13888889 Grados de libertad Dentro de Grupos 2,5 18 Total 77,8333333 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 108,48 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 167 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO F RESULTADOS PRUEBAS DEFINITIVAS CON HERBICIDA 168 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna F.1 PRUEBA PRELIMINAR CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 100 3 4 4 5 200 5 5 5 5 300 5 5 5 5 400 5 5 5 5 500 5 5 5 5 0 80 100 100 100 100 F.2. PRUEBAS DEFINITIVAS Septiembre 3 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 2 2 2 1 40 2 5 2 2 60 3 3 4 4 80 4 4 5 5 100 4 4 5 4 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 35 55 70 90 85 31.5626 41.8040 18.3913 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 7 1,75 2 2 11 2,75 4 4 14 3,5 4 5 5 18 4,5 4 4 5 4 17 4,25 0 0 0 0 0 0 total 67 16,75 R1 R2 R3 R4 20 2 2 2 40 2 5 60 3 3 80 4 100 Blanco Fuente: LAB M07 169 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 57,7083333 6 4 24 5 Promedio de cuadrados 11,5416667 0,56944444 20,2682927 Grados de libertad Dentro de Grupos 10,25 18 Total 67,9583333 23 F Calculado F Teórico 2.77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 3 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 0 0 1 1 40 1 3 1 1 60 2 3 4 4 80 4 3 5 4 100 4 5 4 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 48.5909 57.7525 39.5340 Análisis de varianza Concentración 170 Número de réplicas total promedio R1 R2 R3 R4 20 0 0 1 1 2 0,5 40 1 3 1 1 6 2,75 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 60 2 3 4 4 13 3,25 80 4 3 5 4 16 4 100 4 5 4 5 18 4,5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 55 15 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 71,2083333 6 4 24 5 Promedio de cuadrados 14,2416667 0,54166667 26,2923077 Grados de libertad Dentro de Grupos 9,75 18 Total 80,9583333 23 F Calculado F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 3 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 1 1 0 1 40 1 2 1 1 60 4 3 2 2 80 4 4 4 4 100 4 4 5 4 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 171 50.9970 62.1933 40.7487 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Análisis de varianza Número de réplicas Concentración total promedio 1 3 0,75 1 1 5 1,25 3 2 2 11 2,75 4 4 4 4 16 4 100 4 4 5 4 17 4,25 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 52 13 R1 R2 R3 R4 20 1 1 0 40 1 2 60 4 80 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 62,33 5 Promedio de cuadrados 12,4666667 Dentro de Grupos 5 18 0,27777778 Total 67,333 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 44,88 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 10 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL Blanco 1 0 20 2 1 2 1 40 5 2 2 1 60 2 4 3 2 80 3 4 5 4 100 172 NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 38.2408 49.6108 25.1876 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 6 1,5 2 1 10 2,5 4 3 2 11 2,75 4 5 4 16 4 4 5 4 5 18 4,5 0 0 0 0 0 0 total 61 15,25 R1 R2 R3 R4 20 2 1 2 40 5 2 60 2 80 3 100 Blanco Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 54,2083333 5 Promedio de cuadrados 10,8416667 0,88 Grados de libertad Dentro de Grupos 15,75 18 Total 69,9583333 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 12,3904762 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 173 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Septiembre 10 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 1 1 2 2 40 2 2 2 1 60 3 3 2 3 80 4 4 4 4 100 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 41.1958 51.1070 30.4792 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 2 6 1,5 2 1 7 1,75 3 2 3 11 2,75 4 4 4 16 4 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 60 15 R1 R2 R3 R4 20 1 1 2 40 2 2 60 3 80 4 100 0.0 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 65,5 5 Promedio de cuadrados 13,1 Dentro de Grupos 2,5 18 0,13888889 Total 68 23 Fuente: LAB M07 174 6 4 24 F Calculado F Teórico 94,32 2,77 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 10 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 2 2 1 1 40 2 1 2 1 60 3 3 2 2 80 4 4 3 5 100 4 5 4 4 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 45.4962 59.1399 32.2849 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 6 1,5 2 1 6 1,5 3 2 2 10 2,5 R1 R2 R3 R4 20 2 2 1 40 2 1 60 3 80 4 4 3 5 16 4 100 4 5 4 4 17 4,25 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 55 13,75 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL 175 6 4 24 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 53,2083333 5 Promedio de cuadrados 10,6416667 0,31944444 33,3130435 Grados de libertad Dentro de Grupos 5,75 18 Total 58,9583333 23 F Calculado F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 17 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 1 2 2 2 40 2 1 2 2 60 2 3 3 3 80 4 5 4 4 100 5 5 4 4 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 42.8240 58.6998 23.3415 Análisis de varianza Concentración 176 Número de réplicas total promedio 2 7 1,75 2 2 7 1,75 3 3 3 11 2,75 5 4 4 17 4,25 R1 R2 R3 R4 20 1 2 2 40 2 1 60 2 80 4 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 100 5 5 4 4 18 4,5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 60 15 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 58 5 Promedio de cuadrados 11,6 Dentro de Grupos 4 18 0,22222222 Total 62 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 52,2 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 17 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 1 1 1 0 40 1 2 1 1 60 4 3 2 2 80 4 4 5 4 100 4 4 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 177 48.9913 58.7242 39.6084 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Análisis de varianza Número de réplicas Concentración total promedio 0 3 0,75 1 1 5 1,25 3 2 2 11 2,75 4 4 5 4 17 4,25 100 4 4 5 5 18 4,5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 54 13,5 R1 R2 R3 R4 20 1 1 1 40 1 2 60 4 80 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 70,5 5 Promedio de cuadrados 14,1 Dentro de Grupos 6 18 0,33333333 Total 76,5 23 6 4 24 F Calculado F Teórico 42,3 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 17 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL 178 NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 0 0 1 1 40 1 3 1 1 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 60 2 3 4 4 80 4 3 5 4 100 4 5 4 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 48.5809 57.7525 39.5340 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 2 0,5 1 1 6 1,5 3 4 4 13 3,25 4 3 5 4 16 4 100 4 5 4 5 18 4,5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 55 13,75 R1 R2 R3 R4 20 0 0 1 40 1 3 60 2 80 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 71,2083333 6 4 24 5 Promedio de cuadrados 14,2416667 0,54166667 26,2923077 Grados de libertad Dentro de Grupos 9,75 18 Total 80,9583333 23 F Calculado F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 179 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Septiembre 24 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 1 1 2 2 40 2 2 2 1 60 3 3 2 3 80 4 4 4 4 100 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 41.1958 51.1070 30.4792 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 2 6 1,5 2 1 7 1,75 3 2 3 11 2,75 4 4 4 16 4 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 60 15 R1 R2 R3 R4 20 1 1 2 40 2 2 60 3 80 4 100 Blanco Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 65,5 5 Promedio de cuadrados 13,1 Dentro de Grupos 2,5 18 0,13888889 Total 68 23 Fuente: LAB M07 180 6 4 24 F Calculado F Teórico 94,32 2,77 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 24 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 2 2 2 1 40 2 5 2 2 60 3 3 4 4 80 4 4 5 4 100 4 4 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 31.8725 41.9194 19.1056 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 7 1,75 2 2 11 2,75 4 4 14 3,5 4 5 4 17 4,25 4 4 5 5 18 4,5 0 0 0 0 0 0 2 2 2 1 7 1,75 R1 R2 R3 R4 20 2 2 2 40 2 5 60 3 3 80 4 100 Blanco Fuente: LAB M07 181 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 57,7083333 6 4 24 5 Promedio de cuadrados 11,5416667 0,56944444 20,2682927 Grados de libertad Dentro de Grupos 10,25 18 Total 67,9583333 23 F Calculado F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 24 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 20 0 1 1 1 40 2 2 2 2 60 3 4 3 3 80 4 4 3 4 100 4 5 4 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 182 45.3259 55.3883 35.2295 % MORTALIDAD OBTENIDO 0 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 1 3 0,75 2 2 8 2 4 3 3 13 3,25 4 4 3 4 15 3,75 100 4 5 4 5 18 4,5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 57 14,25 R1 R2 R3 R4 20 0 1 1 40 2 2 60 3 80 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 62,375 5 Dentro de Grupos 3,25 18 Total 65,625 23 Promedio de cuadrados 12,475 6 4 24 F Calculado 0,18055556 69,0923077 F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 183 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna PRUEBAS DE DICROMATO PARALELAS A LAS PRUEBAS CON HERBICIDA Septiembre 3 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1.5 2 2 2 2 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 1.2874 1.5437 1.0992 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 0 0 0 1 1 4 1 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 1 1 1 2 2 1 1 6 1,5 1.5 2 2 2 2 8 2 2 5 5 5 5 20 5 Blanco 0 0 0 0 0 0 total 38 9,5 Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 68,8333333 5 Promedio de cuadrados 13,7666667 0,05555556 Grados de libertad Dentro de Grupos 1 18 Total 69,8333333 23 184 6 4 24 F Calculado F Teórico 247,8 2,77 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 10 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1.5 2 2 2 2 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 1.2874 1.5437 1.0992 Análisis de varianza Concentración Número de réplicas total promedio 0 0 0 1 1 4 1 1 2 6 1,5 2 2 2 8 2 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 38 9,5 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 1 1 1 1 2 1.5 2 2 Blanco Fuente: LAB M07 TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL 185 6 4 24 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Origen de Suma de las cuadrados variaciones Entre grupos 68,8333333 Dentro de Grupos 1 Total 69,8333333 5 Promedio de cuadrados 13,7666667 18 0,05555556 Grados de libertad F Calculado F Teórico 247,8 2,77 23 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna Septiembre 17 de 2008 CONCENTRACION NOMINAL % MORTALIDAD OBTENIDO NO. ORGANISMOS MUERTOS 2 3 4 0 0 0 Blanco 1 0 0.3 0 0 0 0 0.8 1 2 1 0 1 2 1 1 2 1.5 3 2 3 1 2 5 5 5 5 CL 50-48 (ppm) LIMITE SUPERIOR (ppm) LIMITE INFERIOR (ppm) 0 1.2671 1.4904 1.0925 Análisis de varianza Concentración 186 Número de réplicas total promedio 0 0 0 0 4 1 1 2 6 1,5 2 3 1 9 2,25 5 5 5 5 20 5 0 0 0 0 0 0 total 39 9,75 R1 R2 R3 R4 0.3 0 0 0 0.8 1 2 1 1 2 1 1.5 3 2 Blanco DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna TRATAMIENTOS OBSERVACIONES TOTAL Origen de las variaciones Entre grupos Suma de cuadrados Grados de libertad 69,875 5 Dentro de Grupos 5,75 18 Total 75,625 23 Promedio de cuadrados 13,975 6 4 24 F Calculado 0,31944444 43,7478261 F Teórico 2,77 Fuente: LAB M07 Se determina el valor de F para luego poder comparase con el valor de F teórico, y poder concluir teniendo en cuenta dos hipótesis. Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos. Fc > Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna 187 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO G PROTOCOLO PARA EL MANEJO, TRANSPORTE, ALMACENAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS DE HERBICIDAS 188 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna PROTOCOLO PARA EL MANEJO, TRANSPORTE, ALMACENAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS DE HERBICIDAS GLOSARIO Ambiente: el entorno, incluyendo el agua, aire, suelo, y su interrelación, así como las relaciones entre estos elementos y cualesquiera organismo vivo Autoridad competente: autoridad nacional o internacional designada o reconocida por el Estado para un determinado fin. Desecho: material que no tiene ninguna posibilidad de recuperación y debe ser eliminado adecuadamente para no afectar el medio ambiente. Incineración: Es el proceso de oxidación térmica mediante el cual los residuos son convertidos, en presencia de oxígeno, en gases y restos sólidos incombustibles bajo condiciones de oxígeno Estequiométricas y la conjugación de tres variables: temperatura, tiempo y turbulencia. La incineración contempla los procesos de pirolisis y termólisis a las condiciones de oxígeno apropiadas. Mercancía peligrosa: materiales perjudiciales que durante la fabricación, manejo, transporte, almacenamiento o uso, pueden generar o desprender polvos, humos, gases, líquidos, vapores o fibras infecciosas, irritantes, inflamables, explosivos, corrosivos, asfixiantes, tóxicos o de otra naturaleza peligrosa, o radiaciones ionizantes en cantidades que pueden afectar la salud de las personas que entran en contacto con éstas, o que causen daño material. Norma técnica: es el documento establecido por consenso y aprobado por un organismo reconocido, que suministra, para uso común y repetido, reglas, directrices y características para las actividades o sus resultados, encaminadas al logro del grado óptimo de orden en un contexto dado. Las normas técnicas se deben basar en los resultados consolidados de la ciencia, la tecnología y la experiencia y sus objetivos deben ser los beneficios óptimos para la comunidad. Residuos Peligrosos : Sustancias o mezclas de ellas que, independientemente de su estado físico, representen un riesgo para el ambiente y la salud, por sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o biológicoinfecciosas 189 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Tarjeta de emergencia: documento que contiene información básica sobre la identificación del material peligroso y datos del fabricante, identificación de peligros, protección personal y control de exposición, medidas de primeros auxilios, medidas para extinción de incendios, medidas para vertido accidental, estabilidad y reactividad e información sobre el transporte, que se elabora de acuerdo con lo estipulado en la NTC4532. OBJETIVOS Generar una herramienta útil, de incidencia positiva en la manera de almacenar, transportar, manipular y disponer los residuos del herbicida generados en el desarrollo de proyectos de investigación en el laboratorio de Bioensayos. 1. GENERALIDADES Con la Política Ambiental para la Gestión Integral de Residuos Peligrosos y normatividades como el decreto 2676, se da inicio a una concienciación de todos los generadores de residuos peligrosos sobre la responsabilidad compartida para prevenir la generación de tales, y propender por el manejo ambientalmente racional de los mismos. A partir de esto, surge un compromiso por parte del Laboratorio de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de impulsar a través de sus servicios el manejo racional de los productos químicos y sus residuos y proponer ensayos de tratabilidad de acuerdo al tipo de residuo generado. Los plaguicidas constituyen una fuente potencial de infección, por lo que deben tomarse medidas para almacenarlos, transportarlos, manejarlos y disponerlos, separados de los desechos generales. El manejo y control de los plaguicidas son un tema de interés ambiental tanto dentro como fuera de las instituciones de salud y afines, ya que pone en peligro la salud de los trabajadores involucrados en su manipulación. Dando cumplimiento a lo exigido en el Decreto 2676: 1. Garantizar la gestión integral de sus residuos hospitalarios y similares y velar por el cumplimiento de los procedimientos establecidos en el Manual para tales efectos. 2. El fabricante o importador de un producto o sustancia química con propiedad peligrosa que dé lugar a un residuo hospitalario o similar peligroso, se equipara 190 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna a un generador, en cuanto a responsabilidad por el manejo de los embalajes y residuos del producto o sustancia, de conformidad con la Ley 430 de 1998. 3. Garantizar ambiental y sanitariamente un adecuado tratamiento y disposición final de los residuos hospitalarios y similares conforme a los procedimientos exigidos por los Ministerios del Medio Ambiente y Salud. Para lo anterior podrán contratar la prestación del servicio especial de tratamiento y la disposición final. Un incendio que involucre plaguicidas es siempre un accidente grave, no sólo por los riesgos del propio incendio, como generación de humos, vapores tóxicos o explosiones, sino por los desechos tóxicos que quedan después de que el fuego ha sido extinguido. Las actividades consideradas en este documento son: almacenamiento, transporte, manejo de envases, y manejo de desechos líquidos. Todas estas actividades están regidas por la regulación ambiental existente, y su descripción busca a través del conocimiento, reducir el deterioro del hombre y los recursos naturales. 2. MARCO TEORICO Los plaguicidas están sujetos a la acción de varios factores que pueden causar su deterioro inclusive antes de la fecha de vencimiento, señalada por el fabricante en la etiqueta. En la siguiente tabla se clasifican los plaguicidas de acuerdo al tipo de problema que controlan. TIPO DE PLAGUICIDA Insecticida Fungicida Herbicida Acaricida Nematicida Molusquicida Rodenticida PLAGA QUE CONTROLA Insectos Hongos causantes de enfermedades Malezas Ácaros Nemátodos Babosas y caracoles Ratas y ratones Los Herbicidas pueden clasificarse por: A. Su selectividad: Selectivos y no selectivos. No selectivos son aquellos que afectan todo tipo de plantas y selectivos son los que solamente afectan ciertas familias o especies de plantas. 191 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna B. La época de aplicación: Presiembra: se aplican sobre la vegetación existente en un terreno, preparado o sin preparar, antes de la siembra. Presiembra incorporados: Se aplican sobre el terreno convenientemente preparado y se incorporan o mezclan con el suelo, mediante rastrilladas. Después de la incorporación se siembra la semilla del cultivo. Pre-emergencia: Se aplican sobre el terreno preparado y sembrado, pero antes de que el cultivo y/o las malezas hayan nacido. Post –emergencia: Se aplican después de que el cultivo y/o las malezas han nacido. La aplicación en post-emergencia puede ser temprana (malezas recién germinadas) o tardía. C. El punto de aplicación: De aplicación al suelo y de aplicación al follaje. Los de aplicación al suelo inhiben la germinación de las semillas de malezas o las matan en el proceso de germinación. Los de aplicación al follaje se aplican sobre malezas ya nacidas. (Post-emergentes). D. Su movimiento en la planta: Sistémicos, penetran en la planta y la afectan totalmente y de contacto, solamente afectan la parte que tocan. E. Por la clase de malezas que controla: graminicidas, de hoja ancha y de ciperáceas. Un herbicida puede controlar una o varias clases de malezas. F. Por su persistencia en el suelo: residuales, ejercen control durante 15 a 20 días y no residuales, se fijan al suelo y/o se descomponen rápidamente. 3. ALMACENAMIENTO Deberá existir buena ventilación para evitar la acumulación de vapores inflamables o tóxicos. El diseño del techo debe facilitar la ventilación. Si la ventilación natural es insuficiente deben instalarse extractores. Para un correcto almacenamiento de los herbicidas se debe tener en cuenta las recomendaciones siguientes contempladas en el Decreto 1843 de 1991 y la NTC 1319 (Almacenamiento): • Dedicación exclusiva. No debe almacenarse junto al herbicida alimentos para el hombre o los animales, ropas, calzado, elementos de protección, artículos de uso 192 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna doméstico, drogas ni, en general, ningún elemento cuya contaminación pueda representar un riesgo para las personas. (Decreto 1843 de 1991, Cap.VI, art. 54). • Protección contra factores de deterioro. Los herbicidas deben protegerse de la humedad, el sol directo y el calor excesivo, principales factores que contribuyen a su deterioro. Los estantes pueden ser metálicos o de madera (a veces en concreto). Los estantes de madera deben pintarse con pinturas resistentes a los solventes En ellos los herbicidas deben colocarse teniendo en cuenta su formulación y toxicidad: Los líquidos abajo y los sólidos arriba; los más tóxicos abajo y los menos tóxicos arriba. En estibas o estantes los envases de líquidos deben colocarse con las tapas hacia arriba. Nunca deben colocarse acostados, salvo en caso de emergencia y por poco tiempo, cuando presentan filtraciones. Cuanto mayor cantidad de plaguicidas se almacene, mayor es el riesgo potencial y por tanto los requisitos son más estrictos. Los envases o embalajes de herbicidas no deben colocarse directamente en el suelo, sino colocar sobre cualquier sistema que evite el contacto con el piso (Decreto 1843 de 1991, Cap. VI, art. 57) Para envasar herbicida se utilizan diferentes clases de materiales. Las formulaciones líquidas se envasan en recipientes de plástico de diversas clases y metal (hojalata y aluminio) con una capacidad que varía desde 60 hasta 205 litros; las formulaciones sólidas se envasan en bolsas de plástico, aluminio, papel (solos o combinados), desde pocos gramos hasta, generalmente, 25 kilos. Estos materiales presentan diferente grado de resistencia frente a impacto, perforación y oxidación. En la figura N° 1 se observa el tipo de recipiente que debe ser usado según el tipo de residuo a almacenar. Igual de importante que el recipiente es el etiquetado de este. Para ello el responsable del laboratorio y del uso del herbicida tendrá que asegurarse del correcto etiquetado, con sus códigos y símbolos correspondientes. 193 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Figura1. Tipo de recipientes La etiqueta debe ser legible y estar en un lugar visible (ver figura N°2). El gestor actuará en función de su etiquetado, retirando solo los residuos que estén perfectamente identificados y procediendo, posteriormente, al mejor tratamiento posible. Para el almacenamiento, se dispone de un espacio en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental, específicamente en la estantería correspondiente para almacenar los residuos peligrosos. El plaguicida se almacenará en un recipiente de plástico con capacidad para un galón, el cual se rotulara como se muestra en la etiquete anexada (ANEXO I). 194 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna 4. TRANSPORTE El transporte de herbicidas es una actividad en la cual deben tomarse todas las precauciones necesarias para asegurar que los productos lleguen a su destino sin problemas. Los principales objetivos son: A. Minimizar los riesgos para las personas y el ambiente B. Disponer de respuesta ante eventuales emergencias como derrames o incendios. C. Mantener la calidad de los productos, la cual puede afectarse por la luz del sol, alta temperatura, movimiento y humedad. D. Asegurar la disponibilidad de productos a tiempo Los herbicidas deben transportarse únicamente en vehículos cuyo estado de conservación general ofrezca garantía de seguridad Luego de ser utilizado el herbicida en el laboratorio de bioensayos, este se dispondrá a almacenarse en un recipiente de plástico existente dentro del laboratorio de bioensayos (debidamente rotulado) con capacidad de 5 litros, una vez es alcanzado los ¾ del recipiente, es transportado al recipiente existente en el Laboratorio de Ambiental, como se muestra en el plano que aclara la ruta de transporte del herbicida (ANEXO III). Figura N°2. Almacenamiento herbicida 5. MANIPULACION Para el adecuado uso o manejo del herbicida, es indispensable tener en cuenta que finalizada la prueba, o la actividad que se este desarrollando, este no podrá ser arrojado al alcantarillado, se deberá seguir las instrucciones de almacenamiento. 195 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna No podrá hacerse uso del herbicida, sin previa guía y autorización, de la persona a cargo del proyecto. Es indispensable para quien haga uso del Herbicida, portar el completo equipo de protección personal, a continuación se analizan estos aspectos para los diferentes elementos de protección personal para cualquiera de las actividades que tengan relación con el manipuleo o uso de herbicidas. El equipo de protección para manejo de herbicidas está compuesto de diversos elementos destinados a evitar la exposición por vía dermal e inhalatoria. Los elementos más comunes son: ropa (permeable o impermeable) guantes, gorro, calzado cerrado, casco o sombrero, gafas o protector facial y respirador. El grado de protección que estos elementos puede dar depende de los siguientes factores: • Su calidad, la cual está relacionada con el material, el diseño y su estado de conservación. • Su uso correcto. • Su adecuado mantenimiento. • Actividad a desarrollar Permeable. Puede ser de una sola pieza o de camisa y pantalón separados. Se utiliza de algodón o algodón-poliéster. Deben tener manga larga en brazos y piernas. Las mangas no deben recortarse ni re-mangarse. Se debe tener cerrada la cremallera o botones. No debe presentar desgarres: estos deben remendarse. El almidonar la ropa ofrece mayor resistencia a la penetración de los herbicidas y facilita la descontaminación al lavarlos. Figura N°3. Permeable Protección de cabeza. Puede hacerse por medio de gorros de tela, cascos de plástico. Previenen la contaminación por salpicaduras, nube de aspersión o polvos en suspensión que pueden caer en el cabello y luego, por el sudor, entrar en contacto con el cuero cabelludo. Deben lavarse a diario. 196 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Gafas y protectores faciales. Se fabrican en acetato, PVC y otros materiales. Previenen la contaminación por salpicaduras o por la nube de aspersión, especialmente al aplicar cultivos altos. Las gafas deben ser cerradas, con ventilación indirecta. Los protectores faciales, llamados también visores, protegen no sólo los ojos sino la cara y se empañan menos, especialmente en climas calientes y húmedos. Deben lavarse diariamente. Respiradores. Llamados comúnmente máscaras, se obtienen en diferentes modelos y tipos de filtros (o cartuchos) que se ajustan a diversas necesidades. (Polvos, o vapores y gases de distinta clase). Figura N°4. Gafas Los respiradores para polvos ( material particulado) pueden ser desechables, o estar compuestos por una pieza facial construida en PVC u otro material, con un filtro reemplazable. Ofrecen diferente capacidad de filtrado de partículas. Las de tipo A tiene capacidad de filtrar por lo menos un 98% de partículas menores de 10 micras, las de tipo B un 95% y las de tipo C un 90%. Algunos modelos poseen una válvula, llamada de exhalación, que facilita la salida del aire expirado. La máscara o el filtro se deben cambiar cuando se sienta el olor al contaminante o la respiración se haga difícil. Los respiradores para vapores constan de una pieza facial provista de uno o dos filtros y una o dos válvulas de exhalación. La pieza facial se ajusta a la cara, cubriendo boca y nariz, mediante bandas elásticas (resortes) y un arnés o cabezal. Esta pieza se puede obtener en diferentes tallas. Figura N°5. Respiradores 197 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Las máscaras de cara completa cubren totalmente la cara y están provistas de un plástico o acetato transparente, que reemplaza al visor o las gafas. Pueden estar provistas de dos cartuchos normales o uno de mayor tamaño llamado canister. Son muy útiles cuando se manejan sustancias que producen vapores o gases irritantes. En el uso de respiradores recomendaciones: debe tenerse en cuenta las siguientes A. Es fundamental que el respirador ajuste herméticamente a la cara: para ello debe buscarse la talla y diseño apropiados y el usuario no debe tener barba o patillas largas. Debe verificarse que la válvula de exhalación cierra perfectamente. Para comprobar el ajuste del respirador se tapa el filtro (o los filtros) con las manos y se inhala: se debe sentir que el respirador se pega a la cara; se contiene la respiración por unos segundos: si la pieza facial se afloja, es señal que está entrando aire y debe verificarse la causa. Adicionalmente, cuando se está trabajando con productos que presentan algún olor o características irritantes, se debe aprovechar estas características para comprobar el buen funcionamiento del respirador. Figura N°6. Mascarilla B. No debe meterse trapos o papel higiénico dentro del respirador ya que esto no mejora la protección y sí dificulta la respiración. C. No se debe tocar o quitar el respirador con las manos o guantes contaminados. D. La banda elástica debe remplazarse cuando pierda su elasticidad. E. Los filtros tienen una duración limitada, establecida por el fabricante, pero esta varía de acuerdo con las condiciones de trabajo. Debe buscarse la asesoría del fabricante para determinar la vida útil de los filtros en diferentes circunstancias de operación. Si al respirar se siente el olor al contaminante o la respiración es difícil, se debe cambiar el cartucho aunque el tiempo de uso sea inferior al establecido. 198 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Al comprar respiradores o cartuchos de repuesto debe especificarse que sean para plaguicidas, ya que existen cartuchos para diferentes usos. Al terminar la jornada de trabajo se deben quitar el filtro y limpiar exteriormente con un trapo húmedo. El prefiltro puede limpiarse golpeándolo con la mano o con un chorro de aire o, si es el caso, cambiarlo. El resto del respirador debe lavarse con agua, preferiblemente caliente (máximo 65º C) y detergente y dejarlo secar al aire. Los cartuchos deben guardarse en una bolsa plástica cerrada. Los elementos de protección no deben guardarse en el mismo sitio donde se almacenan o manipulan herbicidas. Deben renovarse de acuerdo con el tiempo y condiciones de uso y estado de conservación. Además, los elementos de protección deteriorados o muy contaminados, deben inutilizarse antes de desecharlos e incinerarse en un horno con licencia ambiental según lo contempla la resolución 058 de 2002 de Minambiente. Vestimenta de protección debe ser utilizada por todas las personas que manejen el componente. Adecuadas facilidades deben estar a disposición todo el tiempo durante el manejo y el lugar de manejo debe ser cerrado. Comer, beber y fumar debe ser prohibido durante el manejo y antes y después debe limpiarse. Figura N°. 7 Vestimenta de protección. 6. DISPOSICION Una vez los residuos alcancen los ¾ del recipiente ubicado en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental, se procede a confirmar con la empresa INCINERACIONES BOK el día y la hora la cual harán retiro de los residuos generados por el plaguicida, y ellos harán el respectivo proceso de manejo y eliminación de estos residuos y de los recipiente finalizado el proyecto de investigación. 199 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna Para el retiro de los residuos almacenados en el laboratorio de Ingeniería Ambiental, se deberá seguir el recorrido descrito en la ruta de retiro de los residuos. (ANEXO IV) Existen diversos agentes físicos, químicos o biológicos que degradan los herbicidas. Los más conocidos son: 1. Incineración. En el país existen varios incineradores que cumplen con la Resolución 058 de 2002 del Ministerio del Medio Ambiente y permiten la eliminación de desechos pequeños de derrames y empaques y embalajes. 2. Hidrólisis. Muchos plaguicidas se hidrolizan en el agua, especialmente si el medio es alcalino. Los organofosforados son particularmente sensibles a esta acción. 3. Acción microbiana. Los microorganismos del suelo degradan los plaguicidas orgánicos. En suelos ricos en materia orgánica la actividad microbiana es mayor y en suelos arenosos es menor. 4. Luz solar. Los rayos ultravioleta de la luz del so– descomponen algunos plaguicidas. 5. Oxidación. La oxidación a temperatura ambiente es otro agente que contribuye a la degradación de muchos plaguicidas. La acción de uno o varios de estos agentes puede utilizarse para tratar adecuadamente los desechos siendo la incineración controlada la mejor opción ambiental y la más utilizada. 7. MEDIDAS DE PRIMEROS AUXILIOS Ingestión Ojos Piel Inhalación Inmediatamente dar a beber agua, no inducir vómito. Consultar al médico. Lavar los ojos con aguas limpia durante quince minutos, manteniendo los parpados bien abiertos. Consultar al médico. Quitar ropa y zapatos contaminados, lavar la zona con abundante agua y jabón. Alejar al afectado del área contaminada, trasladarlo a un área de mayor ventilación y mantenerlo en reposo. Tabla N°1. Medidas de primeros auxilios 200 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna BIBLIOGRAFIA http://www.rds.org.co/guias.htm Guía ambiental para el subsector de plaguicidas. 2003. MINISTERIO DE AMBIENTE, VIVIENDA Y DESARROLLO TERRITORIAL. Protocolos de residuos peligrosos. UNIVERSIDAD DE LA SALLE. Laboratorio de Ingeniería Ambiental. 201 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO I. ROTULO PARA DEMARCAR ZONA DE ALMACENAMIENTO Y DESECHOS. 0 3 0 HERBICIDA ROUNDUP 747 Herbicida no selectivo de amplio espectro, desarrollado para eliminación de hierbas y de arbustos, en especial los perennes. Es un herbicida total. R 2-4/20-28/36-41/45-48 S 2-4/7-9/15-17/18/20/21/24-26/29/35-39/42/44-46/51 202 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO II. CLASIFICACIÓN TOXICOLÓGICA PARA PLAGUICIDAS SEGÚN OMS 203 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO III. PLANO. RUTA DE EVACUACIÓN DEL RESIDUO DE HERBICIDA DEL LABORATORIO DE INGENIERIA AMBIENTAL AL CARRO RECOLECTOR DE RESIDUOS GENERADOS 204 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO IV. PLANO. RUTA DE EVACUACIÓN DEL RESIDUO DE HERBICIDA DEL LABORATORIO DE BIOENSAYOS AL LABORATORIO DE INGENIERIA AMBIENTAL 205 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO H REGISTRO DE RESULTADOS PROGRAMA PROBIT 206 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO I PROTOCOLO ANALISIS DE VARIANZA – ANOVA 207 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA CL 50-48 DEL HERBICIDA ROUNDUP 747 SOBRE ECOSISTEMAS ACUATICOS MEDIANTE PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DAPHNIA magna ANEXO J PROTOCOLO PROGRAMA PROBIT 208