Inducción de proteínas con funcionalidad crioprotectora por altas

Inducción de proteínas con funcionalidad crioprotectora por altas
concentraciones de CO2 en chirimoya
O. Goñi, C. Merodio y M.I. Escribano
Departamento de Ciencia y Tecnología de Productos Vegetales. Instituto del Frío. CSIC.
José Antonio Novais 10, Ciudad Universitaria. 28040 Madrid.
Palabras clave: chirimoya (Annona cherimola), conservación frigorífica, 1,3-βglucanasa, isoformas, lactato deshidrogenasa, quitinasa.
Resumen
El estudio de la actividad quitinasa y 1,3-β-glucanasa de los diferentes
extractos proteicos aislados de chirimoya reveló que los frutos responden a las bajas
temperaturas con un incremento inicial de la actividad quitinasa en la fracción ácida
y un descenso de la actividad glucanasa en ambas fracciones, ácida y básica. El
tratamiento durante tres días con un 20% de CO2 retrasó el incremento inicial en la
actividad quitinasa ácida, manteniendo mayores niveles de actividad quitinasa
básica y glucanasa ácida. El estudio de la funcionalidad de los extractos proteicos
reveló una alta actividad crioprotectora en aquellos extractos ácidos y básicos
procedentes de frutos tratados que contienen isoformas quitinasa y glucanasa
inducidas específicamente por el tratamiento gaseoso.
INTRODUCCIÓN
Ciertas plantas tienen la capacidad de inducir o activar una serie de mecanismos
de defensa en respuesta a la baja temperatura que incrementan su resistencia, entre ellos la
inducción de ciertas proteínas con actividad crioprotectora. Estas proteínas tienen la
capacidad de proteger a otras proteínas y a diferentes estructuras celulares del daño por
frío. Muchas de las proteínas que presentan funcionalidad como crioprotectores tienen
una secuencia homóloga a proteínas relacionadas con la patogénesis, como es el caso de
quitinasa (PR-3 o PR-Q), 1,3-β-glucanasa (PR-2), taumatina (PR-5) o una PR-10 (Hon et
al., 1995). Otras proteínas con capacidad crioprotectora son las dehidrinas, una familia de
proteínas dentro del grupo LEA.
En chirimoya, numerosos cambios bioquímicos han sido correlacionados con el
aumento a la tolerancia al daño por frío por la aplicación de tratamiento con altas
concentraciones de CO2 (20% durante 3 días), entre ellos un incremento en la
acumulación de PR proteínas (Merodio et al., 1998). Sin embargo, aún no se ha
establecido cual de estos cambios son adaptaciones a las bajas temperaturas y cuales de
ellos tienen un papel funcional en la resistencia a la conservación a bajas temperaturas.
MATERIAL Y MÉTODOS
Chirimoyas (Annona cherimola Mill. cv. Fino de Jete), procedentes de Almuñecar
(Granada), se mantuvieron en cámaras de respiración de 20 L en oscuridad a 6 ºC bajo
flujo de aire continuo o bajo tratamiento gaseoso (20% CO2 + 20% O2 + 60% N2).
Después de 72 h de tratamiento gaseoso los frutos tratados fueron transferidos a
condiciones de flujo de aire continuo. Periódicamente, los frutos fueron pelados,
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eliminadas las semillas, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a –80ºC hasta su
utilización.
Las proteínas fueron extraídas con tampón acetato sódico 0.1M pH 5.0,
conteniendo 1.5 % PVPP, 10 mM EDTA y 20 mM ascorbato sódico, fraccionadas y
concentradas mediante ultrafiltración y precipitación con sulfato de amonio. La
separación de las fracciones de proteínas ácidas y básicas se realizó utilizando una
columna de intercambio aniónico unida a un sistema de FPLC. Las proteínas fueron
separadas por electroforesis SDS-PAGE e inmunodetectadas utilizando anticuerpos antiPR-Q (quitinasa) y anti-PR-2 (1,3-B-glucanasa) de tabaco.
La actividad quitinasa fue ensayada mediante técnicas espectrofotométricas
utilizando una solución de quitina coloreada según el método descrito previamente
(Merodio et al., 1998). La actividad específica se expresa como incremento en la D.O. a
550 nm por hora y por g de peso fresco. La actividad 1,3-β-glucanasa se determinó
midiendo espectrofotométricamente a 450 nm los azúcares reductores, obtenidos tras la
ruptura hidrolítica del sustrato laminarina, por el método del neocuprato de Dygert et al.
(1965). La actividad específica se expresa como nmol de glucosa por hora y por g de peso
freso. La actividad criopotectora de los extractos proteicos fue medida siguiendo el
método descrito por Lin y Thomashow (1992), usando BSA como proteína crioprotectora
patrón. En todos los ensayos de crioprotección la concentración de proteína utilizada fue
75 µg/mL.
Los datos de tres repeticiones han sido procesados por ANOVA (Statigraphic
program, STSC, Rockville, MD) para un nivel de significancia P≤0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Una vez aislados los extractos proteicos a partir de frutos recién recolectados,
conservados a baja temperatura y tratados con altas concentraciones de CO2, las proteínas
fueron fraccionadas según su carácter ácido o básico por cromatografía de intercambio
iónico. En chirimoya, la fracción de proteínas ácidas es mayoritaria, representando un 70
% del total de proteínas solubles extraídas.
El estudio de la actividad quitinasa y 1,3-β-glucanasa en las diferentes fracciones
de proteínas reveló que en chirimoya están presentes isoformas quitinasa y 1,3-βglucanasa ácidas y básicas. La actividad de estas enzimas se modifica dependiendo de la
composición gaseosa de la atmósfera y tiempo de conservación.
En los frutos recién recolectados es mayoritaria la actividad de ambas enzimas en
la fracción de proteínas básicas. Sin embargo, durante la conservación frigorífica en aire
el incremento de la actividad quitinasa total está asociado con un aumento de la actividad
enzimática en la fracción ácida, excepto a los nueve días de conservación en la que la
actividad se reparte al 50% entre ambas fracciones. Cuando los frutos son pretratados
durante 3 días con altas concentraciones de CO2 (20%), la actividad quitinasa no
incrementó hasta los 9 días de conservación, principalmente debido a un incremento de la
actividad quitinasa ácida. El tratamiento gaseoso mantuvo en la fracción básica niveles de
actividad quitinasa superiores a la de los frutos no tratados, y del orden de los hallados en
frutos recién recolectados (Fig. 1).
Durante la conservación frigorífica, tanto de frutos tratados como no tratados,
desciende la actividad 1,3-β-glucanasa en ambas fracciones hasta casi anularse
transcurridos 5 días de conservación. Sin embargo, a los 9 días incrementa bruscamente la
actividad enzimática, principalmente debida a un incremento en la fracción básica de los
frutos no tratados y al aumento de la actividad en ambas fracciones de proteínas en los
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frutos tratados (Fig. 2). En general, el tratamiento gaseoso mantiene niveles superiores de
actividad glucanasa en la fracción de proteínas ácidas.
El pretratamiento durante tres días con un 20% de CO2 no sólo retrasa la respuesta
inicial de defensa a las bajas temperaturas sino que modifica el patrón de distribución de
la actividad quitinasa y 1,3-β-glucanasa entre las fracciones ácidas y básicas. Estas
diferencias podrían estar relacionadas con la mayor tolerancia a la baja temperatura de
conservación exhibida por los frutos tratados con altas concentraciones de CO2
(Maldonado et al., 2002).
En relación con la funcionalidad de las proteínas de defensa inducidas por el
tratamiento gaseoso se ha estimado, en cada una de las fracciones aisladas, la actividad
crioprotectora frente a la enzima LDH, proteína sensible al daño por ciclos de
congelación-descongelación. Las diferentes fracciones de proteínas procedentes de los
frutos no tratados durante la conservación frigorífica presentaron un nivel de actividad
crioprotectora siempre inferior al patrón BSA (Fig. 3). Sin embargo se observó un
aumento de la actividad crioprotectora en extractos de frutos tratados, principalmente, en
las fracciones ácida y básica procedentes de frutos conservados 9 días.
El estudio del patrón de inducción de isoformas ácidas y básicas mediante la
inmunodetección de proteínas quitinasas y 1,3-β-glucanasas con anticuerpos específicos
para cada una de éstas PR proteínas reveló que el incremento en la actividad
crioprotectora parece estar asociado con la inducción por el tratamiento gaseoso de
isoformas quitinasa y glucanasa de baja masa molecular.
Agradecimientos
Este trabajo está financiado por la CICYT, Proyectos AGL2002-02308 y
AGL2005-04502. O. Goñi es becario predoctoral del Ministerio de Educación y Ciencia
(Beca FPU).
Referencias
Dygert, S., Li, L.H., Florida, D. and Thoma, J.A. 1965. Determination of reducing sugar
with improved precision. Anal. Biochem. 13: 367-374.
Hon, W.C., Griffith, M., Mlynarz, A., Kwok, Y.A. and Yang, D.C.S. 1995. Antifreeze
proteins in winter rye are similar to pathogenesis-related proteins. Plant Physiol.
109:879-889.
Lin, C. and Thomashow, M.F.1992. A cold-regulated Arabidopsis gene encodes a
polypeptide having potent cryoprotective activity. Biochem. Biophys. Res. Común.
183: 1103-1108.
Merodio, C., Muñoz, M.T., Del Cura, B., Buitrago, D. and Escribano, M.I. 1998. Effect
of high CO2 level on γ-aminobutyric acid, total polyamines and some pathogenesisrelated proteins in cherimoya fruit stored at low temperature. J. Exp. Bot. 49:13391347.
Maldonado, R., Molina-García, A.D., Sanchez-Ballesta, M.T., Escribano, M.I. y Merodio,
C. 2002. High CO2 atmosphere modulating the phenolic response associated with cell
adhesion and hardening of Annona cherimola fruit stored at chilling temperature. J.
Agric. Food Chem. 50: 7564-7569.
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Quitinasa
(A550/h/g PF)
250
Aire
CO2
ácida
básica
200
150
100
50
0
0
3
5
9
3
14
5
9
14
Días a 6º
Glucanasa
(nmol glucosa/h/g PF)
Fig. 1. Actividad quitinasa en las fracciones de proteínas ácidas y básicas extraídas
del mesocarpo de chirimoya durante la conservación a baja temperatura y efecto
del tratamiento con altas concentraciones de CO2.
125
Aire
CO2
ácida
básica
100
75
50
25
0
0
3
5
9
14
3
5
9
14
Días a 6 ºC
Fig. 2. Actividad 1,3-β-glucanasa en las fracciones de proteínas ácidas y básicas
extraídas del mesocarpo de chirimoya durante la conservación a baja temperatura y
efecto del tratamiento con altas concentraciones de CO2.
Actividad Crioprotector
(% actividad LDH)
100
ácida
Aire
CO2
básica
80
60
BSA
BSA
40
20
0
0
3
5
9
14
3
5
9
14
Días a 6º C
Fig. 3. Actividad crioprotectora en las fracciones de proteínas ácidas y básicas
extraídas del mesocarpo de chirimoya durante la conservación a baja temperatura
y efecto del tratamiento con altas concentraciones de CO2.
382